Boyut Dışlama ICP-MS kullanarak Nicel Metalloproteomic Analiz Standartları

Bu tekniğin genel amacı, bilinen metaloprotein standartlarının kullanımına dayalı olarak karmaşık standartlarda farklı metaloproteinleri ölçebilmektir. Bu yöntem, metallerin biyolojideki rolü ile ilgili temel soruları cevaplayabilir. Örneğin, bir proteinin metal durumu hastalıkta nasıl değişir?

Bu tekniğin önemli bir avantajı, bir proteinin metal durumunu doğal durumunda ölçmenize izin vermesidir. Tekniği göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Amber Lothian olacak. Başlamak için, homojenize doku veya hücre kültürü örnekleri, Tris tamponlu salin kullanarak beş dakika boyunca manuel inişler veya sonikasyon ile.

Homojenatları beş dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjleme ile berraklaştırın. Elde edilen süpernatanı topladıktan sonra, metin protokolünde tarif edildiği gibi protein konsantrasyonlarını belirleyerek toplam protein miktarını normalleştirin. Üreticinin protokollerini kullanarak endüktif olarak eşleştirilmiş plazma spektrometresini ısıtın ve ayarlayın.

Yüzde bir nitrik asit kullanarak, litre başına sıfır ila 500 mikrogram aralığındaki düşüşün tadını çıkarmak için metaloprotein standartlarını seyreltin. Bu aralıktaki standartlara ulaşmak için bir ve 20'yi aşan seyreltmeler kullanmayın. Önce yedi kalibrasyon seviyesini analiz ederek enjeksiyonların sırasını ayarlayın.

Litre başına sıfır ila 500 mikrogram arasında değişen konsantrasyonlar, ardından metaloprotein standartları. Yedi kalibrasyon seviyesi litre başına sıfır, bir, beş, on, 50, 100 ve 500 mikrogramdır. Ardından, ilgilendiğiniz öğeleri seçin.

Burada demir, bakır, çinko, kobalt ve iyot kullanın. Çünkü bunlar protein standartlarının bağlı olduğu elementlerdir. Eleman seçici sekmesini açarak ve analiz edilecek elementleri ve ilgili izotop kütlelerini ekleyerek edinme yöntemindeki elementleri seçin.

Ardından, cihazla numune analizi yapın. Cihaz yazılımı, analiz edilen elemanların her biri için otomatik olarak kalibrasyon eğrileri oluşturur. Bilinmeyen numunelerdeki metal konsantrasyonunu belirlemek için kalibrasyon eğrilerini kullanın.

Toplu analiz sonuçlarından, bakır, çinko, süperoksit, dismutaz ve ferritin karışımı kullanarak Memeli dokularında en bol bulunan üç eser elementi içeren metaloprotein standartlarını oluşturun. Hyperformance hızlı kromatografi veya HPLC pompalarını 200 milimolar amonyum nitrat tamponu ile dakikada beş mililitre akış hızında beş dakika boyunca temizleyin. Sistem temizlendikten sonra, akış hızını sıfır noktasında dakikada bir mililitre olarak ayarlayın.

Ve yan tarafın dışlama sütununu bağlayın. Kolonun diğer ucunu UV dedektörüne bağlayın, tepe borusunu kullanarak ölçüm emilimini 280 nanometreye ayarlayın. Dakikada sıfır nokta dört mililitrelik bir nihai akış hızına ulaşılana kadar, sütunun akış hızını dakikada sıfır nokta bir mililitre artışlarla kademeli olarak artırın.

Bu gerçekleşirken, kolona giden boru bağlantılarında herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Yazılımdaki kromatogram üzerindeki basınç izini gözlemleyerek kolon gereksinimlerini aşmadığından emin olmak için bu sistemin basıncını izleyin. Sütunu, beş ila 10 sütun hacmi üzerinde gerekli akış hızında dengelenmeye bırakın.

Dengelendikten sonra, numune analizinin gerçekleşmesine izin vermek için aletleri bağlayın. HPLC yöntemini, A arabelleğini sıfır noktasında sütun üzerinde 15 dakika boyunca dakikada dört mililitre pompalamak için ayarlayın. Donanım ayarını değiştirmeden önce ICPMS'yi bekleme moduna alın.

Bekleme modundayken, otomatik örnekleyici iletişimini kapatın ve s'yi değiştirin.ample giriş diğer. UV dedektöründen gelen çıkışı doğrudan ICPMS üzerindeki nebulizatöre bağlamak için PEEK hortumunu kullanın. ICPMS'ye güç verin ve cihazın 10 ila 20 dakika ısınmasına izin verin.

Plazma tutuştuktan sonra, ICPMS'den gelen uzak kabloyu HPLC otomatik örnekleyicinin arkasına bağlayın. Plazma tutuştuktan sonra bunu yapın. Aksi takdirde, ICPMS açık olmadığı için HPLC sistemi otomatik olarak kapanacaktır.

LC ICPMS için veri toplamak üzere ICPMS yöntemini, önce edinim yöntemini spektrumdan zaman çözümleme edinimine değiştirerek değiştirin. Ardından, analiz edilecek öğeleri seçin. Demir, bakır, çinko, kobalt, iyot ve diğer ilgili elementler ve entegrasyon sürelerini ayarlayın.

İlgilenilen unsurlar seçildikten sonra, alım süresini kromatografinin çalışma süresine uyacak şekilde ayarlayın. Tamponda bulunan sezyum ve antimon ile akan bir kromatografi tamponu ile hassasiyet ve çarpışma hücresi helyum gazı akış hızları için ICPMS'yi manuel olarak ayarlayın. Metal iyon sayıları stabilize olduğunda ve bağıl standart sapma değerleri yüzde beşin altına düştüğünde, sistem kullanıma hazırdır.

Hem HPLC hem de ICPMS yazılım programlarında örnek çalıştırma listeleri oluşturun. Numune çalıştırma listesi, numunelerin her birinin enjekte edilme sırasını içerir. Verilerin kaydedileceği adın yanı sıra.

Listedeki toplam örnek sayısının iki program arasında eşleşip eşleşmediğini kontrol edin. Numunenin HPLC tarafından enjeksiyonu, ICPMS'nin veri toplamaya başlamasını tetikleyeceğinden, HPLC'den önce ICPMS için numune partisini başlatın. Bu doğru sırayla yapılmazsa, eksik verilere neden olur.

Değişen hacimlerde süperoksit dismutaz ve ferritin karışık standardını enjekte ederek kalibrasyon eğrisi noktaları oluşturun. Enjeksiyon hacimleri bir mikrolitre ile 30 mikrolitre arasında değişir. Son olarak, verileri metin protokolünde açıklandığı gibi analiz etmeden önce doku, plazma veya hücre kültürü gibi bilinmeyen örneklerin her birini analiz edin.

Kolona enjekte edilen 2000 ila 60.000 pikogram demir aralığında ferritin yanılsaması gösterilmektedir. Regresyon analizi pik alan kullanılarak yapıldı. Bakır, çinko, süperoksit dismutaz için illüzyon profilleri hem bakır hem de çinko için gösterilmiştir.

Tepe alanları kullanılarak oluşturulan regresyon analizleri de gösterilir. Regresyon analizinin sonuçları, saniye başına sayım cinsinden ham verileri saniye başına pikogramlara dönüştürmek için kullanılır. Böylece protein ile ilişkili metal miktarı kantitatif olarak belirlenebilir.

Bu teknik, karmaşık biyolojik numunelerdeki metaloproteinleri tanımlamak için kullanılabilir. Burada, SEC ICPMS ile ayrılmış insan beyni gösterilmektedir. Her biri farklı bir ilgi metalini temsil eder.

Yani bakır, çinko veya demir. Burada, insan plazması bu tekniğe tabi tutulduğunda elde edilen izler gösterilmektedir. Numunenin karmaşıklığı ve bolluğu, görülen tepe noktalarının sayısını etkileyecektir.

Beklendiği gibi, plazmaya seruloplazmin ve transferrin dahil olmak üzere birkaç metaloprotein hakimdir. Bu videoyu izledikten sonra, karmaşık örneklerdeki metaloproteinlerin doğal durumunu ölçmek için bir cihazın nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik üç ila dört saat içinde başarıyla uygulanabilir.

Bu, tek bir günde 20 ila 36 numunenin analiz edilmesini sağlar. Bu prosedürü denerken, bakır ve çinko ile ilgileniyorsanız, bakır çinko SOD gibi uygun metaloprotein standartlarını kullanmak önemlidir. Tampondaki sezyum gibi dahili standartların yanı sıra, zaman içinde cihazdaki herhangi bir kaymayı düzeltmenize olanak tanır.

Bu prosedürü takiben, önemli soruları yanıtlamak için diğer kütle spektrometresi biçimlerini de uygulayabilirsiniz. Örneğin, numunemde bulunan metaloproteinler nelerdir? Bu, sindirim ve kütle özellikli protein peptit diziliminde standart gezilerle yapılabilir.

Ya da proteinleri incelikle, doğal hallerinde analiz ederek. Geliştirildikten sonra bu teknik, proteomik alanındaki araştırmacıların Alzheimer hastalığı gibi hastalıklarda metaloproteinlerin rolünü anlamalarının önünü açabilir. Konsantre nitrik asit ve klinik numunelerle çalışmayı unutmayın.

Uygun kişisel koruyucu giysiler giyilmelidir.