içine RNAi Tetik Teslimat

Bu yöntemin genel amacı, Anopheles gambiae'de gelişiminin pupa evresinde başlayan gen susturmalarını başlatmak için RNA interferans tetikleyicilerinin iletilmesidir. Bu yöntem, vektör biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve ergin öncesi veya erken ergin gelişim evrelerinde rol oynayan genlerin ortaya çıkarılmasını sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacılara, geçmişte RNA interferans enjeksiyon protokollerinin uygulanmadığı bir gelişim aralığı olan pupa evresinde gen susturma işlemini başlatarak hızlı fonksiyonel genomik çalışmalar yürütme fırsatı sunmasıdır.

Enjeksiyon adımlarının gerektirdiği hassasiyet ve pupaların bu gelişim aşamasındaki hassas doğası nedeniyle uzmanlaşması zor olabileceği için, bu yöntemin görsel gösterimi kritik önem taşır. İlgi duyulan geni seçtikten sonra, hedef dışı etkilerinin olmayacağının öngörüldüğü 200 ile 800 baz çiftlik bir bölge belirleyin ve T7 promotör dizisi ile çevrelenmiş çift sarmallı RNA sentez şablonu elde etmek için standart PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Ardından, çift sarmallı RNA'yı sentezleyin ve ürünleri ticari bir in vitro kiti kullanarak temizleyin.

Nihai RNA konsantrasyonunu mikrolitre başına üç mikrograma ayarlayın. Ardından, yarım mikrolitre çift zincirli RNA'yı, kalıp DNA ve standart belirteçlerle karşılaştırmak için standart %2 agaroz jel kullanın. Çalışma tamamlandığında, çift zincirli RNA bandının kalitesini ve uzunluğunu kontrol edin.

Görünür herhangi bir spesifik olmayan ürün olmamalıdır. Çift zincirli RNA, kalıp DNA'ya göre daha yavaş göç edecektir. Saklama için çift zincirli RNA alikotları hazırlayın ve bunları -20 °C'de muhafaza edin.

Fast Green FCF boyasının hazırlanmasıyla başlayın. İlk olarak, boyayı RNase-Free su içerisinde hacimce %0,1 konsantrasyona seyrelitin. Ardından, hazırladığınız çözeltiden bir mikrolitrelik hacimleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.

Suyu buharlaştırmak için doldurulmuş tüpleri yaklaşık üç saat boyunca 65 °C'de ısıtın. Ardından, boya katılarını kullanmadan önce tüpleri en az 30 dakika soğutun. Sonrasında, borosilikat cam tüplerden çekme cam enjeksiyon iğneleri hazırlayın.

İğne çekicisini 10 ila 30 mikronluk bir uç çapına ayarlayın. NARISHIGE kapiler çekici için birinci ısıtıcıyı 100'e, ikinci ısıtıcıyı ise 70'e ayarlayın. Ardından kapiler iğneyi sabitleyin ve çekme işlemine geçin.

Şimdi, enjeksiyon istasyonunu hazırlayın. Mikroskop altında kolayca hareket ettirilebilen bir platform seçin. Platformun üzerine, önce kalın bir filtre kağıdını bantla sabitleyin.

Ardından, kalın filtre kağıdının üzerine bir adet ince filtre kağıdı bantlayın. Sonrasında, boya katı tüplerine, enjekte edilecek her bir çift sarmallı RNA'dan 10 µL ekleyin ve boyayı yeniden süspanse edin. Bu tüpleri buz üzerinde saklayın.

Şimdi, enjekte edilecek pupaları toplayın. 60 milimetrelik bir petri kabını 10 mililitre deiyonize su ile doldurun ve plastik bir transfer pipeti kullanarak yaklaşık 50 adet açık renkli pupayı kaba aktarın. Sadece hafifçe pigmente olmuş pupaları kullanın; zira orta veya koyu tabaklanma seviyelerine ulaşmış pupalar kütikül hasarı yaşayacak ve düşük hayatta kalma oranlarına sahip olacaktır.

Mikroenjeksiyonun ilk adımı iğnenin açılmasıdır. Mikroskop altında, ince bir pens kullanarak iğnenin en uç kısmını kırın. Ardından, 30 gauge bir iğne ve şırınga kullanarak iğneyi mineral yağ ile geri doldurun.

Doldurulduktan sonra, mikroenjektör yardımıyla fazla yağı dışarı atın. Mikroenjektörü 69 nanolitre hacim çekecek şekilde ayarlayın. Ardından, iğneyi ön taraftan hazırlanan enjeksiyon RNA'sı ile doldurun.

Çift zincirli RNA dağıtımını sorunlar açısından test edin. Uçtaki tıkanıklıklar ve yetersiz sabitlenmiş iğneler temel sorun kaynaklarıdır. Enjektör hazırlandıktan sonra, bir ila üç pupa seçin ve bunları filtre kağıdı aşamasına aktarın.

Bir resim fırçası kullanarak, pupayı dorsal kutikula erişilebilir olacak şekilde konumlandırın. Kağıda bastırarak, pupaların üzerindeki fazla su emdirilir. Islak bir resim fırçasıyla pupayı sabit tutarken, iğneyi abdomen ile toraks arasındaki dorsal kutikuladan, yaklaşık 30 derecelik bir açıyla, anteriordan posteriora doğru bir hareketle yerleştirin.

Ardından, hemolenfe bir ila iki pals çift zincirli RNA enjekte edin. Enjeksiyon başarılı olduysa, boyanın vücut geneline dağılımı görünür olmalıdır. Pupaya enjeksiyon yaparken, iğnenin sadece dorsal kütikülü delmesi kritik önem taşır.

İğne delinmesi ventral kütikül boyunca uzanırsa, pupanın dış kısmında boya ile işaretlenmiş sıvının biriktiği belirginleşecek veya boya filtre kağıdına geçecektir. Bu gibi durumlarda, pupa atılmalıdır. Boya hemolenf boyunca dağılmazsa, uç büyük olasılıkla tıkanmıştır.

Ucu hafifçe hareket ettirerek herhangi bir RNA ve boya salınımı olup olmadığını belirleyin. Boya salınımına dair bir belirti yoksa pupayı atın. Ardından, iğnenin ucunu değerlendirin ve yeni bir pupa üzerinde başka bir enjeksiyon gerçekleştirin.

Bir pupa başarıyla enjekte edildikten sonra, pupayı iğneden nazikçe kurtarmak için ıslak boya fırçasını kullanın ve pupayı gelişimini tamamlayacağı su dolu kaba aktarın. Enjekte edilen pupaların bulunduğu kabı, normal yetiştirme koşulları altındaki bir sivrisinek kafesine veya konteynerine yerleştirin. Yetişkinler için besin kaynağı olarak, bir pamuk yumağına emdirilmiş %10 ağırlık/hacim çözelti şeklinde glikoz sağlayın.

Erginler çıktıktan sonra, onları kontrollerle karşılaştırın. Örneğin, çift zincirli SRPN2 böcekleri, psödotümör oluşumu açısından günlük olarak değerlendirilmelidir. Bunu yapmak için, erginleri minus 20 degrees Celsius'ta iki ila üç dakika boyunca soğutun ve görüntüleme için two degrees Celsius soğuk plakaya aktarın.

Yetişkinler incelendikten sonra, onları böcek yetiştirme alanına geri bırakın. Teknikten sonra, enjekte edilen pupalarda çıkış sıklığı yaklaşık %70 civarında gerçekleşmiştir. Enjekte edilen pupaların bir kısmında, pupa kabuğundan kısmi çıkış meydana gelmiş ve bu durum yaşayamayan sivrisineklerle sonuçlanmıştır. Enjekte edilen ve edilmeyen sivrisineklerin çıkış oranları arasında bir gecikme görülmemiştir ve enjeksiyonun etkileri cinsiyete göre farklılık göstermemiştir.

Çıkıştan on gün sonra, enjekte edilen sivrisineklerin sağkalım oranlarında enjeksiyon yapılmayan kontrollere kıyasla belirgin bir değişiklik gözlenmemiştir. Çift sarmallı RNA enjeksiyonları için pozitif kontrol olarak serin proteaz inhibitörü SRPN2, negatif kontrol olarak ise çift sarmallı LacZ kullanılmıştır. Çıkıştan sonraki üçüncü güne gelindiğinde, çift sarmallı SRPN2 enjekte edilen yetişkinlerdeki psödotümörler ışık mikroskobunda belirginleşmiştir.

Sekiz gün sonra, psödotümörler oldukça belirgindi. Erişkin evredeki sivrisineklerde, çift zincirli SRPN2 enjekte edilen hayvanların çoğunda melanotik psödotümörler kütikül üzerinden gözlemlenirken, kontrollerde herhangi bir psödotümör gözlemlenmedi. Enjeksiyondan beş gün sonra, çift zincirli SRPN2 enjekte edilen sivrisineklerdeki SRPN2 protein seviyeleri, çift zincirli LacZ enjekte edilen kontrollere ve enjeksiyon yapılmayan kontrollere kıyasla anlamlı derecede daha düşüktü.

Bu videoyu izledikten sonra, yeni geliştirilen bu enjeksiyon protokolünü kullanarak Anopheles gambiae pupalarına RNA interferans tetikleyici gönderiminin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Genellikle, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, pupanın öngörülemeyen hareketleri nedeniyle zorluk yaşarlar. Bununla birlikte, pupanın doğru şekilde konumlandırılması ve stabilize edilmesi üzerinde pratik yapmak, başarılı enjeksiyon oranını ve enjeksiyon kalitesini büyük ölçüde artırır.

Tekniğe hakim olduğunuzda, bu enjeksiyonlar pupa başına yaklaşık 30 saniye sürer. Bu tekniğin geliştirilmesiyle, vektör biyolojisi alanındaki araştırmacıların, sıtma vektörü Anopheles gambiae'nin yetişkin öncesi ve erken yetişkin gelişim evrelerinde gen fonksiyonlarını keşfetmeleri ve değerlendirmeleri için zemin hazırlamış olduk. Bu prosedürün ardından, hedef gen susturmanın protein veya transkript ekspresyon düzeyindeki boyutunu belirlemek için sırasıyla Western blot analizi veya kantitatif PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Nihayetinde, bu teknik, parazitlerin sivrisinekler yoluyla bulaşması için kritik olan genlerin belirlenmesine yardımcı olabilir ve bu yaklaşım, yeni hedefler tanımlamamıza ve daha etkili vektör kontrol stratejileri oluşturma yollarımız hakkında yeni bakış açıları kazanmamıza katkı sağlayacaktır.