içine RNAi Tetik Teslimat Anofel gambiae Pupa

Bu yöntemin genel amacı, gelişimin pupa aşamasında başlayan gen yıkımlarını başlatmak için Anopheles gambiae'de RNA girişim tetikleyicilerinin verilmesidir. Bu yöntem, vektör biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya ve yetişkinlik öncesi veya erken yetişkinlik gelişim aşamalarında rol oynayan genleri ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacılara, geçmişte RNA girişim enjeksiyon protokollerinin uygulanmadığı gelişimsel aralık olan pupa aşamasında gen yıkımını başlatarak hızlı fonksiyonel genomik çalışmalar yapma fırsatı sağlamasıdır.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü bu gelişim aşamasında gereken hassasiyet ve pupaların hassas doğası nedeniyle enjeksiyon adımlarında ustalaşmak zor olabilir. İlgilenilen geni seçtikten sonra, hedef dışı etkisi olmadığı tahmin edilen 200 ila 800 baz çifti bölgesini belirleyin ve bir T7 promotör dizisi ile çevrili çift sarmallı RNA sentez şablonu elde etmek için standart PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Daha sonra çift sarmallı RNA'yı sentezleyin ve ticari bir in vitro kit kullanarak ürünleri temizleyin.

Son RNA konsantrasyonunu mikrolitre başına üç mikrograma ayarlayın. Daha sonra, çift sarmallı RNA'nın yarım mikrolitresini şablon DNA ve standart belirteçlerle karşılaştırmak için standart bir %2 agaroz jeli kullanın. Bittiğinde, çift sarmallı RNA bandının kalitesini ve uzunluğunu kontrol edin.

Görünür spesifik olmayan ürünler olmamalıdır. Çift sarmallı RNA, şablon DNA'dan daha yavaş göç edecektir. Depolama için çift sarmallı RNA alikotları hazırlayın ve eksi 20 santigrat derecede tutun.

Fast Green FCF (Hızlı Mavi) boyasını hazırlamakla başlayın. İlk olarak, boyayı RNaz içermeyen suda hacimce %0.1'e kadar seyreltin. Daha sonra, preparatın bir mikrolitre hacmini 1.5 mililitrelik mikrofüj tüplerine aktarın.

Suyu buharlaştırmak için yüklü tüpleri yaklaşık üç saat boyunca 65 santigrat derecede ısıtın. Daha sonra boya katılarını kullanmadan önce tüpleri en az 30 dakika soğutun. Daha sonra, borosilikat cam tüplerden çekilmiş cam enjeksiyon iğneleri hazırlayın.

İğne çekiciyi 10 ila 30 mikron uç çapına ayarlayın. NARISHIGE kılcal çektirme için ilk ısıtıcıyı 100'e ve ikinci ısıtıcıyı 70'e ayarlayın. Daha sonra kılcal iğneyi sıkıştırın ve çekmeye devam edin.

Şimdi enjeksiyon istasyonunu hazırlayın. Mikroskop altında kolayca manevra yapılabilen bir platform seçin. Platformda, önce kalın bir filtre kağıdı bantlayın.

Ardından, kalın filtre kağıdına ince bir filtre kağıdı bantlayın. Daha sonra, boya katı tüplerine, enjekte edilecek her çift sarmallı RNA'dan 10 mikrolitre ekleyin ve boyayı yeniden süspanse edin. Bu tüpleri buz üzerinde saklayın.

Şimdi, enjekte edilecek pupaları toplayın. 60 milimetrelik bir petri kabını 10 mililitre deiyonize su ile doldurun ve plastik bir transfer pipeti kullanarak yaklaşık 50 soluk renkli pupayı tabağa aktarın. Sadece hafif pigmentli pupa kullanın, çünkü orta ila koyu bronzlaşma seviyelerine ulaşmış pupalar kütikül hasarına maruz kalacak ve hayatta kalma oranları düşük olacaktır.

Mikroenjeksiyonun ilk adımı iğnenin açılmasıdır. Mikroskop altında, ince forseps kullanarak iğnenin en uzak ucunu kırın. Daha sonra 30 gauge bir iğne ve şırınga kullanarak iğneyi mineral yağ ile doldurun.

Doldurulduktan sonra, mikroenjektörü kullanarak fazla yağı boşaltın. Mikroenjektörü 69 nanolitre hacim çekecek şekilde ayarlayın. Ardından, hazırlanan enjeksiyon RNA'sı ile iğneyi önden doldurun.

Problemler için çift sarmallı RNA'nın dağıtımını test edin. Uçtaki tıkanıklık ve yeterince sabitlenmemiş iğneler başlıca sorun kaynaklarıdır. Enjektör hazırlandıktan sonra, bir ila üç pupa alın ve bunları filtre kağıdı aşamasına aktarın.

Bir boya fırçası kullanarak, pupayı dorsal kütiküle erişilebilecek şekilde yönlendirin. Kağıda bastırarak pupa üzerindeki fazla su emilecektir. Pupa'yı ıslak bir boya fırçası ile sabit tutarken, iğneyi karın ile göğüs kafesi arasındaki dorsal kütikülüne yaklaşık 30 derecelik bir açıyla sokmak için önden arkaya hareket kullanın.

Ardından, hemolenf içine bir ila iki çift sarmallı RNA darbesi enjekte edin. Enjeksiyon başarılı olduysa, boyanın vücuda dağılması görünür olmalıdır. Pupa enjekte edilirken, iğnenin sadece sırt kütikülünü delmesi çok önemlidir.

İğne delinmesi ventral kütikül boyunca uzanırsa, pupanın dışında boya etiketli sıvının birikmesi belirgin olacaktır veya boya filtre kağıdına geçecektir. Bu gibi durumlarda, pupa atılmalıdır. Boya hemolenf boyunca dağılmazsa, uç büyük olasılıkla tıkalıdır.

Ucu hafifçe hareket ettirin ve herhangi bir RNA ve boya salınımı olup olmadığını belirleyin. Boya salınımı belirtisi yoksa, pupayı atın. Ardından, iğnenin ucunu değerlendirin ve yeni bir pupa üzerinde başka bir enjeksiyon yapın.

Bir pupayı başarılı bir şekilde enjekte ettikten sonra, ıslak boya fırçasını iğneden nazikçe serbest bırakmak için kullanın ve gelişimini tamamlayacağı su kabına taşıyın. Enjekte edilen pupa tabağını normal yetiştirme koşulları altında bir sivrisinek kafesine veya kabına yerleştirin. Yetişkin bir gıda kaynağı için, bir pamuğa batırılmış hacimce %10'luk bir çözelti içinde glikoz sağlayın.

Yetişkinler ortaya çıktıktan sonra, onları kontrollerle karşılaştırın. Örneğin, çift sarmallı SRPN2 böcekleri psödotümör oluşumu açısından günlük olarak değerlendirilmelidir. Bunu yapmak için, yetişkinleri eksi 20 santigrat derecede iki ila üç dakika soğutun ve görüntülemek için iki santigrat derece soğuk bir plakaya aktarın.

Yetişkinleri gördükten sonra, onları böcek yetiştirme alanına geri koyun. Tekniğe hakim olduktan sonra, enjekte edilen pupalar yaklaşık% 70'lik bir sıklıkta ortaya çıktıEnjekte edilen pupaların bir alt kümesinde, pupa durumundan kısmi çıkış meydana geldi ve bu da cansız sivrisineklere yol açtı. Enjekte edilen ve edilmeyen sivrisinekler arasında ortaya çıkma oranlarında gecikme olmadı ve enjeksiyonun etkileri cinsiyete göre değişmedi.

Ortaya çıktıktan on gün sonra, enjekte edilmeyen kontrollere kıyasla enjekte edilen sivrisineklerin hayatta kalmasında kayda değer bir değişiklik olmamıştır. Serin proteaz inhibitörü, SRPN2, pozitif kontrol olarak kullanıldı ve çift sarmallı LacZ, çift sarmallı RNA enjeksiyonları için negatif kontrol olarak kullanıldı. Ortaya çıktıktan üç gün sonra, çift sarmallı SRPN2 enjekte edilen yetişkinlerdeki psödotümörler ışık mikroskobu ile belirgindi.

Sekiz gün sonra, psödotümörler çok belirgindi. Erişkin evre sivrisineklerde, çift sarmallı SRPN2 enjekte edilen hayvanların çoğunun kütikülünden melanotik psödotümörler gözlenebilirken, kontrollerde psödotümör gözlenmedi. Enjeksiyondan beş gün sonra, SRPN2 protein seviyeleri, çift sarmallı SRPN2 enjekte edilen sivrisineklerde, çift sarmallı LacZ enjekte edilen kontrollere ve enjekte edilmeyen kontrollere kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü.

Bu videoyu izledikten sonra, bu yeni geliştirilen enjeksiyon protokolünü kullanarak Anopheles gambiae pupalarına RNA girişim tetikleyicisi dağıtımının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, pupanın öngörülemeyen hareketi nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bununla birlikte, pupa'nın doğru konumlandırılması ve stabilizasyonunun uygulanması, başarılı enjeksiyon oranını ve enjeksiyon kalitesini büyük ölçüde artırır.

Tekniğe hakim olduktan sonra, bu enjeksiyonlar pupa başına yaklaşık 30 saniye gerektirir. Bu tekniğin geliştirilmesiyle, vektör biyolojisi alanındaki araştırmacıların, sıtma vektörü Anopheles gambiae'deki yetişkin öncesi ve erken yetişkin gelişim aşamalarında gen fonksiyonunu keşfetmelerinin ve değerlendirmelerinin yolunu açtık. Bu prosedürü takiben, sırasıyla protein veya transkript ekspresyonu düzeyinde hedef gen yıkımının derecesini belirlemek için Western blot analizi veya kantitatif PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Sonuç olarak, bu teknik, sivrisinekler tarafından parazit iletimi için kritik olan genlerin belirlenmesine yardımcı olabilir ve bu yaklaşım, yeni hedefler belirlememize ve daha etkili vektör kontrol stratejileri oluşturabileceğimiz konusunda yeni bilgiler sağlamamıza yardımcı olacaktır.