Name: Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Öğrenin, akciğer metastazlarındaki tümör hücre-stroma etkileşimlerini canlı görüntülemek için dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak fare modellerinde uygulanan bu hızlı yöntemi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Teknik yardımı için Nguyen H. Nguyen'e ve Zeiss Cell Observer spinning-disk konfokal mikroskobu ile ilgili desteği için Audrey O'Neill'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Savunma Bakanlığı doktora sonrası bursu (W81XWH-11-01-0139) ve Weizmann Bilim Enstitüsü-Bilimde Kadınları İlerletmek için Ulusal Doktora Sonrası Ödül Programı (VP'ye) tarafından desteklenmiştir.

açıklanan tüm işlemler yerel Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından önceden onayı dahil olmak üzere, omurgalı hayvanların kullanımı için kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmalıdır. Ex Akciğer Metastazlarının 1. Nesil Canlı Görüntüleme vivo (transgenik veya Kuyruk Ven Enjeksiyon) Not: Akciğer metastazı genetik olarak fare modelleri kullanılarak veya kanser hücrelerinin intravenöz (IV) enjeksiyonu vasıtasıyla üretilebilir. <ol><li> Örneğin, bir transgenik raportör fare içine genetik olarak tümörlü fare modeli geçerek görüntüleme için akciğer metastazı oluşturmak, ACTB-ECFP olarak meme kanseri fare modeli, fare meme tümör virüsü uzun terminal tekrarı-polioma orta T antijenini (MMTV PyMT) 11 arası fare modeli 12. NOT: ACTB-ECFP modeli β-Yasası altında mavi floresan protein (ECFP) geliştirilmiş ifade ederpromoteri tüm hücreler mavi CFP kanal floresan şekilde. Bununla birlikte, kanser hücreleri tarafından bugüne kadar en önemli ve mikroskop altında ECFP-pozitif hücrelerin bir yığın olarak görünür. MMTV PyMT fare modeli meme tümör büyümesi, özellikle akciğerlere, çevresine kanser hücrelerinin yayılması ile ilişkili olduğu ilerleyici hastalık, geliştirir. FVB / n arka plan üzerinde MMTV PyMT farelerde, mikrometastazlar yaşı 10-11 hafta civarında görülebilir. Genellikle 13 yaş civarında 14 hafta makrometastazı bu ilerleme. VEYA </li><li> birincil hücreler veya singeneik hücre hatları kullanılarak deneysel metastaz oluşturur. Iv enjeksiyonu 14 ve ardından nitro manipüle primer tümör hücreleri veya hücre çizgileri (örn., Transdüksiyon) kullanım. <ol><li> Kısaca, bu protokolde, flüoresan raportör farelerde (ACTB-ECFP) ya da vahşi tipli farelere yeşil floresan protein (GFP) -expressing (+) MMTV PyMT hücre hattı enjekte edilir. Daha sonra,yeşil, GFP kanalı kullanılarak VO-PyMT hücreleri 15 olarak anılacaktır bu hücreleri görselleştirmek. NOT: Orijinal VO-PyMT hücre hattı Nashville, TN Vanderbilt Ortopedi de elde edilmiştir. VO Vanderbilt Ortopedi duruyor. </li><li> , Enjeksiyondan sonra birkaç saat hemen ve yukarı kanser hücresi ekstravazasyonu gözlemlemek (200 ul) 10 6 hücre enjeksiyonu takiben; enjeksiyondan sonra 1-3 hafta arasında mikrometastazlar gözlemlemek ve enjeksiyon 15 sonra makrometastazı 3 hafta algılar. Not: daha az hücre metastatik büyümeye enjeksiyondan süresini uzatmak için enjekte edilebilir. </li></ol></li></ol> Metastatik mikroçevrede İlgi Bileşenlerinin 2. Etiketleme (Transgenik ve / veya Enjeksiyon) Not: Etiketleme Transgenik farelerin ve / veya çeşitli enjekte ile elde edilebilir. Çeşitli hücre tiplerinin etiketlenmesi için farklı floresan renkler kullanmak emin olun. <ol><li> transgenik fareler kullanılarak metastatik mikroçevresinin etiket bileşenleri. Daha önce de belirtildiği fare tümör modeli çapraz ilgi stromal hücreler ECFP olmayan bir floresan protein, örneğin., C-fms EGFP etiketli olduğu bir transjenik fare modeli (örneğin., MMTV PyMT ACTB-ECFP x) 4,16. Not: CFP kanal kanser hücrelerinin görselleştirme ek olarak, bu GFP kanalı 4 miyeloid hücrelerin görselleştirme sağlar. VE / VEYA </li><li> Transgenik floresan muhabiri fareler ya da (floresan olmayan) wild tip farelere enjekte edilebilir kullanarak metastatik mikroçevresinin çeşitli bileşenleri etiketleyin. Not: Çeşitli bileşikler, metastatik mikro, örneğin, bir AF647-konjuge Gr-1 antikoru nötrofil etiketlemek için kullanılan ve bazı monositler 13 ve farklı moleküler ağırlık dekstranlar kullanılır çeşitli bileşenleri etiketlemek için enjekte edilebilirAkciğer kılcal etiketlemek için. Bu enjektabl hazırlanması için adım 4&#39;e bakın. </li></ol> Diseksiyon önce Malzemelerin 3. Hazırlanması <ol><li> % 2 agaroz <ol><li> Agaroz 0.2 g tartılır ve 10 mi 1 x PBS ilave edin. agaroz çözmek için çözüm ısıtın. Agaroz oda sıcaklığında katılaşmaya, yani enflasyonu için kullanılana kadar bir 37 ° C su banyosu içinde muhafaza edecektir. </li></ol></li><li> CO2 ve sıcaklık kontrol <ol><li> Nemlendirme odasında GKD 2 O edin. gerektiğinde doldurun. Sıcaklık sahne plaka tutucu (iklim odası) içine yapılandırma plakasını yerleştirin. CO 2 kontrolör açın ve% 5 CO 2 olarak ayarlayın. hava akış oranı 0.4 Nl / dak ayarlanmış olduğundan emin olun. </li><li> Hava ve CO 2 vanalarını açın. Sıcaklık kontrolörü açın. klima kabini sıcaklığı ve kapak 37 ° C&#39;ye ayarlanmış olduğundan emin olun. </li><li> CO 2 metrelik hava basıncını serbest bırakın. CO 2 artan edin, equilibration 30 dakika kadar sürebilir. </li></ol></li><li> İplik Disk konfokal mikroskop Not: Mikroskop kurulumu ayrıntıları daha önce 4,17 tarif edilmiştir. <ol><li> lazerler (488 nm uyarma ve solid-state 405 nm, 561 nm ve 640 nm lazerler için argon laser) açın. mikroskop, kamera, dönen disk kontrol ünitesi, AOTF, lazer kontrol ünitesi ve kamera kontrolörü açın. </li><li> , Mikroskop deklanşör açın mikroskop çalıştıran bilgisayarı açın ve yazılımı açın. </li></ol></li><li> araçları ve diseksiyon platformunun hazırlanması. <ol><li> Sıcak boncuk sterilizatör açın ve 250 ° C ulaşmasını sağlar. su ve sabun ile cerrahi makas ve forseps temiz 2 çift. en az 30 saniye boyunca araçları sterilize edin. araçlar soğumasını bekleyin. diseksiyon platformu olarak bir polistiren kapağı kullanın. laboratuar nemlendiriciye bir parça ile örtün. </li></ol></li></ol> Enjeksiyonlar 4. hazırlanması Not: yarı ömrü ve tercih edilen cevaba bağlı olarak, enjekte floresan etiketli antikorlar ve / veya floresan moleküller, ya hayvan kurban veya daha önce gün sonrası arasında, bir çift hemen önce. <ol><li> Görüntü Gr1 pozitif nötrofiller ve monositler için, başlık altında steril PBS 100 ul içinde hazır AF647-konjuge Gr-1 antikoru 7 ul (1 mg / ml) olan bir şırınga hazırlar. şırınga 27 G ½ iğne yerleştirin. </li><li> Görüntü akciğer kılcallarına için, 100 ya da 70 kD rodamin kaplı dekstran (4 mg / mL) ul ya da 10 kD AF647-konjüge dekstran (4 mg / ml) ile, bir ikinci ve üçüncü şırınga hazırlar. şırınga üzerinde 27 G ½ iğne yerleştirin. </li><li> Önceki akciğerlerin eksizyona AF647-konjuge antikor çözüm iv 5 saat enjekte edilir. </li><li> iv hemen önce akciğerlerin eksizyona biri veya her ikisi dekstran çözümler enjekte edilir. </li></ol> Ex Akciğerler 5. hazırlanması Canlı Görüntüleme vivo NOT: akciğerler içinde bağışıklık hücrelerinin gereksiz sorunları önlemek için mümkün olduğunca steril ve dikkatli çalışmak için deneyin. <ol><li> IACUC onaylı protokol, hayvan, örn. Izin bir anestetik öldürücü bir dozu ile, fare karın içinden (ip) enjekte,% 2.5 Avertin 1 mi. nefes durdurmak ve ağrılı uyarılara (arka pençe tutam) tamamen sigara duyarlı olmaya fare için bekleyin. Not: servikal dislokasyon ve karbondioksit ötanazi zarar verici akciğer hücre canlılığı etkileyebilir kaçınılmalıdır. </li><li> Bir diseksiyon gemide fare hareketsiz ve% 70 etanol ile fare sterilize edin. </li><li> İlk periton aracılığıyla benzer bir kesi ardından deri yoluyla enine epigastrik kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. , Dikey konumda diseksiyon kurulu tutun ve inen aorta kesip değil göğüs boşluğunda karın kan havuzları aşağı böylece. </li><li> Svakumu boşaltmak için diyafram küçük bir açıklık nip. diyaframı tüketim ve akciğerlere görsel erişmek için 10 ve 12. kaburga boyunca kesilir. </li><li> göğüs kafesi üzerinden trakea cilt kesilmiş ama sağlam göğüs kafesi terk cerrahi makas kullanın. göğüs kafesi cilt ayırmak. Trakea kendisi (Şekil 1A) zarar vermemek için dikkatli olmak, çevredeki bağ dokusu kaldırarak trakea Açığa. </li><li> Küçük bir açıklık mümkündür (Şekil 1B) halinde gırtlak yakın olarak kıkırdak halkalarının maruz trakea paralel çapı yaklaşık 1 mm, Kırpılmış. trakea yoluyla tamamen kesmek için dikkatli olun. </li><li> 20 G iğne alın ve yavaşça herhangi bir karşı kuvvet (Şekil 1D) olmadan trakea içine iğne 4-5 mm yerleştirin. Iğne ucu trakea (Şekil 1C) ile görünür olmalıdır. trakea iğne stabilize etmek forseps kullanabilir. Alternatif olarak, bir dikiş aro bağlı olabiliriğneyi yerinde tutmak için trakea und. NOT: Çok derin ekleyerek, karina travma olabilir ya da akciğerlerin sadece bir tarafı şişirilmiş olabilir. </li><li> (Sabit sıcaklık banyosuna doğrudan alınan) 37 ° C&#39;de% 2 düşük erime sıcaklıklı agaroz 400 ul olan bir şırınga doldurun. diseksiyon tahtası ayakta emin olun ve yavaş yavaş akciğerlere iğneden sıcak agaroz aşılamak, akciğerleri şişirmek için ~ 400 ul kullanın. NOT: göğüs kafesi içinde şişirme akciğerleri izleyin. Yarılmasına gibi akciğer aşırı şişirmek etmeyin. </li><li> Akciğerler şişirilmiş sonra, şırınga ayırmak ve sızıntı herhangi bir agaroz önlemek için trakea içine iğne tutmak, göğüs kafesinin ~ ⅔ dolum. </li><li> ayarlamak ve katılaşmaya akciğer içindeki agaroz izin vermek için şişirilmiş akciğer boyunca 20 ° C PBS yaklaşık 50 ml dökün. Yavaş yavaş önlemek için forseps ile trakea iğneyi çıkarın ve kapatın olmayan katılaşmış agaroz sızmasını. &lt;/ Li&gt; <li> Bir sternotomi gerçekleştirerek akciğerleri ortaya çıkarmak ve daha sonra akciğerleri tüketim. Tamamen trakea yoluyla kesim sırasında akciğerlerin eksizyonu için trakea üzerinde tutmak. Yavaşça akciğerler fare (Şekil 1E) ayrılana kadar göğüs boşluğunun dışında akciğerleri çekerken bağ dokusu ve yemek borusu kesip, trakea yukarı çekin. </li><li> Aşırı kan yıkayın sıcak RPMI-1640 akciğerleri daldırın ve yavaşça hilus (Şekil 1F) de loblar ana kök bronşları kesmek için makas ve forseps kullanarak lobları ayırın. </li><li> 24 oyuklu görüntüleme plaka (Şekil 1G) içindeki bir oyuk olarak, görüntüleme yüzeyinin en üst düzeye çıkarmak için aşağı düz yüzey ile, loblar yerleştirin. lob üstünde 37 ° C RPMI-1640 içinde 100 ul ekle. Kayan engellemek için lob üstüne birkaç 15 mm dairesel mikroskop kapak slaytlar yerleştirin. </li><li> EVAP gelen RPMI-1640 medya önlemek için çevredeki kuyulara ılık PBS dökünparfüm içeren. Dengelenmiş klima kabini içine 24 oyuklu plaka ekleme ve hava ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de, akciğer lobları korumak. konfokal mikroskop sahnede iklim odasına yerleştirin. Not: diğer gaz karışımları (örneğin, N2 içinde% 5 O2,% 5 CO2 hipoksi / düşük oksijen koşullarında hücre davranışını incelemek üzere) da düşünülebilir. </li></ol><img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53741/53741fig1.jpg" /> Canlı görüntüleme için akciğerlerin hazırlanması için Şekil 1. Protokol. Fare hazırlandıktan sonra trakea (A) Poz. Kıkırdak halkalar maruz trakea paralel olarak yapılan (B) Küçük kelepir. (C) 20 G iğne trakea içine 4-5 mm takılı. (D) agaroz akciğerlere 400 ul% 2 düşük erime sıcaklığı instilasyon. (E) enflamasyonATED akciğerler fare ayrılır. (F) lobları enflasyon sonra ayrılmış. (G) 24-iyi görüntüleme plaka iyi yerleştirilmiş lobları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53741/53741fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 6. Toplama ve Görüntüler Analizi NOT: Görüntüler çeşitli yazılım programları tarafından desteklenen bir disk konfokal mikroskoplar iplik çeşitli elde edilebilir. Imaris film düzenleme ve analizi için kullanılır ise, bu protokolde, piyasada bulunan dönen disk konfokal mikroskop ile bir ısmarlama dönen bir disk konfokal mikroskop ya da Zen ile ya μManager, görüntü elde etmek için kullanılır. <ol><li> μManager kullanarak görüntüleri elde edin. ΜManager yazılımını kullanarak görüntüleri edinimi için adım protokolü tarafından ayrıntılı bir adım daha önce 18 tarif edilmiştir. VEYA </li><li> görüntüler eldeBöyle Zen olarak kullanarak görüntü analiz yazılımı (Şekil S1 bakınız). <ol><li> &#39;Bulun&#39; sekmesine tıklayın ve &#39;Işık Yolu&#39; aracı (Şekil S1A, kırmızı kutu) (10x veya 20x) objektif seçin. Mercek (Şekil S1A, mavi kutu) üzerinden CFP kanalına bakmak için - &#39;DAPI Gözler&#39; Daha sonra, üzerine tıklayın. El ile mikroskop kullanılarak örnek yerelleştirilmesine. dokuda Off&#39;after tüm görüş alanının merkezi &#39;seçeneğini tıklayın. </li><li> görüntü elde etmek için tüm parametrelerini ayarlamak için &#39;Acquisition&#39; sekmesine tıklayın. </li><li> &#39;Kanallar&#39; aracında, &#39;+&#39; tuşuna (Şekil S1B, kırmızı kutu) tıklayın. Bir pop-up menüsü görünür ve &#39;Boya Veritabanı&#39; (Şekil S1 B) &#39;de numunede mevcut boya (ler) arayın. boya seçin ve &#39;Ekle&#39; düğmesine tıklayın. NOT: Program tüm filtreleri optimize edilmesi koyacaktır. Bir boya silinebilirseçerek o çöp tenekesi tuşuna (Şekil S1B, sarı kutu) tıklayarak izledi. </li><li> &#39;Edinim Modu&#39; menüsünde, 5x5 &#39;diyotları&#39; olarak ayarlayın. seçmek için kanal menüsünde ECFP üzerine çift tıklayın. Örnek görüntü elde etmek için parametreleri kurarken ağartılmış olmayacak şekilde% 20 lazer gücünü azaltın. </li><li> &#39;Deney Yöneticisi&#39; bölümünde &#39;Karo Seramik&#39;in kutusunu işaretleyin ve fayans aracı&#39; Çok Boyutlu Toplama &#39;aracını grubunda (Şekil S1C) görünür. kameradan canlı görüntüyü görüntülemek için &#39;Gelişmiş Kurulum&#39; düğmesine tıklayın. deney 4 ila 6 pozisyon eklemek için &#39;Positions&#39; bölümünde &#39;Ekle&#39; butonuna tıklayın. Bir konumu silmek için, o konumu seçin ve çöp kutusu düğmesine tıklayın. </li><li> &#39;Edinim Parametre&#39; aracını grubunda &#39;Absolut&#39; Odak Stratejisi &#39;aracını açın ve Seçeneke açılan listeden Z-pozisyon &#39;düzeltildi. </li><li> &#39;Deney Yöneticisi&#39; bölümünde ve Z-Stack aracında Z-Yığın kutusunu işaretleyin &#39;Çok Boyutlu Acquisition&#39; aracı grubunun (Şekil S1D) görünür. Pozisyonları &#39;bölümünde ve basın&#39; Canlı &#39;pozisyonların birinde çift tıklayın. El ile ilk set ve görüntüleme alanının son konumunu ayarlamak. 4 mikron aralıklarla ayarlayın. NOT: Program seçilen aralık ve aralık için dilim sayısını belirleyecektir. İdeal olarak, 5-7 dilim yeterli görselleştirme ve hızlı görüntü alımı sağlamak için uygundur. </li><li> &#39;Deney Yöneticisi&#39; bölümünde &#39;Zaman Serisi&#39; kutusunu işaretleyin. Set istenen &#39;Süre&#39; ve &#39;Çok Boyutlu Toplama&#39; aracını grubunda (Şekil S1E) ortaya &#39;Zaman Serisi&#39; aracında &#39;Interval&#39;ın&#39; kez. </li><li> &#39;Zinin içindeyon Modu 2x2 için &#39;diyotları&#39; menüsünden, set &#39;. kanallar menüsünde bir fluorofor çift tıklatın seçin ve% 100 lazer gücünü artırmak için. Basın &#39;Canlı&#39; ve &#39;Pozlama Saati&#39; ayarlayın. Her fluorofor için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> &#39;Enable Auto Kaydet&#39; kutusunu işaretleyin. dosyanın adını bir klasör ve türünü seçin. Tüm edinilen görüntüler otomatik olarak bu klasöre kaydedilecektir. </li><li> görüntü alımı başlatmak için &#39;Deney Yöneticisi&#39; bölümünde &#39;Başlat Deney&#39; üzerine tıklayın. </li></ol></li><li> Görüntü alındıktan sonra, Imaris yazılımında ham verileri derlemek. Dosyaları .ims görüntüleri dönüştürmek ve ayarlamalar yapılabilir. Dosyaların dönüştürülmesi, ayarlamalar yapmak ve Imaris kullanarak tasarruf filmler için adım protokolü tarafından ayrıntılı bir adım daha önce 18 tarif edilmiştir. </li><li> Filmi kaydederken, ikinci (fps) başına 5 kare &#39;Frame Rate&#39; set. </li></ol>

<ol><li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).</li>
<li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+niche%3A+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).</li>
<li>Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).</li>
<li>Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
<li>Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cur+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the lung.</a> Cur Protoc Cytom. , (2012).</li>
<li>Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+separated+antigen+uptake+by+alveolar+dendritic+cells+and+airway+presentation+to+T+cells+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung.</a> J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).</li>
<li>Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).</li>
<li>Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatiotemporal+cellular+dynamics+of+lung+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity.</a> Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li>
<li>Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+and+mice+expressing+different+GFP+variants+for+multiple+non-invasive+reporter+usage+within+a+single+animal%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal.</a> BMC Biotechnol. 2, (2002).</li>
<li>Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+breast+cancer+reprograms+early+myeloid+differentiation+in+the+bone+marrow+to+generate+immunosuppressive+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenteral+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Parenteral injections.</a> Curr Protoc Immunol. , (2006).</li>
<li>Halpern, J., Lynch, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+a+murine+bone+bioreactor+as+a+model+of+tumor%3A+bone+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastas%22%5BJournal%5D)">The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction.</a> Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).</li>
<li>Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).</li>
<li>Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+myeloid+cells+dynamics+in+ApcMin%2F%2B+intestinal+tumors+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer cell. 21 (4), (2012).</li>
<li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+transplantation+of+stromal+cells+and+carcinoma+cells+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells%3A+a+new+model+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).</li>
<li>Wong, C. W., Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+location+of+breast+cancer+cells+after+spontaneous+metastasis+to+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung.</a> Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).</li>
<li>Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ex+vivo+lung+perfusion+as+a+platform+for+transplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research.</a> World J Exp Med. 4 (2), (2014).</li>
<li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).</li>
<li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28 (2), (2000).</li>
<li>Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+suppressor+cells+and+immune+modulation+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer.</a> Immunotherapy. 4 (3), (2012).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).</li>
<li>Kreisel, D., Nava, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur. Tüm hayvan deneyleri, IACUC onaylı protokoller UCSF'ye uygun olarak gerçekleştirildi.

Bu yazıda metastaz taşıyan fare modellerinde akciğer metastazı ex vivo canlı görüntüleme için ayrıntılı bir yöntemi tarif etmektedir. Bu görüntüleme protokol akciğer mikroçevresinin içinde dinamik ve mekansal tümör hücre-stroma etkileşimleri doğrudan görselleştirme sağlar. En az 4 saat akciğer metastazı güvenilir bir görüntüleme sağlayan bir kolay ve hızlı bir yöntemdir. Bu deneylerden elde edilen filmler, hücre motilitesi ve hücresel etkileşimler gibi dinamik işlemleri izlemek için de kullanılabilir. <p cl...

Kanserin en ölümcül yönü, kansere bağlı morbidite ve mortalitenin %90'ından fazlasını oluşturan metastazdır1. Metastaz çok aşamalı bir süreçtir ve karmaşıklığı nedeniyle, metastatik yayılma ve büyümeyi yöneten kesin hücresel ve moleküler mekanizmalar hala belirsizdir. Metastaz yapmak için, primer tümördeki tümör hücrelerinin komşu hücrelerinden ve bazal membrandan ayrılması, hücre dışı matriksten geçmesi, intravazat, kan veya lenfatik damarlar yoluyla seyahat etmesi, ikincil bölgede ekstravaze olması ve son olarak hayatta kalması ve ikincil tümörler oluşturması gerekir. Tümör hücrelerinin özelliklerine ek olarak, kanser hücrelerinin normal muadilleri ile birlikte bitişik stroma'yı içeren mikroçevrenin katkısı, metastatik lezyonların tohumlanması ve kurulması için çok önemlidir2.
Metastatik tohumlama ve büyümeyi incelemek için geleneksel yöntemler, dokular eksize edilir ve histoloji için kesilirken statik durumları inceler. Bu veriler, bu son derece dinamik sürecin yalnızca bir anlık görüntüsünü oluşturur. Bu çalışmalardan bazı yararlı bilgiler elde edilebilse de, tümör ve stromal hücrelerin metastatik oluşum sırasında etkileşime girdiği karmaşık süreç bu yöntemlerle yeterince değerlendirilemez. Ayrıca, uzak bölgede bir koloni kurmada önemli olan tümör veya stromal hücre göç paternleri hakkında bilgi edinmek mümkün değildir. Metastatik süreci etkili bir şekilde incelemek için, kanser hücreleri ve mikro çevreleri arasındaki çeşitli etkileşimleri sürekli ve gerçek zamanlı olarak görselleştirmek önemlidir. 
Akciğer, meme, kolorektal, pankreas kanseri, melanom ve sarkom gibi solid tümörlerden kaynaklanan metastazların yaygın bir bölgesidir3. İntravital görüntüleme daha önce çeşitli primer tümör ve metastatik modellerde hücre-hücre etkileşimini incelemek için kullanılıyordu4,5. İntravital görüntüleme, akciğer kesiti görüntüleme ve ex vivo pulmoner metastaz testi dahil olmak üzere farelerde akciğer görüntüleme yöntemleriyayınlanmıştır 6-9. Fare akciğerlerinin intravital görüntülemesi, akciğerleri stabilize etmek için torasik bir emme penceresi kullanır6. Bu yöntem, akciğer mikrosirkülasyonu ve alveolar boşlukların hızlandırılmış görüntülenmesi için kullanılır. Akciğerlerin anatomik yerleşimi, intravital görüntüleme için bir zorluk teşkil eder. Akciğerlere erişmek için göğüs boşluğunun açılması gerekir, bu da negatif basınç kaybına ve akciğerlerin çökmesine neden olur. Bu yöntem sadece akciğerlerin küçük bir kısmının görüntülenmesine izin verir ve teknik olarak zorludur; Kan akışından bağımsız süreçleri inceleyen çalışmalarda gereksiz bir komplikasyon. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda solunumdan kaynaklanan kapılama hareketini de gerektirir. Bu, ya nefesler arasında görüntü toplanarak ya da görüntü elde etme sonrası analizlersırasında yapılır 10. Alternatif ex vivo akciğer kesiti görüntülemesi stabilite ve derinlik sağlar ve ayrıca akciğer parankimini immün boyama için hazırlar7. Bununla birlikte, uzun kesit alma süreci, hayvan kurban etme zamanı ile görüntüleme seansının başlangıcı arasında büyük bir gecikmeye yol açar. Ayrıca, bir fare akciğerinin kesitlere ayrılması işlemi önemli miktarda hücre ölümüne8 neden olur, böylece görüntüleme örneklerinin kalitesine ve miktarına müdahale eder ve belki de tümör-stroma etkileşimlerini gereksiz yere değiştirir. İntravital görüntüleme ve akciğer kesiti görüntüleme yöntemleri arasında teknik olarak köprü kurmak ve iki tekniğin avantajlarından yararlanmak için, ex vivo akciğer görüntüleme için nispeten hızlı ve kolay bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, kesitsiz tüm akciğer loblarının görüntülenmesi ile elde edildi. Bu yöntemi kullanarak, kanser hücrelerinin hareketliliği ve kanser hücreleri ile mikro çevrelerindeki stromal hücreler arasındaki etkileşimler birkaç saat boyunca gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>MMTV-PyMT/FVB fareleri</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>2374</td><td>Dişi fareler</td></tr><tr><td>ACTB-ECFP/FVB</td><td>fareleri UCSF Werb laboratuvarı</td><td></td><td>Dişi fareler</td></tr><tr><td>c-fms-EGFP/FVB fareleri</td><td>UCSF Werb laboratuvarı</td><td></td><td>Dişi fareler</td></tr><tr><td>FVB fareleri</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>1800</td><td>Dişi fareler</td></tr><tr><td>GFP+ VO-PyMT hücreleri</td><td>UCSF Werb laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70.000 kDa Dekstran, rodamin konjuge</td><td>İnvitrojen</td><td>D1818</td><td>1 x PBS'de&nbsp; 4mg / ml'ye seyreltin ve -20&nbsp;&°C'de saklayın. Hayvan başına 0.4 mg kullanın.&nbsp;</td></tr><tr><td>10.000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>D22914</td><td>1 x PBS'de &nbsp; 4mg / ml'ye seyreltin ve -20&nbsp;&°C'de saklayın. Hayvan başına 0.4 mg kullanın.&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-fare Gr-1 antikoru Alexa Fluor 647</td><td>UCSF Monoklonal antikor çekirdeği</td><td></td><td>Stok 1mg / ml. Hayvan başına 7 ug kullanın.</td></tr><tr>IACUC tarafından onaylanan <td>Anestezik</td><td></td><td></td><td>Anestezi, anestezi ve / veya ötenazi için kullanılır</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>UCSF hücre kültürü tesisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, USP steril ve nbsp;</td><td>Amresco INC</td><td>K813-500ML</td><td>IV enjeksiyon için ultra saf sınıf</td></tr><tr><td>Strafor platformu</td><td></td><td></td><td>Diseksiyon tahtası olarak kullanılacak</td></tr><tr><td>İnce makas keskin&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak boncuk sterilizatörü</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>18000-45</td><td>Kullanmadan 30 dakika önce AÇIN</td></tr><tr><td>Hava</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oksijen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbondioksit</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İğnesiz 1 mL şırınga&nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 iğne&nbsp; &nbsp;</td><td>BD</td><td>305109</td><td>i.v. enjeksiyon için</td></tr><tr><td>20 G x 1 iğne, kısa eğim&nbsp; &nbsp;</td><td>BD</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime sıcaklığında agaroz&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50111</td><td>10 ml çözelti yapmak için, 0.2 g agarozu tartın, 10 ml 1 x PBS'ye ekleyin ve çözünmesi için ısıtın. Agaroz oda sıcaklığında katılaşacaktır, bu nedenle 37 ° C'de tutun; Şişirme için kullanılana kadar C su banyosu.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 fenol kırmızısı içermeyen ortam</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu Görüntüleme plakası&nbsp;</td><td>E& K scientific</td><td>EK-42892</td><td></td></tr><tr><td>Cam kapaklı kızaklar, 15 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-031-144</td><td></td></tr><tr><td>Dijital CO2 ve sıcaklık kontrolörü</td><td>Okolab</td><td>DGTCO2BX</td><td>http://www.oko-lab.com</td></tr><tr><td>İklim odası</td><td>Okolab</td><td></td><td>http://www.oko-lab.com</td></tr><tr><td>Cell Observer eğirme diski konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen yazılımı</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>ICCD kamera</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Dönen disk konfokal tarama kafası</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mManager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Açık kaynaklı yazılım</td></tr></tbody></table>

ex akciğer metastaz ve bunların mikroçevresinin canlı görüntüleme vivo

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastaz kanserle ilgili morbidite ve mortalite açısından önemli bir nedenidir. Metastaz çok aşamalı bir süreçtir ve karmaşıklığı nedeniyle, metastatik yayılması ve büyümesi yöneten tam hücresel ve moleküler süreçler hala sürüncemede bulunmaktadır. Canlı görüntüleme hücreleri ve bunların mikro dinamik ve mekansal etkileşimlerin görselleştirme sağlar. Solid tümörler genellikle akciğerlere metastaz. Ancak, akciğerlerde anatomik konumu intravital görüntüleme bir sorun teşkil etmektedir. Bu protokol, tümör hücreleri ve akciğer metastazı içindeki çevreleyen stroma arasındaki dinamik etkileşimin ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit ve hızlı bir yöntemdir. Bu yöntemi kullanarak, kendi mikro-kanser hücrelerinin stromal hücreleri arasında kanser hücrelerinin hareketliliği ve etkileşimler birkaç saat gerçek zamanlı olarak görülebilir. Transgenik flüoresan raportör fareler kullanılarak, bir flüoresan hücre çizgisi, enjekte edilebilir floresan etiketlimoleküller ve / veya antikorlar, akciğer mikro birden fazla bileşenler, kan damarları ve bağışıklık hücreleri gibi, görselleştirilebilir. farklı hücre tipleri görüntü için, hızlı, dört renkli görüntü elde uzun vadeli, sürekli görüntüleme sağlar dönen bir disk konfokal mikroskop kullanılmıştır. Birden fazla pozisyonları ve odak düzlemleri boyunca toplanan görüntülerden derlenen Time-lapse film en az 4 saat süreyle canlı metastatik ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri göstermektedir. Bu teknik, ayrıca, kemoterapi veya hedeflenen tedavi test etmek için de kullanılabilir. Dahası, bu yöntem, akciğer mikro-etkileyebilecek diğer akciğer ile ilgili patolojilerin çalışma için uyarlanabilir.

eğirme disk konfokal mikroskopi, çeşitli fare modeli sistemleri ve enjektabl kullanarak, metastatik mikroçevresinin görüntülendi ve zamanla izlenebilir. Bir MMTV PyMT kullanımı; ACTB-ECFP; c-FMS-EGFP üçlü transgenik fare modeli, farklı hücresel bileşenleri floresan (Şekil 2A, Film 1) etiketlenir. Akciğer parankimi tipik yapısı, tüm hücrelerin β-aktin organizatörü altında ECFP ifade beri CFP kanal görülebilir. Bu organize akciğer yapısı içindeki hücrelerin bir toplu olarak görün...

Farelerde floresan haberci kullanılarak, akciğer metastazı olan tümör hücre stromanın etkileşimleri ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit bir yöntem tarif eder. iplik disk konfokal mikroskopi kullanılarak, bu teknik, en az 4 saat boyunca canlı hücre görüntülenmesini sağlayarak ve diğer enflamatuar akciğer koşulları incelemek için adapte edilebilir.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Bu prosedürün genel amacı, akciğer metastazları içindeki dinamik tümör hücresi stroma etkileşimlerini görselleştirmektir. Bu yöntem, kanser metastazı alanında, metastaz nasıl kurulur ve mikro çevredeki hangi hücre tipleri bu sürece dahil olur? Bu tekniğin sunduğu temel avantaj, canlı hücrelerin en az dört saat boyunca görselleştirilmesini sağlayan ex vivo akciğer görüntüleme için hızlı ve kolay bir yöntem olmasıdır. Bu teknik, akciğer metastazı tedavisi için çeşitli hedefe yönelik terapötiklerin etki mekanizmalarını anlamamızı daha da geliştirmiş olabilir. Bu yöntem için ilk olarak akciğer kesiti görüntüleme ile metastazı incelerken ve bu işlem sonucunda geniş hücre ölümü ile mücadele ederken aklımıza bir fikir geldi. Akciğerleri ex vivo canlı görüntülemeye hazırlamak için, fareyi bir parça sağanak ile kaplı polistiren köpük bir kapak üzerinde hareketsiz hale getirerek başlayın ve hayvanı %70 etanol ile sterilize edin. Daha sonra, cerrahi makas kullanarak deriden enine epigastrik bir kesi yapın, ardından peritondan benzer bir kesi yapın. Daha sonra, diseksiyon tahtasını dikey bir pozisyona getirin, inen aortu kesin, böylece kan göğüs boşluğuna değil karın içine toplanır. Vakumu ser

ex-vivo-live-imaging-of-lung-metastasis-and-their-microenvironment

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu çalışmada bildirilen yeni protokol kombine farelerde tek hücreli çözünürlükte metastaz seçici algılama...

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem...

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

Sıçanlarda plevral yüzeyin akciğer kanseri metastazlarında mikrodolaşım kan akış hızını otomatik bir şekilde, kapalı göğüs pulmoner intravital mikroskopi kullanarak ölçmek için bir yöntem sunulmuştur. Bu model, kemirgenlerde pulmoner metastazlar üzerinde fizyolojik araştırmalar yapmak için yaygın bir araç olarak kullanılma potansiyeline sahiptir.

Sıçan Pulmoner METASTAZLARINDA Mikrosirkülasyonda Kan Akışı Hızının Otomatik Ölçüm

Bu protokol fare akciğer dokusu içindeki metastazı temsil tümör hücre spesifik mRNA tespit etmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT-PCR) nasıl kullanılacağı açıklanır.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerin gerçek zamanlı olarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobunun kullanımını açıklar.

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Bu iletişim kuralı insan akciğer tümörü dilimleri içinde fluorescently eşleşmiş antikorlar ile etiketli görüntü ikamet tümör infiltre CD8 T hücreleri bir yöntem açıklanır. Bu teknik CD8 T hücre göç confocal mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı analiz izin verir.

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Burada, akciğerin yüksek çözünürlüklü, intravital görüntülemesini sağlayan murine toraks için kalıcı olarak indwelling optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz. Pencerenin kalıcılığı, akciğerdeki dinamik hücresel süreçlerin, özellikle de yayılan tümör hücrelerinin metastatik ilerlemesi gibi yavaş gelişen süreçlerin incelenmesine çok uygun hale getirir.

Akciğere Kanser Metastazını Araştırmak İçin Kalıcı Bir Pencere

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Öğrenin, akciğer metastazlarındaki tümör hücre-stroma etkileşimlerini canlı görüntülemek için dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak fare modellerinde uygulanan bu hızlı yöntemi.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Daha fazla video keşfet