Name: Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Keşfedin SNARE aracılıklı ekzositozun netrin bağımlı akson dallanmasındaki rolünü. Canlı hücre görüntüleme ve biyokimyasal analizlerle nöronal gelişimde plazma membran teslimat mekanizmalarını öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RO1-GM108970 (SLG) ve F31-NS087837 (CW): Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Araştırma etiği Beyanı: Burada detaylı hayvanları da içeren tüm deneylerde kural ve Hayvan Bakım UNC Komitesi tarafından yapılan düzenlemelere ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için NIH standartlarına tabidir. 1. Hazırlık ve Dissosiye Kortikal nöronlar Kaplama <ol><li> CO servikal dislokasyon tarafından takip 2 inhalasyon zamanlı hamile kadın öldürülür. Her yarımkürede embriyonik gün 15.5 (E15.5) fareler ve microdissect korteks kafatası gelen bütün beyinleri çıkarın. Viesselmann ve ark 8 bakınız embriyonik fare korteksin mikrodiseksiyon ilgili detaylı talimatlar için. </li><li> steril 1.6 ml&#39;lik mikrotüp içinde diseksiyon medya 1 ml fazla 4 korteks yerleştirin. 10x tripsin 120 ul ekleyin ve tüpü 3 ters - karıştırmak için 5 kez. </li><li> hemasitometre kullanarak, hücreler, hücre kültür kaplarına tohum saymak. Not: 1 kortikal yarımkürede sağlar yakloximately üç milyon hücre. <ol><li> SDS-dirençli Snare karmaşık biyokimya testi için, 35 mm çanak başına altı milyon hücre plaka ve durum başına iki yemekler kullanmaktadır. Not: Bu birden fazla koşul karşılaştırırken 6 kuyucuğu kullanılarak basitleştirilmiştir. </li><li> Dallanma tahlilleri için, nitrik asit levha nöronlar 150,000 yoğunluğunda akson dallanma plakasının DIC görüntüleme için, 35 mm tabak başına 250,000 hücrelik bir yoğunlukta dairesel lamelleri yıkanmıştır. Bu yoğunluklar aşırı kalabalık önlemek ve analizi basitleştirmek. </li></ol></li><li> canlı hücre TIRF mikroskopi için, oda sıcaklığında nucleofection çözeltide transfeksiyon başına iki milyondan nöron tekrar süspansiyon. <ol><li> İmalatçı protokolüne 9&#39;a göre bir Nucleofector sahip VAMP2-pHlourin sentezleme plasmidi ve elektroporasyona 10 ug içeren bir mikrotüp hücre süspansiyonu 100 ul ekle. </li><li> transfections hemen tripsin söndürme medya 500 ul ekledikten sonra, bir den de küvet ve plaka hücreleri süspansiyon kaldırmak35 mm PDL kaplı cam alt çanak başına 400.000 hücre sity. </li></ol></li><li> Plaka serum serbest medya 2 ml tüm kortikal nöronlar. </li></ol> 2. Snare Kompleks Oluşumu Testi Not: SDS-dirençli tuzak kompleksleri işlenir ve ilk aşağıda detaylı değişikliklerle 10 tarif edildiği gibi analiz edilmiştir. Burada kullanılan olanlar valide alternatif antikorları için, malzeme bölümüne bakın. <ol><li> Önceden lizise 1 saat boyunca 250 ng / ml Netrin-1 ya da sham kontrol ile in vitro (DIV) &#39;de E15.5 kortikal nöronlar 2 gün teşvik. </li><li> işlem örnekleri, 37 ° C, 4 ° C&#39;ye soğutun santrifüj ve set su banyosu sıcaklığında ve 100 ° C sıcaklıkta bir blok önce. </li><li> inkübatör hücre yemekleri çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. <ol><li> yıkama başına 2 dakika - hücrelerden aspire ortam, 2 ~ sahip ml buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 1 yavaşça 2 kez değiştirin. </li><li> Bu tahlil için, koşul başına 2 kuyu kullanımıition. </li><li> bir durumun ilk kuyudan aspire PBS ve 250 ul homojenizasyon tamponu ile değiştirin. buz üzerinde hücreleri homojenize 5 dakika boyunca buz üzerinde bırakın ve daha sonra bir hücre kaldırıcı kullanılmıştır. </li><li> Aynı durum bir sonraki oyuk PBS aspire ve de son zamanlarda homojenize karışımı ekleyin. Bu protein konsantrasyonlarını artacaktır. Tüm koşullar için tekrarlayın. </li><li> tamamlanmasından sonra, bir pipet, buz üzerinde önceden soğutulmuş 1.6 mL mikrotüp çözüm homojenize edilir ve% 1 Triton X-100, bir nihai konsantrasyon elde etmek% 20 Triton X-100 ilave edin. kabarcıklar en aza indirirken 1000 ul pipet ile 10 kez karıştırın triturate. </li></ol></li><li> 2 dakika proteinlerin çözündürülmesi için buz üzerinde inkübe edin. 4 ° C&#39;de 6.010 RCF 10 dakika boyunca inkübasyon, santrifüj olmayan aşağıdaki çözündürülmüş malzeme peletlendi. buz üzerinde yeni soğutulmuş 1.6 ml tüp içine lizat süpernatant taşıyın. </li><li> Bradford tahlili 11 kullanılarak protein konsantrasyonu analizi yapın ve bir fina örnekleri sulandırmakB-Mercaptethanol (BME) ile desteklenmiş,% 1 Triton X-100 ve 5x örnek tampon maddesi ile takviye edilmiş homojenizasyon tamponu kalan 5 mg / ml - 3 L protein konsantrasyonu. </li><li> 2 tüp içine eşit her deneysel örnek bölün. 30 dakika (tuzak kompleksleri) ve 30 dakika (tuzak monomer), 100 ° C de başka bir 37 ° C &#39;de bir örnek inkübe edin. çözeltide örnekleri tutmak için aralıklı olarak tüpler ters. </li><li> SDS-PAGE ile ayrılması için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de örnekleri dondurun. 100 ° C&#39;de 5 dakika boyunca, daha önce kaynatıldı örnekleri reboil, standart teknikler kullanılarak elektroforez ile örnekleri çalışan ancak oda sıcaklığında 37 ° C&#39;de numune çözülme önce. </li><li> Örneklerin Run çiftleri (30 - numune başına protein 40 ug) bir% 8 ve% 15 jel hem; % 15 SNARE protein monomerleri (SNAP-25 ° 25kDa, VAMP2 ~ 18 kDa, sintaksin-1 ~ 35kDa) ölçmek için kullanılır ise,% 8, kompleks doğru ayrılmasını sağlar. boya hattı STAC aracılığıyla kadar 70 V güç kaynağı koruyun90V için kral jel ve artış gerilimi. Boya kapalı bitene kadar jeller çalıştırın. </li><li> monomerler korumak için, 45 dakika boyunca 70 V,% 20 metanol (MeOH) ilave soğuk aktarım tamponu kullanılarak buz üzerinde 0.2 mikron nitroselüloz zar proteinleri aktarın. </li><li> O, 2 saat boyunca kapalı bir tabak içinde kuru membran / oda sıcaklığında N (O / N en iyi sonuçları verir). </li><li> Blok oda sıcaklığında 1 saat için,% 10 Sığır Serum Albumin (BSA) kompleks membranlar SNARE. </li><li> bir döner çalkalayıcı üzerinde 4 ° C&#39;de 1000 ve prob olarak O / N: 1 bir seyreltme (spesifik SNARE kompleks bileşenlerini belirleyen) primer antikorların hazırlanması. <ol><li> Tris Tamponlu tuzlu su artı% 0.1 Tween-20 (TBS-T) her biri 5 dakika için 3 kez lekelerini durulayın. </li></ol></li><li> 1 bir seyreltme floresan ikincil antikor solüsyonları hazırlayın: 20,000,% 1 TBS-T içinde BSA ve prob, oda sıcaklığında kapalı 1 saat için. 1 saat sonra tekrarlayın Adım 2.12.1. </li><li> Bir floresan tarama makinesinde görüntü lekeler yazılım paketi ile donatılmış ve Snare protein co hem ölçmekdikdörtgen İB&#39;leri çizim için üreticinin talimatlarına kullanarak (sırasıyla 25 kDa, 18 kDa, SNAP-25, VAMP2 35 kDa immunoreaktif bantları ve sintaksin-1) mplex (40kDa yukarıda immunoreaktif bantları) ve monomer bantları. </li></ol> TIRF Mikroskopi 3. Görüntüleme ekzositik Etkinlikleri Bu protokol, sıcaklık, nem ve CO2 bir epifluorescent aydınlatma, yüksek bir büyütme / yüksek sayısal açıklık (NA) TIRF amacı, otomatik bir XYZ aşaması ile donatılan bir ters TIRF mikroskop korumak için bir çevre odasının dahil olmak üzere özel mikroskopi ekipman gerektirir ve Not: hassas Charge Coupled Device (CCD) dedektörü. Bu protokol, 100X 1.49NA TIRF amacı yarıiletken 491 nm lazer ve bir elektron Çarpma CCD (EM CCD) ile donatılmış bir tam otomatik ters mikroskop kullanılır. Tüm ekipman görüntüleme ve lazer kontrol yazılımı tarafından kontrol edilir. Envir üzerine daha önce başından görüntüleme protokolü gücüonmental odası, sahne, lamba, bilgisayar ve kamera. <ol><li> görüntüleme yazılımı içinde seçin hedefi. Amaç yerleştirildikten sonra, yaka etrafında objektif ısıtıcı sabitleyin. </li><li> Bu amaç sahne yuvasına sahne inkübatör güvence önce tamamen aşağı iner onaylayın. dökülme önlemek için eşit sahne inkübatör girişlerine içine distile su dökün. </li><li> Kuluçka sistemi açın. CO 2 tanka vanasını açın ve basıncı, üreticinin talimatlarına göre sistemine uygun onaylayın. Bölmesini% 5 CO 2 ve 37 ° C ulaşmak için biraz zaman tanıyın. görüntüleme çanak eklemeden önce, objektif su yoğunlaşmasını önlemek için inkübatör boş çanak yerleştirin. </li><li> lazer kaynağı açın. </li><li> Açık sahne kuvöz ve lens daldırma yağı ekleyin. inkübatör örnek yerleştirin ve kararlılık kol ya da bir tabak ağırlığı stabilize. Yağ örneğinin alt ile temas edinceye kadar objektif kaldırın. switciletilen ışık aydınlatma h ve Okülerin yoluyla nöronal odak düzlemi bulmak. </li><li> Lazer yazılımını başlatın ve lazer kontrol yazılımı bağlanın. Widefield ve objektif kullanılan seçmek için aydınlatma ayarlayın (100X 1.49 NA TIRF tavsiye edilir). Numunenin Set refraktif indeks (hücreler ~ 1.38). 491 nm lazer için &quot;TTL&quot; işaretini kaldırarak lazer yoğunluğunu ayarlayın. % 40 - daha sonra 20 arasında bir değere geri aşağı getirmek 100 sürgüsünü ayarlayın. &quot;TTL&quot; yeniden kontrol edin. </li><li> iletilen ışık aydınlatma tekrar numune odaklanın. görüntüleme yazılımı gidin ve 491 nm lazer aydınlatma ve açık deklanşörü seçin. Güzel tavana lazer odak noktasını ayarlamak ve çıkarılmış kondansatör ile kapalı alan diyafram merkezine gelin merkezi. böylece değil çizik lens, baş aşağı optik bankta Yoğuşturucuyu yerleştirin. </li><li> kondenser değiştirin ve 110 nm TIRF yazılım ve set penetrasyon derinliğine (PD) gidin. TIRF illum için widefield aydınlatma geçingörüntüleme biçimde uygulanması modu. </li><li> epifluorescent ışık kaynağı ile geniş açılı Epifloresans kullanarak oküler üzerinden eksprime eden hücrelerin VAMP2-pHluorin Bul. <ol><li> görüntüleme parametrelerini (pozlama süresi, kazanç ve lazer güç) (örneğin photobleaching ve fototoksisite azaltmak için en az pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu kullanarak gürültü oranı ve dinamik aralık sinyali maksimize etmek için ayarlayın: 50 arasında poz - 100 ms, 15 ile - 30 % 30 maksimum lazer gücü) kazandıracağı. </li><li> Hücre başına ayarlayın sürekli otofokus. edinim 5 dakika boyunca her 0,5 saniyede oluşan seti bir timelapse görüntü kazanır. Netrin-1 uyarılmış durum için, bir laminar akış başlığı içinde hücrelerin çanak-1 netrin, 500 ng / ml ilave edilir ve önce görüntüleme 1 saat için inkübatöre geri çanak. </li></ol></li><li> , ImageJ açık görüntü yığınlar&gt; Aç&gt; Dosya adı (Şekil penceresinin içine dosyayı sürükleyip bırakmak veya dosya giderek hücre alanı ve zaman başına normalize ekzositik olayların sıklığını ölçmek için0; 2A Ankastre 1). <ol><li> Ortalama Yoğunluk: vezikül füzyon olayları temsil etmemektedir kararlı floresan sinyalleri kaldırmak için, Görüntü&gt; Yığın&gt; Z-Project&gt; Projeksiyon tipi kullanarak tüm yığının ortalama z projeksiyonu oluşturmak. &gt; Süreci kullanılarak timelapse&gt; Görüntü Hesaplama her görüntüden Image1 demek görüntüsünü çıkarma: yığını Operasyonu: image2 yeni oluşturulan ortalama z projeksiyon çıkarın. Bu ekzositik olayları (- 3 Şekil 2A Ankastre 2) vurgulamaktadır. </li><li> gözle ekzositik füzyon olayları saymak. Ekzositik etkinlik hızlı VAMP2-pHluorin plazma zarı (Şekil 2A ek 6) içinde dağılır olarak yayılan bir kırınım sınırlı floresans sinyali ortaya olarak tanımlanır. </li><li> &gt; Görüntü kullanarak ilk resmi vurgulayın ayarlayın&gt; Threshold&gt; tam hücre eşiği (- 8 Şekil 2A INSET 7) vurgulanan kadar kaydırıcıyı ayarlamak için Eşik komutunu kullanın. </li><li> Ana altındaLyze, SetMeasurements seçin ve alanı ve ekran etiketi kontrol edin. (- 8 Şekil 2A INSET 7) ölçmek için asa izleme aracı ve basının &#39;m&#39; ile eşiklenir hücresel alanını seçin. </li><li> Hem ekzositik füzyon olayları saymak Transferi, bir elektronik tabloya hücre alanı ölçümleri ve geçen görüntüleme süresi ekzositik olaylar / mm 2 / süresi sayısını (Şekil 2A Ankastre 9) hesaplamak için kullanılır. </li></ol></li></ol> 4. Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Akson dallanma Timelapse Mikroskopi Not: DIC görüntüleme genel bir yaklaşım için tam bir protokol ve gösteri 12 mevcuttur. Bu protokol, DIC kullanır, diğer gönderilen ışık mikroskobu yöntemleri (örneğin: faz kontrast) aynı amaçlar için kullanılabilir. <ol><li> 2 SAYI anda, önceden ısıtılmış çevre odasında untransfected nöron içeren yer cam alt görüntüleme çanak nemli env korumak için% 5 CO2 ve 37 ° C ironment. En iyi görüntü kalitesi ve çözünürlük için 60X Plan-apochromat ile donatılmış mikroskop, 1.4 NA DIC objektif lens ve yüksek NA kondenser yararlanın. </li><li> iletilen ışık aydınlatma kullanarak Okülerin aracılığıyla nöronlar bulmak için odak düzlemi ayarlayın. </li><li> görüntüleme yazılımı çoklu alan edinme işlevi kullanarak, bulmak ve en az 6 hücre XYZ yerleri kaydedin. sahne yerleştirin, böylece en iyi sonuçları elde etmek için görüş alanı içinde faiz uyum nöronlar. <ol><li> 250 ng Canlandıracak / ml netrin-1 ve basın &#39;Çok alanlı alımı başlatabilirsiniz.&#39; Sıralı gerektiği gibi satın alma ve odaklanma duraklatma, 24 saat boyunca her pozisyonda her 20 saniyede görüntü kazanır. </li></ol></li><li> Çok Boyutlu Veriler&gt; açık dosya adını gözden&gt; Apps kullanarak görüntüleme yazılımı görüntüleri inceleyin. istikrarlı akson dalları (20 mikron uzunluğunda) görüntüleme oturumu sırasında bu form tanımlayın. Bir stableaxon branc ölçmek için hat çizmek aracını kullanınucu akson de tabandan saat 20 mikron uzunluk yeterlilik karşılanmasını sağlamak. <ol><li> membran çıkıntılar doğmakta olan dalları uzunluğu 20 mikron ulaştığınızda dalları daha sonra yanı sıra netrin stimülasyon sonrasında kare sayısını oluşturan alanlarda başlattığınızda Elektronik tabloda, netrin uyarılmasından sonra kare numarasını kaydedin. </li><li> Şube başına oluşum süresini hesaplamak için 20 saniye çıkıntı ve şube oluşumu arasındaki kare sayısını çarpın. </li></ol></li></ol> 5. Toksin İşlemler ve Sabit Hücre Immunofluoresence <ol><li> Div 2 &#39;de, 250 ng deney koşullarında nöronları tedavi / ml-netrin 1 ve / ya da 10 nM botulinum etkili / mi netrin- ng tuzak aracılı eksositoz 13 artı 250 inhibe böler SNARE proteini SNAP-25&#39;in ve bir toksin (BoNTA), 1. kontrol koşulu olarak işlenmemiş nöronların bir set bırakın. DİKKAT: hazırlanması ve kullanırken BoNTA göz ve solunum koruması kullanımını gerektirirçözümleri. en kısa sürede biyolojik tehlikesi malzeme ve otoklav gibi tüm kontamine malzemeler koruyun. </li><li> 3 bölme (24 saat sonra muamele) aspire ortam ve hemen PHEM düzeltme (ayrıntılar için Tablo 1 &#39;e bakınız) en az 1 ml yerine 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı. Oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> (4 ° C&#39;de parafilm ve mağaza ile ileride kullanmak mühür) PBS ile 3x durulayın. </li><li> Koyu renk, nemlendirilmiş boyama odası içinde lamelleri ve (% 10 Triton X-100, stoktan yapılmış) PBS içinde Yeni seyreltilmiş% 0.2 Triton X-100, 10 dakika boyunca hücre zarları permeabilize. </li><li> Permeabilization çözüm çıkarın ve PBS ile 1x 50 ul ile yıkayın. 30 dakika boyunca blok ~ PBS (BSA-PBS) içinde% 10 Sığır Serum Albumin 50 ul ya da 10%, oda sıcaklığında PBS içinde eşek serumu Haşlanmış. </li><li> Yine 1x PBS ile durulayın. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile,% 1 BSA-PBS içinde (nöronal kimliğini teyit etmek için 1000 βIII tubulin 1) birincil antikor, 50 ul lamelleri inkübe, karanlıkta. </li><li> PBS içinde 3x 5 dakika yıkama yapın. tübülin (1: 400) için spektral olarak farklı ikincil antikor, 50 ul lamelleri inkübe ve flüoresan Phalloidin (eksitasyon göre değişir: 100, 1 488 falloidin: 400, 647 falloidin 1), 1 saat boyunca% 1 BSA-PBS&#39;de . </li><li> 1x PBS içinde 3x 5 dakika yıkayınız ve montaj medyada Slaytlarınıza lamelleri monte edin. </li><li> şeffaf tırnak cilası ile lamel ve mühür kenarlarından Vakum fazla montaj medya. </li><li> 40X 1.4NA objektif, epifluorescent yetenekleri ve EM-CCD ters bir mikroskop widefield Epifloresans görüntüleri toplayın. <ol><li> El ile ImageJ kullanarak dallanma analiz. Penceresine dosya sürükleyerek veya&gt; Aç&gt; dosya adı (Şekil 4A inset 1) Dosya giderek ImageJ açın görüntü yığınları. </li><li> Line&gt; segmente hattını kullanarak, soma (- 3 Şekil 4A içerlek 2) uzanan en uzun akson olarak tanımlanan akson, iz. </li><li>Analiz&gt; Araçlar&gt; ROI Manager&#39;ı kullanarak, ilgi bir bölge olarak izleme akson kaydedin. Trace ve uzunluğu bir neurite ≥20 mikron olarak tanımlanan her akson dalı kaydedin. Analizi (- 4 Şekil 4A içerlek 3) &#39;de (doğrudan akson çimlenme çıkıntılar) yalnızca birincil dalları yer alır. </li><li> Ü &#39;ilgi kaydedilen bölgeleri ölçmek ve mikron uzunluğunu hesaplamak için bir e-tabloya piksel uzunlukları aktarmak için. </li><li> 100 mikron uzunluk başına akson şube sayısını elde etmek için 100 ile bölünmüş mikron akson uzunluğu, uzunluğu ≥20 mm akson şube sayısını bölün. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Drachman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+we+have+brain+to+spare%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Do we have brain to spare?</a> Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).</li>
<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+Is+Required+for+Commissural+Axon+Guidance+in+the+Developing+Vertebrate+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System.</a> Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).</li>
<li>Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+netrin-1+in+the+guidance+of+cortical+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents.</a> Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li>
<li>Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins%3A+versatile+extracellular+cues+with+diverse+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions.</a> Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).</li>
<li>Pfenninger, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+expansion%3A+a+neuron%27s+Herculean+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).</li>
<li>Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Netrin-1-sensitive+mechanism+promotes+local+SNARE-mediated+exocytosis+during+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+membrane+fusion+complex%3A+action+of+clostridial+neurotoxins+on+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly.</a> The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Centonze Frohlich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Contrast+and+Differential+Interference+Contrast+%28DIC%29+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Blasi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+neurotoxin+A+selectively+cleaves+the+synaptic+protein+SNAP-25%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25.</a> Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Akson dallanması temel bir nörogelişimsel süreçtir ve memeli sinir sisteminin geniş nörobağlantısını destekler. Lokalize plazma zarı genişlemesinde rol oynayan mekanizmaları anlamak, hem normal hem de patolojik nörogelişimi anlamamızın ayrılmaz bir parçasıdır. Hem popülasyon düzeyinde hem de tek hücre düzeyinde metodolojileri içeren çok yönlü bir yaklaşımın kullanılması, tekrarlanabilirliği artırır ve popülasyon düzeyinde analizden ödün vermeden mekansal ve zamansal çözünürlüğü artırır. Tek hücre düzeyinde, netre bağımlı...

Son tahminler, insan beyninin 1014 sinaptik bağlantıya1 sahip 1011 nöron içerdiğini ve akson dallanmasının in vivo önemini vurguladığını gösteriyor. Netrin-1 gibi hücre dışı akson kılavuzlama ipuçları, aksonları uygun sinaptik partnerlere yönlendirir ve aksonal dallanmayı uyarır, böylece sinaptik kapasiteyi2-5 arttırır. Netrin-1'e bağımlı aksonal arborizasyon, SNARE kompleksine bağımlı ekzositik vezikül füzyonu7 yoluyla ek membran bileşenlerinin verilmesini gerektirdiğini varsaydığımız önemli plazma membran genişlemesini6 içerir. 
Netrin-1 bağımlı akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositozun rolünün araştırılması birkaç faktör tarafından karmaşıktır. İlk olarak, kortikal nöronların heterojenliği, görüntüleme gibi tek hücreli teknikleri karmaşıklaştıran önemli etkileri tanımlamak için gereken örneklem boyutunu arttırır. İkincisi, biyokimyasal teknikler popülasyon düzeyinde meydana gelen değişikliklerin gözlemlenmesine izin verse de, akson dallanmasının zaman çerçevesinde aksona plazma zarı genişlemesini lokalize etmek için gerekli zamansal ve mekansal çözünürlükten yoksundurlar. Son olarak, akson dalları saatler içinde oluşsa da, aksonal genişlemeye katkıda bulunan hücresel değişiklikler dakikalar içinde başlayabilir ve saniyeler içinde meydana gelebilir, böylece deneysel değerlendirme için zamansal kapsamı genişletebilir. 
Ekzositoz ve akson dallanmasının bu çeşitli zamansal ve mekansal ölçeklerini ele alan ve böylece temel hücresel mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştiren çok teknikli bir yaklaşımın ana hatlarını çiziyoruz. Bu yaklaşımların kullanılması, akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositoz için kritik bir rolü destekleyen kanıtlar sağlar.

<table><tbody><tr><td>6 oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş plakalar</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>cam lameller</td><td>Fisher scientific</td><td>12-545-81</td><td>12CIR-1.5; 24 saat boyunca nitrik asit ile muamele edilmeli, 2x DI suda durulanmalı ve kullanımdan önce kurutulmalıdır. 1 mg / ml Poli-d-lizin ile kaplanmalı ve hücreleri kaplamadan önce durulanmalıdır.</td></tr><tr><td>Amaxa nükleofeksiyon solüsyonu</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td>100 ml/transfeksiyon</td></tr><tr><td>Amaxa Nükleofektör/elektroporatör</td><td>Lonza</td><td></td><td>programı O-005</td></tr><tr><td>35 mm Cam tabanlı canlı hücre görüntüleme tabakları</td><td>Matek Corporation</td><td>p356-1.5-14-C</td>, <td>1 mg/ml Poli-d-lizin ile kaplanmalı ve hücrelerin kaplanmasından önce durulanmalıdır</td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC2 ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda LS xenon lamba</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çevre Aşaması üst kuluçka makinesi</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.49 NA TIRF hedefi</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon EM-CCD</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Licor Kızılötesi Görüntüleme Sistemi</td><td>LI-COR</td><td>Odyssey CL-X</td><td>Lekeleri taramak için kullanılır</td></tr><tr><td>Görüntü stüdyosu yazılım paketi</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Odyssey Infrared sisteminde tarama yapmak için kullanılır; Olympus Molecular devices, LLC için leke Metamorph'un çevrimdışı analizi için kullanılan görüntü stüdyosu lite</td></tr><tr><td></td><td></td><td>sürüm 7.7.6.0</td><td>DIC timelapse'ın tüm görüntüleme ve analizi için kullanılan yazılım</td></tr><tr><td>CELL TIRF kontrol yazılımı</td><td>Olympus</td><td></td><td>TIRF görüntüleme Fiji için lazerleri kontrol etmek için kullanılan yazılım</td></tr><tr><td>(Resim J)</td><td>NIH</td><td>ImageJ Sürüm 1.49t</td><td></td></tr><tr><td>60x Plan Apochromat 1.4 NA hedefi</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 1.4 NA Plan Apochromat objektif</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobazal media</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td>Hem serum içermeyen hem de tripsin söndürme ortamı için baz solüsyon</td></tr><tr><td>Ek B27</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td>500 ml/50 ml Serum içermeyen ortam ve Tripsin Söndürme ortamı</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td></td><td>35050-061</td><td>1 ml/50 ml Serum içermeyen ortam</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Bio Basic Incorporated</td><td>9048-46-8</td><td>Lamelleri bloke etmek için 1x PBS'de% 10 çözelti; Nitroselüloz membranları bloke etmek için TBS-T'de% 5 çözelti.</td></tr><tr><td>10x&nbsp; tripsin</td><td>Sigma</td><td>59427C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CELLGRO</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) + Ca + Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-cm</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher bilimsel</td><td>CAS67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS tabanı</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>N-Propil Gallate</td><td>MP Biyomedikal</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol Fotometrik sınıf</td><td>Acros Organics</td><td>18469-5000</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol (optik olmayan sınıf)</td> <td>Fisher scientific</td><td>CAS56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoethonal</td><td>Fisher scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış Su&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>152340-147</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin</td><td>Sigma</td><td>p-7886</td><td>1 mg / ml'de steril suda çözülür</td></tr><tr><td>Botulinum A toksini BoNTA</td><td>Listesi Biyolojik Laboratuvarlar</td><td>128-A</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti insan VAMP2</td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>11829</td><td></td></tr><tr><td>Fare monoklonal sıçan önleyici Syntaxin1A</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-12736</td><td></td></tr><tr><td>Keçi poliklonal anti insan SNAP-25</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-7538</td><td></td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti insan ve beta; III-tübülin&nbsp;</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ve Alexa Fluor 488 phalloidin veya Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR IR-boya ikincil antikorları</td><td>LI-COR</td><td>P / N 925-32212, P / N 925-68023, P / N 926-68022</td><td>800 eşek anti-fare, 680 eşek anti tavşan, 680 eşek anti keçi</td></tr><tr><td>0.2 & # 956; m gözenek boyutu nitroselüloz membran</td><td>Biorad</td><td>9004-70-0</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher bilimsel</td><td>S25426A</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher bilimsel</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fisher bilimsel</td><td>O-4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>%40 Bis-Akrilimit</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BP1408-1</td><td></td></tr><tr><td>İsim</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</strong</td></tr><tr><td>><>Alternatif Doğrulanmış Antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare Monoklonal Anti-Sözdizimi HPC-1 klonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0664</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Fare Monoklonal Sinaptobrevin 2 (VAMP2)</td> <td>Sinaptik Sistemler</td><td>104-211</td><td></td></tr><tr><td>Fare Monoklonal SNAP25</td><td>Sinaptik Sistemler</td><td>111-011</td><td></td></tr></tbody></table>

kombine metodolojileri kullanan akson dallanman ve nöronal morfogenez sırasında plazma membran teslimat rolü tanımlayın

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Nöral gelişim sırasında, büyüyen aksonlar, aksonal dalları detaylandırarak birden fazla sinaptik ortağa uzanır. Akson dallanması, netrin-1 gibi hücre dışı rehberlik ipuçları tarafından desteklenir ve aksonal plazma zarının yüzey alanında dramatik artışlara neden olur. Netrin-1'e bağımlı akson dallanması muhtemelen, bileşenleri ekzositik vezikül füzyonu yoluyla sağlanan plazma zarı genişlemesinin zamansal ve mekansal kontrolünü içerir. Bu füzyon olaylarından önce, VAMP2 (vezikülle ilişkili membran proteini 2) ve plazma membranı t-SNARE'ler, syntaxin-1 ve SNAP25 (sinaptozomal ilişkili protein 25) gibi bir v-SNARE içeren SNARE komplekslerinin oluşumu gelir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan, akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositozun rolünü incelemek için kullanılan çok yönlü bir yaklaşımdır. Kombine yaklaşımın gücü, tek tek nöronlardaki tek vezikül füzyon olaylarının dinamiklerinden kültürlenmiş nöron popülasyonlarında SNARE kompleksi oluşumuna ve akson dallanmasına kadar uzanan bir dizi uzamsal ve zamansal çözünürlükte veri toplamadır. Bu protokol, endojen SNARE komplekslerinin seviyelerini test etmek için yerleşik biyokimyasal yaklaşımlardan ve pH'a duyarlı bir GFP (VAMP2-pHlourin) ile etiketlenmiş VAMP2'yi eksprese eden kortikal nöronların Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobundan yararlanır ve bireysel nöronlardaki ekzositik aktivitedeki netrin-1'e bağlı değişiklikleri tanımlamak için. Netrin-1'e bağlı dallanmanın zamanlamasını aydınlatmak için, tek nöronların saatler boyunca hızlandırılmış diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanılır. SNARE mekanizmasını parçalayan ve ekzositozu bloke eden botulinum nörotoksinleri ile eşleştirilmiş sabit hücreli immünofloresan, netrin-1'e bağımlı akson dallanmasının SNARE aracılı ekzositik aktivite gerektirdiğini gösterir.

In vitro biyokimyasal teknikler kullanarak. Nöronların bir popülasyonda SDS-dirençli tuzak komplekslerinin miktarını tahlil Şekil 1 SNAP-25, syntaxin1A ve VAMP2 için incelenir SDS-dirençli tuzak kompleksi deneyinde elde edilen Western blot tamamlanmasının ardından göstermektedir. Bazal hücre membranında TIRF mikroskopi tek hücre bireysel ekzositik füzyon olayları yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar....

Işık mikroskobu teknikleri, biyokimyasal tahlillerle birleştiğinde, netrin bağımlı akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositozun katılımını aydınlatmaktadır. Bu tekniklerin kombinasyonu, akson dallanmasını ve hücre şekli değişikliğini kontrol eden moleküler mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Bu prosedürün genel amacı, nöronal ekzositik vezikül füzyonunun ve akson dallanmasının zamansal ve mekansal oluşumuna dair nicelleştirilebilir gözlemler yapmaktır. Bu yöntem, nöronal gelişim sırasında vezikül füzyonunun plazma membranının genişlemesi sürecinde membran materyalini ne zaman ve nereye eklediği gibi, nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücrelerde hem yüksek mekansal hem de zamansal çözünürlük elde etmek için canlı hücre görüntülemesini, popülasyon bazlı bilgiler elde etmek için kullanılan biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirmesidir.Protokol metnine uygun olarak kortikal nöronları Netrin-1 veya bir kontrol ile kültüre edip simüle ettikten sonra, bir koşulun ilk kuyucuğundaki PBS'yi aspire edin ve yerine 250 µL homogenizasyon tamponu ekleyin. Buz üzerinde beş dakika inkübe edin ve ardından bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri buz üzerinde homogenize edin.Aynı koşuldaki bir sonraki kuyucuktaki PBS'yi aspire edin ve protein konsantrasyonlarını artırmak için yeni homojenize edilmiş karışımı kuyucuğa ekleyin. Ardından, homojenize edilen çözeltiyi buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,6 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve nihai konsantrasyon %1 olacak şekilde %20 Triton X-100 ekleyin. Daha sonra 1.000 mikrolitrelik bir pipetle, kabarcık oluşumunu en aza indirerek karışımı on kez triture edin. Proteinlerin çözünmesi için tüpleri buz üzerinde iki dakika boyunca inkube edin.Ardından, çözünmemiş materyali çöktürmek için 4 derece Celsius'ta 10 dakika boyunca 6.010 RCF'de santrifüjleyin. Üst fazı buz üzerinde yeni ve soğutulmuş 1,6 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, protein konsantrasyonunu belirlemek için Bradford testi uygulayın.Ardından, numuneleri 3-5 mg/mL nihai konsantrasyona seyreltmek için %1 Triton X-100 içeren homojenizasyon tamponu ve BME ile desteklenmiş 5X örnek tamponu kullanın. Her bir deneysel numuneyi iki tüpe eşit şekilde bölün. Daha sonra, numunelerden birini 37 °C'de 30 dakika, diğerini ise 100 °C'de 30 dakika inkübe edin.Numuneleri çözeltide tutmak için tüpleri aralıklı olarak ters çevirin. Ardından, metin protokolüne uygun olarak SDS-PAGE ve Western blotting işlemlerini gerçekleştirin. TIRF mikroskobu ile numuneyi hazırladıktan ve metin protokolüne uygun olarak nöronal odak düzlemini bulduktan sonra.Lazer yazılımını başlatın ve lazer kontrol yazılımına bağlanın. Aydınlatmayı geniş alan (wide field) olarak ayarlayın ve objektifi seçin. Ardından örneğin kırılma indeksini ayarlayın ve 491 lazeri için TTL seçeneğinin işaretini kaldırarak lazer yoğunluğunu düzenleyin.Odak kaymasını ve fototoksisiteyi önlerken, analiz için yeterli ve yüksek sinyal-gürültü oranlı görüntüler elde etmek amacıyla, tabanı sağlam eksositik veziküllerin görüntülenmesi sırasında görüntüleme parametrelerinin optimizasyonu önemlidir. Kaydırıcıyı 100'e getirin ve ardından tekrar 20 ile 40 arasında bir değere düşürün. Ardından TTL'yi yeniden kontrol edin.Ardından, iletime ışık aydınlatmasında örneğe tekrar odaklanın. Daha sonra görüntüleme yazılımında, 491 lazer aydınlatmasını seçin ve panjuru açın. Merceğin çizilmemesi için kondanseri optik bench üzerine ters şekilde yerleştirin.Tavandaki lazer odak noktasını hassas bir şekilde ayarlayın ve kondansatör çıkarılmış haldeyken noktayı kapalı alan diyaframının merkezine hizalayın. Ardından kondansatörü yeniden yerleştirin ve TIRF yazılımında penetrasyon derinliğini 110 nanometre olarak ayarlayın. Daha sonra görüntüleme için geniş alan aydınlatmasından TIRF aydınlatma moduna geçiş yapın.Şimdi, geniş alan epifloresans kullanarak okülerler aracılığıyla VAMP2 floresan eksprese eden hücreleri bulun. Ardından, fotobezmeyi ve fototoksisiteyi azaltmak için görüntüleme parametrelerini, minimum pozlama süresi ve lazer yoğunluğu kullanarak sinyal-gürültü oranını ve dinamik aralığı maksimize edecek şekilde ayarlayın. Hücre başına sürekli otomatik odaklama ayarlamasını yapın.Ardından, beş dakika boyunca her 0,5 saniyede bir görüntüleme yapılacak şekilde bir zaman atımlı görüntü seti edinin. Laminar akışlı bir çeker ocakta, Netrin-1 ile stimüle edilen koşul için, hücrelerin bulunduğu bir kaba final konsantrasyonu 500 nanograms per milliliter olacak şekilde Netrin-1 ekleyin ve görüntülemeden önce kabı bir saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Hücre alanı ve zamana göre normalize edilmiş ekzositik olayların sıklığını nicelleştirmek için.ImageJ'de, dosyayı pencereye sürükleyerek veya Dosya, Aç, dosya adı yolunu seçerek görüntü yığınlarını açın. Vezikül füzyon olaylarını temsil etmeyen stabil floresan sinyalleri gidermek için Görüntü, Yığın, Z Projeksiyonu, Projeksiyon tipi Ortalama Yoğunluk seçeneğini kullanın. Tüm yığının ortalama Z Projeksiyonunu oluşturun.Process, Image Calculator seçeneğini kullanarak; Image 1 kısmında yığınınızı (stack), Operation kısmında ise Subtract image two'yu seçerek, elde edilen ortalama görüntüyü zaman serisindeki her bir görüntüden çıkarın. Bu işlem sonucunda yeni bir Z Projection oluşturulacaktır. Bu işlem, ekzositoz olaylarını belirginleştirecektir.Şimdi gözle, plazma membranında VAMP2 floresanı difüze oldukça hızla yayılan, difraksiyon limitiyle sınırlı floresan sinyal noktaları olarak tanımlanabilen ekzositik füzyon olaylarını sayın. İlk görüntüyü Görüntü, Ayarla, Eşik (Image, Adjust, Threshold) adımlarını kullanarak vurgulayın ve tüm hücre eşik değerine göre vurgulanana kadar sürgüyü ayarlayın. Ardından Analiz (Analyze) sekmesi altından Ölçümleri Ayarla (Set Measurements) seçeneğini belirleyip alan ve görüntü etiketini işaretleyin.Sihirli değnek izleme aracıyla, eşik değeri belirlenmiş hücresel alanı seçin ve ölçüm yapmak için M tuşuna basın. Toplanan verileri metin protokolüne uygun olarak bir hesap çizelgesine aktarın. In-vitro'nun ikinci gününde, transfekte edilmemiş nöronları içeren cam tabanlı görüntüleme kabını önceden ısıtılmış nemli bir çevresel hazneye yerleştirin.En iyi görüntü kalitesi ve çözünürlük için altı DX plan apochromat 1.4 NA DIC objektif lens ve yüksek sayısal açıklıklı bir kondansatör ile donatılmış bir mikroskop kullanın. Ardından, geçirgen ışık aydınlatması ile okülerler aracılığıyla nöronları bulmak için odak düzlemini ayarlayın. Akson dallanmasının DIC görüntülemesi için, soğutucu aydınlatmanın uygun kurulumu görüntü optimizasyonu için temel teşkil edecek ve analiz edilebilir sonuçlar üretmek için kritik olacaktır.Ardından, ilgilenilen nöronlar görüş alanı içerisindeyken, en az altı hücrenin XYZ konumlarını bulmak ve kaydetmek için görüntüleme yazılımındaki çok bölgeli veri toplama fonksiyonunu kullanın. Şimdi, hücreleri simüle etmek için 250 nanogram per milliliter nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde Netrin-1 veya ilgilenilen diğer faktörü ekleyin ve çok bölgeli veri toplamayı başlat düğmesine basın. 24 saat boyunca, her 20 saniyede bir her konumdan sıralı olarak görüntüler toplayın.Gerektiğinde veri toplama işlemini durdurun ve yeniden odaklama yapın. Görüntüleme yazılımı içerisinde, Uygulamalar (Apps), Çok Boyutlu Verileri Gözden Geçir (Review Multi Dimensional Data) seçeneğini belirleyerek görüntüleri inceleyin ve istenen dosyayı açın. Görüntüleme oturumu sırasında oluşmuş olan stabil akson dallarını tanımlayın.Aksonun tabanından ucuna kadar stabil bir akson dalını ölçmek için iz bölgesi (trace region) aracını kullanın. Nöronları Netrin ve botulinum toksini ile tedavi ettikten, ardından metin protokolüne göre sabitleme yaparak beta-3 tubulin ve aktin için immünoboya uyguladıktan sonra; geniş alan epifloresan görüntüleri toplamak için ters mikroskop kullanın.ImageJ'de bir görüntü yığınını açın ve dallanmayı manuel olarak analiz etmek için çizgi (line), bölümlenmiş çizgi (segmented line) araçlarını kullanarak, somadan uzanan en uzun nörit olarak tanımlanan aksonu izleyin. Analyze, Tools, ROI Manager menüleri üzerinden akson izini bir ilgi alanı (region of interest) olarak kaydedin. Ardından, uzunluğu 20 mikrometreye eşit veya daha büyük olan nöritler olarak tanımlanan her bir akson dalını izleyin ve kaydedin.Analize yalnızca birincil dalları dahil edin. Burada, SDS'ye dirençli SNARE kompleks analizi tamamlandıktan sonraki Western blot gösterilmektedir. SNAP25, Syntaxin 1A ve VAMP2 için problanmıştır.Kompleks halindeki SNARE proteinleri ve tanımlanabilir monomerler burada gösterilmektedir. Bir kortikal nöronda zaman içinde gerçekleşen VAMP2 florofor aracılı bir ekzositik olay örneği burada sunulmuştur. Yakınlaştırılmış ekler, bu deneyin mekânsal faydasını gösteren somayı, bir akson dalını ve bir aksonal büyüme konisini belirtmektedir.Daireler, TIRF mikroskobisi ile görülebilen tekil ekzositik füzyon olaylarını belirtir. Bu zaman ayarlı DIC görüntüleme, Netrin tarafından stimüle edilen bir akson dalının oluşumunu gerçek zamanlı olarak göstermektedir. Bu konumlar, bir dal bölgesindeki ilk çıkıntıyı ifade eder.Bunlar, ana aksondan dal ucuna kadar ölçülen, en az 20 µm uzunluğunda tam oluşmuş stabil dalları temsil etmektedir. Bu deneyde, 3 DIV'deki kortikal nöronlar ya dallanmayı uyaran Netrin-1 ile ya da SNARE kompleksinin bir bileşeni olan SNAP25'i kesen ve ekzositozu bloke eden botulinum A toksini ilele işleme tabi tutulmuştur. Sonuçlar, Netrin bağımlı dallanma için SNARE aracılı ekzositozun gerekli olduğunu göstermektedir.Yöntem ustalığa dönüştüğünde, DIC görüntüleme tek bir gece boyunca süren görüntüleme oturumunda tamamlanabilir. Bireysel ekzositoz olaylarının TIRF görüntülemesi 4-5 saat içinde yönetilebilir. SNARE kompleks oluşumu biyokimyasal protokolü ise iki saat içinde gerçekleştirilebilir.Bu prosedürleri uygularken, acele etmemeye ve her bir adımı sakin bir tempoda gerçekleştirmeye özen göstermek önemlidir. En iyi sonuçları elde etmek için her prosedür dikkat ve sabır gerektirir. Bu prosedürün ardından, ek soruları yanıtlamak için etiketli vezikül bileşenlerinin etiketli aday kargolarla birlikte kotransefeksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Ekzositoz veziküllerinin içeriği nedir? Bu teknik geliştirildikten sonra, nörobilim alanındaki araştırmacıların herhangi bir disosiye nöronal kültürde nöritogenezi, akson dallanmasını ve morfogenezin diğer aşamalarını keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, nöronal morfogenezdeki değişikliklere karşılık gelen nöronal ekzositoz vezikül füzyon olaylarının mekansal ve zamansal doğasının nasıl gözlemleneceği ve nicelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Botulinum toksini veya yüksek güçlü lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun güvenlik giysileri giymek ve mikroskobun güvenlik kilitleme mekanizmasını kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

utilizing-combined-methodologies-to-define-role-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video nöronların genetik olarak tanımlanan gruplar aksonal yollar kullanarak embriyonik civciv omurilik görselleştirmek için nasıl...

Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Kemirgen omuriliğe duyusal aferentlerde kalıplaşmış projeksiyonları tek akson izleme yoluyla aksonal dallanma incelemek için kolay ulaşılabilir bir deneysel sistem sunuyoruz.

Fare Embriyonik Omurilik Tüm Dağı Hazırlık aksonal dallanma Eğitim DRG Nöronlar DII-Etiketleme

Nöral tüp içinde gen ekspresyonunu bir hücre tipine özgü, izlenebilir bir şekilde aşağı regüle olabilen göre bir yöntem tarif edilmektedir. Biz nasıl...

Open-kitap Hazırlıklarında Dii Enjeksiyon tarafından geliştirilmesi Nöral Tüp ve fenotipleri Değerlendirilmesinde miRNA tabanlı Plazmidler arasında ovo Elektroporasyon yılında

Kaynak: Winkle, C. C., et al. Akson dallanması ve nöronal morfogenez sırasında plazma zarı iletiminin rolünü tanımlamak için birleşik metodolojilerin kullanılması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, kortikal nöronlarda gerçek zamanlı aksonal dallanmayı gözlemlemek için diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanan bir canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir. Hızlandırılmış videolar, aksonlarda lokalize ekzositoz ve hücre iskeleti yeniden düzenlemelerine neden olan bir sinyal molekülü...

Fare Kortikal Nöronlarında Aksonal Dallanmanın Gerçek Zamanlı İn Vitro Görüntülenmesi

Hücre yüzeyindeki akson kılavuz reseptörlerinin mekansal-zamansal dinamiklerini incelemek için pH'a duyarlı yeşil floresan protein varyantı pHluorin'in kullanımını burada açıklıyoruz. pHluorin etiketli reseptör hem hücre kültüründe hem de in vivoolarak ifade edilir Civciv embriyosunun elektroporasyonunu kullanarak.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

Bu protokol, sıçanlardan izole edilen dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının izolasyonunu ve akson hizalamasını geliştirmek için statik önceden gerilmiş bir hücre kültürü sistemi üzerinde DRG nöronlarının kültürünü ve ardından miyelinasyonu teşvik etmek için Schwann Hücrelerinin (SC'ler) ko-kültürünü tanımlar.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Bu prosedür, nevrit uzamasını yönlendiren mikropipetlere sabitlenmiş poli-D-lizin kaplı boncuklar kullanarak mikroakışkan odacıklar içerisinde düzenlenen nöritlerin hızla nasıl başlatılacağını, genişletileceğini ve bağlanacağını açıklamaktadır.

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Biz kendi kendine montajı, üç boyutlu demetleri boyuna hizalanmış astrositik somata ve süreçlerin bir roman biomaterial encasement içindeki gelişimi vitrin. Bunlar "yaşam iskele santimetre uzunluğunda, genişletme hizmet edebilir henüz test-yatak nörogelişimsel mekanizmaları incelemek veya yönetmenlik nöronal göç ve/veya aksonal neuroregeneration kolaylaştırmak için mikron çaplı çapı sergileyen", mühendislik kılavuz.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Bu iletişim kuralı thalamocortical akson dallanma ve synapse oluşumu organotypic cocultures, talamus ve serebral korteks eşzamanlı görüntüleme için bir yöntemi açıklar. Bireysel thalamocortical akson ve presynaptic onların terminalleri bir tek hücre çoğalmasıyla tekniği ile DsRed ve synaptophysin GFP öğesini tarafından görüntülenmiştir.

Görselleştirme Thalamocortical Axon dallanma ve sinaps oluşumunda Organotypic Cocultures

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Keşfedin SNARE aracılıklı ekzositozun netrin bağımlı akson dallanmasındaki rolünü. Canlı hücre görüntüleme ve biyokimyasal analizlerle nöronal gelişimde plazma membran teslimat mekanizmalarını öğrenin.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

Daha fazla video keşfet