Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

Bu prosedürün genel amacı, nöronal ekzositik vezikül fushion ve akson dallanmasının zamansal ve mekansal oluşumunun ölçülebilir gözlemlerini yapmaktır. Bu yöntem, nöronal gelişim sırasında vezikül füzyonunun zar materyalini genişleyen plazma zarına ne zaman ve nerede soktuğu gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücrelerde hem yüksek uzamsal hem de zamansal çözünürlük elde etmek için canlı hücre görüntülemeyi ve popülasyon tabanlı bilgi elde etmek için biyokimyasal yaklaşımları birleştirmesidir.

Netrin-1 ile kortikal nöronları kültürledikten ve simüle ettikten veya protokol metnine göre bir kontrol ettikten sonra. PBS'yi bir koşulun ilk kuyusundan aspire edin ve 250 mikrolitre homojenizasyon tamponu ile değiştirin. Buz üzerinde beş dakika inkübe edin ve ardından bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri buz üzerinde homojenize edin.

PBS'yi aynı durumdaki bir sonraki kuyucuktan aspire edin ve yakın zamanda homojenize edilmiş karışımı kuyuya ekleyin, bu da protein konsantrasyonlarını artıracaktır. Daha sonra, homojenize çözeltiyi buz üzerinde önceden soğutulmuş 1.6 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın ve% 1'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için% 20 Triton X-100 ekleyin,Daha sonra 1.000 mikrolitrelik bir pipetle, kabarcıkları en aza indirirken karışımı on kez ezin. Proteinleri çözündürmek için tüpleri buz üzerinde iki dakika inkübe edin.

Daha sonra çözünmemiş malzemeyi peletlemek için 6, 010 RCF'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Yalan durumu süpernatanı buz üzerinde yeni soğutulmuş 1.6 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, protein konsantrasyonunu belirlemek için Bradford testini kullanın.

Ardından, numuneleri mililitre başına 3-5 miligramlık bir nihai konsantrasyona seyreltmek için BME ile desteklenmiş %1 Triton X-100 ve 5X numune tamponu ile homojenizasyon tamponu kullanın. Her deney örneğini eşit olarak iki tüpe bölün. Daha sonra bir numuneyi 37 santigrat derecede 30 dakika, diğerini 100 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Numuneleri çözelti içinde tutmak için tüpleri aralıklı olarak ters çevirin. Ardından SDS sayfasını ve Western blotting'i metin protokolüne göre gerçekleştirin. TIRF mikroskobunu ve numuneyi kurduktan ve metin protokolüne göre bir nöronal odak düzlemi bulduktan sonra.

Lazer yazılımını başlatın ve lazer kontrol yazılımına bağlanın. Aydınlatmayı geniş alana ayarlayın ve hedefi seçin. Ardından numunenin kırılma indisini ayarlayın ve 491 lazer için TTL'nin işaretini kaldırarak lazer yoğunluğunu ayarlayın.

Görüntüleme parametresi optimizasyonu, analiz için yeterli yüksek sinyal-gürültü oranına sahip görüntüler üretirken odak kaymasını ve fototoksisiteyi önlemek için zemin sağlam ekzositik veziküllerin görüntülenmesi sırasında önemlidir. Kaydırıcıyı 100'e ayarlayın ve ardından 20 ile 40 arasında bir değere geri getirin. Ardından TTL'yi yeniden kontrol edin.

Ardından, iletilen ışık aydınlatmasında tekrar örneğe odaklanın. Ardından görüntüleme yazılımında 491 lazer aydınlatmasını seçin ve deklanşörü açın. Lensi çizmemek için kondansatörü optik tezgahın üzerine baş aşağı yerleştirin.

Lazerin tavandaki odak noktasını hassas bir şekilde ayarlayın ve kondansatör çıkarılmış durumdayken, noktayı kapalı alan diyaframının merkezine ortalayın. Ardından kondansatörü değiştirin ve TIRF yazılımında penetrasyon derinliğini 110 nanometreye gönderdi. Ardından görüntüleme için geniş alan aydınlatmasından TIRF aydınlatma moduna geçin.

Şimdi, geniş alan epifloresan kullanarak, oküler aracılığıyla VAMP2 florent eksprese eden hücreleri bulun. Ardından, fotoağartmayı ve fototoksisiteyi azaltmak için, minimum pozlama süresi ve lazer yoğunluğu kullanarak sinyal-gürültü oranını ve dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Hücre başına sürekli otomatik odaklamayı ayarlayın.

Ardından, beş dakika boyunca her 0,5 saniyede bir gerçekleşen çekim ile hızlandırılmış bir görüntü seti elde edin. Laminer akış başlığında Netrin-1 ile uyarılmış durum için, bir hücre kabına mililitre başına 500 nanogramlık bir Netrin-1 nihai konsantrasyonuna ekleyin ve görüntülemeden önce çanağı bir saat boyunca inkübatöre geri koyun. Hücre alanı ve zamanı başına normalize edilen ekzositik olayların sıklığını ölçmek için.

ImageJ'de, dosyayı pencereye sürükleyerek veya Dosya, Aç, dosya adı'nı seçerek görüntü yığınlarını açın. Vezikül füzyon olaylarını temsil etmeyen kararlı floresan sinyallerini kaldırmak için Görüntü, Yığın, Z Projesi, Projeksiyon türü Ortalama Yoğunluk'u kullanın. Tüm yığının ortalama bir Z Projeksiyonunu oluşturmak için.

İşlem, Görüntü Hesaplayıcı, Görüntü 1 yığınınız, İşlem Görüntü İki'yi kullanarak zaman atlamalı çekimdeki her görüntüden elde edilen ortalama görüntüyü çıkarın. Yeni oluşturulan bir Z Projeksiyonu ile sonuçlanır. Bu ekzositik olayları vurgulayacaktır.

Şimdi gözle, plazma zarı içinde VAMP2 floren difüsonları olarak hızla yayılan kırınım sınırlı floresan sinyalleri olarak tanımlanabilen ekzositik fushion olaylarını sayın. İlk görüntüyü Görüntü, Ayarla, Eşik ile vurgulayın ve tüm hücre eşik vurgulanana kadar kaydırıcıyı ayarlayın. Ardından Analiz altında, Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve alanı ve ekran etiketini kontrol edin.

Çubuk izleme aracıyla eşikli hücresel alanı ayarlayın ve ölçmek için M'ye basın. Toplanan verileri metin protokolüne göre bir elektronik tabloya aktarın. İki gün in vitro olarak, transfekte edilmemiş nöronları içeren cam tabanlı görüntüleme kabını önceden ısıtılmış nemli bir çevre odasına yerleştirin.

En iyi görüntü kalitesi ve çözünürlüğü için altı DX planlı apokromat 1.4 NA DIC objektif lensi ve yüksek sayısal açıklıklı kondansatör ile donatılmış bir mikroskop kullanın. Daha sonra, iletilen ışık aydınlatması ile oküler aracılığıyla nöronları bulmak için odak düzlemini ayarlayın. Akson dallanmasının DIC görüntülemesi için, soğuk aydınlatmanın uygun şekilde ayarlanması, görüntü optimizasyonu için ayrılmaz bir unsur olacaktır ve analiz edilebilir sonuçlar üretmek için kritik öneme sahiptir.

Ardından, ilgilenilen nöronlar görüş alanı içindeyken, en az altı hücrenin XYZ konumlarını bulmak ve kaydetmek için görüntüleme yazılımındaki çok alanlı toplama işlevini kullanın. Şimdi, hücreleri simüle etmek için mililitre başına 250 nanogram Netrin-1 veya başka bir ilgi faktörü konsantrasyonuna ekleyin ve çok alanlı edinimi başlat'a basın. 24 saat boyunca her 20 saniyede bir sırayla her konumda görüntü elde edin.

Alımı duraklatma ve gerektiğinde yeniden odaklanma. Görüntüleme yazılımı içinde, Uygulamalar'ı seçerek görüntüleri inceleyin, Çok Boyutlu Verileri İnceleyin ve istediğiniz dosyayı açın. Görüntüleme seansı sırasında oluşan kararlı akson dallarını tanımlayın.

Aksonun tabanından ucuna kadar kararlı bir akson dalını ölçmek için izleme bölgesi aracını kullanın. Nöronları Netrin ve botulinum toksini ile tedavi ettikten ve metin protokolüne göre beta-3 tubolin ve aktin için sabitleme ve immün boyama ve immün boyama işleminden sonra. Geniş alanlı epifloresan görüntüleri toplamak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın.

ImageJ'de bir görüntü yığını açın ve dallanmayı manuel olarak analiz etmek için çizgiyi, segmentli çizgiyi kullanın ve sommadan uzanan en uzun nörit olarak tanımlanan aksonu izleyin. Analiz, Araçlar, ROI Yöneticisi ile akson izlemeyi bir ilgi alanı olarak kaydedin. Ardından, uzunluğu 20 mikrometreye eşit veya daha büyük bir nörit olarak tanımlanan her bir akson dalını izleyin ve kaydedin.

Analize yalnızca birincil dalları dahil edin. Burada, SDS'ye dirençli SNARE kompleks testinin tamamlanmasını takiben bir Western lekesi gösterilmektedir. SNAP25, Syntaxin 1A ve VAMP2 için yoklandı.

Kompleks içindeki SNARE proteinleri, tanımlanabilir bir monomer burada gösterilmiştir. Kortikal bir nöronda zamanla meydana gelen bir VAMP2 fluroen aracılı ekzositik olayın bir örneği burada gösterilmiştir. Yakınlaştırılmış iç kısımlar, bu testin uzamsal faydasını gösteren soma, bir akson dalı ve bir aksonal büyüme konisini gösterir.

Daireler, TIRF mikroskobu ile görülebilen tek ekzositik füzyon olaylarını patlatır. Bu zaman atlamalı DIC görüntüleme, gerçek zamanlı olarak Netrin ile uyarılmış bir akson dalının oluşumunu gösterir. Bu konumlar, bir şube bölgesinden ilk çıkıntıyı gösterir.

Bunlar, ana aksondan dal ucuna kadar ölçülen en az 20 mikrometrelik tam olarak oluşturulmuş kararlı dalları temsil eder. Bu deneyde, 3 DIV'deki kortikal nöronlar ya dallanmayı uyaran Netrin-1 ya da SNARE kompleksinin bir bileşeni olan SNAP25'i parçalayan ve ekzositozu bloke eden botulinum A toksini ile tedavi edildi. Sonuçlar, SNARE aracılı ekzositozun Netrin'e bağımlı dallanma için gerekli olduğunu göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, DIC görüntüleme tek bir gece görüntüleme oturumunda tamamlanabilir. Bireysel ekzositik olayların TIRF görüntülemesi 4-5 saat içinde yönetilebilir. SNARE kompleks oluşum biyokimyası protokolü iki saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürleri denerken, hızınızı ayarlamayı ve tek bir adımı aceleye getirmemeyi unutmamak önemlidir. Her prosedür en iyi sonuçlar için dikkat ve sabır gerektirir. Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak için etiketli vezikül bileşenlerinin etiketli aday kargolarla kotransfeksiyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Mesela ekzositik veziküllerin kargosu nedir? Geliştirildikten sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, herhangi bir ayrışmış nöronal kültürde nöritogenez, akson dallanması ve morfojenizdeki diğer aşamaları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, nöronal morfojenizdeki değişikliklere karşılık gelen nöronal ekzositik vezikül füzyon olaylarının uzamsal ve zamansal doğasını nasıl gözlemleyeceğinizi ve ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Botulinum toksini veya yüksek güçlü lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun koruyucu giysiler giymek ve mikroskop güvenlik kilit mekanizması kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.