Tüm Dağı Zebra balığı Embriyolar kirpikli Organları boyanmasına Fosfo-epitoplar

Bu prosedürün genel amacı, zebra balığı embriyosunda aktive olan proteinleri immünolokalize etmektir. Bu yöntem, bütün bir embriyoda fosforile proteinlerin lokalizasyonu ve aktivasyonu gibi gelişimsel ve hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, kalsiyum tarafından aktive edilen proteinleri immün boyayarak bütün bir embriyoda kalsiyuma bağlı sinyalizasyonun lokalize edilebilmesidir.

Metin protokolüne göre yabani tip veya transgenik embriyolar elde edildikten sonra, pigmentasyonu bloke etmek ve istenen gelişim aşamasına kadar inkübe etmek için sistem suyundaki embriyolara %0.003 PTU ekleyin. Embriyolar doğru aşamaya geldiğinde, balığı uyuşturmak için tabağa MESAB ekleyin. Balıklar uyuşturulduktan sonra, mümkün olduğu kadar fazla sistem suyunu alın, ardından taze% 4 PFA ve PBS ekleyin ve oda sıcaklığında üç ila dört saat kuluçkaya yatırın.

İnkübasyondan sonra PFA'yı çıkarın ve yerine %100 metanol kullanın. Daha sonra embriyoları en az 48 saat boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın. İmmün boyamayı gerçekleştirmek için, etiketli 1.5 milimetre mikro santrifüj tüplerine her deney koşulu için en az 10 embriyo yerleştirin.

Embriyolar tüpün dibine yerleştiğinde, metanolü çıkarın ve atın ve embriyoları yeniden nemlendirmek için PBTx'te azalan etanol konsantrasyonlarının aşamalı yıkamalarını kullanın. Son PBTx yıkamasını çıkarın ve PBTx'e 0,5 mililitre% 10 normal keçi serumu veya NGS ekleyin. Ardından, hafifçe sallayarak oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin.

Daha sonra, çözeltiyi çıkarın ve fare anti-asetillenmiş tübülin monoklonal antikoru ve% 10 NGS ve PBTx'in 5'te 1 seyreltilmesinden 0.2 ila 0.5 mililitre ekleyin. Embriyoları gece boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallanarak inkübe edin. Sabahları, antikoru çıkarın ve atın ve her biri beş dakika boyunca hafifçe sallanarak 0.5 mililitre% 2 NGS ve PBTx kullanarak üç yıkama yapın.

Tepe ışıklarını kısın ve% 10 NGS ve PBTx'te floresan konjuge ikincil antikorun 500'de 1 seyreltilmesinin her bir örneğine 500 mikrolitre ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında hafif sallanma ile dört saat inkübe edin. Kuluçkadan sonra embriyoları üç kez yıkayın.

Ko-immünostain için, 20'de 1 oranında bir anti-fosfo CaMKII antikoru seyreltmesi ekleyin. Gece boyunca hafifçe sallanarak karanlıkta kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, embriyoları üç kez% 2 NGS ve PBTx ile yıkadıktan sonra, kırmızı 568 floresan konjuge keçi tavşan önleyici IgG ve% 10 NGS ve PBTx'in 5'te 1'i oranında seyreltme ekleyin.

Karanlıkta oda sıcaklığında dört saat inkübe ettikten sonra, embriyoları üç kez yıkayın ve görüntüleme işlemine bağlı olarak PBTx veya% 50 gliserol içinde PBS'de saklayın. Embriyoları görüntüleme için monte etmek için, bir ila beş embriyoyu bir cam slayt üzerine yerleştirin. Bir oda oluşturmak için balığın her iki tarafında dört adet bir numaralı yığılmış örtü fişi parçası kullanın.

Ve üstüne bir kapak fişi yerleştirin. 100X yağa daldırma lensi ve iletilen ışık ile tek bir embriyoyu odak noktasına getirir. Işığı kapat.

Konfokal mikroskobu uygun lazerlerle açın ve uzak odaklamayı devreye alın. Konfokal programı açın ve edinme çubuğunda uygun hedefi seçin. Ardından, XY temel çubuğunda, görüntü boyutunu ayarlamak için 1024 düğmesine tıklayın.

Lazer ve dedektör çubuğunda, her kanal için lazer dedektörünü açmak için kırmızı 488 ve yeşil 568 kutularına tıklayın ve iğne deliğini orta seviyeye ayarlayın. Ardından, kazanç çubuğunda, görselleştirmek için her kanalın kazancını ayarlayın. Ardından, edinme ayarları çubuğunda, görüntüleri almaya başlamak için canlı'ya tıklayın.

Görünüm ayarları çubuğunda, canlı pencerede ortalamak için integral yakınlaştırmayı zorla kutusunun işaretini kaldırın. Z sekmesinin altındaki ayarları alma çubuğunda, görüntünün katmanları arasında ilerleyin. Görüntüye dahil edilecek katman sayısını seçtikten sonra, Z düzleminin merkezinde bir noktaya gidin.

Z sekmesinin altında, küçük kırmızı referans kutusuna tıklayın. Bu, RFA'yı merkez olarak seçilen noktada sıfırlayacaktır. Adım boyutu etiketli kutuda, katmanların kalınlığını seçin.

Dosya boyutu kutusuna dikkat edin ve dosyaları bir gigabayt ile sınırlamaya çalışın. Görüntünün en üst uç noktasını bulmak için, üst kısmın yanındaki daireyi tıklayın ve Z katmanları arasında hareket edin. Şimdi alttaki daireye tıklayın ve bilgisayar görüntüyü merkez olarak katmana geri götürecektir.

Ardından, edinme ayarları kutusunda, lazer alımını durdurmak için tekrar canlı'ya tıklayın. Bu panelde, ortalama ve Z yığını etiketli kırmızı kutuları tıklayın. Bu kutular yeşile dönecektir.

Ayarları al kutusunda, tüm görüntü serisini almak için tek tek seçeneğini tıklatın. Her iki kanalda ve tüm Z yığınında tarama yaparken ilerlemeyi izleyin. Kaydetmek için birim penceresine tıklayın ve farklı kaydet'e tıklayın ve dosyayı adlandırın.

Dosyayı hacim olarak oluşturmak için, Z yığını hala açıkken veri açılır menüsünü seçin ve hacim oluşturmaya tıklayın. Oluşturulan dosyayı bir nokta tif dosyası olarak kaydedin. Bu şekil, zebra balığı Kuppfer'in vezikülü veya KV'deki kirpikler için standart bir belirteç olan P-CaMKII ve asetillenmiş tübülin için immün boyamayı göstermektedir. Birincil kirpiklerin beslenmesi, dairesel bir sıvı akışı oluşturur, bu da KV'yi kaplayan kirpikli hücrelerde kalsiyumun yükselmesine ve burada görüldüğü gibi ayrı yerlerde CaMKII'nin aktivasyonuna yol açar.

Bu rakamlar, döllenmeden veya HPF'den 24 ila 72 saat sonra perinefrik kanalların belirli bölgelerini kaplayan kirpikli hücrelerin apikal yüzeyinde göründüğü gibi P-CaMKII'yi göstermektedir. Gelişimin bir gününde, PFA ve metanol ile sabitlenmiş zebra balığı embriyonik kulağı yapılarını korur ve tabanda ve kinosilum uzunluğu boyunca CaMKII lekelenmesinin tespit edilmesini sağlar. 72 HPF'de, iç kulak Alexa 488 phalloidin ve Alexa 568 ile anti-asetillenmiş tübülin ile boyandı.

PFA metanol fiksasyonu hem F-aktin hem de tübülini korudu. Bu 30 HPF balığı, metanol fiksasyonu ile kaybedilecek olan zar hedefli bir GFP'yi ifade etti. PFA fiksasyonu, PFA ve metanol ile fiksasyona kıyasla P-CaMKII sinyalinin azalmasına neden oldu.

Bununla birlikte, gelişimin bu aşamasında, sinyal metanol olmadan tespit edilebilecek kadar güçlüdür. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, taze embriyolar ve taze serbest ajanlar kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı embriyolarında fosfoproteinlerin nasıl lokalize edileceğini iyi anlamış olmalısınız.