Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Bu deneyin genel amacı, toplam iç yansıma, yapılandırılmış aydınlatma görüntüleme veya çim simülasyonu ile elde edildikten sonra görüntü korelasyon spektroskopisi ile kortikal aktin dinamiklerini ölçmektir. Bu yöntem, immünolojik sinapstaki etkileşimleri düzenlemede kortikal aktin akışının ne gibi bir rolü olduğu gibi biyofiziksel alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniğin temel avantajı, nanometre ölçeğinde çözünürlüğü yaşam tarzı uyumluluğu ile birleştirerek, geleneksel örnek mikroskopi tekniklerine kıyasla daha küçük ölçekli süreçlerin gözlemlenmesine ve analiz edilmesine olanak sağlamasıdır.

Bu tekniği göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan George Ashdown olacak. Bir test numunesi için, 100 nanometre çapında bir alt kırınım floresan mikroküre stok çözeltisinden beş mikrolitreyi yeni kaplanmamış bir kapak astarının yüzeyine ekleyin. Daha sonra mikroküre solüsyonunu bir pipet ucu ile kapak fişinin üzerine yayın ve kurumasını bekleyin.

Görüntülemenin başlamasına hazırlanmak için test kapağı kızağına 200 mikrolitre montaj ortamı ekleyin, çim SIM sisteminin sahne ısıtıcısı için inkübatörü açın ve ısıtma elemanının tabanını tamamen kaplamak için rezervuarı damıtılmış suyla doldurun. Suyun 37 santigrat dereceye kadar dengelenmesine izin verin. Isıtma bileziğini objektif merceğe bağlayın ve 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Ardından, doğru optik yolun devreye girdiğinden emin olmak için çim 4 88 uyumlu derecelendirme bloğunu mikroskobun ışık yoluna sabitleyin. Lazer yatağındaki kanal modunu tek konuma getirin. Mikroskop tablasındaki fiber kablo için bu işlemi tekrarlayın.

Bu adımlar gerçekleştirilmezse yazılım penceresinde bir hata görmeyi bekleyin. Modu ayarladıktan sonra, hedefi en düşük Z düzlemine indirin ve üzerine bir damla yağ koyun. Test numunesi kapak fişini floresan mikro küreciklerle birlikte mikroskop tablasına yerleştirin.

Ardından mikroskop gövdesinde mükemmel odak sistemini veya PFS işlevini seçin. Hedefi Z düzlemi boyunca kademeli olarak yukarı hareket ettirin ve PFS düğmesinin yanıp sönmesi durduğunda durun, bu da kontrol yazılımında odak düzlemine ulaşıldığını gösterir. Mikro kürecikleri ekranda görüntülemek için canlı görüntüye geçin.

PFS mikro manipülatör çarkını kullanarak odakta ince ayarlamalar yapın. 75 nanometre koku dalgasının üzerinde odak dışı floresan gönderimi olmadan tek tip aydınlatmayı gözlemleyin. Son olarak, T hücresi stimülasyonu için floresan mikroküre örneğinden dalgalanan bir aydınlatma modelini gözlemleyerek yapılandırılmış aydınlatmanın elde edildiğini doğrulayın.

200 mikrolitre anti CD üç ve anti CD 28 antikor karışımı ile kapak fişini iyice örtün ve kapak fişini 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Kapak fişini metin protokolünde anlatıldığı gibi yıkadıktan sonra, mikroskop tablasına yerleştirin ve ardından çim odak düzlemini bulun. Daha sonra, 200 mikrolitre transfekte edilmiş T hücresini kapak kaymasındaki oyuklardan birine nazikçe pipetleyin.

GFP aktin transfekte edilmiş hücreleri kapak kızağına inerken izlemek için epi floresan kullanın. Hücreler yerleştikten sonra, N SimPad'i kullanarak canlı moda geçin ve monitördeki hücrelerin odakta olup olmadığını kontrol edin. Bir zaman seyrini kaydetmek için ND edinme penceresini açın ve zaman sekmesini seçin.

Ardından ekle'ye tıklayın ve aralığı gecikme olmayacak şekilde ayarlayın. Süreyi 10 dakika olarak ayarlayın. Son olarak, ND alma penceresinde Şimdi çalıştır'ı seçerek verileri kaydetmeye başlayın.

Görüntüleri yeniden oluşturmak için önce doğru analiz modülünü içeren analiz yazılımını açın. Uygulamalara tıklayın ve ardından bitiş sim penceresini göster'i seçin. Aydınlatma modülasyonunu, kontrastı ve yüksek çözünürlüklü gürültü bastırmayı bir olarak ayarlayın ve görüntü durum çubuğundan eksiksiz bir SIM görüntüsü oluşturmak için çim SIM veri setini yeniden oluşturun.

Piksel boyutunun 30 nanometre olduğunu onaylayın ve ardından verileri çubuk analizi için TIF dosyaları olarak dışa aktarın. Sticks MATLAB yazılım paketini indirip çıkardıktan sonra komut dosyasını açın. Ardından, hareketsiz kaldırma filtresi için metin protokolünde belirtildiği gibi giriş parametrelerini tanımlayın.

23. satırda, filtreleme parametresini hareketli ortalama olarak ayarlayın ve 24. satırda, bir vektör haritası oluşturmak için ortalama hareket parametresi olarak 21'i kullanın. 31. satırdaki zamansal alt bölgeyi maksimum kare sayısına ayarlayın, bu durumda 63. Ardından 32. satırda, zamansal kaymayı 33 ile 35 arasındaki satırlarda bire ayarlayın.

Çıktı dosyalarının adlarını, çıktı vektör haritalarının başlıklarını ve çıktı dizini yolunu girin. Ardından, vektör harita görüntülerinin kaydedilmesi gereken formatı tanımlayın. Bu durumda, png.

MATLAB düzenleyicisi penceresinde komut dosyasını açın. Bir kanal çubuğu çalıştırın ve komut dosyasının birden 23'e kadar olan satırlarını çalıştırarak görüntü serisini yükleyin. Sonraki çalıştırma 29'dan 35'e kadar olan satırlar bir kanal çubuklarını çalıştırır.

Çubuk analizini başlatmak için istemi izleyin ve istenirse bir ilgi alanı veya yatırım getirisi tanımlamak için bir çokgen seçin. Vektör haritalarını görüntülemek için 38'den 52'ye kadar olan satırları çalıştırın. Ardından, burada gösterilen hız büyüklüğü histogramını çizmek için 53'ten 72'ye kadar olan satırları çalıştırın, çim sim protokolü ile görüntülenen, F aktin etiketli GFP'yi ifade eden bir OT T hücresidir.

Bu hücrenin, immünolojik sinapsların oluşumunu uyarmak için anti CD üç ve anti CD 28 antikorları ile kaplanmış bir kapak astarına sokulmasından beş dakika sonra metinde tartışılmıştır. F aktinin moleküler akışının görselleştirilebilmesi için bir zaman seyri alındı. Bu verilerin bu çubuk programı kullanılarak daha sonraki analizi, sinaps çevresinin bir bölümünü temsil eden soldaki hücrenin kutulu bölgesine karşılık gelen bu vektör haritasında gösterildiği gibi F aktin moleküler akışının nicelleştirilmesini sağladı.

Bu haritanın ve T hücresi alt bölgesinin daha da büyütülmesi, vektör uzunluğundan ve renk kodundan belirlenebilen aktin akış yönlülüğünü ve hızını netleştirir Hız verileri, istatistiksel analize izin veren bir histogramda da çizilebilir. Toplu olarak, bu sonuçlar immünolojik sinapsta F aktinin çevreden hücre merkezine doğru simetrik bir şekilde aktığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, verilerde ts'yi nasıl elde edeceğiniz ve görüntü korelasyon spektroskopisini kullanarak kortikal aktin dinamiklerini nasıl analiz edeceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Bu yöntem, T hücresi göçü sırasında aktin akışı hakkında bilgi edinmek için kullanılabilse de, hücre göçü gibi moleküler akışın önemli olduğu düşünülen diğer sistemlerde de kullanılabilir.