Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Bu deneyin genel amacı, total internal yansıma, yapılandırılmış aydınlatma görüntülemesi veya turf sim ile elde edilen görüntüler sonrası görüntü korelasyon spektroskopisi kullanarak kortikal aktin dinamiklerini nicelleştirmektir. Bu yöntem, kortikal aktin akışının immünolojik sinapstaki etkileşimleri düzenlemede ne tür bir rol oynadığı gibi biyofizik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniğin temel avantajı, nanometre ölçekli çözünürlüğü canlı hücre uyumluluğu ile birleştirerek, geleneksel anlık görüntüleme tekniklerine kıyasla daha küçük ölçekli süreçlerin gözlemlenmesine ve analiz edilmesine olanak sağlamasıdır.

Bu tekniği, laboratuvarımdan doktora öğrencisi George Ashdown uygulamalı olarak gösterecek. Test örneği için, 100 nanometre çapında bir difraksiyon altı floresan mikroküre stok çözeltisinden beş mikrolitreyi, kaplanmamış taze bir lam üzerine ekleyin. Ardından, mikroküre çözeltisini bir pipet ucuyla lam üzerine yayın ve kurumasını bekleyin.

Görüntüleme hazırlığı için test lameline 200 µL montaj medyumu ekleyin; ardından Turf SIM sisteminin tabla ısıtıcısı için inkübatörü açın ve ısıtma elemanının tabanını tamamen kapatacak şekilde rezervuarı distile su ile doldurun. Suyun 37 °C'ye dengelenmesini bekleyin. Isıtma halkasını objektife bağlayın ve 37 °C'ye ayarlayın.

Ardından, doğru optik yolun devreye girdiğinden emin olmak için turf 4 88 uyumlu derecelendirme bloğunu mikroskobun ışık yoluna sabitleyin. Lazer yatağındaki kanal modunu tekli konuma getirin. Bu işlemi mikroskop tablasındaki fiber kablo için de tekrarlayın.

Bu adımlar gerçekleştirilmezse yazılım penceresinde bir hatale karşılaşmanız beklenir. Modu ayarladıktan sonra objektifi en düşük Z düzlemine indirin ve üzerine bir damla yağ damlatın. Floresan mikrokürelerin bulunduğu test örneği lamını mikroskop tablasına yerleştirin.

Ardından, mikroskop gövdesindeki mükemmel odaklama sistemini veya PFS fonksiyonunu seçin. Objektifi Z düzlemi boyunca kademeli olarak yukarı hareket ettirin ve PFS düğmesi yanıp sönmeyi bıraktığında durun; bu, kontrol yazılımında odak düzlemine ulaşıldığını gösterir. Ekrandaki mikroküreleri görüntülemek için canlı görünüme geçin.

PFS mikro manipülatör tekerleğini kullanarak odakta ince ayarlamalar yapın. 75 nanometre dalga boyunun üzerinde, odak dışı floresan yayılımı olmayan homojen bir aydınlatma gözlemleyin. Son olarak, floresan mikroküre örneğinden gelen dalgalı bir aydınlatma deseni gözlemleyerek yapılandırılmış aydınlatmanın sağlandığını doğrulayın.

Lamel üzerine 200 µL anti-CD3 ve anti-CD28 antikor karışımı ekleyin ve lameli 37 °C'de iki saat inkübe edin. Lameli metin protokolünde açıklandığı gibi yıkadıktan sonra mikroskop tablasına yerleştirin ve ardından odak düzlemini bulun. Ardından, 200 µL transfekte T hücresini lameldeki kuyucuklardan birine nazikçe pipetleyin.

GFP aktin transfekte edilmiş hücrelerin lamel üzerine çökmelerini takip etmek için epi floresans kullanın. Hücreler yerleştikten sonra, N SimPad kullanarak canlı moduna geçin ve monitördeki hücrelerin odakta olduğunu kontrol edin. Bir zaman serisi kaydetmek için, ND görüntüleme penceresini açın ve zaman sekmesini seçin.

Ardından ekle'ye tıklayın ve aralığı gecikmesiz olarak ayarlayın. Süreyi 10 dakika olarak belirleyin. Son olarak, ND veri toplama penceresinde Şimdi çalıştır'ı seçerek veri kaydını başlatın.

Görüntüleri yeniden oluşturmak için öncelikle doğru analiz modülünü içeren analiz yazılımını açın. Uygulamalara (applications) tıklayın ve ardından "show end sim" penceresini seçin. Aydınlatma modülasyon kontrastını ve yüksek çözünürlüklü gürültü bastırmayı bir olarak ayarlayın ve görüntü durum çubuğundan eksiksiz bir SIM görüntüsü üretmek için turf SIM veri setini yeniden oluşturun.

Piksel boyutunun 30 nanometre olduğunu onaylayın ve ardından verileri çubuk analizi için TIF dosyaları olarak dışa aktarın. Sticks MATLAB yazılım paketini indirip çıkardıktan sonra betiği açın. Ardından, hareketsiz kaldırma filtresi için metin protokolünde belirtilen giriş parametrelerini tanımlayın.

23. satırda, filtreleme parametresini hareketli ortalamaya ayarlayın ve tek bir vektör haritası oluşturmak için 24. satırda hareketli ortalama parametresi olarak 21'i kullanın. 31. satırdaki zamansal alt bölgeyi, bu durum için maksimum kare sayısı olan 63'e ayarlayın. Ardından 32. satırda zamansal kaymayı bire, 33 ile 35. satırlar arasında ise buna uygun şekilde ayarlayın.

Çıktı dosyalarının adlarını, çıktı vektör haritalarının başlıklarını ve çıktı dizin yolunu girin. Ardından, vektör haritası görüntülerinin kaydedileceği formatı tanımlayın. Bu durumda, png.

MATLAB düzenleyici penceresinde betiği açın. Betiğin 1 ile 23. satırlarını çalıştırarak run one channel sticks'i çalıştırın ve görüntü serisini yükleyin. Ardından, run one channel sticks'in 29 ile 35. satırlarını çalıştırın.

Çubuk analizini başlatmak için istemleri takip edin ve isteğe bağlı olarak bir ilgi alanı veya ROI tanımlamak için bir poligon seçin. Vektör haritalarını görüntülemek için 38 ile 52 arasındaki satırları çalıştırın. Ardından, hız büyüklüğü histogramını çizdirmek için 53 ile 72 arasındaki satırları çalıştırın; burada gösterilen, turf sim protokolü ile görüntülenmiş, GFP etiketli F aktin eksprese eden bir OT T-hücresidir.

İmmünolojik sinaps oluşumunu stimüle etmek amacıyla anti CD3 ve anti CD28 antikorları ile kaplanmış bir lamel üzerine yerleştirilmesinin beş dakika sonrası metinde tartışılmıştır. F-aktin moleküler akışının görselleştirilebilmesi için hücreden bir zaman serisi alınmıştır. Bu verilerin this sticks programı kullanılarak yapılan sonraki analizi, soldaki hücrenin kutu içine alınmış bölgesiyle (sinaps periferisinin bir kısmını temsil eder) karşılık gelen bu vektör haritasında gösterildiği üzere F-aktin moleküler akışının kantifikasyonunu sağlamıştır.

Bu haritanın ve T hücresi alt bölgesinin daha fazla büyütülmesi, vektör uzunluğunun yanı sıra renk kodundan da belirlenebilen aktin akış yönelimini ve hızını netleştirir. Hız verileri, istatistiksel analize olanak tanıyan bir histogramda da çizdirilebilir. Toplu olarak bu sonuçlar, immünolojik sinapsta F aktinin çevreden hücre merkezine doğru simetrik bir şekilde aktığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, görüntü korelasyon spektroskopisi kullanarak nasıl zaman serisi verileri elde edileceği ve kortikal aktin dinamiklerinin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Bu yöntem, T-hücresi migrasyonu sırasında aktin akışına dair bilgi edinmek için kullanılabileceği gibi, hücre migrasyonu gibi moleküler akışın önemli olduğu düşünülen diğer sistemlerde de kullanılabilir.