Transcriptome Profil In-vivo Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Bu videonun genel amacı, yedinci gün sığır embriyolarından düşük miktarda toplam RNA kullanarak iki renkli, özel yapım bir sığır dizisi kullanarak optimize edilmiş bir teknik prosedür sağlamaktır. Bu yöntem, yüksek verimli süt ineklerinde embriyonik kayıp ile ilgili temel soruları ve implantasyondan önce gelişmekte olan embriyodaki gen ekspresyonuna göre embriyonik kalite ile ilgili soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, tek embriyolardan ekstrakte edilen toplam RNA'nın pikogram seviyesini kullanarak gen ekspresyonunu inceleyebilmemizdir.

Bu yöntem, in vivo üretilen sığır implantasyon öncesi embriyoların sağkalımını etkileyen faktör hakkında fikir verebilir. Bu aynı zamanda in vitro embriyo üretimleri gibi üreme teknolojilerinin geliştirilmesine de yardımcı olabilir. Prosedüre başlamak için, kolon bazlı bir piko ölçekli RNA ekstraksiyon kitinden bir mikrosantrifüj tüpünde donmuş sığır embriyolarını hazırlayın.

Tüpe 10 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve embriyoları 30 dakika boyunca 42 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, tüpü 800 kez G.Pipette 250 mikrolitre şartlandırma tamponunda iki dakika boyunca saflaştırma sütunu filtre membranına santrifüjleyin ve sütunu oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Kolonu ön koşullandırmayı bitirmek için toplama tüpünü bir dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjleyin.

Lizis tamponu ve embriyo karışımına 10 mikrolitre% 70 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, karışımı arıtma kolonuna yükleyin. Kolonu iki dakika boyunca 100 kez G'de ve daha sonra 30 saniye boyunca 16.000 kez G'de santrifüjleyin.

Kolona 100 mikrolitre ilk yıkama tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca 8.000 kez G'de santrifüjleyin. Bir DNase kiti kullanarak, beş mikrolitre stok çözeltisini 35 mikrolitre tamponla karıştırın ve kapalı tüpü hafifçe ters çevirerek karıştırın. Daha sonra DNase karışımını saflaştırma kolonu membranına yükleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Kolona 40 mikrolitre ilk yıkama tamponu ekleyin ve 15 saniye boyunca 8.000 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, ikinci yıkama tamponundan 100 mikrolitre ekleyin ve bir dakika santrifüjleyin. İkinci yıkama tamponunun başka bir kısmını kolona ekleyin ve 16.000 kez G'de iki dakika santrifüjleyin. Saflaştırma kolonunu başka bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve kolon membranına 11 mikrolitre elüsyon tamponu yükleyin.

Sütunu oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin. Sütunu 1.000 kez G'de bir dakika ve ardından 16.000 kez G'de bir dakika daha santrifüjleyin. Bir amplifikasyon kiti kullanarak, 100 pikogram yüksek kaliteli RNA'yı amplifiye edin.

Floresan bazlı kantitasyon ile amplifiye edilmiş aRNA'nın boyut aralığını değerlendirin. Ardından, spektrofotometri ile aRNA konsantrasyonunu belirleyin. Standart bir kit ile floresan etiketleme için iki mikrogram amplifiye edilmiş aRNA hazırlayın.

Karanlık odada bir ozon kutusu kurun ve ozon seviyesi milyonda 0,001 parçaya düşene kadar bekleyin. Işığın üzerine bir karanlık oda filtresi yerleştirin. Daha sonra numuneyi ozon kutusuna getirin ve her birine iki mikrolitre siyanin beş boya ve etiketleme tamponu ekleyin.

Numune güvenli bir ışık altındayken, toplam 20 mikrolitre hacim elde etmek için RNaz içermeyen su ekleyin. Numuneyi nazikçe karıştırın ve ardından tüpü 85 santigrat derecede bir termosiklerde 15 dakika inkübe edin. Numuneyi buz üzerinde bir dakika soğutun ve ardından numuneyi aşağı doğru döndürün.

Etiketli ve güçlendirilmiş aRNA'yı bir RNA ekstraksiyon kiti ile temizleyin. Uygun spektrometre tipini kullanarak, etiketli, amplifiye edilmiş aRNA konsantrasyonunu belirleyin. Siyanin üç boya ile etiketlenmiş ikinci bir amplifiye aRNA numunesi hazırlayın.

aRNA örneklerini eksi 80 santigrat derecede üç güne kadar saklayın. Her biri 825 nanogram Cy3 ve 5 etiketli aRNA'yı birleştirin. Buna engelleme tamponunu ve parçalanma tamponunu ekleyin.

Karışımı 60 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin ve ardından bir dakika buz üzerinde soğutun. 55 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin ve hava kabarcıkları oluşturmadan iyice karıştırın. Karışımı bir dakika boyunca 11.300 kez G'de santrifüjleyin.

Dizi slaytına 100 mikrolitre numune yükleyin ve slaytı hibridizasyon odasında kapatın. Numuneyi dakikada 10 dönüşte döndürürken 65 santigrat derecede 17 saat boyunca hibritleştirin. Ozon temizleyici, stabilize edici ve kurutma solüsyonu hazırlayın.

Ozon maruziyetini en aza indirmek için önlemler alarak dizileri yıkayın ve ardından 30 saniye boyunca dengeleyici ve kurutma solüsyonuna daldırın. Dizi yüzeyinin kuru ve tozsuz olduğundan emin olun. Dizileri karanlık bir yerde saklayın.

Mikrodizi tarayıcıyı açın ve taramaya hazır olana kadar bekleyin. Ardından, barkodu sola gelecek şekilde diziyi yükleyin. Nokta analizi yapın ve verileri bir GPR dosyası olarak kaydedin.

İstatistiksel analiz yazılımında verileri normalleştirin ve analiz edin. Pozitif nokta seçim eşiğini hesaplayın ve hibritleştirilmiş ve arka plan sinyallerinin grafiğini görüntüleyin. Dizi içinde bir Loess normalleştirmesi ve ardından diziler arasında bir nicelik normalleştirmesi gerçekleştirin.

Normalleştirilmiş verileri bir elektronik tablo dosyasına aktarın. Seçilen benzersiz genlerin bir kimlik listesini oluşturmak için bir mikrodizi veri deposundaki tüm pozitif sinyalleri kullanın. Kimlik listesini bir protein sınıflandırma ve analiz veritabanına yükleyin, organizma olarak bos taurus'u seçin ve varsayılan bir istatistiksel aşırı temsil testi gerçekleştirin.

İki turlu amplifikasyondan sonra, parçalar boyut olarak çok benzer ve iyi kalitededir. Bu yöntemle başarılı amplifikasyon, aRNA'da en az bin kat artış sağlamalıdır. Yüksek kaliteli bir mikrodizi görüntü, her iki kanalda da yüksek nokta yoğunluğuna ve düşük arka plan yoğunluğuna sahiptir.

Arka plan yoğunluğu çok yüksekse, sinyal çözünürlüğü düşük olacaktır. Lekelerin yaklaşık% 46'sı arka planın üzerindeydi ve blastosistte ifade edilen 6.765 benzersiz RNA transkripti izole edildi. İstatistiksel bir aşırı temsil testi, ilk 10 gen ontolojisi teriminin aktif hücresel bölünme süreçlerini temsil ettiğini gösterdi.

Bu tekniğin geliştirilmesi, hayvan üremesi alanındaki araştırmacıların embriyonik gen ekspresyonunu keşfetmelerine ve çeşitli faktörlerin gelişmekte olan embriyoyu nasıl etkilediğini değerlendirmelerine izin vermiştir. Bu teknik, domuz gibi diğer önemli türlerde de geliştirilmiştir. Bu prosedürü takiben, mikrodizi sonuçlarını doğrulamak için kantitatif PCR gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, embriyolardan RNA'nın nasıl çıkarılacağının yanı sıra iki renkli mikrodizi analizi yapmak için RNA'nın nasıl çoğaltılacağı ve etiketleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.