Name: Transcriptome Profil In-vivo Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin, iki renkli özel yapım sığır mikroarray ile düşük RNA miktarında gün yedi sığır embriyolarında gen ifadesi profillemesini. Bu yöntem, embriyo kalitesi ve hayatta kalma faktörleri hakkında bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Alberta Hayvancılık ve Et Ajansı, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Süt ve Hayvancılık Araştırma Şubesi, Alberta Tarım ve Ormancılık tarafından desteklenen araştırma.

Bu çalışmanın hayvan parçası Alberta Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından tüm hayvan deney prosedürleri onaylı (Protokol # AUP00000131) ile, Alberta, Edmonton, Kanada Üniversitesi Metabolik Araştırma Birimi&#39;nde yürütülen ve hayvanlar göre bakım için Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi (1993). 1. Embriyo Üretim, Toplam RNA ve DNaz Tedavi İzolasyonu <ol><li> Hayvan deneysel protokollerin ve embriyo toplama önceki yayınlarda 17, 18&#39;de başvurun. </li><li> Havuz ve sıvı azot içinde her ineğin benzer sahne embriyoların dondurularak ek ve daha sonra RNA ekstraksiyonu kadar -80 ° C tutun. </li><li> (Kit bilgisi Malzeme Listesinde mevcut) piko ölçekli örneklerinden RNA ayıklamak sağlayan bir sütun tabanlı RNA ekstraksiyon kiti sayesinde toplam RNA ayıklayın. NOT: Tavsiye edilen kit içerir: Klima Buffer, Ekstraksiyon tamponfer,% 70 Etanol, yıkama tampon çözeltisi 1, Yıkama Tamponu 2, elüsyon tamponu, toplama tüpleri ve mikrosantrifüj tüpleri RNA saflaştırma sütunlar. </li><li> Tüp içeren embriyo 10 ul ekstraksiyon tampon ekleyin ve 42 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. 2 dakika boyunca 800 xg&#39;de santrifüj tüpü mikrosantrifüj tüp içine hücre ekstresi toplamak için. </li><li> arıtma sütun filtresi zar üzerine 250 ul Klima Buffer Pipet. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Tertibatı Tamponu ile RNA saflaştırma sütunu inkübe edin. 1 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de toplama tüpü arıtma sütun santrifüjleyin. </li><li> Pipet RNA ekstraksiyon tampon maddesinin ve embriyo karışımına% 70 Etanol 10 uL. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. şartlandırılarak arıtma sütuna Pipet karışımı. </li><li> 100 x g&#39;de 2 dakika süre ile RNA, santrifüj saflaştırma kolona bağlanacağı hemen akışı çıkarmak için 30 saniye süreyle 16,000 xg&#39;de santrifüj uygulayın. </li><li> pipet 10081; 8000 x g, 1 dakika için arıtma kolonu ve santrifüj içine yıkama tampon çözeltisi 1 L. NOT: DNaz tedavi RNA izolasyonu sonrası ters transkripsiyon veya çoğaltım işlemi ise tavsiye edilir. </li><li> Sağ adım 1.8 sonra genomik DNA sindiremez. NOT: Önerilen DNaz kiti Malzeme Listesinde mevcuttur. Önerilen kit içerir: DNaz I stok solüsyonu ve Buffer. </li><li> 35 ul tampon, 5 uL DNaz I stok solüsyonu karıştırılarak DNaz inkübasyon karışım hazırlayın. yavaşça ters çevirerek karıştırın. </li><li> saflaştırma kolonudur zarı içine, doğrudan 40 uL DNase inkübasyon karışımı pipetle. 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Pipet 40 mcL Yıkama arıtma sütun zarı içine Tampon 1 ve daha sonra 15 saniye süreyle 8,000 xg&#39;de santrifüj. </li><li> 8,000 x g&#39;de 1 dakika için arıtma kolonu ve santrifüj içine pipetle 100 uL yıkama tampon çözeltisi 2. </li><li> saflaştırma kolonudur ve santrifüj içine bir 100 uL yıkama tamponu 2 Pipet16,000 x g&#39;de 2 dakika süre ile. </li><li> Yeni bir 0.5 mL mikrosantrifüj tüpüne saflaştırma sütunu aktarın. doğrudan arıtma sütunun zar üzerine Seyreltme Tampon Pipet 11 mcL. elüsyon tamponu dağıtım sırasında membran içine, Seyreltme Tampon maddesi maksimum absorpsiyonu garantilemek üzere, hafifçe membran yüzeyine pipet ucu dokunun. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca sütun inkübe edin. sütununda, Seyreltme Tampon maddesi dağıtma 1000 xg&#39;de 1 dakika için sütun santrifüj ve ardından RNA elüte etmek için 16,000 x g&#39;de 1 dakika boyunca dönerler. </li><li> RNA kalitesini ve miktarını 19 değerlendirmek için üreticinin talimatlarına göre Bioanalyzer alet kullanın. </li><li> kullanılana kadar -80 ° C&#39;de RNA numunesi saklayın. </li></ol> 2. Mikroarray Analizi RNA Amplifikasyon ve Etiketleme NOT: RNA amplifikasyonu ve etiketleme işlemleri ile çalışan ilk kez kullanıcı için, RNA alo başak-beş ng kullanımıGerçek Arna örnekleri ile ng RNA amplifikasyonu ve melezleşme kalite kontrol ölçümü izlemek için. Başak RNA karışımı önceden belirlenen oranlarda on nitro sentezlendi, poliadenile transkript içerir. Prosedür düzgün yapıldığında, etiketli transkript özellikle dizilerde tamamlayıcı kontrol sondaları sadece melezleşme ve veri asgari öz- veya çapraz melezleşme ile kalite kontrol güvencesi izlemek için taranabilir. Dizi ve veri analizi taradıktan sonra, kontrol şiddetleri içinde-çivili ve normalizasyon prosedürü ile ilgili daha fazla detay açıklama önceki yayınlarda 20, 21 bölümüne bakınız. Aşağıdaki yordam rutin mikroarray kullanıcılara verilir. <ol><li> 11 uL - 10 toplam hacmi 100 pg kaliteli RNA örnek (RNA Bütünlük sayısı (RIN) değeri en az&gt; 7.0) hazırlayın. </li><li> amplifikasyon kiti edememek RNA örnekleri artırın(Küçük pg 100 gibi), piko ölçekli örnekleri ile çalışır. NOT: Tavsiye edilen amplifikasyon kiti bilgisi Malzeme Listesinde mevcuttur ve herhangi bir değişiklik yapılmadan üreticinin talimatlarına uyar. </li><li> amplifiye Arna büyüklüğü aralığındaki profilini değerlendirmek için bir floresan bazlı kantitatif kullanın. </li><li> amplifiye Arna konsantrasyonunu ölçmek için (260 ve 280 nm &#39;de absorbans göre) spektrofotometre cihazı kullanın. </li><li> Etiketleme için hazır olana kadar -80 ° C &#39;de büyütülmüş ARNA saklayın. </li><li> ULS Arna etiketleme kiti kullanım kılavuzuna göre floresan etiketleme için güçlendirilmiş RNA 2 ug kullanın. Not: 647 boya kolayca ozon tarafından parçalanır foto-degradasyon ve Siyanin 647 boya duyarlı siyanin 547 ve siyanin için, etiketleme prosedürü ışık az miktarda ve bir ozon içermeyen ortamda gerçekleşir. </li><li> Ozon seviyesi kadar ozon kutusuna (Şekil 1A) açın 0.001 ppm. </li><li&gt; siyanin 547 veya siyanin 647, etiketleme tamponu 2 uL 2 ul ekleyerek ozon kutusuna (Şekil 1B) içindeki tepkime setup fazlası, ve daha sonra Karanlıkodanızda altında RNaz içermeyen su ile 20 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar ayarlayın. ışık kaynağına karanlık oda filtre ekleyin. </li><li> İyice karıştırın ve 15 dakika boyunca 85 ° C &#39;de bir PCR inkübe edin. en az 1 dakika boyunca buz üzerinde Örnekleri. Cy-boya etiketli güçlendirilmiş RNA temizlemek için, (1,9 ila 1.11) DNaz tedavi ile ilgili adımlar dışında, RNA ekstraksiyon kiti ile devam etmeden önce tüplerin içeriğini toplamak için aşağı doğru döndürün. </li><li> ölçülmesi ve etiketli büyütülmüş RNA&#39;nın konsantrasyonu belirlemek ve kullanımdan önce 3 gün -80 ° C&#39;de en fazla etiketli ARNA tutmak için spektrofotometre cihazı kullanın. </li></ol> 3. Mikroarray Hibridizasyon ve yıkama Not: Aşağıdaki önemli adımlar İki renkli Microarray- tabanlı Gen İfadesi Analizi Protokolüne göre adapte edilir (versiyon6.5, Mayıs 2010). <ol><li> Her cyanine 547- ve Siyanin 647 etiketli Arna ng 825 eşit miktarda ekleyin ve 25x parçalanma ve 10x engelleme tampon ile karıştırın. </li><li> 15 dakika boyunca 60 ° C&#39;de ısıtın ve 1 dakika boyunca buz üzerinde soğutulur. </li><li> 2x hibridizasyon tamponu eşit miktarda ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> 13.000 rpm&#39;de santrifüj, sonra karışım hibridizasyon için hazır hale gelir. </li><li> Dizi slayt üzerine karışımdan 100 uL yüklemek ve melezleme odasının içine slayt mühür. </li><li> Fırında 10 rpm&#39;de dönen 65 ° C&#39;de 17 saat melezleme fırını içine monte bölmeyi yükleyin. </li><li> stabilizasyon daldırma ve 30 saniye için çözüm kurutulmasıyla ozon koruma tedavisi ile protokole göre diziler yıkayın. </li><li> toz parçacıkları ile çözümünden diziler çıkarın ve dizi yüzeyi kuru olduğundan emin olun </li></ol> 4. Tarama Mikroarray slayt <ol><li> karanlık bir yerde diziler tutun ve TARAMAn açmaker (15 dk bekleme süresi) kullanmak için hazır olana kadar. </li><li> tarayıcıya, sol dizi barkod yükleyin ve taramaya başlayın. yazılım kullanım kılavuzuna göre nokta analiz yapmak ve (GPR) dosya biçimi olarak verileri kaydetmek. </li></ol> 5. İstatistiksel Analiz <ol><li> FlexArray yazılımı http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php &quot;ithal ham veri&quot; üzerine tıklayın ve FlexArray içine GPR dosyaları yüklemek indirin. </li><li> Gerekirse talimat takip ederek normalleşme ve istatistiksel analiz. Not: Daha önce 22 açıklandığı gibi bu çalışmada olumlu nokta seçimi için eşik hesaplayın. </li><li> tüm melezleştirilmiş noktalar ve arka plan sinyalleri görüntülemek için FlexArray arsa izleyiciden kılavuzda açılır seçin. Not: mikrodizi hibridizasyon sonrası kontrol çivili benzer bir görüntü önceki çalışmada 8&#39;de görülebilir. </li><li> seçinFlexArray gelen diziler normalleşme süreci arasında bir persantil aşağıdaki dizinin içinde lös normalleşme buna kılavuzu açılır. </li><li> Bir Excel içine FlexArray tüm normalleştirilmiş verileri dışa daha fazla kullanım için dosya. </li></ol> 6. Biyoinformatik Analizi Sığır embriyo özgü transkriptleri prob dizilerinin orijinal açıklama (BESTv1) mikrotertip önce 8 tarif edilmiştir. Bu çalışmada, 20.403 benzersiz Gen Semboller (GS) (elde edildi <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">Dosya1 Supplement</a> EmbryoGENE Laboratuar Bilgi Yönetim Sistemi (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca) yoluyla). 6765 benzersiz genlerin (listesi <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">file2 Ek</a> ) seçilmiş ve mikroarray normalleşme sürecinden sonra tüm olumlu sinyaller (Adım 5 tekabül oldu0,5) sığır Günlük 7 embriyolar gen ifadesi profilinden. Olumlu bir sinyal eşik A değerinin sinyal yoğunluğu gelen geçirgen yayında 16 üzerinden hesaplanmıştır. <ol><li> Sınıflandırma Sistemi 23, 24 (Evrimsel ilişkiler yoluyla protein analizi) PANTHER fonksiyonel analizi gerçekleştirmek için aşağıdaki linki (http://www.pantherdb.org/about.jsp) açın. </li><li> İstatistiksel overrepresentation testi kullanılarak embriyonik gelişim sırasında belirli biyolojik süreci tanımlamak ve referans listesine 25 olarak Bos taurus varsayılan ayarı (veritabanındaki tüm genler) kullanmak için 6765 embriyo özgü GS listesini yükleyin. Not: Bu istatistiksel olarak fazla veya az ifade edilen bir binom testi kullanılarak olan GO açısından gelişimsel ilgili süreçlerin belirlenmesini sağlar. </li><li> Yazılım varsayılan olarak &lt;0.05 Set P-değeri eşik. Veriler indirilebilir ve expo olabilirDaha fazla seçim 16 Excel dosyasına rted. </li></ol>

<ol><li>Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+in+dairy+cows%3A+bridging+the+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Fertility in dairy cows: bridging the gaps.</a> Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).</li>
<li>Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+survival+in+dairy+cows+managed+under+pastoral+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions.</a> Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).</li>
<li>Wrenzycki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+culture+system+and+protein+supplementation+on+mRNA+expression+in+pre-implantation+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos.</a> Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).</li>
<li>Menezo, Y. J., Herubel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+bovine+models+for+human+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse and bovine models for human IVF.</a> Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+%28MAQC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li>
<li>Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+the+cancer+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of the cancer transcriptome.</a> Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).</li>
<li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+resources+to+obtain+a+comprehensive+survey+of+the+bovine+embryo+transcriptome+through+deep+sequencing+and+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays.</a> Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).</li>
<li>Nygaard, V., Hovig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+available+for+profiling+small+samples%3A+a+review+of+sample+amplification+technology+when+combined+with+microarray+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling.</a> Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).</li>
<li>Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isothermal%2C+linear+nucleic+acid+amplification+systems+for+highly+multiplexed+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications.</a> Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).</li>
<li>Phillips, J., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+RNA+Amplification%3A+A+linear+amplification+method+for+analyzing+the+mRNA+population+from+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells.</a> Methods. 10 (3), 283-288 (1996).</li>
<li>Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+aRNA+production+during+T7+amplification+to+prevent+the+loss+of+sample+representation+during+microarray+hybridization+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 65(2009).</li>
<li>Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Linkage+System%3A+versatile+nucleic+acid+labeling+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Re.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique.</a> Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).</li>
<li>Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Providing+a+stable+methodological+basis+for+comparing+transcript+abundance+of+developing+embryos+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays.</a> Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).</li>
<li>Tsoi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+porcine+%28Sus+scofa%29+embryo-specific+microarray%3A+array+annotation+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation.</a> BMC Genomics. 13, 370(2012).</li>
<li>Salehi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/rd/rdv26n1ab208">Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid.</a> Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).</li>
<li>Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diets+enriched+in+unsaturated+fatty+acids+enhance+early+embryonic+development+in+lactating+Holstein+cows%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows.</a> Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).</li>
<li>Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf</a> (2016).</li>
<li>Kerr, K. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17915030">Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray.</a> BMC Bioinformatics. 8, 371(2007).</li>
<li>Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wholly+defined+Agilent+microarray+spike-in+dataset%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset.</a> Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).</li>
<li>Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+and+known+oocyte-specific+genes+using+complementary+DNA+subtraction+and+microarray+analysis+in+three+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species.</a> Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).</li>
<li>Thomas, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER%3A+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li>
<li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PANTHER+database+of+protein+families%2C+subfamilies%2C+functions+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways.</a> Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).</li>
<li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).</li>
<li>Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+gene+transcript+abundance+in+bovine+fertilized+and+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).</li>
<li>Gilbert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+products+fluctuation+during+bovine+pre-hatching+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).</li>
<li>Vallee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+bovine+embryo+transcript+profiles+during+early+in+vivo+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development.</a> Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).</li>
<li>Dafforn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+mRNA+amplification+from+as+little+as+5+ng+total+RNA+for+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis.</a> Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).</li>
<li>Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaujean%2C+N+%22Studying+Bovine+Early+Embryo+Transcriptome+by+Microarray%22">Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray</a>. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).</li>
<li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+%28MAQC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

İlk sorun gen ifadesinin çalışmak için yüksek kaliteli RNA yeterli miktarda almıyor Günlük 7 sığır embriyolarının kullanarak mikroarray analizi gerçekleştirmek için. Geleneksel fenol / kloroform RNA ekstraksiyonu ve etanol çökeltme yöntemi, düşük verim ve RNA amplifikasyon reaksiyonu inhibe olası artık fenol elde Gün 7 embriyo için uygun değildir. Bunun yerine, standart sütun tabanlı bir yöntem, toplam RNA izole etmek ve daha sonra konsantrasyonunu arttırmak için en az elüsyon tamponuyla RNA elüt edilmesi için daha iyid...

Yüksek verimli sütçü sığırlarda erken embriyonik kayıp süt endüstrisi 1, 2 ana zorluklardan biridir. Sığır nedeniyle benzer gelişimsel süreç 3, 4 insan preimplantasyon embriyo gelişimini incelemek için ilginç bir model haline gelmiştir. Ancak, daha fazla araştırma sığır erken embriyonik gelişiminde rol oynayan genler hakkında daha iyi bir anlayış olması gerekir. İlk mikrodizi teknolojisi bu yana yirmi yıl 1995 5 geliştirilen sonra daha sofistike prob üretim teknolojisi azaltılmış baskı hataları içinde ve farklı mikroarray platformları 6 arasında dizi yongalarının değişkenlik gelişimi. Geliştirilmiş mikrodizi teknolojisi erken embriyo q, son zamanlarda klinik araştırmalar 7 ve bu teknolojinin yaygın bir uygulama ile sonuçlanmıştıruality değerlendirmesi 8. mikroarray teknolojisi için gerekli malzeme büyük miktarda mikroarray teknolojisi başlangıçta böyle erken embriyonik gelişme olarak araştırma alanları bir dizi giremedi ana nedeni olduğunu. Daha yakın zamanda, RNA amplifikasyon yöntemleri doğrusal RNA Başlangıç Maddesi 9 alt nanogram arasında mikrogram seviyesine kadar RNA amplifikasyonu için geliştirilmiştir. Piyasada bulunan birçok ticari RNA amplifikasyon kitleri vardır; Ancak, daha popüler iyi gelişmiş kitleri Ribo-Tek Primer İzotermal Amplification 10 ile ilgili ve T7 organizatörü 11 yöntemleri sürülür. En popüler antisens RNA amplifikasyonu 5 &#39;ucunda 12 bir T7 promotörü bağlantılı bir oligo dT primeri ile in vitro transkripsiyonu ile kullanır. Bu teknoloji doğrusal amplifikasyon f sonra temsili bir anti-duyu transkript en muhafaza veriyorveya diziler melezleme 13. Bu yöntem, sığır embriyo 8 ekstrakte edilen toplam RNA pikogram seviyesini yükseltmek için adapte edilmiştir. Evrensel Bağlantı Sistemi (ULS) doğrudan guanin 14 N7 pozisyonunda bir koordinatif bağ oluşturarak, platin bağlı flüoresan boya ya siyanin 547 veya cyanine 647 ile DNA veya RNA güçlendirilmiş içeren etiketleme yöntemidir. Bu yöntem, Arna enzimatik yöntem 15 tarafından üretilen tadil edilmiş aminoallyl göre değişiklik olmadan Arna amplifiye daha stabil oluşturmak için embriyolar araştırma uyarlanmıştır. Tek boya ve iki boyalar etiketleme Her iki yöntem mikroarray Evrensel Bağlantı Sistemi kullanılarak adapte edilmiştir. Büyük bir mikroarray karşılaştırmaları çalışma tek ve iki renkli dizisi platformları 6 arasındaki veri kalitesi iyi bir korelasyon olduğunu oldu. Son zamanlarda, hem T7 yükseltici sürücün, antisens RNA amplifikasyonu ve uls etiketleme yöntemleri mikrodizi hibridizasyon 8, 16 için Arna malzeme etiketli yüksek kalitede yeterli miktarda üretmek için daha güvenilir bir protokol sağlamaktır geliştirilmiştir. Bu nedenle, bu çalışmada örnek olarak 7. Gün sığır embriyoları kullanılarak iki renkli mikroarray yer alan veri analizi RNA ekstraksiyon önemli adımlardan bazıları göstermek için bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>PicoPure RNA İzolasyon Kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İçermeyen DNaz Seti (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus RiboAmp HS PLUS Kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör Cihazları</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>RNA Ekran Bandı</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>ULS Floresan Etiketleme Kiti</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>Özel Gen İfade Mikrodizileri</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gen Ekspresyonu yıkama tamponu 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>Bölüm #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gen İfadesi yıkama tamponu 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Bölüm #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Hibridizasyon tamponu</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Parça #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Parça tamponu</td><td>Agilent Technologies</td><td>Parça #5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x GE Engelleme Maddesi</td><td>Agilent Technologies</td><td>Bölüm #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>Stabilizasyon ve kurutma çözümü</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Parça #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Agilent SureHyb teknolojisi tarafından etkinleştirilen conta kızakları</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>20 conta kızağı paketi, 4 mikrodizi/slayt</td></tr><tr><td>İki Renkli RNA Spike-In Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Kedi # 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B dizi tarayıcı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr><tr><td>Ozonsuz Kutu</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>GAL dosyası</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptome profil in-vivo Üretilen sığır pre-implantasyon embriyolar

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Erken embriyonik kayıp, sığırlarda kısırlığa büyük katkıda bulunur. Dahası, sığır, benzer gelişim süreçleri nedeniyle insan preimplantasyon embriyo gelişimini incelemek için ilginç bir model haline gelir. Genetik faktörlerin erken embriyonik gelişimi etkilediği bilinmesine rağmen, bu tür faktörlerin keşfi ciddi bir zorluk olmuştur. Mikroarray teknolojisi, transkript seviyelerinin genom çapında kantitatif ölçümüne ve gen ekspresyon profiline izin verir. Bir mikrodizi deneyi planlarken verilmesi gereken ana kararlardan biri, bir veya iki renkli bir yaklaşımın kullanılıp kullanılmayacağıdır. İki renkli tasarım, teknik çoğaltmayı artırır, değişkenliği en aza indirir, hassasiyeti ve doğruluğu artırır ve ayrıca ortak referans örneklerini tanımlayan döngü tasarımlarına izin verir. Mikrodizi güçlü bir biyolojik araç olmasına rağmen, gücünü azaltabilecek potansiyel tuzaklar vardır. Bu nedenle, bu teknik makalede, iki renkli analiz stratejisini kullanarak RNA ekstraksiyonu, amplifikasyonu, etiketleme, etiketlenmiş amplifiye edilmiş RNA'nın diziye hibridizasyonu, dizi taraması ve veri analizi için optimize edilmiş bir protokol gösteriyoruz.

7. Gün sığır embriyolarının toplam RNA ve amplifiye Arna temsili bir sonuç Şekil 3'te gösterilen ve Tablo 1 'de özetlenmiştir. RNA bütünlüğü ve profil RNA ekstraksiyonu sonrasında değerlendirilebilir. RNA kalitesinin değerlendirilmesi Bioanalyzer cihazı (Şekil 3A) ve daha yüksek 7.0 amplifikasyonu (Tablo 1) için kullanılacak nitelikli RIN değeri yalnızca örnek...

Mikroarray teknolojisi, transkriptlerin genom çapında kantitatif ölçümüne ve gen ekspresyon profiline izin verir. Bu nedenle, bu protokol, düşük miktarda toplam RNA kullanmanın fizibilitesini göstermek için 7. gün sığır embriyolarını kullanan iki renkli özel yapım bir sığır dizisinde optimize edilmiş bir teknik prosedür sağlar.

Transcriptome Profil In-vivo Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Bu videonun genel amacı, yedinci gün sığır embriyolarından düşük miktarda toplam RNA kullanarak iki renkli, özel yapım bir sığır dizisi kullanarak optimize edilmiş bir teknik prosedür sağlamaktır. Bu yöntem, yüksek verimli süt ineklerinde embriyonik kayıp ile ilgili temel soruları ve implantasyondan önce gelişmekte olan embriyodaki gen ekspresyonuna göre embriyonik kalite ile ilgili soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, tek embriyolardan ekstrakte edilen toplam RNA'nın pikogram seviyesini kullanarak gen ekspresyonunu inceleyebilmemizdir.Bu yöntem, in vivo üretilen sığır implantasyon öncesi embriyoların sağkalımını etkileyen faktör hakkında fikir verebilir. Bu aynı zamanda in vitro embriyo üretimleri gibi üreme teknolojilerinin geliştirilmesine de yardımcı olabilir. Prosedüre başlamak için, kolon bazlı bir piko ölçekli RNA ekstraksiyon kitinden bir mikrosantrifüj tüpünde donmuş sığır embriyolarını hazırlayın.Tüpe 10 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve embriyoları 30 dakika boyunca 42 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, tüpü 800 kez G.Pipette 250 mikrolitre şartlandırma tamponunda iki dakika boyunca saflaştırma sütunu filtre membranına santrifüjleyin v

transcriptome-profiling-vivo-produced-bovine-pre-implantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Mikroarray analizi genetik ekspresyon profillerini belirlemek için...

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

Biz bıldırcın embriyo modeli sistemde çoklu proteinlerin hızlı ve verimli ifade izin veren bir yöntem olarak haberci RNA (mRNA) elektroporasyonu rapor. Bu yöntem floresan hücreler için kullanılabilir ve Elektroporasyon kısa bir süre sonra zaman atlamalı mikroskopinin in vivo hareketlerini kaydetmek.

MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

Öğrenin, iki renkli özel yapım sığır mikroarray ile düşük RNA miktarında gün yedi sığır embriyolarında gen ifadesi profillemesini. Bu yöntem, embriyo kalitesi ve hayatta kalma faktörleri hakkında bilgi sağlar.

Transcriptome Profil In-vivo Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Daha fazla video keşfet