Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma

Bu prosedürün genel amacı, sıçan oligodendrosit progenitör hücrelerini izole etmek ve kültürlemek ve deneysel faktörlere yanıt olarak oligodendrogenezi ölçmektir. Etkili oligodendrogenez, omurilik yaralanması, neonatal hipoksi ve transvers miyelit ve multipl skleroz gibi demiyelinizan hastalıklar dahil olmak üzere çok sayıda araştırma alanında terapötik hedeftir. Bu tekniğin ana avantajı, çok sayıda OPC'nin izolasyonu için bir protokolü, aynı anda birden fazla deneysel koşulda oligodendrogenezi belirlemek için hızlı ve güvenilir bir yöntemle birleştirmesidir.

Bu işleme başlamak için, tüm diseksiyon ekipmanını ısıtılmış bir boncuk sterilizatörü kullanarak sterilize edin. Ardından, 50 mililitrelik konik bir tüpe 15 ila 20 mililitre PBS ekleyin. Konik tüpü buzun üzerine yerleştirin ve diseksiyon sırasında doğranmış korteks dokusunu tutmak için kullanın.

Daha sonra, ışık mikroskobu altında diseksiyon için kullanılacak olan 10 santimetrelik bir Petri kabına soğuk PBS ekleyin. Sıçan yavrularını kurban ettikten sonra, küçük bir makas kullanarak kulakların arkasındaki deriyi orta hat boyunca kesin. Ve cildi soyun, geri kanatlar.

Daha sonra, kafatasını beyin sapından gözlere kadar orta hat boyunca kesin. Ve altta yatan korteksin yapısını korumak için çok derin kesmemeye dikkat edin. Bundan sonra, foramen magnumuna küçük cerrahi makas sokarak beyincikten daha düşük iki yanal kesi yapın.

Koku alma ampullerinin önündeki gözler arasında ek bir kesim yapın. Kafatasının her iki yarısını dikkatlice soyun. Tüm beyni çıkarın ve soğuk PBS ile doldurulmuş 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.

Diseksiyon ışığı mikroskobu altında, koku ampullerini ve beyinciği ince cerrahi forseps ile çıkarın. Beyni, ventral yüzey görünecek şekilde çevirin. Daha sonra, ince düz forsepsler kullanarak, korteks ve hipotalamus arasına beynin yaklaşık üçte ikisi kadar bir derinliğe kadar kapalı forseps uçları yerleştirerek künt bir diseksiyon yapın.

Forsepsleri yerine oturduktan sonra açın, ardından diğer yarım küre için prosedürü tekrarlayın. Bundan sonra, korteksi hipotalamus ve orta beyin bölgelerinden uzaklaştırın. Orta beyni arka yüzeyinde tutarak ve beynin ön ucuna doğru soyarak hipotalamu, talamusu ve orta beyni çıkarın.

Daha sonra, ön bağlantıları kesin. İnce bükülmüş diseksiyon forsepsleri kullanarak, hipokampusu çıkarın ve korteks ile bağlantısını kesin. Ardından, kalan striatumu dışa doğru çapraz bir hareketle alttaki korteksten kazıyarak çıkarın.

Kan damarlarını ve meninksleri korteksin ventral yüzeyinden temizleyin. Ardından, beyni, sırt yüzeyi görünecek şekilde çevirin. Meninksleri, koku soğancığının bulunduğu alttaki korteksten soyun.

Prosedürleri toplam üç ila dört sıçan yavrusu için tekrarlayın. Ve tüm disseke korteksleri bir Petri kabına yerleştirin. Bir milimetreye bir milimetre parçalar elde edene kadar sterilize edilmiş bir tıraş bıçağıyla doğrayın.

Ardından, tekrar buza koymadan önce tabağı PBS ile durulayarak dokuları toplayın. Şimdi, bir pipet kontrolörüne bağlı bir cam Pasteur pipeti kullanarak, on ila on beş kez pipetleyerek veya doku parçalarının boyutu küçülene ve çözelti bulanıklaşana kadar dokuyu mekanik olarak ayırın. Daha sonra, numuneyi sürekli rotasyonla 15 dakika boyunca 37 santigrat derece doku kültürü inkübatörüne geri koyun.

Bundan sonra, her numuneye 10 mililitre PBS ekleyin ve homojenatı 50 mililitrelik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 40 mikrometrelik bir gözenekli filtreden süzün. Ardından, filtreyi bir ila iki mililitre PBS ile durulayın. Tüm homojenat örneklerini 50 mililitrelik tek bir konik tüpte toplayın ve genel hücre sayımı elde edin.

Hücre sayımını gerçekleştirdikten sonra, homojenatı 15 milileter konik tüpe eşit olarak bölün ve 300 g'da 10 ila 12 dakika santrifüjleyin. Beş mililitre sütun arabelleği ekleyerek her LS sütununu hazırlayın. Ve akışı 15 mililitrelik bir konik borudan toplayın.

Kolon tamponu üst hazneden tamamen geçtikten sonra, her kolona 1000 mikrolitre hücre süspansiyonu uygulayın ve hücrelerin yerçekimi ile geçmesine izin verin. Ardından, her bir sütunu çıkarın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Beş mililitre sütun tamponu ekleyin ve bağlı hücreleri yerinden çıkarmak ve onları sütundan serbest bırakmak için tamponu sütundan hızlı bir şekilde daldırın.

Hücreleri plakalamak için, onları OPC proliferasyon ortamı ile mililitre başına 60.000 hücreye seyreltin. Her bir siyahın kenarı boyunca 500 mikrolitre hücre pipetleyin, 24 oyuklu bir plakanın alt kuyusunu temizleyin. Plakayı yatay olarak sallayarak, sekiz rakamlı bir hareket kullanarak hücreleri karıştırın.

Bu prosedürde, aspirasyon sırasında kuyunun zarar görmemesini sağlamak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucunu bir cam Pasteur pipetinin üzerine yerleştirin. Daha sonra, hücrelerin kurumasını önlemek için ortamı kültür kuyularından her seferinde bir tedavi grubundan aspire edin. Bundan sonra, bir mililitrelik bir pipet kullanarak kuyu kenarına yavaşça 500 mikrolitre arıtma ana karışımı ekleyin.

Kültürleri kuluçkaya yatırın ve her iki ila üç günde bir taze tedavi ortamı ile tam bir ortam alışverişi gerçekleştirin. İstenilen tedavi süresinin sonunda besiyerini aspire edin. Hücreleri sabitlemek için kuyu kenarına yavaşça 400 mikrolitre PFA ekleyin.

Ve plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, PFA'yı aspire edin ve hücreleri yıkamak için yavaşça 500 mikrolitre steril D-PBS ekleyin. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın ve son yıkamayı aspire etmeyin.

Şimdi, plakayı oda sıcaklığına getirin, kuyuları aspire edin ve yüzde beş NGS ve yüzde 0.1 Triton x-100 içeren 250 mikrolitre D-PBS ekleyin. Plakayı hafif yörünge sallama ile bir saat oda sıcaklığında inkübe edin. Fare monoklonal anti MBP antikoru ve tavşan poliklonal anti olig2 antikorunu yüzde beş NGS içeren D-PBS'de seyrelterek birincil inkübasyon çözeltisini hazırlayın.

Daha sonra, birincil antikorları gece boyunca dört santigrat derecede 16 ila 18 saat boyunca hafif yörünge çalkalama ile inkübe edin. Plakayı yıkarken, yüzde beş NGS içeren D-PBS'de anti fare 680 ve anti tavşan 800 antikorlarını seyrelterek ikincil inkübasyon çözeltisini hazırlayın. Ardından, son yıkamayı aspire edin ve 250 mikrolitre ikincil inkübasyon çözeltisi ekleyin.

Plakayı ışıktan koruyun ve hafif yörünge sallama ile bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bundan sonra, 700 nanometre ve 800 nanometre floresan emisyonlarını tespit edebilen bir görüntüleme sistemi kullanarak plakayı tarayın. Başlangıç noktası olarak, odak ofsetini üçe ve hassasiyetleri MBP için bir nokta beşe, aktin için beş nokta sıfıra ve olig2 için üç nokta beşe ayarlayın.

Sinyalin aşırı maruz kalmasını önlemek için hassasiyet değerlerini gerektiği gibi ayarlayın. Bu şemada, DIFS testi, PLL kodlu kültür kapları üzerine kaplanmış yeni izole edilmiş A2B5 pozitif sıçan OPC'leri ile başlar. Bu kültürler, mililitre PDGFAA başına 20 nanogram varlığında üç gün boyunca çoğaltılır ve daha sonra sıfırıncı günde taze PDGF içermeyen ortamda deneysel faktörlerle muamele edilir.

Tedavi ortamı ikinci günde tamamen yenilenir. Ve hücreler dördüncü günde yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlenir. Burada, olig2 ve MBP için immünositokimya, temsili kültürlerde sıfırıncı ve dördüncü günde nükleer karşı boyama olarak Dapi kullanılarak gerçekleştirildi.

Bu kültürler, sıfırıncı ve dördüncü günlerde pan oligodendrosit soy hücresi markörü Olig2 için yapısal boyama sergiler. Olgun oligodendrosit belirteci MBP için boyama ise sadece dördüncü günde belirgindi. Bu videoyu izledikten sonra, deneysel faktörlerin oligodendrogenez üzerindeki etkisini ölçmek için A2B5 pozitif sıçan OPC'lerinin nasıl saflaştırılacağını, kültürleneceğini ve ayırt edileceğini iyi anlamalısınız.

Oligodenrogenezi destekleyen faktörlerin tanımlanması, multipl skleroz gibi demiyelinizan hastalıkların incelenmesi ile özellikle ilgilidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, burada açıklanan teknikler bu tür faktörlerin belirlenmesine ve nihayetinde daha iyi terapötiklerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.