Name: Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Öğrenin, sıçan kortekslerinden oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için bu yöntemi. Çift kızılötesi floresan tarama ile oligodendrogenezisi nicelendirin ve demiyelinizan hastalıklara yönelik tedavi stratejileri geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

; Ulusal Sağlık Enstitüleri: sponsor Grant Hibe numarası: R37 NS041435.

<ol><li>Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+genetics+of+vertebrate+glial-cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification.</a> Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).</li>
<li>Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+capacity+of+the+MS+brain+decreases+with+disease+chronicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity.</a> Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).</li>
<li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li>
<li>Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+glial+cells%3A+a+novel+glial+cell+population+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropath+Exp+Neur%22%5BJournal%5D)">NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain.</a> J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).</li>
<li>Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+generate+A2B5-positive+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells.</a> Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).</li>
<li>Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+bipotential+glial+progenitor+cells+in+adult+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve.</a> Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).</li>
<li>Popko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+deficient+mice%3A+expression+of+myelin+basic+protein+and+generation+of+mice+with+varying+levels+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin.</a> Cell. 48 (4), 713-721 (1987).</li>
<li>Bourre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+profile+and+basic+protein+measurements+in+the+myelin+range+of+particulate+material+from+normal+developing+mouse+brain+and+from+neurological+mutants+%28Jimpy%3B+quaking%3B+Trembler%3B+shiverer+and+its+mld+allele%29+obtained+by+zonal+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation.</a> J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).</li>
<li>Baxi, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+thyroid+hormone+%CE%B2+receptor+agonist+enhances+human+and+rodent+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation.</a> Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).</li>
<li>Warringa, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+stimulates+the+development+of+oligodendrocytes+in+primary+glial+cultures+and+affects+glucose+metabolism+and+lipid+synthesis+in+these+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures.</a> Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).</li>
<li>Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+has+diverse+and+multiple+stimulating+effects+on+expression+of+the+major+myelin+protein+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes.</a> J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quetiapine+facilitates+oligodendrocyte+development+and+prevents+mice+from+myelin+breakdown+and+behavioral+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes.</a> Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).</li>
<li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropillar+arrays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li>
<li>Deshmukh, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerative+approach+to+the+treatment+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis.</a> Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-based+modulation+of+endogenous+stem+cells+promotes+functional+remyelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo.</a> Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+glial+cells+during+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defining glial cells during CNS development.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).</li>
<li>O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enriched+oligodendrocyte+cultures+and+oligodendrocyte%2Fneuron+myelinating+co-cultures+from+post-natal+murine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Dugas, J. C., Emery, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+precursor+cells+from+rat+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada sunulan protokol sıçan OPC izole edilmesi ve deney faktörlere yanıt olarak in vitro oligodendrogenesis olarak ölçülmesi için hızlı ve güvenilir bir yöntem tarif eder. Pozitif bir seçim kullanarak, canlı ve saf OPC yüksek verimi deneysel amaçlar için doğrudan kullanılır. Bu yöntem, bir 1 haftalık bir zaman çerçevesi içinde izolasyon, kültürlenmesini, ve farklılaşma adımları kolaylaştırır ve sabit hücreler uygun bir deney, hassasiyet kaybı olmaksızın birkaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir....

Memeli merkezi sinir sisteminde (MSS) etkili sinir iletim oligodendrositlerin akson myelinizasyonunu gerektirir. Gelişimi sırasında, oligodendrosit gelişmekte olan ön beyin ve nöral tüp 1 ventriküler bölgelerinden göç düşünülen oligodendrosit progenitör hücrelerin (OPC) havuzundan kaynaklanmaktadır. Göç OPC olgun, myelinating oligodendrositlere içine ayırt sonra etkili uyarı iletimini kolaylaştırmak değil, aynı zamanda trofik desteği 2 ile aksonlar sağlamaz sadece. Yetişkin MSS tüm hücrelerin 3 yaklaşık 5-8% oluşan gri ve beyaz cevher boyunca dağılmış OPC bol bir nüfusa tutar. demiyelinizan bir hakaret sonrasında, OPC, yaralanma siteye göç çoğalırlar ve maruz aksonlar kayıp ya da hasarlı miyelin kılıflar yerine ayırt. Ancak, bazı hastalık / yaralanma ayarlarında bu süreç verimsiz olduğu bulunursa veya tamamen 4 başarısız olabilir. SüreKronik demiyelinizasyon belirtileri 5 hafifletmek olabilir hastalığı, verimli oligodendrogenesis ve remiyelinizasyon yükü eklemek için düşünülmektedir. Bu nedenle oligodendrogenesis deneysel faktörlerin etkisini belirlemek için in vitro OPC çalışma ilgi olmuştur. oligodendrosit farklılaşma farklı evreye Insight sahne spesifik hücre belirteçleri tanımlanması ile mümkün olmuştur. Kendini sürekli yenileyen, erken progenitör hücreler trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa onların ifadesi (PDGFRα) tarafından tanımlanan, sinirsel / glia antijen 2 (NG2) ve A2B5 6-8. OPC kendi farklılaşma programlarının başlatmak ve hücre döngüsünün çekilme olarak, bu markerlerin ifadesinin aşağı ve siklik nükleotid 3&#39;-fosfodiesteraz (CNPase) ve O4 içeren oligodendrositlerin premyelinating göstergesidir proteinleri ifade etmek için başlar. Son olarak, daha fazla erişkin oligodendrositlerin, farklılaşmasıytes myelin-ilintili glikoproteinin (MAG), proteolipid protein (PLP) ve miyelin bazik protein (MBP) gibi miyelin ilişkili proteinlerin ekspresyonu ile karakterize edilir. MBP hücre içi bir çevresel zar proteini ve miyelin kılıfının bir ana bileşenidir. MBP eksik Fare MSS miyelinasyon anlamlı titremeler, kasılmalar ve erken ölüm 9,10 giden azalmış olduğu ciddi bir fenotip geliştirmek. Miyelinasyon MBP bu önemli bir rol, in vitro ve in vivo 11 hem de oligodendrosit farklılaşması için bir markör olarak kullanımına yol açmıştır. MBP miktarının çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir. RT-PCR ve Batı boya analizi Farklı tedavi rejimleri altında MBP seviyelerinin ölçümü için izin verir. Immünsitokimya kamera bazlı mikroskopi yaklaşımlar kullanıldığında da nicel olabilir ortak bir nitel bir yaklaşımdır. Bu sistemler güvenilir ve temel rağmenOligodendrosit farklılaşma çalışması, her bir ilaç taramasında, kullanımlarını sınırlayan kendi dezavantajları vardır. İlk olarak, RT-PCR ve Batı boya analizi için gerekli olan primer OPC miktarı eş zamanlı olarak kontrol edilebilir değişken sayısını azaltır. immünsitokimya hücre gereksinimi çok daha düşük olsa da kantitatif hedefi ise, önemli ölçüde zaman her bir deney için ayrılmış olmalıdır. Sayısız görüntüler yakalanır ve daha sonra deneysel analizi kolaylaştırmak için ölçülebilir olmalıdır. Bu uyarılar yüksek verimlilik değerlendirmesi gerektiren çalışmalar için dikkate almak önemli engeller haline gelir. önemli ölçüde gerekli hücrelerin sayısını ve kantitatif analiz tamamlamak için zaman hem azaltırken Burada, immünsitokimya ve miyelin ölçümü için Western Blot metodolojileri hem temel yönlerini kullanan bir yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Diseksiyon Malzemeleri < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ca 2 + ve Mg 2 + </td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>10 cm Polistiren Petri Kapları</td><td>Fisherbrand</td><td>0857512</td><td></td></tr><tr><td>Işık Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Motic</td><td>SM2-168</td><td></td></tr><tr><td>Dissosiyasyon Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tüp Döndürücü</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>Ayrışma Tüpü Döndürücü</td></tr><tr><td>Nöral Doku Ayrışma Kiti (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>Enzimatik Ayrışma Kiti</td></tr><tr><td>PBS, Ca2 + ve Mg2 + </td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>40 & mu; m Hücre Süzgeci</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>A2B5 Kolon Saflaştırma&nbsp; < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anti-A2B5 Mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td><td>Boncuk Bağlı A2B5 Antikoru</td></tr><tr><td>LS Sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Manyetik Seçim Sütunları</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>PBS, Ca2 + ve Mg2 + </td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>%0.50</td></tr> <tr><td>< güçlü > Kültür Malzemeleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ng / ml</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 ml</td></tr><tr><td>Triiyodotironin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>45 nM</td></tr><tr><td>Clemastine fumarat tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0445-100MG</td><td>1 & mu; M</td></tr><tr><td>Ketiapin hemifumarat tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q3638-10MG</td><td>1 & mu; M</td></tr><tr><td>N-asetil sistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>5 & mu; g / ml</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>60 ng / ml</td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>10 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>Putrecine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>16 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>Sodyum Selenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>d-Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>5 & mu; g / ml</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>100 & g / ml</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4161</td><td>100 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>Eser Elementler B</td><td>Corning</td><td>25-022-Cl</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 Ek Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>17504044</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140122</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11995-065</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapaklı 24 oyuklu Siyah Vizör</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>Doku kültürü sınıfı</td></tr><tr><td><güçlü>İmmünositokimya ve Kantifikasyon</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100-13A</td><td>%4</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78787</td><td>%0.10</td></tr> <tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Jackson İmmüno Araştırmaları</td><td>005-000-121</td><td>%5</td></tr><tr><td>fare monoklonal anti-MBP</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1,000 Seyreltme</td></tr><tr><td>tavşan poliklonal anti-Aktin</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-7210</td><td>1:200 Seyreltme</td></tr><tr><td>tavşan poliklonal anti-Olig2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:1,000 Seyreltme</td></tr><tr><td>keçi anti-fare 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500 Seyreltme</td></tr><tr><td>keçi anti-tavşan 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>1:500 Seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 keçi anti-fare</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11032</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11008</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr>DAPI <td>Life Technologies</td> ile<td>Altın antifadesini uzatın</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ ve Mg2+Corning ile DPBS</td><td></td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Licor Odyssey Clx Kızılötesi Görüntüleme Sistemi</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sıçan oligodendrosit progenitör kültürler hazırlanması ve oligodendrogenesis niceleme Çift kızılötesi floresan tarama kullanma

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Etkili oligodendrogenez, omurilik yaralanması, neonatal hipoksi ve multipl skleroz ve transvers miyelit gibi demiyelinizan hastalıklar dahil olmak üzere bir dizi araştırma alanının terapötik hedefidir. Miyelinasyon sadece merkezi sinir sistemi içinde hızlı impuls yayılımını kolaylaştırmak için değil, aynı zamanda altta yatan aksonlara trofik destek sağlamak için de gereklidir. Oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC'ler), oligodendrosit farklılaşmasını teşvik edebilecek veya inhibe edebilecek faktörlerin belirlenmesine yardımcı olmak için in vitro olarak incelenebilir. Bugüne kadar, bu süreci değerlendirmek için mevcut olan yöntemlerin çoğu ya çok sayıda hücre gerektirmiş, böylece herhangi bir zamanda araştırılabilecek koşulların sayısını sınırlamış ya da emek yoğun niceleme yöntemleri gerektirmiştir. Burada, aynı anda birden fazla koşuldan oligodendrogenezi belirlemek için hızlı ve güvenilir bir yöntemle birlikte çok sayıda yüksek saflıkta OPC'nin izolasyonu için bir protokol açıklıyoruz. OPC'ler P5-P7 neonatal sıçan kortekslerinden izole edilir ve farklılaşmadan önce üç gün boyunca in vitro olarak büyütülür. Farklılaşmadan dört gün sonra, oligodendrogenez, miyelin proteininin ekspresyonunu belirlemek için çift kızılötesi floresan tarama testi kullanılarak değerlendirilir.

A2B5-pozitif OPC manyetik kolon ayırma sistemi kullanılarak pozitif hücre seçimi ile izole edilir. İzolasyon ^ işleminde önce, tüm beyin P5 ve P7 arasında olan sıçan yavrularından kaldırılır. Tüm beyin başarıyla kafatası ayrılmış sonra, koku ampuller ve beyincik ince cerrahi forseps (Şekil 1A) kullanarak kaldırılır. Serebral kortikal doku izole etmek için hipotalamus, talamus ve orta beyin dikkatli diseksiyon (Şekil 1B) tarafından çıkarılır. Sonraki, hip...

Oligodendrositler, merkezi sinir sisteminin miyelinli hücreleridir. Bu protokol, öncülleri olan oligodendrosit progenitör hücrelerinin sıçan kortekslerinden izolasyonu ve kültürü için bir yöntemin yanı sıra, deneysel faktörlere yanıt olarak in vitro oligodendrogenezi değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir kantitatif yöntemi tanımlar.

Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Bu prosedürün genel amacı, sıçan oligodendrosit öncül hücrelerini izole etmek ve kültürlemek ve deneysel faktörlere yanıt olarak oligodendrogenezi nicel olarak belirlemektir. Verimli oligodendrogenez; omurilik yaralanması, neonatal hipoksi ve transvers miyelit ile multipl skleroz gibi demiyelizan hastalıklar dahil olmak üzere birçok araştırma alanında terapötik hedeftir. Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda OPC izole etmeye yönelik bir protokolü, birden fazla deneysel koşulda oligodendrogenezi eş zamanlı olarak belirlemeye yarayan hızlı ve güvenilir bir yöntemle birleştirmesidir.Bu prosedüre başlamak için tüm diseksiyon ekipmanlarını ısıtmalı boncuk sterilizatör kullanarak sterilize edin. Ardından, 50 mililitrelik konik bir tüpe 15 ila 20 mililitre PBS ekleyin. Konik tüpü buz üzerine yerleştirin ve diseksiyon sırasında doğranmış korteks dokusunu tutmak için kullanın.Ardından, ışık mikroskobu altında yapılacak diseksiyon için kullanılacak olan 10 santimetrelik bir Petri kabına soğuk PBS ekleyin. Sıçan yavrularını sakrifiye ettikten sonra, küçük bir makas kullanarak kulakların arkasındaki deriyi orta hat boyunca kesin. Ve deri fleplerini geriye doğru soyun.Ardından, kafatasını beyin sapından gözlere doğru orta hat boyunca kesin. Altta kalan korteksin yapısını korumak için çok derin kesmemeye dikkat edin. Bundan sonra, küçük cerrahi makasları foramen magnum'a yerleştirerek serebellumun alt kısmından iki lateral kesi yapın.Olfaktör bulbusların ön tarafında, gözlerin arasından ek bir kesi yapın. Kafatası yarısını dikkatlice geriye doğru soyun. Beynin tamamını çıkarın ve soğuk PBS ile doldurulmuş 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.Bir diseksiyon ışık mikroskobu altında, ince cerrahi pensler yardımıyla olfaktör bulbusları ve serebellumu çıkarın. Beyni, ventral yüzey görünecek şekilde ters çevirin. Ardından, ince düz pensler kullanarak, kapalı pens uçlarını korteks ile hipotalamus arasına beynin yaklaşık üçte iki derinliğine kadar yerleştirerek künt bir diseksiyon gerçekleştirin.Pensler yerleştiğinde bunları açın, ardından aynı işlemi diğer hemisfer için tekrarlayın. Bundan sonra, korteksi hipotalamus ve orta beyin bölgelerinden ayırın. Orta beyni posterior yüzeyinden tutup beynin anterior ucuna doğru soyarak hipotalamusu, talamusu ve orta beyni çıkarın.Ardından, ön bağlantıları kesin. İnce eğri diseksiyon pensi kullanarak hipokampüsü çıkarın ve korteksle olan bağlantısını kesin. Daha sonra, kalan striatumu, alttaki korteksten dışa doğru diyagonal bir hareketle sıyırarak çıkarın.Kan damarlarını ve meningesleri korteksin ventral yüzeyinden temizleyin. Ardından, dorsal yüzey görünecek şekilde beyni ters çevirin. Olfaktör bulbun bulunduğu bölgede, meningesleri alttaki korteksten soyun.İşlemleri toplam üç ila dört sıçan yavrusu için tekrarlayın. Ardından, diseke edilen tüm korteksleri bir Petri kabına yerleştirin. Bunları, 1 mm x 1 mm boyutunda parçalar elde edilene kadar sterilize edilmiş bir jiletle kıyın.Ardından, kabı tekrar buzun üzerine yerleştirmeden önce PBS ile durulayarak dokuları toplayın. Şimdi, bir pipet kontrolörüne bağlı cam Pasteur pipeti kullanarak, doku parçaları küçülene ve çözelti bulanıklaşana kadar on ila on beş kez pipetleyerek dokuyu mekanik olarak ayrıştırın. Sonrasında, örneği sürekli rotasyonla 15 dakika boyunca 37 degree Celsius doku kültürü inkübatörüne geri koyun.Ardından, her örneğe 10 mililitre PBS ekleyin ve homogenatı 50 mililitrelik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 40 mikrometre gözenekli bir filtreden süzün. Daha sonra, filtreyi ek bir bir ila iki mililitre PBS ile durulayın. Tüm homogenat örneklerini tek bir 50 mililitrelik konik tüpte birleştirin ve toplam hücre sayımını gerçekleştirin.Hücre sayımı işlemini gerçekleştirdikten sonra, homojenatı 15 mililitrelik konik tüplere eşit olarak paylaştırın ve 300 gs'de 10 ila 12 dakika boyunca santrifüjleyin. Her bir LS kolonuna beş mililitre kolon tamponu ekleyerek kolonları hazırlayın. Ve akışı 15 mililitrelik bir konik tüpe toplayın.Kolon tamponu üst bölmeden tamamen geçtikten sonra, her bir kolona 1000 µL hücre süspansiyonu uygulayın ve hücrelerin yerçekimi ile akmasını sağlayın. Ardından, her bir kolonu çıkarıp 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Beş mL kolon tamponu ekleyin ve bağlı hücreleri yerinden oynatıp kolondan serbest bırakmak için tamponu kolon boyunca hızlı bir şekilde geçirin.Hücreleri ekmek için, OPC proliferasyon medyası ile mililitre başına 60.000 hücre olacak şekilde dilüye edin. Her bir 24 kuyucuklu plakadaki siyah, şeffaf tabanlı kuyucuğun kenarından 500 microliters hücre pipetleyin. Plakayı sekiz çizerek yatay şekilde sallayarak hücreleri karıştırın.Bu prosedürde, aspirasyon sırasında kuyucuğun zarar görmemesini sağlamak için 200 µL pipet ucunu cam bir Pasteur pipetinin üzerine yerleştirin. Ardından, hücrelerin kurumasını önlemek için kültür kuyucuklarındaki medyumu her seferinde bir tedavi grubu olacak şekilde aspire edin. Daha sonra, 1 mL'lik bir pipet kullanarak kuyucuğun kenarı boyunca 500 µL tedavi ana karışımını yavaşça ekleyin.Kültürleri inkübe edin ve her iki ila üç günde bir taze işlem medyumu ile tam bir medyum değişimi gerçekleştirin. İstenen işlem süresinin sonunda medyumu aspire edin. Hücreleri sabitlemek için kuyucuğun kenarına yavaşça 400 microliters PFA ekleyin.Ve plakayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. 20 dakika sonra, PFA'yı aspire edin ve hücreleri yıkamak için yavaşça 500 microliters steril D-PBS ekleyin. Yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın ve son yıkama sıvısını aspire etmeyin.Şimdi plakayı oda sıcaklığına getirin, kuyucukları aspire edin ve yüzde beş NGS ile yüzde 0,1 Triton x-100 içeren 250 microliters D-PBS ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında, hafif orbital çalkalama ile bir saat boyunca inkübe edin. Mouse monoklonal anti MBP antikoru ve rabbit poliklonal anti olig2 antikoru, yüzde beş NGS içeren D-PBS içerisinde dilüe edilerek birincil inkübasyon solüsyonu hazırlayın.Ardından, primer antikorları dört derece Celsius'ta, hafif orbital çalkalama ile 16 ila 18 saat boyunca gece boyunca inkübe edin. Plaka yıkanırken, anti mouse 680 ve anti rabbit 800 antikorlarını yüzde beş NGS içeren D-PBS içinde seyrelterek sekonder inkübasyon çözeltisini hazırlayın. Sonrasında, son yıkama sıvısını aspire edin ve 250 microliters sekonder inkübasyon çözeltisi ekleyin.Plakayı ışıktan koruyun ve hafif orbital sallama ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, plağı 700 nanometre ve 800 nanometre floresan emisyonlarını tespit edebilen bir görüntüleme sistemi kullanarak tarayın. Başlangıç noktası olarak, odak ofsetini üç; duyarlılıkları ise MBP için bir virgül beş, actin için beş virgül sıfır ve olig2 için üç virgül beş olarak ayarlayın.Sinyal aşırı pozlamasını önlemek için hassasiyet değerlerini gerektiği gibi ayarlayın. Bu şemada, DIFS testi, PLL kodlu kültür kaplarına ekilmiş taze izole edilmiş A2B5 pozitif sıçan OPC'leri ile başlar. Bu kültürler, 20 ng/mL PDGFAA varlığında üç gün boyunca çoğaltılır ve ardından sıfırıncı günde, taze PDGF içermeyen besiyerinde deneysel faktörlerle işleme tabi tutulur.İkinci günde tedavi ortamı tamamen yenilenir. Ve dördüncü günde hücreler yüzde 4 paraformaldehit ile fikse edilir. Burada, sıfırıncı ve dördüncü günlerdeki temsili kültürler üzerinde, nükleer karşıt boyama olarak Dapi kullanılarak olig2 ve MBP için immünositokimya gerçekleştirilmiştir.Bu kültürler, sıfırıncı ve dördüncü günlerde pan oligodendrosit soyu hücre belirteci Olig2 için konstitütif boyama göstermektedir. Olgun oligodendrosit belirteci MBP için boyama ise yalnızca dördüncü güne gelindiğinde belirginleşmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, deneysel faktörlerin oligodendrojenez üzerindeki etkisini nicelleştirmek amacıyla A2B5 pozitif sıçan OPC'lerinin nasıl saflaştırılacağı, kültüre edileceği ve farklılaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Oligodendrositogenezi teşvik eden faktörlerin belirlenmesi, multipl skleroz gibi demiyelizan hastalıkların incelenmesi açısından özel bir öneme sahiptir. Burada açıklanan teknikler uzmanlık düzeyinde uygulandığında, bu tür faktörlerin tanımlanmasına ve nihayetinde daha iyi terapötiklerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

preparation-rat-oligodendrocyte-progenitor-cultures-quantification

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential progenitör hücreler...

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Bu video, bir sıçanın retinasından retinal ganglion nöronlarını (RGN'ler) izole etme ve bunları koku alma kılıflayıcı glia (OEG) hücreleriyle birlikte kültürleme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, nöral yaralanma sonrası OEG'lerin nöro-rejeneratif potansiyelinin incelenmesine izin verir.

Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Kılıfı Glia ile Kokültürasyonu

Video, oligodendrosit öncü hücrelerini (OPC'ler) oligodendrositlere farklılaştırmak ve dorsal kök ganglion (DRG) nöronları ile bir ko-kültürde miyelinasyonu indüklemek için bir protokolü göstermektedir. OPC'ler, miyelinasyonu düzenleyen bir sinyal proteinini kodlayan lentiviral vektörlerle dönüştürülür. Dönüştürülen OPC'ler, oligodendrositlere farklılaşmayı ve sinyal proteini kaynaklı miyelinasyonu değerlendirmek için DRG nöronları ile birlikte kültürlenir.

Oligodendrosit Öncü Hücreleri için İn Vitro Transdüksiyonla İndüklenen Miyelinasyon Testi

Kaynak: Schott, J. T., {{}} ve diğerleri. Sıçan Oligodendrosit Progenitör Kültürlerinin Hazırlanması ve Çift Kızılötesi Floresan Taraması Kullanılarak Oligodendrogenezin Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Uzm.  (2016).  Bu video, bir sıçan yavrusu beyninden izole edilen öncü hücrelerden (OPC'ler) oligodendrositlerin farklılaşmasını değerlendirmek için ikili floresan görüntülemenin kullanımını göstermektedir. İşlem, hücrelerin sabitlenmesini, spesifik belirteçlerin birincil ve florofor konjuge...

Farklılaşmış Oligodendrositleri Tanımlamak için Çift Floresan Görüntüleme

Kaynak: Portela-Lomba, M., et. al. Aksotomize Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Kılıfı Glia ile Kokültürü, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun İn Vitro Modeli Olarak. J. Vis. Uzm. (2020). Bu video, ölümsüzleştirilmiş insan koku alma kılıflayıcı glia hücreleri ile birlikte kültürlenmiş aksotomize sıçan retinal ganglion nöronlarında (RGN'ler) aksonal rejenerasyonun görüntülenmesini ve niceliklendirilmesini göstermektedir. RGN'ler, kırmızı somalar ve yeşil aksonlar ile immün olarak...

Aksotomize Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarında Aksonal Rejenerasyonun Görüntülenmesi ve Miktar Tayini

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

Burada, İmmünohistokimya ve yüksek çözünürlüklü beyin bölgelerinin proteinleri için tarama ile birlikte yakın kızılötesi boyalar kullanan bir protokol sunuyoruz.

Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Burada, oligodendrositlerin saflaştırılması ve ortak kültür deneyleri için kullanılabilecek oligodendrosit şartlı ortamın üretimi için etkili bir yöntem gösteriyoruz.

Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

Nöral yaralanmadan sonra koku alma glia (OEG) nörojeneratif kapasitesini değerlendirmek için bir in vitro model sunuyoruz. RGN aksonal ve somatodendritik belirteçleri analiz ederek, OEG monolayerleri üzerinde axotomized adult retinal ganglion nöronlarının (RGN) bir kokülatürüne ve daha sonra aksonal rejenerasyon çalışmasına dayanmaktadır.

Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak

Canlı sıçanların beyinlerinden nöral kök hücrelerin ve oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem burada deneysel olarak ayrıntılı olarak sunulmaktadır. Refahlarından ödün vermeden bu hücrelerin aynı hayvanlardan birden fazla toplanmasına izin verir.

Canlı Sıçanlardan Nöral Kök Hücrelerin ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin İzolasyonuna Yönelik "Beyin Sağım" Yöntemi

Öğrenin, sıçan kortekslerinden oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için bu yöntemi. Çift kızılötesi floresan tarama ile oligodendrogenezisi nicelendirin ve demiyelinizan hastalıklara yönelik tedavi stratejileri geliştirin.

Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma

Daha fazla video keşfet