Name: CD146 İzolasyonu + Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Öğrenin, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanı ayırma kullanarak sıçan akciğerinden CD146 pozitif yerleşik mezenkimal stromal hücrelerin izolasyonunu. Bu yöntem akciğer hastalıkları ve doku onarımı araştırmaları için hızlı ve tekrarlanabilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JJPC, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) doktora sonrası bursu tarafından desteklenmektedir. MAM, Alman Ulusal Akademik Vakfı - Studienstiftung des Deutschen Volkes'ten bir başarı bursu alır ve EFCNI'den (Avrupa Yeni Doğan Bebek Bakımı Vakfı) bir hibe ile desteklenir. BT, CIHR, Kanada Akciğer Derneği, Kök Hücre Ağı ve Doğu Ontario Araştırma Enstitüsü Çocuk Hastanesi tarafından desteklenmektedir.

Tüm işlemler Ottawa Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (hayvan etik protokol Ohri-1696) tarafından onaylanmıştır. Hayvan bakımı, kurumsal prensiplere uygun olarak gerçekleştirildi. Akciğer Mezenkimal Stromal Hücrelerin 1. İzolasyon <ol><li> 50 ml tüp enzim karışımı hazırlayın: 30 U Nötr Proteaz tartmak, 2500 U kollajenaz I ve 500 U DNAz I. Bu miktarlar yetişkin bir fare veya sıçan yavru akciğerler için yeterli. kullanılana kadar 4 ° C &#39;de izolasyon ve mağaza gününde hazırlayın. </li><li> pentobarbital sodyum, intra-peritonal enjeksiyon ile günde 13 Kurban yavrular (0.2 mi, 65 mg / ml). bilinç oluşturmak için ayak tutam refleks kullanın. Aşağıda tarif edilen hayvanın ölümü, göğüs açılarak sağlanır. </li><li> çok dikkatli olmama,% 70 etanol ile hayvan püskürtülerek cildin dezenfekte ve dikkatle diyafram başlayan ve rostral tarafa doğru kesim, cerrahi makas kullanarak göğüs kafesi açmakakciğerlere zarar. Toraks erişim sağlamak için göğüs kafesi kesip alternatif hemostatik kelepçeler kullanarak açık göğüs kafesi yayıldı, ya da. </li><li> kalbi kaldırarak hayvan asıl bulbus olfaktoryusları alındı. kalbi kaldırmak için, küçük forseps ile timus ve kalp kavramak ve cerrahi makas ile bu kesip. artık kan kopmuş aort ve pulmoner arter çıkana kadar hemen ardından, bir gazlı bez ile kan emer. </li><li> aşağıdaki gibi toraks akciğerlere kaldırın: küçük forseps ile trakea tutun, daha sonra rostral tarafında cerrahi makas ile trakea sever. yavaşça toraks dışına akciğer paketini çekerken, akciğerler serbest göğüs kafesi boyunca sırt tarafında herhangi bir bağ dokusu kesip. </li><li> cerrahi makas ile diyafram boyunca keserek aorta ve yemek borusu akciğerlere Sever. Şimdi akciğerler tamamen toraks arınmış bir gazlı bez ile hafifçe kalan kan kaldırın. </li><li> sur ile trakea ve bronşlar kaldırjik makas ve dikkatli bir şekilde soğuk 35 mi% 30 sitrat-fosfat-Dekstroz Adenin (CPDA-1) pıhtı önleyici ihtiva eden 50 ml&#39;lik bir tüp akciğer lobları transferi (26.30 g trisodyum sitrat dihidrat, 3.27 g askorbik asit monohidrat, 2.22 g monosodyum dihidrojen fosfat, 31.80 g D-glikoz, 1 L 0.275 g adenin H2O arıtıldı; steril filtre kan ve ortadan kaldırmak için, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde kullanımdan önce 0.22 um membran filtre) kullanılarak çözelti. </li><li> % 30 CPDA-1 / PBS içinde 5 dakika çalkalandıktan sonra, 35 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) (RT) içeren yeni bir 50 ml&#39;lik tüpe akciğer transfer sitrat çıkarmak için hafifçe ters. içeren bir tüpe aktarın 35 mi Dulbecco PBS + Sodyum pirüvat + Glukoz (DPBS ++) (RT). Her durulama adımı yaklaşık 5 dakika sürer. Not: Kalsiyum klorür dihidrat 132.4 mg, magnezyum klorür heksahidrat 100 mg, potasyum klorür (susuz), 200 m: DPBS ++ ticari sipariş veya kadar yapılabilir 21 şug potasyum fosfat monobazik (susuz) 200 mg sodyum klorür (susuz) 8000 mg sodyum fosfat dibazik (susuz) 1,144.5 mg, D-glikoz, 1000 mg sodyum piruvat ve 36 mg 1 L arı H2O, pH 7.3. Steril filtre kullanmadan önce, bir 0.22 mikron membran filtresi kullanılarak çözelti. </li><li> (37 ° C önceden ısıtılmış) ++ 10 mi DPBS ekleme ve çözünene kadar hafifçe baş aşağı çevirerek enzim karışımı içinde çözülür. </li><li> Yeni 50 ml tüp akciğerlere aktarın ve ince kıyılmış kadar neşter kullanılarak tüp duvara akciğer doğrayın. dokuya (10 mi, yetişkin fare / sıçan yavru akciğer başına enzim karışımı /) enzim karışımı ekleyin tüpü sıkıca kapatın ve (yumuşak çalkalama ile 38 ° C&#39;de inkübe ya ısı karıştırıcı, çalkalanan bir su banyosu ya da su içinde düzenli manuel ajitasyon ile banyo). Fetal doku 60 dakika, çocuk / erişkin doku 90-120 dakika, fibrotik yetişkin doku 120-150 dk: süre doku tipine bağlıdır. </li><li> iki değerli katyonlar w şelat sindirim durduruni 200 Etilendiamintetraasetik asit ul (EDTA, 0.15 M, pH 7.4 ile yıkanır. Steril filtre kullanılmadan önce 0.22 um membran filtre kullanılarak çözeltisi). </li><li> 20 mi% 5 fetal sığır serumu (FBS) / PBS ilave edin ve yeni bir 50 mL tüp içine 100 mikron hücre süzgecinden Bütün süspansiyon geçmektedir. 40 ml kadar olan toplam hacim getiren 10 mi,% 5 FBS / PBS ile boru ve hücre süzgecinden yıkayın. </li><li> 500 xg, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> 40 ml% 5 FBS / PBS tekrar süspansiyon, (pelet açıkça görülebilir olmalı) Süpernatantı ve santrifüj adımı 1.13 tekrarlayın. </li><li> 4 mi,% 5 FBS içinde yeniden süspanse / PBS (RT) ve dikkatli bir şekilde fazla 3 mi yoğunluk gradyan maddesi tabakası (1.073 g / cm3), 15 ml&#39;lik bir tüpe 14. İyi bir interfaz elde etmek için, tek bir hücre süspansiyonu katman, çok düşük bir hızda&gt; 45 ° &#39;lik açıyla meydana çok önemlidir. </li><li> 900 xg&#39;de Santrifüj 20 dakika, orta (5/10) hızlanma, hiçbir yavaşlama, 19 ° C. </li><li> in mevcut hücreleri toplayınterphase ve steril 10 ml PBS bunları tekrar süspansiyon. </li><li> 500 xg&#39;de 5 dakika, 21 ° C santrifüj. </li><li> 500 mi αMEM,% 20 hacim / hacim FBS başına 2 mmol L-glutamin ile takviye edilmiş Süpernatantı ve 10 ml hücre pelletini önceden ısıtılmış tamamlanmış L-MSC kültür ortamı (minimum temel ortam Kartal, alfa modifikasyonu (αMEM), ve% 1 hacim / hacim Penisilin / streptomisin / Amfoterisin B </li><li> Tekrar santrifüj adımı 1.18. Daha sonra, önceden ısıtılmış taze kültür ortamı, 10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> Bu aşamada hücreler çoğu plastik yapışık değildir, çünkü yüksek bir yoğunlukta bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ve plaka kullanarak hücreleri sayın. Sıçan yavru akciğer hücreleri 1-2 önce tohum ekme yoğunluğu yeterince yoğun iken tam kaplama yoğunluğu X, örneğin, bir yetişkin fare akciğer hücreleri 10 5 hücre / cm2&#39;de tohumlanmıştır hayvanın türüne ve yaşına bağlıdır 10 4 hücre / cm2 </sup&gt;. 0.2 ml L-MSC kültür ortamı / cm 2 kullanın. </li><li> Kültürü L-erişkin nemlendirilmiş bir% 5 O2,% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C &#39;de. </li><li> PBS ile bir kez durulama sonra ortam ilk ekimden 24 saat sonra, ve daha sonra, her 3 günde bir değiştirin. Hücreler kökenli hayvan bağlı olarak ortalama 3-5 gün sürer% 80-90 izdiham kadar kültürlü olmalıdır. Yüksek izdiham fibroblastlar içine farklılaşmasını teşvik edecektir. </li></ol> CD146 + Akciğer Mezenkimal Stromal Hücrelerin 2. Seçim <ol><li> Ikincil antikor ile manyetik boncuk kaplanması <ol><li> Steril koşullarda cryovial Coat yuvarlak tabanlı 10 ug ikincil antikor / 100 ul manyetik boncuk oranında biyotinlenmiş sekonder antikor ile, manyetik boncuklar, 2 ml&#39;lik steril. Beklenen 0.5 x 10 6 hücre başına 10 ul ikincil antikoru kullanarak, ve 100 ul manyetik boncukları ve 10 ug antikor, en az kullanın. Not: oranıüreticileri arasında farklılık gösterebilir boncuk hacmi başına kullanılan antikorlarının verilmesinin, seçim boncuk için üreticinin talimatlarına başvurun. Bu protokol, bu protokolün optimizasyonu kullanılan boncuk ve antikor masaya 1 bakınız. </li><li> Oda sıcaklığında / 30 dakika (RPM), 30 dakika için bir döner Örnek karıştırıcı içinde inkübe edin. </li><li> 1.5 ml steril% 0.1 sığır serum albümini (BSA) boncuk tekrar / PBS ve 3 ml transfer yuvarlak tabanlı tüp (tüp akış sitometrisi). Ek bir 1.5 mi% 0.1 BSA / PBS ile dondurarak saklamaya uygun vialler durulayın ve 3 ml tüp aktarın. </li><li> Uygun bir mıknatıs tüp yerleştirin ve tüm boncuk tüpün arka duvara bağlı ve çözelti berrak kalır kadar 2 dakika bekleyin. 3 ml% 0,1 BSA / PBS ile iki kez akış ve tekrar yıkama çıkarın. </li><li> ışıktan korumalı 4 ° C &#39;de 3 mi% 0.1 BSA / PBS içinde boncuklar ve mağaza, yeniden süspanse edin. 5 gün içinde kullanın. </li></ol></li><li> CD146 + L-mezenkimal Etiketleme<ol><li> yumuşak olmayan bir tripsin çözeltisi kullanılarak PBS ile durulandıktan sonra mezenşimal hücrelerin hasat. Not: Cilt kültür şişesi büyüklüğüne (0.2 ml / cm2, orta ya da PBS) bağlıdır. <ol><li> kültür ortamı çıkarın ve steril PBS ile hücreler üç kez yıkayın. </li><li> Yumuşak olmayan tripsin çözeltinin uygun hacmi ekleyin (Tablo 1 e bakınız). Hücreler müstakil kadar Tablo 1 &#39;de çözeltisi kullanıldığında, yaklaşık kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 10 dakika kuluçkalayın. </li><li> 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca, L-MSC kültür ortamı, ve santrifüj ekleyerek enzimi. </li></ol></li><li> % 0.1 BSA / PBS içinde, tekrar süspansiyon hücreleri Süpernatantı ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak. Not:% 0.1 BSA hacmi / PBS kültür şişesi büyüklüğüne bağlıdır: 5 ya da 10 mi% 0.1 BSA / PBS için amaçlanmıştır. </li><li> Adımı yineleyin 2.2.2 ve 3 ml% 0,1 BSA / PBS (bloklar un hücrelerin özel miktarda tekrar süspansiyonBelirli bağlanma yerleri ve) hücrenin hayatta kalabilmesi için. hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> birincil anti-CD146 antikoru ile alt tüp yuvarlak bir 3 ml hazırlayın, ve buz üzerinde tutmak. Not: hücrelerin özel bir miktarda ilave edilir ki ilk antikor konsantrasyonu kullanılır antikor bağlıdır. Önerilen anti-sıçan CD146 antikoru için bakınız Tablo 1. </li><li> primer antikor ile tüp aşama 2.2.3 hücrelerin toplam hacim. Sıkıca kapatmak ve 15 rpm, 4 ° C&#39;de dönen bir örnek mikserde 30 dakika kuluçkalayın. </li><li> 500 xg, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje hücreleri, 3 mi% 0.1 BSA / PBS içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın. Tekrarlayın santrifüj adımı. </li><li> Bölüm 2.1&#39;de talimatlara göre hazırlandı ve 15 rpm, 4 ° C&#39;de dönen bir örnek mikserde 30 dakika inkübe edildi ikincil antikor kaplı boncuklar içeren 3 ml çözelti içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol></li><li> CD146 + L-mezenkimal seçme<ol><li> Mıknatıs üzerinde etiketli CD146 + L-MKH&#39;lerin içeren tüp yerleştirin. pozitif hücrelerin tüpün arkasına çizilecektir. tüp hareketli veya boncuklar dokunmadan yavaşça steril bir Pasteur pipeti (bu toplanır ve deneysel tasarım göre atılabilir olarak) negatif hücreleri ile süpernatant hasat edilir. </li><li> mıknatıstan tüpü çıkarın ve 3 ml% 10 BSA / PBS hücrelerin tekrar süspansiyon. Adım 2.3.1 açıklanan seçim prosedürü tekrarlayın. dört kez daha (Σ 5 Seçim aşama). </li><li> Önceden ısıtılmış L-MSC kültür ortamında CD146 + L-mezenkimal yeniden süspanse edin ve mıknatıs geri döner. </li><li> Uygun büyüklükte bir kültür şişesi (0.2 ml / cm2) &#39;de, L-MSC kültür ortamı ve plakadaki supernatant, tekrar süspansiyon çıkarın. Genel bir kural olarak, aynı boyutta bir kültür şişesi içinde plaka hücreleri olan hücreler Boncuk seçiminden önce kaldırılmıştır. CD146 + L-MKH sayısı ve bu nedenle kaplama yoğunluğu, olacakKaynak hayvanın yaşı, türler ve suşuna bağlıdır. Her zaman ~ 5,000 hücre / cm2 bir kaplama yoğunluğu hedefliyoruz. Not: boncuk hücre büyümesini rahatsız etmeyecek ve hücreler çoğalmaya olarak yavaş yavaş kaybolacaktır. </li></ol></li></ol> 3. Dondurucu Hücreler <ol><li> Aşağıdaki dondurma ortamı kullanın:% 20 FBS,% 12.5 (% 0.9 NaCI içinde% 10 pentastarch)% 60 pentastarch çözeltisi CPDA-1,% 2.5 NaCI (% 0.9),% 5 dimetil sülfoksit (DMSO) 22. Not: tüm malzemeyi varsa,% 5 DMSO,% 30 FBS ve% 65 αMEM içeren bir çözüm iyi bir alternatiftir. </li><li> 1 ml her bir cryovials 0.5 x 10 6 hücre / mL, kısım yeniden süspanse hücre bir donma kap kullanılarak -80 ° C &#39;de O / N dondurma. </li><li> Sonraki gün, bir sıvı azot depolama tankı transfer. </li></ol> 4. Çözülme Hücreler <ol><li> 5 dakika için 37 ° C su banyosu içinde hücreleri bir şişe çözülme. </li><li> 10 ml içinde süspanse edin hücreleriönceden ısıtılmış bir kültür ortamı ile 500 x g&#39;de 5 dakika, 21 ° C&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Süpernatantı ve 10 ml kültür ortamı içinde hücre pelletini. Havalandırmalı kap hücre kültürü içinde tohum hücreleri, 0.2 ml / cm2 ortam 5000 hücre / cm2&#39;de şişeler muamele (örneğin, 75 cm 2 şişeye 15 mL) eklenmiştir. </li><li> % 5 Kültür hücreleri O2,% 5 hasat ve / veya deneysel kullanım için% 80-90 konfluent kadar CO2. Aşırı confluency farklılaşmasını neden olacaktır. 5.000 hücre / cm 2 ekim yaparken, L-MKH kültürü 3-4 gün içinde% 80-90 confluency ulaşacaktır. </li></ol>

<ol><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Wei, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXF1+mediates+mesenchymal+stem+cell+fusion-induced+reprogramming+of+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells.</a> Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).</li>
<li>Marriott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2pos+lung+mesenchymal+stem+cells+are+a+novel+pericyte+subpopulation+that+contributes+to+fibrotic+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).</li>
<li>Collins, J. J., Thebaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+mesenchymal+stromal+cells+in+development+and+disease%3A+to+serve+and+protect%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).</li>
<li>McQualter, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27, 623-633 (2009).</li>
<li>Holmes, C., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+stem+cell+antigen-1%3A+expression%2C+function%2C+and+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma.</a> Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).</li>
<li>Gottschling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+non-small+cell+lung+cancer--different+from+others%3F+Insights+from+comparative+molecular+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses.</a> Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).</li>
<li>Bertoncello, I., McQualter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+clonal+assay+of+adult+lung+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells.</a> Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).</li>
<li>Jun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+bleomycin-induced+fibrosis+is+associated+with+loss+of+resident+lung+mesenchymal+stem+cells+that+regulate+effector+T-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation.</a> Stem Cells. 29, 725-735 (2011).</li>
<li>Majka, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+resident+pulmonary+stem+cells%3A+form+and+function+of+the+lung+side+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population.</a> Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).</li>
<li>Hennrick, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cells+from+neonates+show+a+mesenchymal+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype.</a> Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).</li>
<li>Salama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+governs+proliferation+and+migration+of+bronchoalveolar+lavage-derived+lung+mesenchymal+stem+cells+in+bronchiolitis+obliterans+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome.</a> Transplantation. 92, 155-162 (2011).</li>
<li>Hoffman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-derived+mesenchymal+stromal+cell+post-transplantation+survival%2C+persistence%2C+paracrine+expression%2C+and+repair+of+elastase-injured+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung.</a> Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).</li>
<li>Grisendi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-manufactured+density+gradient+media+for+optimized+mesenchymal+stromal%2Fstem+cell+isolation+and+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion.</a> Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).</li>
<li>Bardin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Endo+1%2C+a+pan-endothelial+monoclonal+antibody+recognizing+a+novel+human+endothelial+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+antigens%22%5BJournal%5D)">S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen.</a> Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).</li>
<li>Covas, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+obtained+from+diverse+human+tissues+share+functional+properties+and+gene-expression+profile+with+CD146%2B+perivascular+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts.</a> Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).</li>
<li>Russell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+high-capacity+assay+to+quantify+the+clonal+heterogeneity+in+trilineage+potential+of+mesenchymal+stem+cells+reveals+a+complex+hierarchy+of+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment.</a> Stem Cells. 28, 788-798 (2010).</li>
<li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+CD146%2B+multipotent+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells.</a> Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).</li>
<li>Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+distinguishing+mesenchymal+stem+cells+from+fibroblasts+are+downregulated+with+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging.</a> Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).</li>
<li>McGowan, S. E., Torday, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+lipofibroblast+%28lipid+interstitial+cell%29+and+its+contributions+to+alveolar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development.</a> Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+formation+and+isolation+of+pure+lines+with+poliomyelitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses.</a> The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).</li>
<li>Hayakawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%25+dimethyl+sulfoxide+%28DMSO%29+and+pentastarch+improves+cryopreservation+of+cord+blood+cells+over+10%25+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO.</a> Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+self-renew+and+differentiate+according+to+a+deterministic+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy.</a> PLoS One. 4, 6498(2009).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+tissues+by+adult+stem%2Fprogenitor+cells+%28MSCs%29%3A+controversies%2C+myths%2C+and+changing+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).</li>
<li>Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).</li>
<li>Boron, W. F., Boulpaep, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoron%2C+WF+%22Medical+Physiology.+2nd+edn%22">Medical Physiology. 2nd edn</a>. , Saunders Elsevier. (2009).</li>
<li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter%3F+Small+molecules+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).</li>
<li>Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+alveolar-capillary+O2+partial+pressure+gradient+by+using+15NO%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide+%3A+biology+and+chemistry+%2F+official+journal+of+the+Nitric+Oxide+Society%22%5BJournal%5D)">Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO.</a> Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).</li>
<li>Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+in+stem+cell+biology%3A+a+critical+component+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche.</a> Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).</li>
<li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).</li>
<li>Le, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+tumor+oxygenation+and+gene+expression+in+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers.</a> Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).</li>
<li>Krampera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+characterization+of+multipotent+mesenchymal+stromal+cells-The+International+Society+for+Cellular+Therapy+%28ISCT%29+working+proposal%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal.</a> Cytotherapy. , (2013).</li>
<li>Corselli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+perivascular+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).</li>
<li>Russell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Surface+Expression+of+Neuron-Glial+Antigen+2+%28NG2%29and+Melanoma+Cell+Adhesion+Molecule+%28CD146%29+in+Heterogeneous+Cultures+of+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue engineering. Part A. , (2013).</li>
<li>Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).</li>
<li>Dagur, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+interleukin-17+by+CD8%2B+T+cells+expressing+CD146+%28MCAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM).</a> Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).</li>
<li>da Silva Meirelles, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+adipose+tissue+pericytes+and+mesenchymal+stromal+cells+display+a+very+similar+gene+expression+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+MSCs+are+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">All MSCs are pericytes.</a> Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).</li>
<li>McGowan, S. E., McCoy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibroblast+lipid+storage+and+myofibroblast+phenotypes+during+alveolar+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).</li>
<li>Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+platelet-derived+growth+factor+receptor+alpha+expression+in+alveolar+fibroblasts+during+realveolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).</li>
<li>Bonyadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitor+self-renewal+deficiency+leads+to+age-dependent+osteoporosis+in+Sca-1%2FLy-6A+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).</li>
<li>Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+and+progenitor+defects+in+Sca-1%2FLy-6A-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice.</a> Blood. 101, 517-523 (2003).</li>
<li>Chow, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+resident+lung+mesenchymal+stem+cells+contribute+to+pulmonary+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+circulation%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling.</a> Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Birincil L-MKH izolasyonu ve kültürü daha iyi işlev ve hücresel düzeyde diğer hücre popülasyonlarının ile olan etkileşimlerini ve akciğer gelişimi, sağlık ve hastalık rollerini anlamak için bir fırsat sunuyor. Bu, belirli bir hücre tek işaretleyici olmaması neredeyse imkansız yerinde bu hücrelerin çalışma yapar, bu özellikle önemlidir. Tüm ilköğretim hücre popülasyonlarının olduğu gibi, kimse bu hücreler (24 gözden) kültür 19 tutulur artık onların karakteri değiştirmek için daha muhtemel o...

Mezenkimal stromal hücreler (MKH) giderek akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere, hastalıkların geniş bir yelpazede terapötik potansiyeli için tanınır. kemik iliği ve eksojen hücre tedavisinde göbek kordonu MKH kullanımı yanında, aynı zamanda yerleşik doku MKH tamir ilgi ve rejeneratif potansiyeli artmaktadır. gelişimi sırasında, akciğer olmak üzere, mezenşimin gelişimsel ipuçları önemli bir kaynak olduğunu ve yerleşik MKH bu merkezinde olması olası bir aday vardır. Ayrıca, kanıtlar ikamet MKH kanser 1,2 ve fibrozis 3 de dahil olmak üzere, yetişkin hastalıkları altüst ortaya çıkmaktadır. Bu yerleşik doku MKH çalışmanın ana engel bu hücrelerin 4 izolasyonu ve tanımlanması için net bir belirteç olmaması. Kök hücre antijenini-1 (Sca-1) doku kök hücrelerin bir çeşitliliği için bir markör olarak farelerde tespit edilmiştir, ve L-MSC 5 izole edilmesi için de kullanılabilir, ancak ne yazık varBaşka bir tür 6 ortologlarını da bilinir. Araştırmacılar akciğer dokusu ya da sıvı ya da L-MSC izolasyonu için farklı yalıtım çeşitli yöntemler bildirilmiştir. / CD45 - / - CD90 + hücreleri 7, CD31 - / CD45 - / epitelyal hücre yapışma molekülü (EpCAM) - Bu, CD31 seçilmesi (FACS) göre yöntem flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması değişir / Sca-1 + hücreleri 8, çok ilaca dirençli taşıyıcı kıyılmış dokusu 13 takım plastik bağlılık 11,12 ve göç ATP bağlayıcı kaset G (ABCG2) pozitif hücreler 9 veya Hoechst 33.342 boya efflux 10. Burada sunulan yöntemin avantajı pek çok kat bulunmaktadır. Yumuşak enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanı 14 kullanılarak, tek bir MKH&#39;lerin arasında, ancak epitelial veya endotelial hücreleri hariç yoğunluğu aralığının tüm hücreleri elde edilir. sonraki plastik bağlılık adım sadece mesench sağlarymal hücreleri lökosit ortadan kaldırarak, yapışır ve kültür kalmak. Bu hücreler CD146 ifade yok gibi en önemlisi, ancak CD146 + seçim aşaması, fibroblast ortadan kaldırılması için izin verir. Hücre yapışma molekülü CD146 ekspresyonu pozitif multipotency ile ilişkilidir ve bir mezenkimal hücre popülasyonu 15-19 den fibroblastlar ayıklamak için iyi bir belirteç etmektir. Sadece MSC değil, aynı zamanda lipofibroblasts 5,20 ifade edilmediği gibi bu, bir seçme markeri olarak CD90 ile bir avantajdır. o hücreler üzerinde nazik olduğu gibi bu protokolde açıkça, bir manyetik boncuk seçimi seçmiş ve tüm prosedür steril şartlarda yapılabilir. sonucudur yönteme karşı, bu izolasyon yönteminin bir başka önemli avantajı, sonucudur yöntemi için bir ay ya da daha fazla karşı bu 6-10 gün, nispeten hızlı olmasıdır. Üç beş gün ilk izolasyondan sonra mezenkimal nüfus CD146 + sele hazır<html> ction; Başka bir üç ila beş gün sonra CD146 + hücreleri deneyler için kullanılmaya hazır ya da daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. MKH uzun ex vivo kültür 19 fibroblastlar doğru transdifferentiate olarak kültür azalmış zaman hücrelerinin kalitesini artırır. Son olarak, çünkü protokol doğası, sindirim enzimleri ve inkübasyon süresi seçilerek ayarlanması ile diğer organ sistemleri sadece uygun antikorlar seçerek veya hatta diğer türler için bu yöntemi uygulamak mümkündür. Bu izolasyon yönteminin ayrıntılı bir protokol aşağıda verilmiştir ve izolasyon ve CD146 + alt populasyonun sonraki seçimi genel şematik bir görünümüdür, sırasıyla Şekil 1 A ve 1 B &#39;de verilmektedir. Ayrıca, ayrıntıları bu hücrelerin dondurulması ve çözülmesi, geçiş için dahil edilmiştir. reklam / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; . Pulmoner mezenkimal hücreler (A) ve daha sonraki CD146 + hücre seçimi (B) min = dakika izolasyonu Şekil 1. Şematik genel bakış; EDTA = Etilendiamintetraasetik asit; 2. Ab = ikincil antikor; a-CD146 antikor = birincil anti-CD146 antikor; -ve hücreleri = CD146 negatif hücrelerin; + hücreler = CD146 pozitif hücreler ettik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Nötr Proteaz</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>İzolasyon gününde hazırlanın ve 4 ° C'de saklayın; </td></tr><tr><td>Kollajenaz I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td> kullanılana kadar C <td>İzolasyon gününde hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın; DNAse</td></tr><tr><td>I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td> kullanılana kadar C <td>İzolasyon gününde hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın; </td></tr><tr><td>Pentobarbital sodyum (Ötenazi)</td> <td>Bimeda-MTC Hayvan Sağlığı A.Ş., Dublin, İrlanda</td> <td>-</td> <td>20-30 g arasındaki sıçan yavruları için 0.2 ml kullanın; daha büyük hayvanların daha fazlasına ihtiyacı olabilir.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS + Sodyum-piruvat + Glikoz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14287-072</td><td>Bu D-PBS'de bulunan kalsiyum ve magnezyum enzimatik sindirimi kolaylaştırdığından, bu D-PBS'yi kullanmak çok önemlidir</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5446-52</td><td>Yoğunluk gradyan ortamı. İyi bir interfaz elde etmek için, tek hücreli süspansiyonun katmanlanmasının >45 ° C'de gerçekleşmesi çok önemlidir; açı çok düşük hızda ve sonraki santrifüjleme 19 ° C'de yapılır.</td></tr><tr><td>&alfa; MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15240-062</td><td>Penisilin / Streptomisin / Fungizone</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11205D</td><td>Manyetik boncuklar</td></tr><tr><td>biyotinile poliklonal tavşan-anti-fare IgG</td><td>Dako, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Aşağıda açıklanan anti-sıçan CD146 antikoru ile eşleşen biyotinile edilmiş ikincil antikor</td></tr>, <tr><td>DynaBeads ile kullanılması önerilen DynaMag5-magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12303D</td><td>Magnet. NOT: mıknatıs üreticiye göre seçilmelidir. Tercih edilen mıknatıs boncuklarının talimatları.</td></tr><tr><td>TrypLE ekspres&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12605-028</td><td>Nazik tripsin olmayan alternatif, 1 ml TrypLE express / 25 cm 2 yüzey alanı kullanın. Ayrıldıktan sonra, 3 ml TrypLE</td></tr><tr><td>anti-sıçan CD146 antikoru</td><td>Lifespan Biosciences Inc.'i</td> inaktive etmek için 10 ml L-MSC kültür ortamı yeterlidir.<td>C35841</td><td>12.5 ve mu; 0,5 x 106 hücre başına l</td></tr><tr><td>Pentaspan (pentastarch çözeltisi)</td><td>Bristol-Myers Squibb</td> <td>Kanada-Yerel</td> <td>kan bağışı hizmetleri veya hematoloji departmanları aracılığıyla elde edilebilir. Alternatif olarak, %0.9 NaCl ile 1:1 oranında seyreltilmiş PSI %20 Pentastarch çözeltisi (Koruma Solüsyonları, PST001) kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty dondurma kabı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>L-MSC'leri gece boyunca -80 ° C'de dondururken canlılığı artırır; Ç</td></tr></tbody></table>

cd146 İzolasyonu<sup&gt; +</supsıçan akcigerlerinden&gt; resident akciğer mezenkimal stromal hücreler

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mezenkimal stromal hücreler (MKH) giderek akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere, hastalıkların geniş bir yelpazede terapötik potansiyeli için tanınır. kemik iliği ve eksojen hücre tedavisinde göbek kordonu MKH kullanımı yanında, aynı zamanda yerleşik doku MKH tamir ilgi ve rejeneratif potansiyeli artmaktadır. Ayrıca, büyük olasılıkla normal organ gelişiminde rol var ve hastalık rolleri, bir fibrotik doğa ile özellikle atfedilmiştir. Bu yerleşik doku MKH çalışmanın ana engel bu hücrelerin izolasyonu ve tanımlanması için net bir belirteç olmaması. Burada anlatılan izolasyon tekniği akciğer ikamet MSC (L-MKH) birden özelliklerini uygular. sıçanların kurban üzerine, akciğerler çıkarıldı ve kan kaldırmak için birden çok kez durulanır. neşter mekanik ayrışma ardından, akciğerler kollajenaz tip I, nötr proteaz ve DNaz tip I obtaine bir karışımını kullanarak 2-3 saat sindirilirD tek bir hücre süspansiyonu daha sonra yıkandı ve yoğunluk gradyan ortamı (yoğunluk 1.073 g / ml) üzerine yayıldı. Santrifüj işleminden sonra, interfaz gelen hücreler yıkanır ve kültürü ile işlenmiş balonlarına kaplanmıştır. Hücreler, fizyolojik,% 5 O2 4-7 gün% 5 CO2 şartları için kültürlenir. Fibroblastlar (CD146 -) tüketmek ve CD146 + hücreleri yalnızca L-MSC&#39;ler (CD146 +), pozitif seçim popülasyonu sağlamak için manyetik boncuk seçim yoluyla gerçekleştirilir. Özet olarak, bu prosedür, güvenli başka in vitro çalışma ve işleme için primer L-MSC nüfusu üretir. Çünkü protokol doğası, kolayca diğer deneysel hayvan modellerinde tercüme edilebilir.

MKH, yoğunluk ve plastik bağlılığın en güvenilir fiziksel özelliklerinin İki, L-MKH&#39;lerin içeren akciğer mezenkimal hücre fraksiyonu elde etmek için bu protokolün ilk bölümünde kullanılmaktadır. yoğunluk gradyan interfaz akciğer mezenkimal hücrelerin yanı sıra monosit ve makrofajlar dahil olsa da, plastik yapışma kültür 3-5 gün sadece akciğer mezenkimal hücreler kalmasını sağlar izledi. Nitekim bu hücre popülasyonu klasik MSC yüzey belirteçleri CD73, CD90 ve CD146 ifade ve artık herh...

Bu protokol, enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma plastik uyumu ve CD146 + manyetik boncuk seçimi aracılığıyla, sıçanlardan primer akciğer yerleşik mezenkimal stromal hücreler elde etmek için bir izolasyon tekniği tarif etmektedir.

CD146 İzolasyonu<sup&gt; +</supSıçan Akcigerlerinden&gt; Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Bu prosedürün genel amacı; enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanı ayırımı, plastik adezyonu ve boncukla sıralama kombinasyonunu kullanarak, sıçan akciğerinden izole edilen CD146 pozitif resident Mezenkimal Stromal Hücrelerin veya MSC'lerin in vitro karakterizasyonunu yapmaktır. Bu yöntem, akciğer MSC'lerinin hastalık durumunda nasıl enfekte olduğu ve immün modülasyon ile doku onarımına nasıl katkıda bulunduğuyla ilgili pulmoner hastalıklar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları; hızlı, tekrarlanabilir olması ve farklı deneysel hayvan türlerine veya dokulara kolayca uygulanabilmesidir.Prosedürün ilk adımları, laboratuvarımdan araştırma görevlisi Arul Vadivel tarafından gösterilecektir. Akciğeri torakstan çıkarmak için trakeyı küçük bir pens ile tutun ve trakeyı rostral taraftan ayırmak için cerrahi makas kullanın. Ardından, akciğer paketini nazikçe torakstan dışarı çekerken, göğüs kafesi boyunca dorsal taraftaki tüm bağ dokusunu kesin.Akciğerleri aortadan ve özofagustan ayırmak için diyafram boyunca kesin ve akciğer dokusundaki kalıntı kanı nazikçe temizlemek için gazlı bez kullanın. Makas yardımıyla trakeayı ve bronşları çıkarın ve kan ile kalıntıları temizlemek için akciğer loblarını 35 milliliter soğuk CPDA antikoagülan ve PBS içeren 50 milliliter'lik bir tüpe dikkatlice yerleştirin. Beş dakika sonra, akciğerleri 35 milliliter steril, oda sıcaklığındaki PBS içeren yeni bir 50 milliliter'lik tüpe aktarın.Sitratı uzaklaştırmak için tüpü nazikçe altüst edin. Beş dakika sonra akciğerleri, sodyum piruvat ve glukoz eklenmiş, oda sıcaklığında 35 mL steril Dulbecco's PBS içeren yeni bir 50 mL'lik tüp içinde yıkayın ve nazikçe altüst edin. Ardından akciğerleri başka bir 50 mL'lik tüpe aktarın ve bir bistüri kullanarak dokuyu tüpün duvarına karşı ince parçalar halinde kıyın.Maksimum hücre verimi sağlamak için dokuyu çok küçük parçalara bölmek çok önemlidir. Ayrıca, güçlü bir hücre canlılığı sağlamak için hızlı çalışılmalıdır. Dokunun tamamı kıyıldıktan sonra tüpe taze hazırlanmış enzim ekleyin ve kapağı sıkıca kapatın.Ardından doku parçalarını, uygun sindirme süresi boyunca 38 °C'de hafif ajitasyonla inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, sindirme işlemini 200 µL steril filtrelenmiş EDTA ile durdurun. Doku süspansiyonuna FBS takviyeli 20 mL PBS ekleyin ve tüm süspansiyonu 100 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir 50 mL'lik tüpe aktarın.Ardından, sindirim tüpünü ve hücre süzgecini 10 milliliters FBS/PBS ile durulayın ve yıkama işlemini filtrelenmiş bir örnekle gerçekleştirin. Hücreleri iki kez santrifüjledikten sonra, ikinci peleti oda sıcaklığındaki dört millimeters FBS/PBS içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri, 45 dereceden büyük bir açıyla üç milliliters yoğunluk gradyanı ortamının üzerine yavaşça katmanlandırın.Hücre süspansiyonu ile yoğunluk gradyanı medyumu arasında 45 dereceden büyük bir açıyla vurma işlemi, hücrelerin gradyan medyumuyla karışmasına neden olan makaslama kuvvetlerini önleyerek tabakaların oluşmasını sağlar; eğer karışma meydana gelirse yoğunluk gradyanı oluşmaz. Hücreleri santrifüj ile ayırın ve ara fazı toplayın. Ardından akciğer MSC'lerini 10 milliliters steril PBS ile yıkayın ve ekim için peleti önceden ısıtılmış tam akciğer MSC kültür medyumunda yeniden süspande edin.CD146 pozitif hücre popülasyonunu izole etmek için, öncelikle steril koşullar altında, iki mililitrelik steril yuvarlak tabanlı bir kriyoviyal içerisinde, her 100 mikrolitre manyetik boncuk için 10 mikrogram biotinillenmiş sekonder antikor ile manyetik boncukları kaplayın. Boncukları ve antikoru, bir döner numune karıştırıcıda oda sıcaklığında, 30 RPM'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, antikor konjuge edilmiş boncukları 1,5 mililitre BSA takviyeli PBS içinde yeniden süspanse edin ve boncukları üç mililitrelik yuvarlak tabanlı bir akış sitometrisi tüpüne aktarın.Kriyo tüpünü ek 1,5 mililitre BSA/PBS ile durulayın ve yıkama solüsyonunu boncuklarla birlikte içeri çekin. Tüm boncuklar tüpün arka duvarına yapışana ve solüsyon berraklaşana kadar tüpü iki dakika boyunca uygun bir mıknatıs üzerinde bekletin. Ardından süpernatantı uzaklaştırın ve boncukları üç mililitre BSA/PBS ile iki kez daha yıkayın.MSC'leri takviye edilmemiş PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra hücreleri, 37 °C'de 10 dakika boyunca nazik, tripsin içermeyen bir çözelti ile işleme tabi tutun. Tüm hücreler ayrıldığında, taze akciğer MSC kültür ortamı ekleyin ve hücreleri santrifüjle çöktürün.Peleti PBS artı BSA içerisinde yeniden süspande edin ve hücreleri sayın. Ardından hücreleri CD146 primer antikoru içeren üç mililitrelik bir tüpe aktarın, tüpün kapağını kapatın ve hücreleri 15 RPM'de ve dört santigrat derecede döner bir numune karıştırıcıda inkübe edin. İnkübasyonun sonunda hücreleri üç mililitre PBS artı BSA ile iki kez yıkayın ve ikinci peleti üç mililitre sekonder antikor konjuge boncuklar içerisinde yeniden süspande edin.Dört santigrat derecede, döner numune karıştırıcıda 30 dakika beklettikten sonra, tüpü mıknatıs üzerine yerleştirin ve negatif hücreleri yavaşça ve dikkatle uzaklaştırmak için steril bir pasteur pipeti kullanın. Ardından, tüpü mıknatıstan ayırarak hücreleri üç mililitre BSA takviyeli PBS içinde yeniden süspande edin ve seçim işlemini dört kez daha tekrarlayın. Son negatif hücre uzaklaştırmasından sonra, CD146 pozitif akciğer MSC'lerini önceden ısıtılmış kültür ortamında yıkayın.Son olarak, boncuklarla konjugle edilmiş hücreleri taze akciğer Mezenkimal Stromal Hücre kültür ortamında yeniden süspande edin ve uygun boyutlu bir kültür balonuna santimetrekare başına 5.000 hücre gelecek şekilde yerleştirin. Plastiğe tutunmayı takiben üç ila beş günlük kültürleme, CD90, CD73 ve CD146 pozitif akciğer MSC'ler için yoğunluk gradyent ayrımı interfaz popülasyonunu zenginleştirir.Ayrıca, bu hücreler üç klasik MSC soyu boyunca farklılaşan, kemik iliği veya diğer MSC alt kümeleri için genellikle bildirilen değerden çok daha yüksek olan yaklaşık %30'luk bir koloni oluşturma birimi verimliliğine sahiptir. CD146 pozitif alt popülasyonda yapılan pozitif seçilim, MSC ile ilişkili yüzey belirteçlerini eksprese eden hücrelerin daha yüksek yüzdesiyle kanıtlandığı üzere, akciğer MSC'leri açısından oldukça zenginleştirilmiş bir hücre popülasyonu ile sonuçlanmaktadır. Bu hücreler, CD146 seçimi öncesinde elde edilen toplam Mezenkimal hücre popülasyonuna kıyasla, özellikle Kondrojenik soy hücrelerinde önemli ölçüde daha yüksek bir koloni oluşturma potansiyeli ve daha güçlü bir farklılaşma yanıtı göstermektedir.Dikkat çekici bir nokta olarak, bu akciğer MSC'leri, çok az sayıda gerçek adiposit oluştururken, muhtemelen hem akciğer gelişimi hem de alveoler tip iki hücre desteği için kritik olan lipofibroblast soyunu yansıtan, küçük lipid vezikülleriyle dolu çok daha fazla iğ şeklinde hücre sergiler. Bu teknik bir kez kavrandığında, verim hayvanın yaşına ve türüne bağlı olmakla birlikte, altı ila 10 gün içinde CD146 pozitif akciğer MSC'leri elde edilebilir. Bu prosedür uygulanırken, hücrelerin canlılığını korumak için hızlı çalışmak önemlidir.Bu prosedürü takiben, MSC'lerin T hücresi proliferasyonunu inhibe etme ve yara iyileşmesini destekleme etkinliği hakkında ek soruları yanıtlamak için karışık lenfosit reaksiyonu veya yara iyileşmesi SA'ları gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra; enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanı ayrımı, plastik adezyonu ve boncukla ayıklama kullanarak CD146 pozitif akciğer MSC'lerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-cd146-resident-lung-mesenchymal-stromal-cells-from-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Rat MKH, femur ve tibiaları izole edilmiş ve daha sonra manyetik hücre sıralama ile zenginleştirilmiş. Sıralama hücreler flow sitometri ile yüzey belirteçlerinin ifade teyit edildi. Bu hücreler de klonal yoğunluğu tek koloniler oluşturmak için kültüre edildi ve daha sonra bu kolonilerin klonlama silindir ile ayrıldı.

İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

Bu yazıda, fare ikamet akciğer mezenkimal kök hücreler (akciğer MSC), genişleme, karakterizasyonu ve immünomodülatör özellikleri analiz izolasyonu göstermektedir.

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Fare akciğer dendritik hücreler yüksek oranda saflaştırılmış açıklanmıştır. Özgül ağırlık, geleneksel dendritik hücre alt izolasyon verilir.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Bu makalede, primer akciğer endotel hücreleri yenidoğan farelerden izole edilmiş ve kültürlenmiştir.

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Çene kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler, çeşitli farklılaşma, kendini yenileme ve immün modülasyonda önemli işlevlere sahiptir. Gen terapisi, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta öncü hücrelerin çok önemli bir rezervuarı olarak ortaya çıkmışlardır. Burada, sıçanlarda çene kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek için benzersiz bir yöntem sunuyoruz.

Sıçan Çene Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü Tekniği

Bu protokol, canlı bağışıklık ve bağışıklık dışı popülasyonların fare akciğerinden kararlı bir durumda ve grip enfeksiyonunu takiben izolasyonunu detaylandırır. Ayrıca epitelyal ve miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejileri sağlar.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Aşağıda açıklanan protokol, spesifik retinoid otofloresan kullanarak ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması kullanarak retinoid içeren hücreleri oldukça heterojen akciğer hücresi popülasyonlarından izole etmenin basit ve etkili bir yoludur.

Akciğer Retinoid İçeren Hücrelerin Hücre Ayıklama ile İzolasyonu

Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

İlköğretim hepatositler bir fizyolojik ilgili deneysel sistem biyokimyasal, moleküler ve metabolik fonksiyonlarını değerlendirmek için değerli bir araç sağlar. Biz sürekli to1.0 × 10 kadar yaşayabilir hepatositler üretir yerinde karaciğer perfüzyon, sıçan için güvenilir bir protokol...

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Öğrenin, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanı ayırma kullanarak sıçan akciğerinden CD146 pozitif yerleşik mezenkimal stromal hücrelerin izolasyonunu. Bu yöntem akciğer hastalıkları ve doku onarımı araştırmaları için hızlı ve tekrarlanabilir bir protokol sunar.

CD146 İzolasyonu

Daha fazla video keşfet