Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Bu prosedürün genel amacı, araştırmacıların bir floresan proteini, CAS9 ve sgRNA'ları eksprese eden virüsleri tasarlamalarını ve paketlemelerini ve daha sonra bunları stereotaktik olarak fare beynine enjekte etmelerini sağlamaktır. Bu yöntem, nörolojik ve nöro-gelişimsel bozuklukların altında yatan genlerin rolü gibi sinirbilim alanındaki belirli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik olarak tasarlanmış hayvanlar yaratmanın zaman ve kaynak yoğun süreci olmadan belirli genleri manipüle etme yeteneğidir.

Hücreleri hazırlamadan önce, tek sarmallı oligoları tasarlamak için kullanılacak 20 nükleotidlik bir kılavuz iplik veya sgRNA oluşturmak için bir web sitesi kullanın. Oligoları sipariş ettikten ve bunları metin protokolünde açıklandığı gibi nihai bir plazmit oluşturmak için kullandıktan sonra, tüm th-od hücrelerini bir kriyotüpten 15 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyerek devam edin. Daha sonra 2 mililitre önceden ısıtılmış CO2 dengelenmiş tam IMDM ekleyin.

Daha sonra hücreleri 500 kez G'de beş dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 10 mililitre tam IMDM'de yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 cm'lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede %5'lik bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin. Kaplamadan 24 saat sonra, mevcut ortamı aspire ederek ve 10 mililitre önceden ısıtılmış IMDM ekleyerek ortamı değiştirin.

Hücreleri birleştikten sonra bölün. Hücreleri bölmek için, ortamı aspire edin ve plakayı 5 mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra plakaya bir mililitre% 0.25 tripsin ekleyin ve hücreler plakadan kalkana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, tripsin reaksiyonunu nötralize etmek için 0,5 mililitre IMDM ekleyin ve hücreleri 1,5 mililitrelik bir tüpe pipetleyin. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 500 kez G'de döndürün. Hücreleri bir mililitre IMDM'de yeniden süspanse edin ve 10 mikrolitre hücreyi 90 mikrolitre PBS'de seyreltin.

Bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücreleri tam IMDM ile yeniden plakalayın. Beşinci günde, transfeksiyondan iki saat önce ortamı değiştirin ve 10 santimetrelik plakada tam olarak 10 mililitre ortam olduğundan emin olun. Daha sonra, transfeksiyon reaktiflerini iki adet beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren tüp kullanarak iki disshes için hazırlayın.

İlk tüpü DNA ve ikinci tüpü 2X HBS olarak etiketleyin. Daha sonra DNA konsantrasyonunu PH 7.4'te Tris EDTA'da mikrolitre başına bir mikrograma ayarlayın. Lentivirüsler ve retrovirüsler için transfeksiyon reaktifleri yapmak için, karıştırmak için tüpe sürekli olarak vururken gerekli bileşenleri DNA etiketli tüpe yavaşça ekleyin.

Bundan sonra, 2X HBS etiketli tüpe bir mililitre 2X HBS ekleyin. Daha sonra, DNA tüpünden gelen içeriğin bir mililitresini 2X HBS tüpüne, her seferinde bir damla olacak şekilde yavaşça ekleyin. Transfeksiyon komplekslerinin başarılı bir şekilde oluşturulmasını sağlamak için 2X HBS tüpüne sürekli olarak dokunun ve her damladan sonra oluşan kalsiyum fosfat çökeltisini gözlemleyin.

Daha sonra tüpü karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, her 10 santimetrelik hücre plakasına yavaş damlacıklar halinde bir mililitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Medyayı altıncı günde değiştirin.

Yedinci günde, viral partiküller içeren ortamı 10 mililitrelik serolojik pipetle 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve ardından dört santigrat derecede saklayın. Ardından, her hücre plakasına sekiz mililitre% 0.5 FBS ortamı ekleyin. Sekizinci günde, viral parçacıklar içeren hücre ortamını toplayın ve 50 mililitrelik konik tüpte önceki günün hasadı ile birleştirin.

Bu adımda, viral süpernatanı 10 dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, viral ortamı 0.45 mikrometre düşük protein bağlayıcı şırınga filtresinden süzerek saflaştırın. Ardından, ortama 5X polietilen glikol 6000 çözeltisi ekleyin.

Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Daha sonra viral karışımı en az 12 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Dokuzuncu günde, viral karışımı 45 dakika boyunca 2500 kez G'de santrifüjleyin.

45 dakika sonra, süpernatanı atın ve iki dakika boyunca tekrar döndürün. Ardından süpernatantın tekrar çıkarılması takip edilir. Daha sonra, 320 mikrolitre steril PBS ekleyerek peleti yeniden süspanse edin ve çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Ertesi gün, virüsü alın ve alikotları eksi 80 santigrat derecede dondurun. Bu işleme başlamak için, enjeksiyon bölgesine hazırlanmak için anestezi uygulanmış bir farenin kafasını tıraş edin. Doğrudan% 4 izofluran burun konisine girer.

Ardından, fareyi stereotaktik alete yerleştirin. Kulak çubuklarını sabitlemeden önce ısırma çubuğunu dişleri yuvaya düşene kadar ağzına sokun. Hayvanın vücudunun ısıtma yastığının üzerinde olduğundan ve burnun burun konisine yerleştirildiğinden emin olun.

Ardından, bir ayak tutamağı vererek anesteziyi onaylayın. Sonra gözleri yağlamak için suni gözyaşı uygulayın. Daha sonra traş edilmiş kafayı povidon iyot ve lidokain ile temizleyin.

Şimdi kafa derisinin orta çizgisi boyunca küçük bir kesi yapın. Kafatasını bir çubukla kurulayın ve bregmayı görselleştirmeye yardımcı olmak için hidrojen peroksit uygulayın. Bir diseksiyon dürbünü kullanarak, kafatasındaki bregmayı bulun ve matkap ucunu üzerine yerleştirin.

X, Y ve Z düzlemlerinin dijital stereotaktik koordinatlarını sıfıra ayarlayın. Kafanın rostral kaudal Y ekseni üzerinde hizalandığından emin olmak için, matkap ucunu lambda üzerine yerleştirin ve kafayı, Z koordinatı bregma ve lambda'da kabaca sıfıra eşit olacak şekilde düzleştirin. Kafanın X ekseni boyunca hizalandığından emin olmak için, matkap ucunu bregma ve lambda arasındaki orta noktaya yerleştirin ve eşit olduklarından emin olmak için Z koordinatlarını her iki taraftaki orta noktadan bir milimetre uzakta ölçün.

Ardından, matkabı istenen koordinatların üzerine yerleştirmeden önce izofluranı %2'ye düşürün ve kafatasını dikkatlice delin. Tüm delikleri açtıktan sonra, virüs dolu şırıngayı stereotaktik alete yapıştırın. Şırıngayı deliğin üzerine ortalayın ve kafatasındaki Z koordinatını sıfıra ayarlayın.

Şırıngayı yavaşça en derin Z derinliğine indirin ve stereotaktik bir enjektör kullanarak dakikada 0,25 mikrolitre oranında enjeksiyona başlayın. Enjeksiyon en derin Z derinliğinde tamamlandıktan sonra, bir sonraki koordinata yükseltmeden önce bir dakika bekleyin ve tekrar enjeksiyona başlayın. Tüm Z enjeksiyon koordinatları enjekte edilene kadar bu desene devam edin.

Son enjeksiyondan sonra, şırıngayı çıkarmadan önce iki dakika bekleyin. Ardından fareyi stereotaktik aletten çıkarın ve kafa derisini dikin. Cerrahi bölgeye lidokain ve antibakteriyel krem uygulayın ve hayvanı ısıtılmış bir iyileşme odasına aktarmadan önce ağrı kesici ilaçlar uygulayın.

Bu 10X geniş alanlı floresan görüntü, yüksek titreli retrovirüslerin, morfolojisi florofor ekspresyonu ile değerlendirilebilen çok sayıda hücreyi enfekte ettiğini gösterdi. Bu örnekte, GFP veya mCherry eksprese eden virüsler dentat girusa birlikte enjekte edildi. Bir retrovirüs sistemi kullanarak, GFP ile işaretlenmiş bir genetik manipülasyon ve mCHerry ile işaretlenmiş başka bir manipülasyon yapmak için bir virüs kullanılabilir ve daha sonra her virüse bağlı tek veya ilave değişiklikleri değerlendirebilirsiniz.

Bu, viral yayılımın kapalı konturlarının 21 seri kesit üzerinde izlendiği enjeksiyon derecesinin 3 boyutlu bir rekonstrüksiyonudur. Kontur izlemeleri daha sonra hacim ölçümü için 3D görüntüler oluşturmak üzere hizalandı. Toplam viral yayılma yeşil renkle gösterilir ve dendate lokalize yayılma mor renkle gösterilir.

Bu görüntü, dentat girusun rostral kaudal eksenini doldurmanın yanı sıra iğne yolu ve korpus kallozum boyunca yayılan virüsü göstermektedir. İn vivo viral enjeksiyonu takiben, genetik manipülasyonun nöronal gelişim üzerindeki sonucunu incelemek için histoloji, elektrofizyoloji veya mikroskopide canlı iki yönlü gibi diğer yöntemleri kullanıyoruz.