Name: Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Öğrenin, tütün geçici ifade sistemi kullanarak bitki hücrelerinde MAPK sinyal yolunun mekansal reorganizasyonunu nasıl görüntüleyeceğinizi. Bu yöntem, protein-protein etkileşimlerini dinamik olarak izlemek için etkili bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El yazması düzenlemesi için Yumeng (Helen) Xia'ya (Rutgers Üniversitesi) teşekkür ederiz. BASL polarite oluşumu üzerine yapılan çalışmalar, ABD Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden J.D. (R01GM109080) ve Rutgers Üniversitesi'ne verilen hibelerle desteklenmektedir.

1. Plazmid Yapı <ol><li> Daha önce 1,6 açıklandığı gibi teknoloji klonlama yoluyla yapıları oluşturmak. <ol><li> İlk BASL kodlama dizilerini amplifiye etmek için uygun olan primerler ile yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanarak, YDA ve MPK6 ve giriş vektörleri içine alt klonlanması. 7&#39;de ayrıntılı protokol bulun. </li><li> (Sırasıyla DNmpk6 8 ve DNyda 4) MPK6 ve YDA baskın negatif sürümlerini oluşturmak için şablon olarak MPK6 ve YDA giriş plazmidleri kullanmak ve bölgeye yönelik mutajenez yöntemi 9 ile nokta mutasyonlar. </li></ol></li><li> PH35CG 10 içine BASL entegre standart LR (attL x attR rekombinasyon) reaksiyonları (7 ayrıntılı prosedürü) yürütmek, tütün geçici deneyleri için yapıları inşa etmek, DNyda ve pXNGW içine DNmpk6 ve pXCGW sırasıyla 11 vektörleri. <ol><li> enzim sindirimi ve dizileme ile elde edilen plazmidler teyit edin. Bir kez successful Agrobacterium GV3101 ırkına 12 tumefaciens içine ikili yapılar dönüştürmek ve 2 28 ° C &#39;de seçme plakaları üzerinde büyümek - 3 gün. </li></ol></li></ol> Agrobacterium Sızma Çözüm 2. Hazırlık <ol><li> Inşa pH35CG, pXNGW ve pXCGW için 100 ug / ml Luria-Bertani (LB), uygun antibiyotik ile birlikte ortam 10 ml taze bir kaç transforme edilmiş Agrobacterium koloniler inoküle (gentamisin 25 ug / ml, Rifamisin 25 ug / ml, spektinomisin, aynı konsantrasyonlar P19 için Kanamisin 50 ug / ml gentamisin ve rifamisin (transgenik susturma karşı proteinleri eksprese) 13. </li><li> Yaklaşık 16 saat boyunca 200 rpm hızda 28 ° C çalkalayıcı Agrobacterium kültürleri büyür ve sonra (1.5 ulaştığı tahmin - 1.8) OD 600 ölçümü (Şekil 2A-B). 10 dakika boyunca 2.500 xg&#39;de kültürleri aşağı doğru döndürün. Yeniden askıya ve waMgCl 2 10 mM (infiltrasyon çözeltisi) ile hücre pelletleri sh. </li><li> Yine kültürleri aşağı Spin ve nihai OD 600 = 0.5 (Şekil 2C-D) ulaşmak için sızma solüsyonu uygun miktarda pelet yeniden askıya. 3 saat - bitkiler nüfuz etmeden önce, 1, oda sıcaklığında hücre karışımları bırakın. Bu aşama, hücre homeostazının muhafaza edilmesine yardımcı olur. </li></ol> 3. Tütün Fabrikası ve Yaprak Enjeksiyon <ol><li> Yaprak enjeksiyon için (16 saat ışık / 8 saat-karanlık döngüleri ile 23 ° C) standart bitki büyüme odasında 5 haftalık 14-4 yetiştirilen tütün bitkileri (Nicotiana benthamiana), kullanın. Not: Bu aşamada, tütün bitkileri genellikle 6 yaprakları (2 büyük, 2 orta, ve 2 küçük) var. İki orta ölçekli yaprakları yaprak enjeksiyonu (iki küçük olanlar genellikle çok genç iken iki büyük olanlar, çok eski) için en uygun bulunmaktadır. </li><li> sızma gün önce, tobac suco bitkiler toprak doyurmak için. </li><li> 3 saat - infiltrasyon günde 1 karanlıkta bitkiler önceden inkübe edin. Bu adım yaprak epidermal hücreler nüfuz zaman büyük ölçüde Agrobacterium kolaylaştıran, epidermis stoma yaygın açmanızı sağlar. </li><li> Yaprakları tarihleri ​​ile etiketlenmiş renk bantları bayrağını kullanarak sızmış olması. Mark alanlar siyah kalın sharpie ile infiltre olması (isteğe bağlı; sızmış alanlar enfekte edildikten sonra görebilir.). </li><li> Agrobacterium yeniden süspansiyon eşit hacimlerde alın ve Hafifçe girdapladıktan (Şekil 2E) ile, 100 x 15 mm Petri kabı içinde karıştırın. NOT: durumda, CFP-BASL 1 ml, 1 DNyda-nYFP ml ve DNmpk-cYFP 1 ml P19 1 ml karışık. </li><li> Infiltrasyonu işlemde, infiltrasyon karışımı ile 3 mi iğnesiz şırınga dolgu (1-2 mi) ve tütün yaprak (Şekil 2F) alt tarafına (eksen dışı) itin. infiltre iken, yararlıitmek için tek bir elinizi kullanın ve diğer yandan hafifçe (itme kuvvetine karşı, adaxial) üst tarafını destekleyecek. Not: infiltrasyon karışımı başarıyla enjekte edildikten sonra, enfekte alanlar epidermis kolayca tanınabilir hale gelecektir. Ancak, sızma nedeniyle sert enjeksiyon (doku hasarı) ya da yetersiz itme (herhangi bir sıvı penetrasyon) başarısız olabilir. Her bir test için, (çeşitli bitkilerden) iki bağımsız yapraklarda en az iki enjeksiyon göstermektedir. </li><li> geri büyüme odasına enfekte bitkiler yerleştirin. Genellikle, protein ekspresyonları 48 saat aşağıdaki sızma sonra saptanabilir. </li></ol> 4. Konfokal Görüntüleme <ol><li> (- 4 disk / alan üretilebilir normalde 3) (Şekil 2G) 48 saat sonrası infiltrasyonu at, enjekte edilen bölgede bir yaprak diski çıkarılması için bir delgeç kullanın. yavaşça su damlaları ile bir slayt (yukarı abaxial tarafı) yaprak diskleri aktarmak ve monte etmek için cımbız kullanın. Çok har basılmasını önlemekkapak kayma d sıkılmış / hasarlı hücreler konfokal mikroskop (Şekil 2H) altında iyi göstermez çünkü. </li><li> konfokal görüntüleme önce ifade seviyelerini kontrol etmek için bir epi-floresan bileşik mikroskop üzerine monte örnekleri tarayın. Not: Bizim deneyime dayalı, orta ifade seviyelerini göstermek hücreler en konfokal mikroskop altında temsil edilmektedir. </li><li> konfokal mikroskop 40X (NA 1.3) lens ile başlayın. floresan protein ve orta seviyelerde ifade eden hücreler merkezinde kaldığı şekilde istenen konuma slaydı ayarlayın. OBP ve YFP için uyarma / emisyon spektrumları 458 nm / olan 480-500 nm ve 514 nm / 520 - sırasıyla 540 nm. </li><li> Görüntüler daha sonra en dengeli floresan yoğunluğu / gürültü oranı için lazer yoğunluğu ve akıllı kazancı ayarlamak önizleme &quot;Canlı&quot; düğmesini etkinleştirin. Görüntüleme kalitesini artırmak tarama piksel ve / veya çerçeve / hat ortalamasını artırmak için. Son olarak, rea için odaklama topuzunu ayarlamakch medyan odak düzlemi ve görüntü almak için &quot;Capture&quot; butonuna tıklayınız. Not: OBP ve YFP görüntüleri veya sırasıyla &quot;sıralı&quot; tarama modu, seçeneği işaretleyerek sırayla veya aynı anda yakalanabilir. </li><li> Z-projeksiyon hücrelerinin derinlemesine görünüm için istendiğinde, tarama aralığı derinliğini tanımlamak, &quot;xyz&quot; görüntüleme modunu seçin (10-15 mikron) ve hedef hücrenin alt üst görüntüleri toplamak . seçmek .tiff dosyaları olarak &quot;yeniden adlandırmak&quot; ve ihracat görüntüleri resim dosyası üzerinde sağ tıklayarak Leica yazılımı ile elde edilen görüntüleri derleyin. </li><li> Resim 30 - ölçümü analizi için 40 hücreleri. </li></ol> 5. Görüntü İşleme ve miktarının belirlenmesi Analizi <ol><li> görüntüleri işlemek ve kantifikasyonunu yapmak Fiji yazılımı (http://fiji.sc/Fiji) kullanın. <ol><li> Floresan yoğunluğu grafikleri çizilir. <ol><li> daha CFP / YFP sentezleme olup görselleştirmek içineşit dağıtılmış, hücre çevresi boyunca CFP ve YFP sinyal gücünü göstermek için Fiji kullanın. Bunu başarmak için, öncelikle Fiji ardından resmi başlatmak için &quot;Dosya&quot; ve &quot;Aç&quot; seçeneğini başlatın. aracı menüsünden &quot;çizgi&quot; tıklayın ve sağ tıklayarak &quot;Segment çizgi&quot; seçeneğini seçin. Ilgi bölgeyi karar verin ve CFP veya YFP sinyali (Şekil 3A-C) iz hücre çevresi boyunca bir çizgi çizin. Not: Fiji dilimli çizgisinde mutlak floresan yoğunluğu değerini ölçer. </li><li> Parçalara hattı boyunca CFP / YFP seviyelerini temsil eden pozisyon ve yoğunluk değerleri ile bir grafik oluşturmak için açılır menüyü &quot;Analiz&quot; ve &quot;Plot profili&quot; seçeneğini seçin. İstenirse, karşılaştırılabilir yoğunluk grafikler oluşturmak için EXCEL veya diğer grafik yazılımı içine (menü &quot;Kopyala&quot; seçerek) yoğunluk değerlerini çoğaltmak. </li></ol></li><li> polarite derecesini ölçmek. <ol><li> yaklaşık 20 Represen toplamak3 tekrarlı deneyler niteliksel hücreler tütün hücrelerinde CFP ve YFP polarite derecesini değerlendirmek için. (L olarak tanımlanan) düşük floresan yoğunluğu üzerinde (H olarak tanımlanır) yüksek floresan yoğunluğu oranına göre polarite derecesine hesaplayın. Not: ölçme yöntemi Şekil 3&#39;te açıklanmıştır. <ol><li> H ve L değerlerini ölçmek için, &quot;Tedbir&quot; açılır menüden &quot;Analiz&quot; ve sonra seçim tıklayın (yukarıda anlatılan) hücre çevresinde ilgi bölge boyunca bir parçalı bir çizgi çizin. Bir &quot;Sonuçlar&quot; penceresi açıldığında, kullanmak miktarının gerçekleştirmek için değerler &quot;ortalama&quot;. </li><li> Örneğin CFP ve YFP, nispeten homojen bir ifade gösteren hücrelerden, CFP-BASL (Şekil 3A) ve YFP ölçülmesiyle, H ve L değerlerini elde, DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP (Şekil 3B) birlikte ekspresyonundan tamamlanmaktadır iki rastgele eşit uzunlukta olan periferik segmentleri seçildi. </li> &lt;li&gt; Bu durumda, floresan proteinleri belirgin polar birikimini gösteren hücrelerden, CFP-BASL, DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP (Şekil 3C), ko-ekspresyonu zenginleştirilmiş floresans sinyalleri ile çevre bölgelerinden H değerleri toplamak ve düşük / hayır floresan birikimi ile bölgelerden Ls. </li><li> normal dağılım 20 birlikte hücre ve testi, H / L Elde edilen oranları havuz. (Normal dağılım için) Student t testi p değerleri veya (non-normal dağılım için) Kolmogorov-Smirnov (KS) testi hesaplayın. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li>
<li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li>
<li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304, 1494-1497 (2004).</li>
<li>Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+expanded+roles+for+MAPK+signaling+in+Arabidopsis+stomatal+cell+fate+revealed+by+cell+type-specific+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations.</a> Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).</li>
<li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19, 63-73 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BASL+Polarity+Protein+Controls+a+MAPK+Signaling+Feedback+Loop+in+Asymmetric+Cell+Division%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division.</a> Dev Cell. 33, 136-149 (2015).</li>
<li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+Streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway%28R%29+TOPO+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system.</a> Plant methods. 4, 4(2008).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+evidence+that+the+Arabidopsis+MAP+kinase+MPK6+is+involved+in+anther%2C+inflorescence%2C+and+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development.</a> J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).</li>
<li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).</li>
<li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+transport+activity+by+heterotrimerization+of+Arabidopsis+ammonium+transporter+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo.</a> Plant Cell. 25, 974-984 (2013).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH protocols. 2006 (7), (2006).</li>
<li>Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> Plant J. 33, 949-956 (2003).</li>
<li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+Arabidopsis+plants%3A+growth%2C+preservation+of+seeds%2C+transformation%2C+and+genetic+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).</li>
<li>Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+signaling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell polarity signaling in Arabidopsis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).</li>
<li>Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIN+phosphorylation+is+sufficient+to+mediate+PIN+polarity+and+direct+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).</li>
<li>Furutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar-localized+NPH3-like+proteins+regulate+polarity+and+endocytosis+of+PIN-FORMED+auxin+efflux+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers.</a> Development. 138, 2069-2078 (2011).</li>
<li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+localization+and+degradation+of+Arabidopsis+boron+transporters+through+distinct+trafficking+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).</li>
<li>Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCTOPUS%2C+a+polarly+localised+membrane-associated+protein%2C+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li>
<li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Genel Kullanım ve sinyal iletimi için Tütün geçiş sentezleme sisteminin olası değişiklikler: floresan proteinin aşırı ekspresyonunu (FP) başarılı bir şekilde, bitki hücrelerinde protein hücre içi lokalizasyonu hızlı inceleme için kullanılmıştır Tütün epidermis proteinleri etiketli. Bununla birlikte, in planta protein kompleksi dinamik sinyal dağılımını incelemek komplike hücre içi ortamlarda, geçici protein-protein etkileşimi ve sinyal transdüksiyon etkinlikleri için zor bir konudur. Bu zorluğu...

Proteinler öngörülemeyen hücresel ortamda meydana gelen neredeyse tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır karmaşık bir hiyerarşik ağ ve form kompleksleri içinde etkileşimde. Ancak, büyüme yanıtları bitki gelişiminden, sadece hızlı değil, aynı zamanda etkin bir şekilde hücre içi düzeyde bu dinamik sinyal olaylarını tespit etmek ve izlemek edemez uygun araçlardan bir eksikliği vardır. Tütün yaprağı epidermis geçici protein sentezleme sistemi canlı hücrelerin floresan proteinleri görselleştirmek için avantajlar cazip gelmiştir. Bu sistem post-translasyonel protein modifikasyonu ve protein lokalizasyonu hızlı incelenmesine olanak yarı in vivo koşulları sağlar. tamamlanmaktadır YFP sinyal inceleyerek, bimoleküler flüoresan tamamlama (BiFC) deneyi, bitki hücrelerinde protein-protein etkileşimi olasılığı bildirir. Diğer yöntemler, örneğin, maya-iki hibrid (Y2H) ve CO ile karşılaştırıldığında-immunoprecipitation (Co-IP) BiFC, protein-protein etkileşimleri hücre içi seviyede oluşabilir bölmeleri görselleştirme güçlü bir yol temin etmektedir. Asimetrik hücre bölünmesi (ACD) doku / organ oluşumu için yeni bir hücre tipleri oluştururken hücre popülasyonu kök tutar için, ökaryotik multicellularity teşvik etmek için vazgeçilmez bir mekanizmadır. Arabidopsis stoma gelişimi bitkilerde ACD çalışmak için bir model sistem olarak kullanılmıştır. öncü hücre, Meristemoid anne hücresi, asimetrik bölmek ve içine ayırt edebilir (ve bir stoma soy zemin hücre (SLGC) (bekçi hücreleri bir çift içine sonlandırmadan önce hücre benzeri bölünmeleri kök uğrar), bir Meristemoid iki farklı kızı hücreler üretmek için bölen bir kaldırım hücresi), sırasıyla (Şekil 1). stoma ACD olarak, Stoma Lineage içinde Asimetrisinin yeni protein Kırma (BASL) inc hangi bölünme asimetrilerini sürücü premitotically polarizelude fiziksel asimetri ve hücre kaderi asimetri 1. MAPKKK YODA ve MAPK, MPK3 ve 6 oluşan bir MAPK kaskad stoma bölümü desen ve kader kabulü 2,3, 4,5 için merkezi. Son zamanlarda, Zhang ve diğ. ACD 6 stoma Arabidopsis YDA-MAPK sinyal yoluna polarite protein BASL bağlı. kanonik YODA-MAPK yolağı, MPK3 / 6&#39;ya kadar, BASL fosforile ve kutuplaşma aktive eder. Fosforile BASL bir iskele olarak fonksiyonları ve YODA (YDA) ve MPK3 / 6 acemi bir protein kompleksi oluşturmak ve hücre korteks 6 da sinyalini konsantre. MAPK bileşenleri ve BASL ve YDA-MAPK yolağı arasındaki pozitif geri besleme döngüsü Polarizasyon bitki hücrelerinde protein kutuplaşma için yeni bir mekanizmayı temsil etmektedir. Yerel olarak zenginleştirilmiş MAPK sinyal yakından stoma ACD 6 hücre kaderi farklılaşma (Şekil 1) bağlantılı olduğu varsayılmaktadır. k birBu model desteklenen ey deneysel veriler BASL 6 ekspresyonu ile sebep olunan MAPK mekansal yeniden dağıtım gösterdi tütün tahlilleri geldi. MAPK molekülleri genellikle hücrenin içine her bulunduğu için, MAPK sinyal meydana geldiği, genel olarak, takip etmek kolay değildir. Bu çalışmada, biz sinyal rölesi oluştuğu önermek yukarı kinaz ve aşağı olanlar arasındaki etkileşimi görselleştirmek için bölünmüş YFP sistemi kullanılmaktadır. Bu, ek olarak BiFC sisteminin kullanımı uzatılmış birlikte ifade (protein-protein etkileşimi göstermektedir) bölünmüş YFP çift üçüncü bir proteini (CFP-etiketli) tamamlanmaktadır YFP uzamsal CO- ile modüle edilebilir ve bunun nasıl görselleştirmek CFP proteini ifade etmiştir. Bu şekilde, Tütün Epiderm hücre kortekste polarize dokusuna da dağıtım YDA ve MPK6 arasındaki etkileşimlerin uzaysal yeniden düzenlenmesi neden CFP-BASL bu ko-ifadesini gösterdial hücreleri. Bu sistem, bu nedenle hücre dahili veya harici stimuli ile meydan zaman koşulları altında, bitki hücrelerinde, dinamik sinyal olaylarını izlenmesi için geliştirilecek bir potansiyele sahip (örneğin, başka proteinler, kimyasal uygulama, patojen saldırısı ya da çevresel değişiklikler, vb birlikte ifadesi. ).

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D/TOPO</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange II XL Sahaya Yönelik Mutajenez Kiti</td><td>Agilent Technology</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>LB suyu</td><td>AMRESCO</td><td>J106-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J673-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spektinomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm Slayt</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm Kapak camı</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Leica&nbsp;</td><td>TCS SP5 II</td><td>LAS AF Lite yazılımı</td></tr><tr><td>40X objektif lensi</td><td>Leica</td><td>HCX&nbsp; APO Planı&nbsp;</td><td>HCX&nbsp; Plan APO, NA 1.30</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>SORVALL 6+</td><td></td></tr><tr><td>Delgeç</td><td>Zımba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml şahin tüpleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Forseps</td><td>Canemco & Marivac</td><td>205EQA-Teknik Özellikler</td><td></td></tr></tbody></table>

tütün geçici İfade sisteminin kullanılması bir mapk sinyal yolu mekansal reorganizasyon görüntüleme

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

canlı hücrelerde dinamik sinyal olaylarının Görselleştirme bir meydan okuma olmuştur. Bu, bitki hücrelerinde sinyal transdüksiyonu uzaysal dağılımının izlenmesi için test protein-protein etkileşimi kurulu bir geçici ifade sisteminin tütün epidermal hücrelerinde biyomoleküler floresan tamamlama (BiFC) deneyi genişletilmiştir. Bu protokol, etkileşimi ve Arabidopsis MAPKKK Yoda ve MAPK6 arasındaki sinyal plazma membranında meydana göstermek için BiFC tahlili kullanılmıştır. çatgı proteini BASL birlikte ifade edildiğinde Yoda-MAPK etkileşimi dağıtılabilir ve mekansal CFP-BASL ile birlikte polarize. Bu modifiye tütün sentezleme sistemi lokalizasyonu ve dinamik değişiklikleri (az 4 gün) ve floresan protein renk (en az üç) çarpanı ağırlayacak sinyalizasyon hızlı inceleme için izin verir. Biz de protein dağılımı (asimetrik mekansal lokalizasyonu, ya da &quot;kutuplaşma&quot; ölçmek için ayrıntılı yöntemler sundu;), Tütün hücrelerinde. Bu gelişmiş tütün ifade sistemi, canlı bitki hücrelerinde dinamik sinyal olaylarının hızlı test için yaygın olarak kullanılan bir potansiyele sahiptir.

hiperaktif MAPK sinyallemesinin başlatılan hücre ölümünü engellemek için, YDA (DNyda) ve MPK6 (DNmpk6) kinaz aktif olmayan ve tütün hücrelerine eş-sentezleme tahlilinde kullanılmıştır. Ne BiFC de CFP-BASL kendisinde oluşturulan düzensiz dağılım deseni (Şekil 3A-B) ortaya DNyda ve DNmpk6 arasındaki etkileşim. CFP-BASL DNyda-DNmpk6 etkileşim çifti girmiştir Ancak, OBP ve YFP sinyalleri hem son derece kutuplaşmış bir şekilde (Şekil 3C) yeniden dağıtılır bul...

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Bu prosedürün genel amacı, proteinin dinamik mekansal dağılımını görselleştirmektir

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Segmentasyon saati, somitik öncesi mezoderm (PSM) boyunca salınımlı gen ekspresyonunu yönlendirir. Dinamik Çentik etkinliği bu sürecin anahtarıdır. Delta ligand ve Notch reseptör ekspresyonunun omurgalı PSM'de salındığını göstermek için uzamsal ifade verilerinden zamansal dinamikleri çıkarmak için görüntüleme ve hesaplamalı analizler kullanıyoruz.

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Burada, TGF-β/Smad3 sinyal faaliyet bir adenovirus muhabir sistemi kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu sistem gerçek zamanlı olarak transkripsiyon etkinlikleri izler ve her iki tek hücreleri vitro ve canlı hayvan uygulanabilirmodelleri.

Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Bir prosedür protein kinaz görselleştirmek için sunulmuştur baş-sabit, davranan fareler bir aktivite. Gelişmiş A-kinaz aktivite muhabiri, tAKARα, kortikal nöronlar içinde ifade edilir ve kafatası penceresinden görüntüleme için erişilebilir hale gelmiştir. İki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi, uygulanan lokomotif sırasında PKA etkinliklerini görselleştirmek için kullanılır.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Morfolojik değişiklikler, aktivasyon sonrasında bağışıklık duyarlı fibroblast hücrelerinde ortaya çıkar ve hücresel işe alma değişiklikleri teşvik. Genetik olarak tasarlanan fibroblast spesifik protein 1 (FSP1)-CRE ile birlikte 2-foton görüntülemenin kullanılması; tdtomato floxed-dur-floxed (TB/TB) fare hattı ve yeşil floresan etiketlenmiş lipopolisakkarid-fitc, biz dermal fibroblastlar ve morfolojik değişiklikler içinde lipopolisakkarid son derece spesifik alımı göstermek olabilir vivo.

İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Öğrenin, tütün geçici ifade sistemi kullanarak bitki hücrelerinde MAPK sinyal yolunun mekansal reorganizasyonunu nasıl görüntüleyeceğinizi. Bu yöntem, protein-protein etkileşimlerini dinamik olarak izlemek için etkili bir protokol sunar.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Daha fazla video keşfet