Analiz İn Vivo Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, Zebra balığı embriyosunda canlı görüntüleme ile birlikte hücre nakli kullanarak in vivo hücre göçünü kontrol etmede bir aday genin işlevini analiz etmektir. Bu yöntem, in vivo hücre göçünde yeni aday genlerin rolünü ve önemini belirlemek gibi hücre göçü alanındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, iyi görüntüleme ve hücre adenomyozuna izin veren mozaik embriyolar oluşturmasıdır.

Hücre nakli iğnelerini hazırlamak için, bir cam kılcal damarı çekmek için bir mikro pipet çektirme kullanın. Daha sonra, bir mikro dövme ile iğnenin ucunu iç çapın 35 mikrometre olduğu noktada kesin. Bir mikro öğütücü kullanarak, kılcal damarın kesik ucunu 45 derecelik bir açıyla eğim verin.

Cam kalıntılarını ortadan kaldırmak için, iğneyi bir şırınga üzerine monte edilmiş bir iğne tutucuya yerleştirin, ardından solüsyonu içeri ve dışarı çekerek iğnenin içini üç kez durulamak için% 2 hidroflorik asit kullanın. İğneyi asetonla üç kez durulayarak takip edin. Enjeksiyon veya hücre nakli için yemekler hazırlamak için, 0.5 gram agaroz içeren 50 mililitre embriyo ortamını bir mikrodalgada bir dakika boyunca tam güçte ısıtarak% 1 agaroz hazırlayın.

Agaroz jeli yaklaşık 60 santigrat dereceye soğutun ve tüm hacmi 90 milimetrelik bir petri kabına dökün. Enjeksiyon için hatlar oluşturmak veya hücre nakli için kuyular oluşturmak için bir kalıp yerleştirin. Agaroz jeli ayarlandığında, kalıbı çıkarmak için forseps kullanın.

Donör embriyoları enjekte etmek için, bir stereomikroskop altında, toplanan transgenik embriyoları embriyo ortamı ile doldurulmuş bir enjeksiyon kabının hatlarına hafifçe sıkmak için forseps kullanın. Forseps ile embriyoları hücrelerle birlikte tepeye doğru yönlendirin, ardından embriyolar dört hücre aşamasına ulaşana kadar tabağı 28 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, mcherry'ye bağlı maya aktin bağlayıcı protein 140'ın aktin bağlama alanını içeren önceden hazırlanmış bir enjeksiyon çözeltisinden iki mikrolitre ile bir enjeksiyon iğnesi yükleyin.

Ardından iğneyi bir mikromanipülatöre bağlı ve bir hava transjektörüne bağlı bir iğne tutucusuna yerleştirin. İğne ucuna hafifçe dokunmak için ince forseps kullanarak veya ekstremitesini sıkıştırarak iğneyi açın. Daha sonra iğneyi dört hücreden birine sokun ve hücre hacminin %70'ini doldurmak için solüsyonu enjekte edin.

Benzer şekilde 30 embriyo enjekte edin. Embriyolar küre aşamasına ulaştığında, konakçı transgenik goosecoid GFP embriyolarını ve daha önce enjekte edilmiş donör embriyoları, embriyo ortamında bir milimetre agaroz ile kaplanmış ve Kalem / Strep embriyo ortamı ile doldurulmuş ayrı 35 milimetre petri kaplarına aktarmak için plastik bir mera pipeti kullanın. İnce cımbız kullanarak embriyoları koryonlarından manuel olarak çıkarın.

Daha sonra embriyoları 28 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Embriyolar floresan mikroskobu altında kalkan aşamasına ulaştığında, yeşil kalkan içinde ABP140 mcherry eksprese eden donör embriyoları seçin. Ateşle parlatılmış bir mera pipeti kullanarak, konakçı embriyoları Pen / Strep EM ile doldurulmuş hücre nakli kabındaki bir dizi oyuğa aktarın. Daha sonra donör embriyoları komşu sıraya yerleştirin.

Daha sonra, bir kirpik ile embriyoları kalkan yukarı bakacak şekilde dikkatlice yönlendirin. Daha sonra bir şırıngaya bağlı bir iğne tutucu kullanarak, iğnenin ucunu %70 etanolü çekerek ve dışarı atarak durulayın. İçine hava çekerek iğneyi kurulayın.

İğne kuruduğunda, eğim yukarı bakacak şekilde Hamilton şırıngaya bağlı iğne tutucusuna yerleştirin. Kalkandan kalkana nakli gerçekleştirmek için, nakil iğnesi ile bir donör embriyonun kalkanına girin ve ABP140 kirazı ile etiketlenmiş yaklaşık 10 ila 20 hücre çizin. Dikkatlice yumurta sarısı çizmekten kaçının.

Hücreleri konakçı embriyonun kalkanına nakledin ve tüm konakçı embriyolar nakledilene kadar hücre transferini tekrarlayın. Nakil tamamlandığında, hasarlı embriyoları çıkarmak için ateşle parlatılmış bir mera pipeti kullanın. Nakledilen embriyoları, iyileşmelerini sağlamak için yaklaşık 30 dakika boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.

Daha önce gösterildiği gibi, embriyoları dekoryonlaştırdıktan sonra tek prekordal plaka pregenitör hücrelerini nakletmek için, üç donör embriyoyu Kalem / Strep kalsiyum içermeyen halkalarla doldurulmuş bir hücre nakli kabına aktarmak için ateşle parlatılmış bir mera pipeti kullanın. Her embriyo için ince cımbızla, enjekte edilen ABP140 mcherry etiketli hücreleri içeren bir eksplantı inceleyin ve embriyoların geri kalanını hızla atın. Bir kirpik kullanarak, hücreler ayrışana kadar eksplantları hafifçe karıştırın.

Daha sonra transplantasyon iğnesinde izole edilmiş tek bir hücre çizin ve videoda daha önce gösterildiği gibi bir konakçı embriyonun kalkanına nakledin. Aspirasyon ve transplantasyonun optimum kontrolü için hava/su ayrımını iğnenin ucundan yaklaşık 20 santimetre uzakta tutun. Embriyoları monte etmek için, EM'de bir milimetre sıcak% 0.2 agaroz ile bir cam alt şişeyi doldurun. Şişeyi 42 santigrat derecede bir ısı bloğuna yerleştirin.

Seçilen bir embriyoyu agaroz çözeltisine aktarın ve fazla embriyo ortamını pipetten atın. Daha sonra embriyoyu agarozlu pipete çekin ve bir damla agaroz ile birlikte önceden hazırlanmış bir görüntüleme odasına aktarın. Agaroz ayarlanmadan önce, dik bir mikroskopla görüntülemek için perspektif prekordal plakayı yukarı doğru veya ters mikroskopla görüntülemek için cam tabana yerleştirerek embriyoyu yönlendirmek için bir kirpik kullanın.

Oda sıcaklığına bağlı olarak agaroz jel sertleşmeden önce embriyoyu yönlendirmek için yaklaşık 40 saniye olacaktır. Çok kırılgan olan yumurta sarısı yerine blastodermi manipüle ederek embriyoyu hızlı bir şekilde yönlendirin. Tüm embriyolar monte edildikten ve agaroz ayarlandıktan sonra, embriyoların kurumasını önlemek için hazneyi doldurmak için Pen / Strep EM kullanın.

Metin protokolüne göre canlı hücre görüntüleme ve hücre dinamiği deneyimleri gerçekleştirin. Bu videoda gösterilen teknik, in vivo hücre göçünü kontrol etmede TOR kompleks iki'nin temel bileşenlerinden biri olan Sin1'in rolünü analiz etmek için kullanıldı. Bu film, nakledilen prekordal plak pregenitör hücrelerinin göçünü göstermektedir.

Aktin etiketlemesi, aktin açısından zengin sitoplazmik çıkıntıların görselleştirilmesini sağlar. Frekans ve yönelim analizi yoluyla, yabani tip hücrelerin sıklıkla hayvan kutbu ve göç yönüne yönlendirilmiş büyük sitoplazmik çıkıntılar ürettiği gözlendi. Bu şekilde görüldüğü gibi, Sin1'in fonksiyon kaybı, çıkıntıların sayısında ciddi bir azalmaya ve kalan çıkıntıların randomizasyonuna yol açar, bu da Sin1'in aktin açısından zengin çıkıntı oluşumunu kontrol etmedeki önemini gösterir.

İlginç bir şekilde, Sin1 fenotipi, yapısal olarak aktif bir Rac1 formunun ekspresyonu ile kurtarılabilir, bu da TOR C2'nin Rac1 yoluyla aktin dinamiklerini ve hücre çıkıntı oluşumunu kontrol ettiğini kuvvetle düşündürür. Bu teknik aynı zamanda ARP2/3 kompleksinin bir inhibitörü olan arpinin hücre göçündeki rolünü analiz etmek için de kullanıldı. Burada gösterildiği gibi, arpinin fonksiyon kaybı, ya daha sık çıkıntı oluşumuna ya da çıkıntı stabilitesindeki artışa bağlı olarak çıkıntı frekansında bir artışa yol açar.

Arpin yokluğunda çıkıntı ömrünün ölçülmesi, çıkıntıların zamansal kalıcılığının iki katına çıktığını ve stabilitede bir artış olduğunu ortaya koydu. Bir kez ustalaştıktan sonra, yaklaşık 30 embriyonun nakli 45 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tüm adımlar kritik bir şekilde zamanlandığından, embriyoların gelişimine göz kulak olmak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, daha iyi görüntüleme sağlamak ve sitoskotik elementlerin, polarite belirteçlerinin, ilave proteinlerin veya diğer herhangi bir hücre bileşeninin alt hücre organizasyonu ile ilgili soruları ele almak için canlı konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, herhangi bir aday genin in vivo hücre göçündeki rolünü analiz etmek için prekordal plaka pregenitörlerinin transplantasyonlarının nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.