Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu Plasmodium Sporozoitler

Bu prosedür setinin genel amacı, fareleri radyasyonla zayıflatılmış plazmodyum parazitleri ile bağışıklamaktır. Fare derisinde miyeloid hücre alımının analizini ve lenf düğümlerinin boşaltılmasını kolaylaştırmak. Bu yöntem, sıtma alanında, canlı zayıflatılmış parazitlere karşı doğuştan gelen immün yanıtta yer alan hücresel aktörlerin neler olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Enfeksiyonlardan 18-25 gün sonra kan yemeği, enfekte sivrisinekleri toplayın ve buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüpte soğuk anestezi uygulayın. Daha sonra, tüpü dikkatlice buz üzerinde bir Petri kabına ters çevirin ve böcekleri 12 kilorad dozunda gama veya X ışınlamasına maruz bırakın. Işınlanmış sivrisinek tükürük bezlerini buz üzerinde 15 mikrolitre DPBS'de toplayın.

Ardından, sporozoitleri serbest bırakmak için bezleri hafifçe ezin. Yüksek konsantrasyonlu bir parazit süspansiyonunun küçük bir hacimde enjeksiyonu kritik öneme sahiptir, bu nedenle yeşil floresanın sağlam ekspresyonu ile kanıtlandığı gibi, iyi enfekte olmuş sivrisineklerden yeterli sayıda tükürük bezinin toplanması önemlidir. 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne uyarlanmış 35 mikrometrelik bir süzgeçten filtrasyondan önce parazit süspansiyonunu yeniden askıya alın.

Bir mikroskop sayma odası kullanarak, izole edilmiş sporozoitlerin toplam sayısını sayın ve parazit süspansiyonunu, buz üzerinde soğuk DPBS'de mikrolitre konsantrasyonu başına 8.3 kez on ila dördüncü sporozoite ayarlayın. Sporozoitleri enjekte etmeden önce, deney hayvanının uygun sedasyon seviyesini ayak parmağını sıkıştırarak onaylayın ve kornea kurumasını önlemek için göz merhemi uygulayın. Daha sonra, hızlı bir şekilde çalışarak, kulak kepçesinin ventral tarafını stereo mikroskop altında nazikçe sabitlemek için şeffaf bant kullanın ve 35 gauge iğne ile donatılmış on mikrolitrelik bir şırıngayı 0.6 mikrolitre yeniden süspansiyon paraziti ile yükleyin.

Daha sonra, iğneyi, eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde, kulağın dorsal tarafındaki epidermisin altına dikkatlice yerleştirin ve bölgeye 0.15 mikrolitre sporozoit enjekte edin. Enjeksiyon bölgesinde karakteristik bir papül gözlenecektir. Dermisi üç kez daha enjekte ettikten sonra, daha önce gösterildiği gibi, bandı dikkatlice çıkarın ve tamamen iyileşene kadar fareyi izleyin.

Sporozoit aşılamasını takiben istenen zaman noktasında, fareyi feda edin ve işleme hemen başlayın. Farenin klinik ölüm belirtileri gösterdiğinden emin olun. Kulağı ve ilgili boyun bölgesini yüzde 70 etanol ile dezenfekte edin.

Daha sonra, steril makas ve forseps kullanarak, jugulo-karotidiyen bölgesinde bir kesi yapın. Ardından, gri görünümlü drenaj lenf düğümünü ortaya çıkarmak için kesiği iki forseps ile gerin. Bağ dokusunu doğrudan lenf düğümünün üzerine dikkatlice sıkıştırın ve çıkarın ve altına yerleştirilmiş ikinci bir forseps çifti ile çıkarın.

Lenf nodunu, kollajenaz ve DNaz ile desteklenmiş 4.5 mililitre standart ortam içeren altı oyuklu bir doku kültürü plakasının bir oyuğunda 70 mikronluk bir süzgecin içine aktarın. Daha sonra, aşılanmış kulağın tamamını toplayın ve kulağı dorsal ve ventral yönlere sıkıştırmak ve ayırmak için iki forseps kullanın. Daha sonra kulağın her iki tarafını, her bir dokunun ortama tamamen daldırılmasına dikkat ederek, sindirim enzimleri ile takviye edilmiş ortam oyuğu başına 4,5 mililitre içeren ikinci bir altı oyuklu plakanın kuyusuna yerleştirin.

Bağışıklık hücrelerini lenf düğümlerinden izole etmek için, lenfoid doku plakasını hafif ajitasyon altında 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de inkübe edin. 15 dakika sonra, her bir oyuğa on milimolar EDTA ekleyin ve plakayı buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, her lenf nodu için, beş milimetrelik yeni bir şırınga pistonunun ucunu kullanın ve dokuyu ayırmak için dairesel hareketler kullanarak lenf düğümünü süzgecin üzerine bastırın.

Sadece beyaz bağ dokusu kaldığında, süzgeci FBS ve EDTA içeren 500 mikrolitre DPBS ile iki kez durulayın ve yıkamayı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, 500 mikrolitre takviye edilmiş DPBS ile kuyuyu iki kez daha yıkayın ve yıkamayı buz üzerine yerleştirilen tüpe aktarın. Bağışıklık hücrelerini kulaktan izole etmek için, kulak broşürlerini hafif çalkalama ile 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de inkübe edin.

20 dakika sonra, sindirimlerini kolaylaştırmak için dokuları daha küçük parçalara kesin ve numuneleri inkübatöre geri koyun. 40 dakika sonra, on milimolar EDTA ile sindirimi durdurun ve plakayı buzun üzerine yerleştirin. Kesilmiş uçlu bir mililitrelik bir pipet kullanarak, her bir kuyucuğun tüm içeriğini 70 mikron süzgeçler içeren yeni kuyucuklara aktarın.

Ve kulak dokusu parçalarını az önce gösterildiği gibi dairesel hareketlerle ayırmak için beş mililitrelik bir şırınga pistonu kullanın. Sadece beyaz bağ dokusu ve saç kaldığında, süzgeçleri ve kuyucukları az önce gösterildiği gibi DPBS artı FBS ve EDTA ile yıkayın ve yıkamaları buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Son olarak, kuyuyu takviye edilmiş DPBS ile iki kez yıkayın ve yıkamayı buz üzerine yerleştirilen tüpe aktarın.

Bu videoda, parazitlerin intradermal enjeksiyonundan 15 dakika sonra radyasyonla zayıflatılmış sporozoitlerin fare derisine göçü görülebilir. İntradermal sporozoit enjeksiyonundan 24 saat sonra, toplam hücreler deriden izole edilir ve lenf nodu boşaltılır. Bu şekilde görüldüğü gibi, derideki miyeloid hücrelerin sıklığı ve lenf nodunun boşaltılması, saf farelere kıyasla sağlam bir şekilde artmıştır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, sivrisinek ışınlaması için sporozoit enjeksiyonu için protokolün ilk adımları dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, sivrisinek tükürük bezlerinden izole edilen sporozoitin bulaşıcılığını hızla kaybettiğini hatırlamak önemlidir. Bu yüzden mümkün olduğunca çabuk enjekte edilmeleri gerekir.

Bu videoyu izledikten sonra, canlı zayıflatılmış plazmodyum parazitlerinin intradermal enjeksiyonuna karşı immün yanıtı keşfetmek için miyeloid hücrelerin fare derisinden ve boşaltılan lenf nodundan nasıl izole edileceğini iyi anlamalısınız.