Name: Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu Plasmodium Sporozoitler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Öğrenin, Plasmodium sporozoitleri intradermal enjeksiyonu sonrası fare deri ve akan lenf düğümlerinden miyeloid hücre izolasyonu yöntemini. Akış sitometrisi ile iltihabi yanıt analizi, sıtma immünolojisi ve aşı geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar fare derisinde sporozoit motilite in vivo görüntüleme öğretim için resim ve Pauline Formaglio alarak yardım için Patricia Baldacci, Vanessa Lagal ve Sabine Thiberge eleştirel okuma, Irina Dobrescu ve Sabine Thiberge teşekkür ederiz. Biz de sivrisinek yetiştirme için Üretim ve Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) ve Enfeksiyon için Marek Szatanik ve Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Laboratoire d&#39;Excellence &quot;Infectious Diseases Yükselen ve Bütünleştirici Biyoloji&quot; den AXA Araştırma Fonu ve fonlar tarafından desteklenmiştir (no. ANR-10-LabX-62-IBEID hibe).

<html> Tüm işlemler Pasteur Enstitüsü komitesi tarafından ve yerel Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Etik kurul IDF-Paris 1, Paris, Fransa; anlaşma numarası: 2012-0015) tarafından onaylanmış ve yürürlükteki kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Malzemeler ve Reaktifler <ol><li> Daha önce 21 açıklandığı gibi 3-5 gün ortaya çıkması ve arka sonrası enfekte olmuş fareler üzerinde beslemek dişi Anopheles stephensi sivrisinek (Sda500 suşu) kullanın. </li><li> Kullanım parazitler yapısal ısı şok proteini 70 (HSP70) promoteri kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) geni, Plasmodium berghei ANKA klonu. Bu parazit yaşam döngüsü 22 boyunca parlak floresan verir. </li><li> Kullanım dişi C57BL / 6JRj fareleri (7 haftalık). NOT: açıklanan protokol kullanılan tüm reaktifler Malzemeleri / Ekipman güçlü T listelenmiştir. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Radyasyon-zayıflatılmış Sivrisinek Tükürük Bezleri gelen Sporozoit İzolasyon <ol><li> Bulaşıcı kan yemekten sonra 18-25 gün arasında, toplamak ve daha önce 21 açıklandığı gibi buz üzerinde bir 15 ml tüp içine sivrisinekler soğuk uyutmak. Dikkatle tersini tüp Petri kabı üzerine aktarabilirsiniz. buz üzerinde böcekleri korumak ve γ- veya x-radyasyon 12 Krad dozuna sivrisinek maruz bırakmaktadır. </li><li> Işınlanmış sivrisinek tükürük bezlerinden gelen zayıflatılmış sporozoit yalıtmak daha önce 21 nitelendirdi. sporozoit serbest ezmek yavaşça buz üzerinde 1 x Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) (15 ul) etrafında küçük bir hacme enfekte tükürük bezleri toplayın ve. Not: kendi güçlü bir ifade ile kanıtlandığı gibi kritik bir küçük bir hacim içinde oldukça konsantre bir parazit süspansiyonu enjeksiyonu, önceden seçilmiş de enfekte sivrisinek yüksek sayıda tükürük bezi yeterli sayıda hasat etmek gereklidirYeşil-floresan. </li><li> kümeleri ve sivrisinek artıkları yok etmek için düşük bir yapışma 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü için uyarlanmış bir 35 um hücre filtresi kapağı ile sporozoit süspansiyon filtre. </li><li> Daha önce 21 açıklandığı gibi izole sporozoitlerine toplam sayısını ve 83000 sporozoit / ul elde etmek için soğuk 1x DPBS ile parazit süspansiyonu konsantrasyonunu ayarlamak. Bir sonraki adımlar devam ederken buz üzerinde parazit saklayın. </li><li> Negatif kontrol olarak kullanılan ve adım 2.2 ve 2.3 açıklandığı gibi örnek işleme edilecek bulaşmamış sivrisineklerden tükürük bezlerinin eşdeğer sayıda toplamak. süspansiyon içinde tükürük bezi özleri içindeki konsantrasyonu elde etmek için, yukarıda belirtildiği gibi örnek seyreltilir. Not: Sporozoitler 2 saatlik bir süre için buz üzerinde saklanabilir. Ancak, ideal olarak da tükürük bezleri ezme sonra bir saat içinde enjekte edilir. </li></ol> Dermal La içine sporozoitlerine 3. EnjeksiyonKulak Yer <ol><li> ketamin intraperitoneal enjeksiyonu (50 mg / kg) / ksilazin (5 mg / kg) karışımı, hayvanların anestezisi. Fare bilinçsizlik durumda olması ve kornea kurumasını önlemek için gözleri oftalmik merhem uygulamak için 5-8 dakika bekleyin. iki arka ayakları üzerinde yumuşak bir ayak tutam yaparak anestezi derinliği değerlendirin. NOT: Anestezi dozu az 20 dakika sürer, bu nedenle sonraki adımlar hızla yapılmalıdır. </li><li> Daha önce bir stereomikroskopta (Şekil 1A) altına şeffaf bir bantla ventral tarafı sabitleme ile fare kulak kulak kepçesi stabilize. Yavaşça damarların zarar görmesini önlemek için kulak basın. </li><li> Yeniden süspanse parazitlerin 10 0.6 ul 10 ul şırınga / 35 ölçü eğimli iğne yükleyin. </li><li> Ile dikkatlice epidermis altında, kulak (Şekil 1A) dorsal tarafında iğne sokarak 4 enjeksiyon siteleri (site başına 0.15 ul) sporozoit süspansiyon sununkonik kadar herhangi bir kan damarları önlemek için özen. Birkaç saniye çıkarmadan önce, enjekte geri akmasını önlemek için iğne dermis kalmasına izin. Bir prosedür (Şekil 1B ve 1C) sonunda her enjeksiyon noktasında karakteristik papül dikkate alınmalıdır. </li><li> Enjeksiyondan sonra, dikkatlice kasetten kulak çıkarın. </li><li> adım 3.2-3.4 izleyerek parazitlerin aynı dozda karşı kulak enjekte edilir. </li><li> yalnız enjeksiyon ve dermis sivrisinek materyalin birikimi ile oluşan iltihabi yanıtı değerlendirmek amacıyla 1x DPBS 0.6 ul veya enfekte olmayan sivrisineklerden 1x DPBS + tükürük bezi ekstraktı 0.6 ul ya 2 ek fareler enjekte edilir. </li><li> kafes içine geri koymadan önce anestezi fare kurtarma izleyin. Not: Cilt uygun sporozoit yerleştirme floresan mikroskobu (Şekil 2A ve 2B ile izlenebilirPrevisously 23 tarif edildiği gibi), fare hazırlanmaktadır. </li></ol> 4. Deri ve boşaltılması lenf nodu diseksiyonu <ol><li> standart ortam (SM) hazırlanması şu şekilde: Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) + 25 mM 4- (2-hidroksietil) 400 U ile takviye edilmiş 1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) / ml kolajenaz ve 50 ug / ml deoksiribonükleaz (Dnase) . </li><li> dLn örnekleri için oyuk başına + 70 um hücre filtresi 4.5 mi SM (plaka) ve deri örnekleri için oyuk başına 4.5 mi SM (Levha B) buz üzerinde iki adet 6 gözlü düz dipli doku kültürü plakaları hazırlayın. </li><li> sporozoit inokülasyondan sonra arzu edilen bir zaman noktasında, derin intraperitonal ketamin enjekte (125 mg / kg) / ksilazin (12.5 mg / kg) karışımı ile önceden servikal dislokasyon ile fare anestezi. Fare klinik ölüm belirtileri gösteren emin olun ve hemen diseksiyonu başlar. Not: miyeloid hücre alımı kinetiği inj sonra farklı zamanlarda incelenebilirection (yani 2 saat, 4 saat ve daha önce tarif edildiği gibi 14 24 saat). </li><li> bulaşma olasılığını azaltmak için aşılanmış kulak ve% 70 etanol ile ilgili boyun bölgesini dezenfekte. </li><li> Steril makas ve forseps kullanarak, aseptik çevreleyen yağ toplama olmadan proksimal aurikular dLn teşrih. jugulo-carotidian sulkusta bir ilk kesi gerçekleştirmek ve işletme alanında tüyleri. çevre dokuya kıyasla grimsi görünür dLn açığa 2 forseps ile kesi gerin. </li><li> onun çıkarılmasını kolaylaştırmak için forseps ile dLn üstünde dikkatle bağ dokuları çimdik. Lenfoid doku (Şekil 3A ve 3B) altında bir forseps yerleştirerek dLn çıkarın. iyi içeren 4,5 ml SM + 70 mikron hücre süzgeç (Levha A) dLn yerleştirin. </li><li> Steril keskin bir makas ve forseps (Şekil 4A) kullanarak tüm inoküle kulak hasat. Separkısma ve iki forseps (- 4E Şekil 4B) ile biten kesim dışında boşluk ile kulağın dorsal ve ventral yönlerini yedik. Her iki dokular tamamen ortamda batırılır emin iyi içeren 4.5 ml SM (Levha B) içine yerleştirin. Not: Deney güvenilirliğini artırmak ve ilgi hücre sayısını arttırmak için, havuz 2 numune başına aynı fare kulağı ya da 2 dLNs enjekte edildi. </li><li> Kulakları ve 1x DPBS veya tükürük bezi özleri ya ile aşılanmış farelerin dLNs paralel olarak hasat ve süreç. Negatif ve tek boyama tazminat kontrolleri için naif bir fare hasat 2 ek kulak ve lenf nodu örnekleri ekleyin. </li></ol> Lenf düğümleri 5. Hücre İzolasyonu <ol><li> Hafif ajitasyon altında 15 dakika boyunca 37 ° C ila +% 5 CO2 lenf düğümleri (plaka) inkübe edin. kolajenaz ve DNaz acti nötralize etmek için oyuk başına 10 mM son etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilavevities. buz üzerinde sonraki adımları gerçekleştirin. </li><li> 5 ml şırınga pistonu üst ucunu kullanarak lenf düğümleri ayırmak. kalan tüm kadar süzgeç karşı dairesel hareketlerle basın beyaz bağ dokusu olduğunu. </li><li> 500 ul 1x DPBS +% 2 fetal sığır serumu (FBS) + 2mM EDTA ile iki defa hücre süzgecinden durulayın. 15 ml&#39;lik bir tüp içinde oyuk tüm hacmi aktarın. </li><li> +% 2 FBS + 2 mM EDTA, 500 ul 1 x DPBS ile de iki kez yıkayın ve 15 ml tüp içine ses transferi. buz üzerinde tüpler tutun. </li></ol> Kulak Cilt 6. Hücre İzolasyonu <ol><li> Hafif ajitasyon altında, 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de 5% CO2 kulak bildiri (levha B) inkübe edin. Not: inkübasyon 20 dakika sonra, doku sindirimi kolaylaştırmak ve kalan 40 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde tekrar örnek koymak için küçük parçalar halinde makas kulak bildiriler kesti. Tek hücre inkübasyon süresi sonunda ortam içinde görülmektedir. </li><li> 10 mM finalini ekle<html> oyuk başına EDTA kolajenaz ve DNaz eylemlere karşı. buz üzerinde sonraki adımları gerçekleştirin. </li><li> Yeni kuyu bir 1ml pipet kullanarak 70 mikron hücre süzgeç içeren kulak doku parçaları ve orta tüm hacmi aktarın. daha kolay kulak doku parçaları toplamak için ucunun sonundan itibaren 2 ila 3 mm kesin. </li><li> 5 ml şırınga pistonu üst ucunu kullanarak kulak doku parçaları ayırmak. kalan tüm kadar süzgeç karşı dairesel hareketlerle basın beyaz bağ dokusu olduğunu. </li><li> 500 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile iki kez hücre gericileri durulayın. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden 50 ml&#39;lik tüp içine de tüm hacmi aktarın. </li><li> de 500 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA yıkayın ve 50 ml&#39;lik bir tüp içine ses transferi. buz üzerinde tüp tutun. Not: farklı adımlar cilt toplam hücrelerin izole edilmesi ve dLn dokular Şekil 5&#39;te özetlenmiştir. </li></ol>başlığı &quot;&gt; 7. Kont ve Canlılık Toplanan Hücreler <ol><li> 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 5 dakika boyunca deri ve dLn örnekleri santrifüj ve supernatant atın. Yavaşça 300 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile pelletini. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak deri ve dLn izole hücrelerin toplam sayısını saymak için, her numune, küçük bir hacim toplayın. % 0.04 hücre yaşayabilirliğini belirlemek için tripan mavisi ekleyin. </li></ol> Sigara 8. Bloklama antijene özgü bağlanma <ol><li> işaretsiz CD16 / CD32 Fc Block antikorunun 10 ug / ml ilave edilir. (Daha uzun gidebilir), 4 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Soğuk 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA 2 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 5 dakika boyunca numune santrifüj ve supernatant atın. Yavaşça +% 2 FBS + 2 mM EDTA, 300 ul 1 x DPBS pelletini ve buz üzerinde örneklerin korumak. </li></ol> 9. Boyama Deri ve Lenf Nodu Myeloid Hücreleri <ol><li> Daha önce bloke ski inküben ve dLn canlı / ölü izleyicinin (örneğin 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol ve DAPI), anti-CD45 ve anti-CD11 b özgü antikorlarla hücreleri izole edilmiştir. NOTLAR: ilgi miyeloid hücre alt-popülasyonunu, özellikle az olanları zenginleştirmek için, CD45 + hücreleri ve lenfositler, sırasıyla deriden saflaştırılabilir veya manyetik boncuk kolaylaştırıcı hücre sıralama ile dLn tükenmiş. DLn izole hücrelerin çoğu bu yana CD45 +, anti-CD45 kullanılması zorunlu değildir bulunmaktadır. Diğer belirteçleri pozitif veya negatif-yolluk strateji ile ilgi miyeloid hücre alt popülasyonlarını belirlemek için dahil edilebilir. Bu protokol, dLn olarak silah miyeloid hücrelerin CD8α + hücreler hariç tutarak zenginleştirildi (tüm T hücresi bölümü, hem anti-CD3 spesifik antikor kullanılarak hedeflenebilir). </li><li> Karanlıkta 4 ° C&#39;da 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 500 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA, santrifüj numune 5 dakika ekleyin ve supe atınrnatant. iki kez yıkama adımı yineleyin. </li><li> 300 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile örnekleri yeniden süspanse edin. 35 mikron hücre süzgecinden FACS tüp içinde tüm hacim aktarın. 100 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile durulayın. </li><li> bir akış sitometresinin lekeli hücrelerin çalıştırın. Kapı tek hücreleri canlı (DAPI - FSC-W) ölü hücreleri ve ikilileri dışlamak için. DLN (Şekil 6B) için CD11b + olaylar - Deri (Şekil 6A) ve (CD45 +) CD8α için arsa CD45 + CD11b + olaylar. </li></ol>

<ol><li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).</li>
<li>Hoffman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+humans+against+malaria+by+immunization+with+radiation-attenuated+Plasmodium+falciparum+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites.</a> J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).</li>
<li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+liver+stage+developmental+arrest+by+depletion+of+a+protein+at+the+parasite-host+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).</li>
<li>Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).</li>
<li>Tarun, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protracted+sterile+protection+with+Plasmodium+yoelii+pre-erythrocytic+genetically+attenuated+parasite+malaria+vaccines+is+independent+of+significant+liver-stage+persistence+and+is+mediated+by+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells.</a> J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).</li>
<li>van Dijk, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated%2C+P36p-deficient+malarial+sporozoites+induce+protective+immunity+and+apoptosis+of+infected+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).</li>
<li>Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+antimalarial+immunity+after+vaccination+with+late+liver+stage-arresting+genetically+attenuated+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites.</a> Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+T+cell+immunity+against+malaria+liver+stage+after+vaccination+with+live+sporozoites+under+chloroquine+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment.</a> J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).</li>
<li>Behet, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporozoite+immunization+of+human+volunteers+under+chemoprophylaxis+induces+functional+antibodies+against+pre-erythrocytic+stages+of+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 13, 136(2014).</li>
<li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+Plasmodium+transmission+from+mosquito+to+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal.</a> Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).</li>
<li>Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+sporozoites+trickle+out+of+the+injection+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).</li>
<li>Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrahepatic+exo-+erythrocytic+forms+of+rodent+malaria+parasites+at+the+site+of+inoculation%3A+clearance+after+immunization%2C+susceptibility+to+primaquine%2C+and+contribution+to+blood-stage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection.</a> Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).</li>
<li>CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat+Med%22">Nat Med</a>. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).</li>
<li>Obeid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-draining+lymph+node+priming+is+sufficient+to+induce+sterile+immunity+against+pre-erythrocytic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria.</a> EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).</li>
<li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+traversal+is+important+for+progression+of+the+malaria+parasite+through+the+dermis+to+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-node+resident+CD8%CE%B1%2B+dendritic+cells+capture+antigens+from+migratory+malaria+sporozoites+and+induce+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses.</a> PLoS Pathog. 11 (2), e1004637(2015).</li>
<li>da Silva, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+skin+immunological+disturbance+after+Plasmodium-infected+mosquito+bites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites.</a> Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).</li>
<li>Mac-Daniel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+immune+response+to+injection+of+Plasmodium+sporozoites+into+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin.</a> J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).</li>
<li>Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+capture+of+infected+neutrophils+by+dendritic+cells+in+the+skin+inhibits+the+early+anti-leishmania+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response.</a> PLoS Pathog. 8 (2), e1002536(2012).</li>
<li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).</li>
<li>Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium-dependent+protein+kinase+regulates+Plasmodium+ookinete+access+to+the+midgut+epithelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell.</a> Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).</li>
<li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites+in+the+dermis+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).</li>
<li>Ploemen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+liver+load+following+parenteral+sporozoite+administration+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents.</a> Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).</li>
<li>Epstein, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+malaria+vaccine+designed+to+protect+through+hepatic+CD8+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity.</a> Science. 334 (6055), 475-480 (2011).</li>
<li>Roestenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+protection+against+malaria+after+experimental+sporozoite+inoculation%3A+an+open-label+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study.</a> Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).</li>
<li>Seder, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li>
<li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040(2012).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Microbiol+Immunol+%28Bp%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Bütün sporozoit sıtma aşısı kullanan insanların büyük ölçekli aşılama perspektifinde, üstesinden gelmek için ana sorunlardan biri başarılı bağışıklama ve koruma 24,25 sağlamak için optimize yolları ve parazit uygulama yöntemlerini geliştirmektir. İnsanlarda, canlı azaltılmış parazitler (LAP) tarafından aracılık edilen koruyucu etkinlik değerlendirilmesi doğal sivrisinek takip gerçekleştirilmiştir 2, hem de intradermal, deri altı 25,26 ve IV&#39;ün aşı 27 ısırır. Kemirgenler <s...

Sıtma her yıl yarım milyondan fazla kişi öldü dünyanın en ölümcül bulaşıcı hastalıklardan biridir. Plasmodium hastalığın nedensel maddesi ile enfeksiyon, bir eritrositik öncesi (PE), faz başlar. Bu aşamada, bir dişi anopheline türü sivrisinek tarafından konak deriye enjekte sporozoitler kan yoluyla karaciğere ulaşır ve hastalığın belirtilerini kırmızı kan hücreleri enfekte ve neden parazit formları içine iç hepatositler ayırt. Plasmodium PE aşamaları, anti-sıtma aşısı için ayrıcalıklı bir hedef temsil etmektedir. Nitekim, bu tür radyasyon zayıflatılmış sporozoitlerle (RAS) olarak bu aşamaların karşı zayıflatılmış aşılar, canlı, genetik tutuklandı parazitler (GAP) ya da kemoprofilaksi ve sporozoitler (CPS) kemirgen ve insan ana 1-9 hem korumak için kapasitelerini ortaya koymuşlardır. kemirgen modelinde, çok aşılama çalışmaları intravenöz bağışıklık kullanılarak yürütülmektedirKoruyucu etkinlik açısından altın standart hangi. Ancak, cilt aşamasında tanımı ve koruması sağlamaya cilt ilişkili lenf düğümüne (DLN) önemi PE aşaması algı değişti ve enjeksiyon intradermal yolunun önemini vurgulamıştır. P. Intravital görüntüleme kemirgen derisine enjekte berghei sporozoitler aşı sadece ~% 25 kan yoluyla karaciğer ulaşır göstermiştir. ~ Geri kalan% 75, küçük bir oranda deri hücrelerinin 12,13 içinde haftalarca canlı dönüştürmek ve kalabilir proksimal dLn (~% 15) ve cilt (~% 50) 10,11 arasında dağıtır. Ayrıca, daha sonraki çalışmalarda, intradermal aşılamadan sonra etkin koruyucu bağışıklık kurulması özellikle parazit spesifik CD8 + T hücreleri, aktive deri dLn, yer alır ve sadece marjinal karaciğer veya dalak-dLNs 14,15 bu tarif. İkençalışmaların çoğu koruyucu bağışıklık yanıtının kurulmasında rol efektör hücrelerin karakterizasyonu üzerine yoğunlaşmıştır, çok daha az doğuştan gelen bağışıklık sistemi ile özellikle etkileşimleri, deri içine enjekte canlı zayıflatılmış parazitlerin akıbeti hakkında bilinmektedir. Özel olarak, CD8 + T hücreleri için, parazit antijen alımı, işleme ve sunumunda rol alan antijen sunan hücreler karakterizasyonu PE antijen alıcı deri ve dLn bölümlerinde hem oluşabilir bilerek kritik önem taşımaktadır. Önceki intravital görüntüleme çalışmaları sporozoitler ve dendritik hücreler arasındaki ilk etkileşimler dLn 10,17 gözlenmiştir ise enfeksiyon sivrisinek ısırığı 16 Aşağıdaki deri, parlak floresan Lys-GFP pozitif hücrenin erken akışını tarif. Daha yakın zamanda, sivrisinekler tarafından deri aşılanmış sporozoitler deri hem de dendritik ve düzenleyici T hücrelerinin hareketliliği artırdığı bildirilmiştirfareler, antijen sunan hücre bir azalma sayısı dLn 18 gözlenmediğini gösterdi. Belirlemek ve daha kesin olarak, lökosit alt kümelerini cilt alınmış ve RAS 19 dozlarının immünize intradermal enjeksiyonu takiben parazit ile etkileşim gibi da dLn gelen ölçmek için amaçlanmıştır. Bu bağlamda, her iki dokulardan miyeloid hücreler (CD45 + CD11 +) izole edilmiş ve sitometrisi = çoklu parametre akış ilgi subpopülasyonunun karakterize edilir. Leishmania majör deri enfeksiyonu 20 erken evrede açıklanan immün yanıt ile tutarlı, enjeksiyon sporozoitlerden birincil konak yanıtı inflamatuar monositler (CD45 + CD11 b takip polimorfonükleer nötrofillerin (CD45 + CD11 b + Ly6G + Ly6C int) bir ardışık işe oluşur + Ly6G - differenti temelinde tanımlanan Ly6C +)Ly6G ve Ly6C yüzey belirteçleri al ifadesi. Farenin deri miyeloid hücrelerin izole edilmesi ve dLn enfekte sivrisinek tükürük bezlerinden ekstre RAS dozlarının immünize intradermal enjeksiyonu takiben burada bir protokol açıklar. Tekrarlanabilir intradermal enjeksiyonları ve doku işleme enfekte dokular içinde hücre popülasyonu infiltre fenotipik değişiklikleri ölçmek için kritik adımlar vardır. Aşağıda ayrıntılı bir yaklaşım güvenilir bir deney Plasmodium paraziti cildin ve dLn enflamatuar tepkiyi değerlendirmek için çeşitli deney sistemlerinde uzatılabilir içerir.

<table><tbody><tr><td>Ketamin: Imalgene&reg; 1.000</td><td></td> <td>Merial-50</td> <td>mg / kg: önceki sporozoit enjeksiyonu

125 mg / kg: önceki fedakarlık</td></tr><tr><td>Ksilazin: Rompun&reg;% 2</td> <td>Bayer-5</td><td></td> <td>mg / kg: önceki sporozoit enjeksiyonu

12.5 mg / kg: önceki fedakarlık</td></tr><tr><td>NanoFil şırınga + 35 gauge iğne</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Omnican&reg; 50 İnsülin şırıngası 0.5 ml / 50 IU</td><td>B. Braun Medikal&nbsp;</td><td></td><td></td>9151125-MultiwellTM</tr> <tr><td>6 kuyulu doku kültürü plakası &ndash; Düz Tabanlı</td><td>BD Şahin&nbsp;</td><td></td><td>353046-70</td></tr> <tr><td>ve mikro; M hücre süzgeci&nbsp;</td><td>BD Şahin&nbsp;</td><td>352350-2</td><td></td></tr> <tr><td>ml şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS-02S-BLUE</td><td></td></tr> <tr><td>MAXTM 15 ml Polipropilen konik tüp</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>352097-BLUE</td></tr> <tr><td>MAXTM 50 ml Polipropilen konik boru</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>352098-5</td></tr> <tr><td>ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüp, 35 & m Hücre Süzgeç Kapağı</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>352235-DPBS</td></tr> <tr><td>1x CaCl2- ve MgCl2- içermeyen</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-094-DMEM</td><td></td></tr> <tr><td>1x + GlutaMAXTM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31966-021-Clostridium</td><td></td></tr> <tr><td>histolyticum'dan kollajenaz, Tip IV 0.5-5.0 FALGPA birimi / mg katı&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Sığır pankreasından deoksiribonükleaz I, tip IV&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 ve mikro; g/ml</td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM veya 2,5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500-HEPES</td><td></td></tr> <tr><td>tampon çözeltisi (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Tripan mavisi Lekesi (%0,4)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15250-061</td><td>Seyreltme 1:10&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-fare CD16 / CD32 (2.4G2 klonu)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 ve mikro; g/ml final (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPureTM sınıfı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D21490</td><td>1 & g/ml final</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (30-F11 klonu)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&nbsp; Seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>Anti-fare CD11b (M1/70 klonu)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&nbsp; Seyreltme 1:400</td></tr><tr><td>Anti-fare CD8 ve alfa; (5H10 klonu)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>MCD0830</td><td>&nbsp; Seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Dişi C57BL / 6JRj fareler (7 haftalık)&nbsp;</td><td>Janvier Laboratuvarları</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında fare deri ve akan lenf düğümü gelen myeloid hücre İzolasyonu<em&gt; plasmodium</em&gt; sporozoitler

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Plasmodium sporozoit aşaması bir sivrisinek ağzın içinden bir memeli konakçının derisine inoküle edildiğinde sıtma enfeksiyonu başlar. son derece hareketli parazit sadece hepatositler istila ve eritrosit-enfektif forma dönüşme karaciğere ulaşır. Aynı zamanda deri içine ve tanınan ve ikamet ve / veya işe miyeloid hücreleri tarafından bozulmuş olabilir enjeksiyon yerinde, drene yakın lenf nodu geçirir. Intravital görüntüleme parlak floresan Lys-GFP pozitif cilt lökositler ve lenf düğümünde sporozoitlerle ve CD11c&#39;nin + hücreler arasındaki etkileşimlerin erken işe bildirdi. Biz burada, kurtarmak belirlemek ve fare cilde işe ve bir fare modelinde sporozoitlerine dozlarının immünizasyon intradermal enjeksiyonu takiben lenf nodu tüketiyor miyeloid hücre alt grupları numaralandırmak için verimli bir prosedür mevcut. Fenotipik karakterizasyonu kullanarak çok parametrik akış sitometri sağlargüvenilir bir tahlil Plasmodium enfeksiyona inflamatuar yanıt sırasında erken dinamik hücresel değişiklikler değerlendirmek.

Biz son zamanlarda P. immünizasyon dozlarda o iğne şırınga enjeksiyonu gösterdi fare derisi, deri ve dLn 19 iltihaplı monositler ve ardından polimorfonükleer nötrofillerin ardışık işe indükler bölgesindeki berghei sporozoitler. Protokol Yukarıdaki bölümde başarılı kulak dermisteki sporozoitler çok sayıda çoklu enjeksiyonlardan sonra, her iki doku canlı miyeloid hücreleri izole etmek için kullanılan prosedürü detayları tarif edildiği gibi (Şekil 1</str...

Burada, Plasmodium sporozoitlerinin intradermal enjeksiyonunu takiben fare derisinden miyeloid hücreleri izole etmek ve lenf düğümünü boşaltmak için bir protokol açıklıyoruz. Toplanan hücrelerin akış sitometrisi, cildi karakterize etmek ve parazite karşı drenaj lenf nodu inflamatuar yanıtını karakterize etmek için güvenilir bir test sağlar.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Bu prosedür setinin genel amacı, fareleri radyasyonla atenüe edilmiş plasmodium parazitleri ile immünize etmektir. Bu işlem, fare derisindeki ve drenaj lenf düğümlerindeki miyeloid hücre göçünün analizini kolaylaştırmak için yapılır. Bu yöntem, canlı atenüe parazitlere karşı gelişen doğal immün yanıtta rol oynayan hücresel aktörlerin neler olduğu gibi, sıtma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Enfeksiyonlu kan öğünüyle beslenmeden 18-25 gün sonra, enfekte sivrisinekleri toplayın ve 15 mililitrelik bir tüp içerisinde buz üzerinde soğuk anestezi uygulayın. Ardından, tüpü buz üzerindeki bir Petri kabına dikkatlice ters çevirin ve böcekleri 12 kilorad dozunda gama veya X-ışını radyasyonuna maruz bırakın. Işınlanmış sivrisinek tükürük bezlerini buz üzerinde 15 mikrolitre DPBS içine toplayın.Ardından, sporozoitleri serbest bırakmak için bezleri nazikçe ezin. Küçük bir hacimdeki yüksek konsantrasyonlu parazit süspansiyonunun enjeksiyonu kritik olduğundan, güçlü yeşil floresans ekspresyonu ile kanıtlanmış, iyi enfekte olmuş sivrisineklerden yeterli sayıda tükürük bezinin toplanması önemlidir. 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne adapte edilmiş 35 mikrometrelik bir süzgeçten filtrelemeden önce parazit süspansiyonunu yeniden süspanse edin.Bir mikroskop sayım odası kullanarak, izole edilen sporozoitlerin toplam sayısını belirleyin ve parazit süspansiyonunu, buz üzerinde soğuk DPBS içinde µL başına 8,3 × 10⁴ sporozoit konsantrasyonuna ayarlayın. Sporozoitleri enjekte etmeden önce, deney hayvanının sedasyon düzeyinin uygun olduğunu ayak parmak sıkıştırma testi ile doğrulayın ve kornea kurumasını önlemek için göz pomadı uygulayın. Ardından, hızlı hareket ederek, bir stereo mikroskop altında kulak kepçesinin ventral tarafını şeffaf bantla nazikçe sabitleyin ve 35 gauge iğneli on mikrolitrelik bir şırıngaya 0,6 µL resüspande edilmiş parazit yükleyin.Ardından, iğneyi eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde kulağın dorsal tarafındaki epidermisin altına dikkatlice yerleştirin ve bölgeye 0,15 µL sporozoit enjekte edin. Enjeksiyon bölgesinde karakteristik bir papül gözlemlenecektir. Dermise, az önce gösterildiği gibi üç kez daha enjeksiyon yaptıktan sonra, bandı dikkatlice çıkarın ve fare tamamen iyileşene kadar takip edin.Sporozoit inokülasyonunu takip eden istenen zaman noktasında fareyi sakrifiye edin ve prosedüre derhal başlayın. Farenin klinik ölüm belirtileri gösterdiğinden emin olun. Kulağı ve ilgili boyun bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin.Ardından, steril makas ve pensler kullanarak jugulo-karotid bölgesine bir insizyon yapın. Daha sonra, gri görünümlü drenaj lenf nodunu açığa çıkarmak için insizyonu iki pens ile gerin. Lenf nodunun hemen üzerindeki bağ dokusunu dikkatlice sıkıştırıp uzaklaştırın ve nodu, altına yerleştirilmiş ikinci bir pens çifti ile çıkarın.Lenf düğümünü, kollajenaz ve DNaz ile desteklenmiş 4,5 mililitre standart medyum içeren altı kuyucuklu bir doku kültürü plağının bir kuyucuğundaki 70 mikronluk süzgece aktarın. Ardından, inoküle edilmiş kulağın tamamını hasat edin ve iki pens kullanarak kulağı dorsal ve ventral kısımlar şeklinde sıkıştırıp ayırın. Daha sonra, her bir dokunun medyum içinde tamamen daldığından emin olarak, kulağın her bir tarafını, kuyucuk başına sindirim enzimleri ile desteklenmiş 4,5 mililitre medyum içeren ikinci bir altı kuyucuklu plağın kuyucuklarına yerleştirin.Lenf nodüllerinden immün hücreleri izole etmek için, lenfoid dokunun bulunduğu plakayı 37 °C'de ve %5 CO2 altında hafif ajitasyonla inkübe edin. 15 dakika sonra, her kuyucuğa 10 mM EDTA ekleyin ve plakayı buza yerleştirin. Ardından, her bir lenf nodülü için yeni bir 5 mm'lik şırınga pistonunun ucunu kullanarak, dokuyu ayrıştırmak amacıyla lenf nodülünü dairesel hareketlerle süzgece doğru bastırın.Sadece beyaz bağ dokusu kaldığında, süzgeci FBS ve EDTA içeren 500 µL DPBS ile iki kez durulayın ve yıkama sıvısını 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Ardından, kuyucuğu takviyeli DPBS'den 500 µL ile iki kez daha yıkayın ve yıkama sıvısını buz üzerindeki tüpe aktarın. Bağışıklık hücrelerini kulaktan izole etmek için, kulak yaprakçıklarını 37 °C ve %5 CO2'de hafif ajitasyonla inkübe edin.20 dakika sonra, sindirimi kolaylaştırmak için dokuları daha küçük parçalara ayırın ve örnekleri inkübatöre geri yerleştirin. 40 dakika sonra, sindirimi on milimolar EDTA ile durdurun ve plakayı buza yerleştirin. Ucu kesilmiş bir mililitrelik pipet kullanarak, her kuyucuğun tüm içeriğini 70 mikron süzgeçler içeren yeni kuyucuklara aktarın.Ardından, az önce gösterildiği gibi, kulak dokusu fragmanlarını dairesel hareketlerle ayırmak için beş mililitrelik bir şırınga pistonu kullanın. Sadece beyaz bağ dokusu ve kıl kaldığında, süzgeçleri ve kuyucukları az önce gösterildiği gibi DPBS artı FBS ve EDTA ile yıkayın ve yıkama sıvılarını buz üzerindeki 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Son olarak, kuyucuğu tamamlayıcı eklenmiş DPBS ile iki kez yıkayın ve yıkama sıvısını buz üzerindeki tüpe aktarın.Bu videoda, parazitlerin intradermal enjeksiyonundan 15 dakika sonra, radyasyonla atenüe edilmiş sporozoitlerin fare derisine göçü görülebilir. İntradermal sporozoit enjeksiyonundan 24 saat sonra, deriden ve drene eden lenf düğümünden toplam hücreler izole edilir. Bu şekildete gözlemlendiği üzere, derideki ve drene eden lenf düğümündeki miyeloid hücrelerin frekansı, naif farelere kıyasla belirgin şekilde artmıştır.Sivrisinek ışınlamasından sporozoit enjeksiyonuna kadar olan protokolün ilk adımları, uzmanlaşıldığında dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, sivrisinek tükürük bezlerinden izole edilen sporozoitlerin enfeksiyözlüklerini hızla kaybettiklerini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, mümkün olan en kısa sürede enjekte edilmelidirler.Bu videoyu izledikten sonra, canlı atenüye plasmodium parazitlerinin intradermal enjeksiyonuna karşı gelişen immün yanıtı araştırmak için fare derisinden ve drenaj lenf nodundan miyeloid hücrelerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bazı fare suşlar miyelin temel protein olan deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) indüksiyon karşı edebiliyoruz. Burada anlatılan yanıtsızlık tersine çevirir ve birkaç tipik EAE dirençli fare lekeler paralitik hastalığın neden basit bir bağışıklama protokoldür.

Kabul edilmiş Transfer ve antijenik Challenge Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis (EAE) Dayanıklı Fare Suşlarında yanıtsızlık Aşmak

Bu video, farelerde Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG ile ayak tabanı enfeksiyonunu takiben dendritik hücre göçünü izlemek için bir testi göstermektedir. Bakteriyel enfeksiyon üzerine, aktive edilmiş cilt DC hücreleri, hücre geçirgen bir karboksifloresein diasetat süksinimidil ester (CFSE) boyası ile etiketlenir. Popliteal drenaj lenf noduna DC migrasyonu için uygun bir aralıktan sonra, nod hücreleri izole edilir ve DC'ye özgü yüzey belirteçleri için immün boyamaya tabi tutulur.

Enfekte farelerde drenaj lenf düğümlerine cilt dendritik hücre göçünü izlemek için CFSE tabanlı bir test

Bu video, bir fare modelini canlı zayıflatılmış sporozoitlerle bağışıklamak için bir testi göstermektedir. Radyasyonla zayıflatılmış Plasmodium sporozoitler, farenin kulağının sırt tarafına enjekte edilir. Her iki kulakta birden fazla yere enjeksiyonlardan sonra, farenin iyileşmesine izin verilir.

Bir Fare Modelinde Canlı Zayıflatılmış Sporozoitlerle İntradermal Bağışıklama

Profilaktik ve terapötik aşılama çoğu zaman düğümleri ve bağışıklık hücrelerinin dolayısıyla kötü katılımını lenf nedeniyle aşının hafta drenaj güçlü bağışıklık tepkilerini uyarmak için başarısız olur. Lenf düğümlerine aşı doğrudan enjeksiyon ile, sözde lenf sistemi içi enjeksiyon, aşı etkinliği güçlü geliştirilebilir ve aşı doz azaltılabilir.

Fare intralenfatik immünoterapi ve Aşılama

Cilt, karmaşık bir bağışıklık hücresi ağına ev sahipliği yapar. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek ve deride bulunan farklı lökosit popülasyonlarını akış sitometrisi ile analiz etmek için hayvanın vücudunun farklı bölgelerinden fare derisinin sindirimi için etkili bir metodoloji açıklıyoruz.

Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Bu protokol, fare derisinin besin açısından zengin ortamda enzimatik sindirimini ve ardından lökositleri izole etmek için gradyan ayrımını tanımlar.  Bu şekilde türetilen hücreler, çeşitli alt uygulamalar için kullanılabilir. Bu, doku ayrışma makinelerine ve daha sert tripsin ve dispas bazlı doku sindirim protokollerine etkili, ekonomik ve gelişmiş bir alternatiftir.

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Farelerde, deriden boşaltılan lenf noduna hücre göçünü izlemek için yapılan ve Bacille Calmette-Guérin ile ayak pedi enfeksiyonundan sonra lenf noduna mobilize edilen cilt Dendritik hücrelerinin karakterizasyonunu sağlayan bir test tanımlanmıştır.

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Basil Calmette-Guerin

Burada, enfeksiyonun kan aşamasında Plasmodium'a hücresel bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu, sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçen in vitro bir testtir.

In Vitro Sitotoksik Lenfositler Tarafından Plazmodyum ile Enfekte Kırmızı Kan Hücresi Öldürme Testi

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Öğrenin, Plasmodium sporozoitleri intradermal enjeksiyonu sonrası fare deri ve akan lenf düğümlerinden miyeloid hücre izolasyonu yöntemini. Akış sitometrisi ile iltihabi yanıt analizi, sıtma immünolojisi ve aşı geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu Plasmodium Sporozoitler (Video) | JoVE Journal

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu

Daha fazla video keşfet