Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Bu prosedürün genel amacı, immünositokimya etiketlemesini ve nöronal hücre otonom mekanizmalarının incelenmesini kolaylaştırmak için ultra düşük yoğunlukta birincil fare hipokampal nöronlarının sağlıklı uzun vadeli kültürlerini oluşturmaktır. Bu çalışma, gelişimin işlevinin nöromorfolojisinde proteinin özgüllüğü üzerine yapılan çalışmalar gibi sinirbilim araştırmaları alanındaki bazı önemli soruların anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, nöronların bir glial besleyici tabakanın desteği olmadan bir örtü kayma üzerinde ultra düşük yoğunlukta büyümesine izin vermesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir öğrenci olan Mariel Piechowicz olacak. İki yüksek yoğunluklu ve iki düşük yoğunluklu 24 oyuklu plaka hazırlayın. 28 gauge bir iğne kullanarak, 24 kuyulu plakanın altını aşındırın, böylece yer değiştiren plastikler, üzerlerinde büyüyen düşük yoğunluklu nöronlar ile kapak kaymaları için bir destek görevi görecektir.

Steril cam kapak kızaklarını, düşük yoğunluklu kültürler için tasarlanmış iki adet 24 oyuklu plakaya aktarın. Dört plakayı da borat tamponunda seyreltilmiş mililitre başına 300 mikrolitre 0.1 miligram Poli-D-lizin ile kaplayın ve gece boyunca inkübasyon kaplaması için inkübatöre geri koyun. Doku toplamadan önce, buz gibi steril HBSS ile doldurulmuş iki adet 10 santimetrelik petri kabı hazırlayın.

Mikroskop altında, embriyoyu forseps ile boynundan tutun ve ilk kesimi orta hatta, beyincik seviyesinin altında yapın. Daha sonra, kafatasının tabanının sol tarafında bir kesik yapın. Ardından, kafatasının tabanının sağ tarafında başka bir kesim yapın.

Kafatasının, kemiğin ve cilt dokusunun küçük bir kısmını rostral uçta kesilmeden bırakın, böylece tüm beyin kolayca ekstraksiyon için bir kenara çevrilebilir. Şimdi beyni HBSS çözeltisine aktarın. Brüt kesilmiş bölgeler olmadan sağlam olduğundan emin olmak için beyni inceleyin.

Ardından, embriyo beyinlerinin geri kalanını 20 mililitre soğuk HBSS tamponu içeren yeni bir petri kabında toplamak için prosedürleri tekrarlayın. Her beyni ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Beyni kaudal uçta forseps ile tutarken, orta rostral nokta ile kaudal temporal bölge arasında keskin bir cımbız ile çapraz olarak bir kesi yapın.

Bunu diğer yarımküre için tekrarlayın. Daha sonra, sağlam hipokampuslu iki yarım küreyi beynin kök dokularının geri kalanından ayırın. Tüm beyinler için prosedürleri tekrarlayın ve disseke edilmiş tüm yarım küreleri bir araya getirin.

Ardından, iki çift cımbız kullanarak meninksleri çıkarın. Gelişmekte olan hipokampusu, temporal lobun içinde katlanmış kavisli bir yapı olarak tanımlayın ve onu bitişik kortikal dokulardan ayırın. Tüm hipokampus dokularını bir araya toplayın ve bir araya getirin.

Bu prosedürde, diseke edilmiş tüm hipokampusları 15 mililitrelik konik bir tüpte enzimatik sindirim çözeltisine aktarın. Daha sonra, tüpü bir su banyosunun içine yerleştirin ve 25 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 25 dakika sonra, enzim çözeltisini dikkatlice çıkarın.

Ardından, toplam hacmi 10 mililitreye çıkarmak için beş mililitre ılık yıkama ortamı ekleyin. Tüpü beş kez yavaşça ters çevirerek dokuyu nazikçe yıkayın. Yıkama ortamını çıkarın ve ek bir yıkama için tekrar 10 mililitre yıkama ortamı ekleyin.

Bundan sonra, yıkama ortamını çıkarın ve tekrar üç mililitre taze ılık yıkama ortamı ekleyin. Sindirilen nöronları dokudan çıkarmak için tüpü elle 15 kez sertçe çalkalayın. Hücreler dokudan yıkama ortamına ayrıldıktan sonra ortam bulanık hale gelmelidir.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik yeni bir konik tüpte toplayın ve kalan dokuyu tüpte bırakın. Bundan sonra, dokuya iki mililitre daha yıkama ortamı ekleyin ve kalan dokuyu plastik bir pipetle 15 kez ezerek nazikçe ayırın. Hücre süspansiyonunun, toplanan sallama hücrelerini içeren 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe yerleştirilmeden önce beş dakika bekletin.

Ardından, bir hemositometre ile nöronların yoğunluğunu sayın. Mililitre başına 250.000 nöron yoğunluğu elde etmek için gereken hücre süspansiyon hacmini hesaplayın ve yüksek yoğunluklu bir nöron kaplama ortamı elde etmek için 30 mililitre tam kültür ortamı içeren iki konik tüpten birine ekleyin. Bu yüksek yoğunluklu nöron çözeltisinin 1.2 mililitresini, mililitre başına 10.000 nöronluk bir konsantrasyon elde etmek için 30 mililitre tam kültür ortamına aktarın ve bu çözeltiyi düşük yoğunluklu örtü fişlerini tohumlamak için kullanın.

Bu prosedürde, kültür başlığına yüksek yoğunluklu nöronlar için kazınmış tabanlara sahip 24 oyuklu plakalar yerleştirin. Önceden şartlandırılmış ortamın 300 mikrolitresini vakumla çıkarın, ardından mililitre başına 250.000 nöronda 0.6 mililitre yüksek yoğunluklu hücre süspansiyonu kaplayın. Diğer iki 24 oyuklu plakayı kapak fişleri ile kültür davlumbazına yerleştirin.

Kapak kızakları üzerine mililitre başına 10.000 nöronda 0.6 mililitre düşük yoğunluklu hücre süspansiyonu kaplamadan önce, önceden koşullandırılmış ortamın 300 mikrolitresini vakumla çıkarın. Daha sonra, dört adet 24 oyuklu plakayı da inkübatöre geri koyun ve iki saat inkübe edin. Bundan sonra, düşük yoğunluklu örtü kızaklarını yüksek yoğunluklu kültüre yapışan nöronlarla çevirin ve nöronların birbirine baktığından emin olun.

Daha sonra, ko-kültür ile iki plakayı inkübatöre geri koyun. DIV beşte 300 mikrolitre taze besleme ortamı ekleyerek ko-kültürleri besleyin. Bu ilk beslemeyi takiben, her hafta her kuyucuğa sitozin arabinozit içermeyen 300 mikrolitre taze besleme ortamı ekleyin.

Kültürün bir aydan fazla saklanması durumunda, ortamın yarısını bir aylık zaman diliminden sonra her hafta taze besleme ortamıyla değiştirin. Morfolojik olarak, hem yüksek yoğunluklu hem de düşük yoğunluklu nöronlar üç aya kadar sağlıklı görünmelidir. Burada, immünositokimya etiketlemesi, NMDA reseptör alt birimi NR1 ve ApoE reseptör alt birimi GluR1'in çift boyama ile etiketlendiği fonksiyonel glutamaterjik sinapsları ortaya çıkarmak için kullanılır.

Düşük yoğunluklu nöronlar ayrıca aksonal protein belirteci p-Tau ile kombinasyon halinde dendritik protein belirteci MAP2'ye karşı antikor ile etiketlenir. Bu çift etiketleme, dendritlerin ve aksonların net bir şekilde ayırt edilmesini sağlar. Düşük yoğunluklu kültürler, kalsiyum fosfat yöntemleri kullanılarak DNA plazmitleri ile de başarılı bir şekilde transfekte edilebilir, ancak transfeksiyon hızı daha sonraki aşamalarda tipik olarak çok düşüktür.

Bu şekil, EGFP transfeksiyonunun nöronal morfolojiyi ortaya çıkarabileceğini ve ince dendritik omurga yapılarını görünür hale getirebileceğini göstermektedir. Son olarak, kavramın bir kanıtı olarak, ultra düşük yoğunluklu nöronlar, autapse oluşumunu teşvik eden koşullar altında büyütülebilir. Poli-D-lizin kaplı mikro adalarda yetiştirilen bu ultra düşük yoğunluklu autaptik nöronlar, bu ko-kültür protokolü ile yüksek yoğunluklu besleyici nöronlar tarafından iki aydan fazla sürdürülebilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, hücre kültürü gününde iki ila üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, cam kapak kızaklarını ve 24 oyuklu plaka tabanlarını Poli-D-lizin ile kaplamak çok önemlidir. Plaka tabanlarının basit bir şekilde aşındırılması, düşük yoğunluklu hipokampal nöronların örtü kızakları üzerinde büyümesine mekanik ve besinsel destek sağlamak için yeterlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, glial besleyici tabakasının yokluğunda ultra düşük yoğunluklu birincil fare embriyonik hipokampal nöronlarının nasıl yetiştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Umarım bu yöntemi kendi deneysel amacınız için kullanabilirsiniz.