Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü
March 5th, 2016
Primer hipokampal nöronların düşük yoğunluklu kültürleri, nörotrofik faktörleri sağlamak ve uzun ömürlülüğü sürdürmek için genellikle glia besleyici tabakaya ihtiyaç duyar. Burada, spesifik nöronal-otonom mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştıran yüksek yoğunluklu bir nöronal besleyici tabakanın varlığında cam lameller üzerinde ultra düşük yoğunluklu nöronları kültürlemek için basitleştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz.
Bu prosedürün genel amacı, immünositokimya etiketlemesini ve nöronal hücre otonom mekanizmalarının incelenmesini kolaylaştırmak için ultra düşük yoğunlukta birincil fare hipokampal nöronlarının sağlıklı uzun vadeli kültürlerini oluşturmaktır. Bu çalışma, gelişimin işlevinin nöromorfolojisinde proteinin özgüllüğü üzerine yapılan çalışmalar gibi sinirbilim araştırmaları alanındaki bazı önemli soruların anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, nöronların bir glial besleyici tabakanın desteği olmadan bir örtü kayma üzerinde ultra düşük yoğunlukta büyümesine izin vermesidir.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir öğrenci olan Mariel Piechowicz olacak. İki yüksek yoğunluklu ve iki düşük yoğunluklu 24 oyuklu plaka hazırlayın. 28 gauge bir iğne kullanarak, 24 kuyulu plakanın altını aşındırın, böylece yer değiştiren plastikler, üzerlerinde büyüyen düşük yoğunluklu nöronlar ile kapak kaymaları için bir destek görevi görecektir.
Steril cam kapak kızaklarını, düşük yoğunluklu kültürler için tasarlanmış iki adet 24 oyuklu plakaya aktarın. Dört plakayı da borat tamponunda seyreltilmiş mililitre başına 300 mikrolitre 0.1 miligram Poli-D-lizin ile kaplayın ve gece boyunca inkübasyon kaplaması için inkübatöre geri koyun. Doku toplamadan önce, buz gibi steril HBSS ile doldurulmuş iki adet 10 santimetrelik petri kabı hazırlayın.
Mikroskop altında, embriyoyu forseps ile boynundan tutun ve ilk kesimi orta hatta, beyincik seviyesinin altında yapın. Daha sonra, kafatasının tabanının sol tarafında bir kesik yapın. Ardından, kafatasının tabanının sağ tarafında başka bir kesim yapın.
Kafatasının, kemiğin ve cilt dokusunun küçük bir kısmını rostral uçta kesilmeden bırakın, böylece tüm beyin kolayca ekstraksiyon için bir kenara çevrilebilir. Şimdi beyni HBSS çözeltisine aktarın. Brüt kesilmiş bölgeler olmadan sağlam olduğundan emin olmak için beyni inceleyin.
Ardından, embriyo beyinlerinin geri kalanını 20 mililitre soğuk HBSS tamponu içeren yeni bir petri kabında toplamak için prosedürleri tekrarlayın. Her beyni ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Beyni kaudal uçta forseps ile tutarken, orta rostral nokta ile kaudal temporal bölge arasında keskin bir cımbız ile çapraz olarak bir kesi yapın.
Bunu diğer yarımküre için tekrarlayın. Daha sonra, sağlam hipokampuslu iki yarım küreyi beynin kök dokularının geri kalanından ayırın. Tüm beyinler için prosedürleri tekrarlayın ve disseke edilmiş tüm yarım küreleri bir araya getirin.
Ardından, iki çift cımbız kullanarak meninksleri çıkarın. Gelişmekte olan hipokampusu, temporal lobun içinde katlanmış kavisli bir yapı olarak tanımlayın ve onu bitişik kortikal dokulardan ayırın. Tüm hipokampus dokularını bir araya toplayın ve bir araya getirin.
Bu prosedürde, diseke edilmiş tüm hipokampusları 15 mililitrelik konik bir tüpte enzimatik sindirim çözeltisine aktarın. Daha sonra, tüpü bir su banyosunun içine yerleştirin ve 25 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 25 dakika sonra, enzim çözeltisini dikkatlice çıkarın.
Ardından, toplam hacmi 10 mililitreye çıkarmak için beş mililitre ılık yıkama ortamı ekleyin. Tüpü beş kez yavaşça ters çevirerek dokuyu nazikçe yıkayın. Yıkama ortamını çıkarın ve ek bir yıkama için tekrar 10 mililitre yıkama ortamı ekleyin.
Bundan sonra, yıkama ortamını çıkarın ve tekrar üç mililitre taze ılık yıkama ortamı ekleyin. Sindirilen nöronları dokudan çıkarmak için tüpü elle 15 kez sertçe çalkalayın. Hücreler dokudan yıkama ortamına ayrıldıktan sonra ortam bulanık hale gelmelidir.
Daha sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik yeni bir konik tüpte toplayın ve kalan dokuyu tüpte bırakın. Bundan sonra, dokuya iki mililitre daha yıkama ortamı ekleyin ve kalan dokuyu plastik bir pipetle 15 kez ezerek nazikçe ayırın. Hücre süspansiyonunun, toplanan sallama hücrelerini içeren 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe yerleştirilmeden önce beş dakika bekletin.
Ardından, bir hemositometre ile nöronların yoğunluğunu sayın. Mililitre başına 250.000 nöron yoğunluğu elde etmek için gereken hücre süspansiyon hacmini hesaplayın ve yüksek yoğunluklu bir nöron kaplama ortamı elde etmek için 30 mililitre tam kültür ortamı içeren iki konik tüpten birine ekleyin. Bu yüksek yoğunluklu nöron çözeltisinin 1.2 mililitresini, mililitre başına 10.000 nöronluk bir konsantrasyon elde etmek için 30 mililitre tam kültür ortamına aktarın ve bu çözeltiyi düşük yoğunluklu örtü fişlerini tohumlamak için kullanın.
Bu prosedürde, kültür başlığına yüksek yoğunluklu nöronlar için kazınmış tabanlara sahip 24 oyuklu plakalar yerleştirin. Önceden şartlandırılmış ortamın 300 mikrolitresini vakumla çıkarın, ardından mililitre başına 250.000 nöronda 0.6 mililitre yüksek yoğunluklu hücre süspansiyonu kaplayın. Diğer iki 24 oyuklu plakayı kapak fişleri ile kültür davlumbazına yerleştirin.
Kapak kızakları üzerine mililitre başına 10.000 nöronda 0.6 mililitre düşük yoğunluklu hücre süspansiyonu kaplamadan önce, önceden koşullandırılmış ortamın 300 mikrolitresini vakumla çıkarın. Daha sonra, dört adet 24 oyuklu plakayı da inkübatöre geri koyun ve iki saat inkübe edin. Bundan sonra, düşük yoğunluklu örtü kızaklarını yüksek yoğunluklu kültüre yapışan nöronlarla çevirin ve nöronların birbirine baktığından emin olun.
Daha sonra, ko-kültür ile iki plakayı inkübatöre geri koyun. DIV beşte 300 mikrolitre taze besleme ortamı ekleyerek ko-kültürleri besleyin. Bu ilk beslemeyi takiben, her hafta her kuyucuğa sitozin arabinozit içermeyen 300 mikrolitre taze besleme ortamı ekleyin.
Kültürün bir aydan fazla saklanması durumunda, ortamın yarısını bir aylık zaman diliminden sonra her hafta taze besleme ortamıyla değiştirin. Morfolojik olarak, hem yüksek yoğunluklu hem de düşük yoğunluklu nöronlar üç aya kadar sağlıklı görünmelidir. Burada, immünositokimya etiketlemesi, NMDA reseptör alt birimi NR1 ve ApoE reseptör alt birimi GluR1'in çift boyama ile etiketlendiği fonksiyonel glutamaterjik sinapsları ortaya çıkarmak için kullanılır.
Düşük yoğunluklu nöronlar ayrıca aksonal protein belirteci p-Tau ile kombinasyon halinde dendritik protein belirteci MAP2'ye karşı antikor ile etiketlenir. Bu çift etiketleme, dendritlerin ve aksonların net bir şekilde ayırt edilmesini sağlar. Düşük yoğunluklu kültürler, kalsiyum fosfat yöntemleri kullanılarak DNA plazmitleri ile de başarılı bir şekilde transfekte edilebilir, ancak transfeksiyon hızı daha sonraki aşamalarda tipik olarak çok düşüktür.
Bu şekil, EGFP transfeksiyonunun nöronal morfolojiyi ortaya çıkarabileceğini ve ince dendritik omurga yapılarını görünür hale getirebileceğini göstermektedir. Son olarak, kavramın bir kanıtı olarak, ultra düşük yoğunluklu nöronlar, autapse oluşumunu teşvik eden koşullar altında büyütülebilir. Poli-D-lizin kaplı mikro adalarda yetiştirilen bu ultra düşük yoğunluklu autaptik nöronlar, bu ko-kültür protokolü ile yüksek yoğunluklu besleyici nöronlar tarafından iki aydan fazla sürdürülebilir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, hücre kültürü gününde iki ila üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, cam kapak kızaklarını ve 24 oyuklu plaka tabanlarını Poli-D-lizin ile kaplamak çok önemlidir. Plaka tabanlarının basit bir şekilde aşındırılması, düşük yoğunluklu hipokampal nöronların örtü kızakları üzerinde büyümesine mekanik ve besinsel destek sağlamak için yeterlidir.
Bu videoyu izledikten sonra, glial besleyici tabakasının yokluğunda ultra düşük yoğunluklu birincil fare embriyonik hipokampal nöronlarının nasıl yetiştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Umarım bu yöntemi kendi deneysel amacınız için kullanabilirsiniz.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, cam örtü camlarında ultra düşük yoğunlukta birincil fare hipokampal nöronlarının kültürlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Teknik, glial besleyici tabaka ihtiyacını ortadan kaldırarak nöronal-özerk mekanizmaların çalışılmasına olanak sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Nöronal Kültür Teknikleri
Arka Plan
- Birincil hipokampal nöronlar genellikle büyüme için glial destek gerektirir.
- Ultra düşük yoğunluklu kültürler, spesifik nöronal fonksiyonların çalışılmasını artırabilir.
- Nöronal mekanizmaların anlaşılması, sinirbilim araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, nöron sağlığını korurken kültürleme sürecini basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Birincil hipokampal nöronların uzun süreli kültürlerini kurmak.
- İmmünositokimiyasa etiketlemesini kolaylaştırmak.
- Nöronal hücre özerk mekanizmalarını araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yüksek yoğunluklu ve düşük yoğunluklu 24 kuyuluk plakaların hazırlanması.
- Plakaların tabanının 28 gauge iğne ile kazınması.
- Düşük yoğunluklu nöron büyümesi için örtü camlarının kullanılması.
- Prosedürün bir laboratuvar öğrencisince gösterilmesi.
Ana Sonuçlar
- Ultra düşük yoğunluklu nöron kültürlerinin başarılı kurulması.
- Nöronların glial destek olmadan sağlık ve uzun ömür sürdürdüğü.
- Nöronal mekanizmaların çalışılmasının etkili bir şekilde kolaylaştırılması.
- Gelecekteki araştırma uygulamaları için basitleştirilmiş bir yöntem sağlanması.
Sonuçlar
- Yöntem, nöronal-özerk mekanizmaların çalışılmasına olanak tanır.
- Birincil nöronlar için kültürleme sürecini basitleştirir.
- Bu yaklaşım, sinirbilimdeki araştırmaları artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Establishing ultra-low density primary hippocampal neuron cultures without glial support enables mechanistic interrogation of cell-autonomous neuronal functions, reducing confounding variables in target validation. This approach supports predictive confidence in early discovery by isolating intrinsic neuronal phenotypes relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative disease models. Long-term culture stability (>3 months) facilitates sustained assay windows for lead compound screening and phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal cell-autonomous mechanisms by eliminating glial feeder layer variability.
- Operational Value: Simplifies culture workflow by removing time-consuming glial preparation and maintenance steps.
- Predictive Value: Supports target de-risking through isolated study of protein function in neurite morphology and synaptic formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a stable, serum-free, glial-free platform for quantifying synapse formation and dendritic spine morphology over extended periods.
- Operational Value: Etched well-bottom microspaces allow reproducible, low-density neuron seeding without physical spacers, enhancing assay standardization.
- Scalability: Compatible with standard 24-well plates and coverslips, enabling integration into existing imaging and transfection workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Ultra-low density autaptic neuron cultures model isolated neuronal circuit function, relevant to studying hyperexcitability in epilepsy and autism spectrum disorders.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal observation of neuronal health and synaptic marker expression (e.g., NR1, GluR1, MAP2, p-Tau) to assess compound effects on neuronal integrity.
- Assay Continuity: Supports immunocytochemistry and transfection-based readouts for target engagement and pathway modulation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early neuronal phenotype screening to mechanistic follow-up in lead optimization, particularly for CNS-targeted programs requiring neuronal health readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuronal-autonomous pathways by isolating intrinsic growth and synaptogenesis without glial interference.
- Screening: Enables reproducible, low-density plating for high-content imaging of dendritic complexity and spine density as phenotypic endpoints.
- Analytics: Facilitates quantitative immunocytochemistry and image-based analysis of synaptic puncta and axonal-dendritic compartmentalization.
- Translational Research: Autaptic neuron islands allow study of isolated synaptic function, modeling monosynaptic circuit disruptions in disease.
- Enterprise Reuse: Poly-D-lysine coated coverslips and etched plates represent a low-cost, reusable platform for long-term neuronal culture across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal studies by eliminating glial-derived trophic and signaling confounders.
- Operational Value: Eliminates need for glial feeder layer preparation, reducing culture setup time and technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in CNS target validation by providing cleaner phenotypic readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on neuron-specific functional data rather than mixed glia-neuron responses.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique for hippocampal dissection and enzymatic dissociation of embryonic mouse tissue.
- Depends on precise Poly-D-lysine coating of glass coverslips and 24-well plate surfaces for neuron adhesion.
- Necessitates micro-etching of well plate bottoms with a 28-gauge needle to create supportive microspaces for coverslips.
- Relies on weekly feeding with fresh medium (without cytosine arabinoside after DIV5) to maintain culture health beyond one month.
- Limited transfection efficiency at later stages may require alternative methods (e.g., viral vectors) for genetic manipulation in mature neurons.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
24-well Plate Preparation for High and Low Density Neuron Culture
1:48
Brain Removal and Hippocampi Dissection of E16.5 - E17.5 Mouse Embryos
4:02
Enzymatic Digestion and Separation into Single Neurons
6:53
Plating of Neurons and Long Term Co-Culture
8:51
Results: Experimental Manipulations of Low Density Neurons Grown in Co-Culture
10:23
Conclusion
