Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği Xenopus Böbrek

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan ksenopus böbreğine mikroenjeksiyonları hedeflemektir. Bu yöntem, böbreğin nasıl oluştuğu ve bu süreç için hangi genlerin önemli olduğu gibi gelişim biyolojisi alanındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mikroenjekte edilen reaktiflerin hedeflenen bir dokuya verilmesini en üst düzeye çıkarmasıdır.

Bu yöntemin görselleştirilmesi önemlidir, çünkü hedeflenen mikroenjeksiyon için doğru blastomerin belirlenmesi kritik öneme sahiptir. Bu işleme başlamak için, her iki testis de tek bir erkek kurbağadan izole edildi ve 10 milileter testis saklama çözeltisi ile doldurulmuş 60 milimetrelik bir petri kabına yerleştirildi. Daha sonra testisleri dört derece Santigrat derecede saklayın.

Daha sonra, 100 milimetrelik bir petri kabında dişi bir kurbağadan yumurta toplandı. Petri kabındaki fazla suyu boşaltın. Bundan sonra Testes Depolama Solüsyonunda bir testisin dörtte birini kesin.

Testis parçasını yumurtaların bulunduğu petri kabına aktarın. Daha sonra, testis kısmını küçük parçalar halinde kesin. Yumurtaları kaplamak için petri kabına MMR artı Gentamisin ekleyin.

Tabağı döndürerek karıştırın ve ardından oda sıcaklığında döllenmenin gerçekleşmesi için yaklaşık 30 dakika bekleyin. Döllenmeden sonra embriyoların pigmentli tarafı yukarı bakmalıdır. Bir transfer pipeti kullanarak MMR'yi petri kabından çıkarın ve embriyoları kaplayacak kadar jöle giderici solüsyon ekleyin.

Daha sonra, embriyoların üzerindeki jöle tabakasını çözmek için tabağı önümüzdeki birkaç dakika boyunca döndürün. Embriyolar tabağın ortasında birbirine yakından temas ettiğinde, jöle kaplama çıkarılmıştır. Jöle giderme solüsyonunu bir transfer pipeti ile çıkarın.

Daha sonra, jöleli embriyoları MMR artı Gentamisin'de 3 ila 5 kez, MMR'yi dikkatlice dökerek ve tabağı yeni MMR ile doldurarak yıkayın. MMR'nin tamamını tabaktan çıkarmayın, bu embriyolara zarar verebilir. Bundan sonra, döllenmemiş yumurtaları veya testis parçalarını petri kabından çıkarın.

Gelişimlerini kademelendirmek için, tek bir döllenmeden elde edilen embriyoların yarısını 14 santigrat derecede tutulan bir petri kabına, diğer yarısını ise 18 santigrat derecede tutulan bir petri kabına yerleştirin. Embriyolar 14 derece Santigrat'ta 18 derece Santigrat'a göre daha yavaş gelişecektir. Tek bir döllenmiş kavramadan birden fazla enjeksiyon setine izin verir.

Nanolitre Membrana bağlı Kırmızı Floresan Protein mRNA'sı başına sıfır noktası bir nanogram içeren enjeksiyon solüsyonunu hazırlayın. Embriyolar 4 hücreli veya 8 hücreli aşamaya gelişirken. Enjeksiyon solüsyonunu kullanana kadar buz üzerinde tutun.

Ardından, yedi inçlik bir yedek cam kılcal boruyu, yedek borunun üst kısmı iğne çektirme kasasının üst kısmı ile aynı hizada olacak şekilde bir iğne çektirmesine yükleyin. İki numaralı ısı değerini 800'e ve çekme değerini 650'ye ayarlayın ve iğneyi çekmek için çekme düğmesine basın. Bundan sonra, çekilen iğnenin ucunu bir çift Dumont forseps ile kesin.

Mikropipet halkasını iğnenin arkasına kaydırın. Ardından, büyük delikli O-halkayı pensin arkasındaki iğnenin arkasına kaydırın. Şimdi, iğneye hava kabarcıkları girmemesine dikkat ederek 27 gauge hiperdermik iğne kullanarak iğneyi mineral yağ ile doldurun.

İğneyi mikroenjektörün pistonuna kaydırın ve iğneyi pistona takılan beyaz plastik ara parçanın büyük deliğine oturtun. Pensi sıkarak iğneyi sabitleyin. Ardından, iki bip sesi gelene kadar mikro enjektör kontrol kutusundaki Boş" düğmesini basılı tutun.

Daha sonra, üç mikrolitre enjeksiyon solüsyonunu bir parça parafilm üzerine pipetleyin. Ardından, iğnenin ucunu parafilm üzerindeki enjeksiyon çözeltisinin boncuğuna yerleştirin. Enjeksiyon solüsyonunu iğneye çekmek için mikroenjektör kontrol kutusundaki Doldur düğmesini basılı tutun.

Mikroenjeksiyondan önce, ksenopus embriyosunun erken hücre bölünmelerini anlamak önemlidir. Tek hücreli embriyo, koyu pigmentli, hayvansal bir kutba ve beyaz ve boyunduruk olan bitkisel bir kutba sahiptir. İki hücreli embriyoda, ilk bölünme tipik olarak embriyonun sol ve sağ tarafları arasında gerçekleşir.

Bu hücreler pronefrik soya eşit olarak katkıda bulunur. İkinci bölünme, embriyonun dorsal ve ventral yarısını bölerek 4 hücreli bir embriyoya yol açar. Dorsal hücreler daha küçüktür ve ventral hücrelerden daha az pigmente sahiptir.

4 hücreli bir embriyoya enjekte ediliyorsa, sol böbreği hedeflemek için sol ventral blastomeri enjekte edin. Üçüncü bölünme, hayvansal ve bitkisel tarafları ikiye böler. 8 hücreli bir embriyo ile sonuçlanır.

Bu noktada dört hayvan blastomeri ve dört bitkisel blastomer vardır. 8 hücreli bir embriyonun sol böbreğini hedeflemek için sol ventral vegetal blastomere enjekte edin. Daha sonra, 500 mikron polyester ağ ile kaplı 60 milimetrelik bir petri kabını MMR artı Gentamisin içinde yüzde beş fycol ile doldurun.

20 ila 30 adet 8 hücreli embriyoyu dikkatlice tabağa pipetleyin. Bir saç halkası kullanarak, embriyoları, enjekte edilecek blastomer iğneye bakacak şekilde manipüle edin. Sol böbreği hedeflemek için, embriyoları, 8 hücreli embriyoların sol ventral bitkisel blastomerleri iğneye bakacak şekilde hizalayın.

Tabaktaki her embriyonun seçilen blastomerine 10 nanolitre enjeksiyon çözeltisi enjekte edin. Daha sonra, enjekte edilen embriyoları, MMR artı Gentamisin'de yüzde beş fycol içeren bir kültür plakasının kuyucuklarına aktarın. Enjekte edilen blastomerlerin iyileşmesini sağlamak için enjekte edilen embriyoları 16 santigrat derecede yaklaşık bir ila iki saat inkübe edin.

Bundan sonra, mikroenjekte edilen embriyoları MMR artı Gentamisin ile doldurulmuş kültür plakasındaki yeni oyuklara aktarın. Embriyoları, 38 ila 40. aşamaya ulaşana kadar 14 ila 22 derece Santigrat derecede inkübe edin. Bu prosedürde 10 ila 20, aşama 38 ila 40 embriyoyu bir cam şişeye aktarın.

Şişeye yüzde 100 etanol içinde 10 mikrolitre yüzde beş benzokain ekleyin. Şişeyi ters çevirerek karıştırın ve embriyoları uyuşturmak için 10 dakika bekleyin. Daha sonra, MMR'yi şişeden çıkarın ve MEMFA ile doldurun.

Ardından, oda sıcaklığında bir saat boyunca üç boyutlu, sallanan bir platforma yerleştirin. Bir saat sonra MEMFA'yı şişeden çıkarın ve yüzde 100 metanol ile doldurun. Ardından, şişeyi oda sıcaklığında on dakika boyunca üç boyutlu, sallanan bir platforma yerleştirin.

Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın ve embriyoları gece boyunca eksi 20 santigrat derecede yüzde 100 metanolde saklayın. Embriyolar artık sabitlenmiştir ve immün boyamaya hazırdır. Bu şema, izleyici olarak Membrana bağlı Kırmızı Floresan Protein mRNA kullanılarak 8 hücreli aşamada ksenopus embriyolarının sol pronefrosunun hedeflenmesi için hangi blastomerin enjekte edileceğini gösterir.

Sol ventral vegetal blastomerde enjeksiyon sonrası izleyici lokatlizasyonu kırmızı renkle gösterilirken, böbrek yeşil renkle işaretlenmiştir. Bu görüntü, böbreğin 3G8 ve 4A6 antikorları ile yeşile boyandığını göstermektedir. İşte izleyici loakalizasyonunu gösteren böbrek bölgesinin yakından bir görünümü ve burada izleyicinin böbrek ile birlikte lokalizasyonunu gösteren birleştirilmiş görüntü.

Burada gösterilen, 3G8 ve 4A6 ile boyanmış ikinci bir embriyonun böbreğinin konfokal görüntüsüdür. Bu, kırmızı izleyicinin böbrek ve çevresindeki dokudaki lokalizasyonudur ve bu, izleyici 3G8 ve 4A6'nın böbrekte birlikte lokalizasyonunu gösteren birleştirilmiş görüntüdür. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce, erken ksenopus embriyosuna aşina olmak önemlidir.

Bu, yerleşik xenopus solma haritası aracılığıyla mikroenjeksiyonları düzgün bir şekilde hedeflemenize olanak tanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik nöral tüp veya kalp gibi diğer dokuları hedef alacak şekilde uyarlanabilir.