Name: Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği Xenopus Böbrek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Öğrenin Xenopus laevis embriyolarında böbrek gelişimini incelemek için hedefli mikroenjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, organ gelişimindeki gen fonksiyonlarını anlamak için hassas reagent iletimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Texas McGovern Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatri Bölümü&#39;nden Sağlık NIDDK hibe (K01DK092320) ve başlangıç ​​fon Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

(: HSC-AWC-13-135 protokol #) Aşağıdaki protokol Kurumsal Bakım ve Kullanım Kurulu olarak hizmet vermektedir Laboratuar Hayvan Hastalıkları Hayvan Refahı Komitesi için Houston&#39;ın Merkezi&#39;nde Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Böbrek hedefli Enjeksiyonlar için blastomer 1. Kimlik ve Seçimi <ol><li> Embriyoların oluşturmadan önce, embriyo erken hücre bölünmeleri yönünü anlamak için Xenopus Kalkınma 21 Normal Tablo kullanın. Alternatif olarak, Xenbase 11 Xenopus erken gelişim aşamaları erişim şemaları. </li><li> Mikroenjeksiyon için hedeflenen hangi blastomere seçmek için Xenbase 11 interaktif Xenopus hücre kaderi haritalar erişin. </li><li> Tek hücreli embriyo bir koyu pigmentli hayvan kutup beyaz ve yolky bir bitkisel kutup, sahip olduğunu gözlemleyin. Not Vitellin E olarak bilinen koruyucu zar,nvelope, embriyo kapsar. </li><li> İlk bölünme genellikle embriyonun sol ve sağ taraf arasında meydana dikkat edin. Bu hücreler Pronephric soy eşit katkıda bulunur. </li><li> İkinci bölünme 4 hücreli embriyo lider, dorsal ve embriyonun ventral yarılarına ayıran unutmayın. Dorsal hücreleri daha küçüktür ve ventral hücreleri (Şekil 2A ve Şekil 3A) daha az bir pigment. <ol><li> Sol ve sağ tarafta, dorsal daha gelişen böbrek daha fazla katkıda (D; küçük, hafif hücreler) blastomer (Şekil 2A); ventral blastomer (büyük, koyu hücreler V) belirleyin. </li><li> 4 hücreli embriyo içine enjekte ise, sol böbrek (Şekil 3A ve Bölüm 3) hedef sol ventral blastomer enjekte. </li></ol></li><li> üçüncü bölge sekiz hücreli embriyonun sonucu, hayvansal ve bitkisel tarafı ikiye bölmektedir. Bu noktada, dört hayvan blastomerler [vardır sol ve sağ ventral(V1) ve dorsal (D1)], dört bitki blastomerler [sol ve ventral sağ (V2) ve dorsal (D2)] (Şekil 2B ve Şekil 3B). <ol><li> ventral, bitkisel blastomer (V2) bulun. Bu blastomer başka hücreler bu aşamada (Şekil 2B) gelişmekte böbreğe daha fazla katkıda bulunur. 8 hücreli embriyo sol böbrek hedeflemek için, sol V2 blastomer (Şekil 3B ve Bölüm 3) içine enjekte edilir. </li></ol></li><li> Dördüncü ve beşinci bölünmelerin hayvansal ve bitkisel blastomer ikiye bölmek dikkat edin. İki döl 16 hücreli embriyo ile sonuçlanan, her blastomere oluşturulur. Hücreler kendi selefi adını taşır. Örneğin, 8-hücre evresinden itibaren V2 blastomere 16 hücreli aşamada (Şekil 2C) V2.1 ve V2.2 döl yol açar. 16-hücre aşamasında V2.2 hücrenin gelişmekte olan böbrek katkıda hücrelerin çoğunluğu içerir. </li><li> Altıncı ve yedinci bölünmelerin 32 hücre Embry neden NotO. Yine, iki döl onların selefi aşağıdaki adlandırılır her blastomer, oluşturulur. Örneğin, 16-hücre evresinden itibaren V2.2 blastomere 32 hücreli aşamada V2.2.1 ve V2.2.2 yol açar. Orada hücreleri (bitkisel hayvana) A, B, C ve D olmak üzere dört sıra halinde tespit edildiği 32. hücreli aşamada alternatif bir adlandırma sistemi ve dört sütun içinde 1, 2, 3 ve 4 (şekilde dorsal) ventral için. Bu nedenle, gelişmekte olan pronephros en çok katkıda bulunan V2.2.2 blastomere, bu alternatif bir adlandırma sistemi (Şekil 2D) altında C3 adlandırılır. </li></ol> Embriyolar 2. Hazırlık <ol><li> (PH-8,0% 2 sistein, NaOH) Dejelly çözeltisinden 50 ml hazırlayın. </li><li> Standart protokollere 14&#39;e göre bir tek erkek kurbağa hem testis izole edin. 0.1 M NaCI, 2 mM KCI, 1 mM MgSO 4, 2 mM; 10 mi Testis saklama solüsyonu (1 x Marc Modifiye Ringer [MMR ile dolu bir 60 mm Petri kabı içinde testisler yerleştirinCaCl2, 5 mM HEPES, pH 8, 0.1 mM EDTA] 12,% 1 sığır serum albümini, 50 ug / ml gentamisin). 4 ° C&#39;de testisler saklayın. Not: Testis yaklaşık 7 saklanabilir - 4 ° C&#39;de 10 gün, ancak döllenme verimliliği testis saklanmış olan daha azalır. </li><li> Standart protokollere 14&#39;e göre yumurta elde etmek için bir dişi kurbağa sıkıştırın. 100 mm Petri kabındaki yumurta toplamak. Fazla suyu dökünüz. </li><li> o forseps ve bir jilet kullanarak Testis Depolama Çözüm ise bir testisin ¼ kesti. yumurta içeren Petri kabı testis parçasını aktarın. Testis saklanan ne kadar süredir testis, büyüklüğüne hesabına kullanılan testis bölümünün boyutunu ayarlayın ve kaç yumurta döllenir edilecektir. Genellikle yumurta bir debriyaj döller taze disseke testis 1/3 ¼ kullanın. </li><li> forseps ve bir jilet kullanarak küçük parçalar halinde testis bölümünü kesmek. Yeterince 0.3x MMR eklePetri kabı + 30 mg / ml gentamisin yumurta kapsayacak. karıştırmak için çanak MMR girdap. </li><li> döllenme oda sıcaklığında gerçekleşmesi için yaklaşık 30 dakika bekleyin. Hayvan yarımküre (embriyonun pigmentli tarafı) etkili verimlilik üzerine embriyonun üstünde oturup unutmayın. Daha sonra, bir transfer pipeti kullanılarak Petri kabı MMR çıkarın. Embriyoların karşılamak için çanak yeterli Dejelly Çözüm ekleyin. </li><li> Önümüzdeki birkaç dakika içinde, yavaşça aralıklı çanak girdap. Şu anda yemeğin Dinç sallayarak ekseni kusurlarına neden olabilir. &#160; Embriyoların jöle kat eriyecektir ve embriyolar dönen sırasında yemeğin ortasında birleştirmek olacaktır. Embriyolar yakından yemeğin ortasında birbirlerine dokunmadan sonra, bir transfer pipet yardımıyla Dejelly Çözüm kaldırın. 5 dakikadan daha uzun için Dejelly Çözüm embriyolar bırakmayın, ya da embriyolar zarar görebilir. </li><li> 0.3x 5 kez - dejellied embriyolar 3 yıkayındikkatlice dökerek veya MMR kapalı pipetleme ve yeni MMR ile çanak doldurarak MMR + 30 mg / ml gentamisin. çanak MMR tüm çıkarmayın ya da embriyolar zarar görebilir. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak Petri kabı herhangi bir gübresiz yumurta ya da testis parçaları çıkarın. </li><li> 14 ve 22 ° C arasında embriyolar inkübe edin. Not: düşük sıcaklıklarda yetiştirilen Embriyolar yüksek sıcaklıklarda yetiştirilen embriyolar daha yavaş gelişir. Gelişim aşamaları Zamanlama Xenbase 22 bulunabilir. <ol><li> gelişim üzerinden alanı için, bir Petri kabı içinde tek bir döllenme embriyoların yerde yarısı 14 ° C &#39;de tutulur ve bir Petri tabağına embriyoların yarısı 18 ° C&#39;de tutuldu. Bu, tek bir gübreleme 4-hücre ya da 8 hücreli embriyolara enjeksiyonu iki set sağlar. </li></ol></li></ol> Enjeksiyon Çözümleri ve Embryoların Mikroenjeksiyon 3. hazırlanması <ol><li> 0.01 içeren enjeksiyon çözeltisi hazırlayınng / nl membrana bağlı kırmızı floresan proteini (MEM-RFP) mRNA 9 embriyolar 4-hücre ya da 8-hücre aşamasına kadar olan gelişmekte iken. enjekte etmeye hazır olana kadar buz üzerinde enjeksiyon solüsyonu saklayın. </li><li> &quot;. İğne çektirmenin durumda üst hizalanmış yedek tüp üst, bir iğne çektirmenin içine yedek cam kapiller tüp 800 ısı 2. değerini ayarlayın ve 650 Press çekme değer&quot; 7 Yük çekme &quot;butonuna iğneyi çekin. Bu, tek bir 7 2 iğne yaratacak&quot; cam kapiller tüp. </li><li> Dumont forseps bir çift ile bir çekti iğne ucu kapalı snip. Not: İğneyi çekerek sonra, ucu kapalı mühürlü ve açık kesmek gerekir. İğne ucu olacak çapı daha küçük, bu kesilir iğne noktasına yakın. uç çapı Burada kullanılan mikroenjeksiyon sistemi ile enjeksiyon hacmi etkilemez, ancak daha büyük bir çapa sahip bir uç embriyo hasar olasılığı daha yüksektir. </li><li> m kaymaİğnenin sırtına icropipette pens. Sonraki, yuvanın arkasında iğne sırtına büyük delik O-halkasını slip. </li><li> madeni yağ iğne hava kabarcıkları almak için dikkatli olmak, bir 27 ölçü derialtı iğne kullanarak iğne doldurun. </li><li> piston yüklü beyaz plastik spacer büyük bir delik içine iğne oturma, mikroenjektör piston üzerine iğne Kayma. dalgıç beyaz aralama, büyük delik O-ring ve halkasında takip mikroenjektör gövdesine, en yakın küçük bir O-ring olmalıdır. halkayı sıkarak iğne sabitleyin. Düzgün güvenli olduğundan emin olmak için iğne yavaşça çekin. </li><li> iki bip kalmayana kadar basın ve mikroenjektör kontrol kutusu üzerindeki &quot;boş&quot; düğmesini basılı tutun. </li><li> Parafilm bir parça üzerine enjeksiyon solüsyonu pipetle 3 ul. Parafilm enjeksiyon solüsyonu boncuk içine iğne ucu yerleştirin. Basın ve microi düğmesine &quot;doldurmak&quot; tutunnjector kontrol kutusu iğne içine enjeksiyon çözümü çizmek için. </li><li> 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin içinde% 5 Ficoll kenetlenmek 500 mikronluk bir poliester ile kaplı bir 60 mm Petri kabı doldurmak. çanak içine 30 4-hücreli ya da 8 hücreli embriyolar - dikkatle 20 pipetle. </li><li> Saç döngüsünü 14 kullanılarak blastomer iğne karşı karşıya enjekte edilecek, böylece embriyolar manipüle. Sol böbreği hedef 4-hücreli embriyolar ya da 8 hücreli embriyo sol V2 blastomer sol ventral blastomer iğne bakacak şekilde embriyolar sıraya. </li><li> çanak her bir embriyonun seçilen blastomere içine enjeksiyon solüsyonu 10 nL enjekte edilir. Not: Petri kabı altındaki örgü embriyolar stabilize eder ve bunları stabilizasyon için saç döngü kullanılmadan enjekte sağlayan, kaymasını engeller. </li><li> Aktarım 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin içinde% 5 Ficoll ile dolu bir kültür plakasının oyuklarına embriyolar enjekte edilmiştir. Enjekte embriyo inkübeen az bir saat süreyle 16 ° C&#39;de in enjekte blastomerler iyileşmesi izin vermek. </li><li> aşama 9 (ön gastrulasyon kadar) 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin ile dolu olan yeni bir kültür plakasının yuvaları içine iyileşti embriyolar aktarın. </li><li> 40 21 - embriyolar evre 38 ulaşana kadar 22 ° C - 14 embriyolar inkübe edin. </li></ol> 4. Sabitleme ve Embriyolar immün <ol><li> MOPS / EGTA / magnezyum sülfat 50 ml hazırlamak / formaldehit Tamponu [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7.4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4,% 3.7 (h / h) formaldehid]. </li><li> bir cam şişede 40 embriyo - 20 evre 38 - Bir transfer pipeti kullanarak, 10 koydu. karıştırmak için flakon ve ters şişeye% 100 etanol içinde 10 ul% 5 benzokain ekleyin. embriyoların uyutmak için 10 dakika bekleyin. </li><li> Cam bir pipet kullanılarak şişeden MMR çıkarın. Aynı anda birden fazla şişe işleme durumunda, şişeler, 24-iyi hücre kültür plakasına dik yapılabilir. </li><li> Cam borutte, MEMFA ile flakon doldurun. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, üç boyutlu bir sallanan platform üzerinde şişe yerleştirin. </li><li> Cam bir pipet kullanılarak şişeden MEMFA çıkarın. % 100 metanol ile flakon doldurun. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç boyutlu bir sallanan platform üzerinde şişe yerleştirin. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın ve -20 ° C&#39;de% 100 metanol gecede embriyolar saklayın. </li><li> Hazırlama 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su-İnek Serumlu bir Albümin-Triton (PBT): 1X PBS, 2 mg / ml inek serum albümini,% 0.1 Triton X-100. </li><li> 1x PBT 1% 10 keçi serumu ile: Primer antikor solüsyonu hazırlayın fare monoklonal 5 seyreltme 4A6 antikoru, fare monoklonal antikorunun 3G8 bir 1:30 seyreltme (ara ürün uzak ve bağlantı tübüller 20 zarlarını etiket) ve 1 (proksimal tübüllerin 20 etiket lümen): tavşan poliklonal RFP antikor 250 seyreltme (MEM-RFP izli etiket). 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Seconda hazırlayınRy antikor çözeltisi:% 10 keçi serumu ile 1 x PBT, 1: 500 Alexa 488 keçi anti-fare IgG (stok konsantrasyonu 2 mg / ml; etiket 4A6 ve 3G8 etmek için) ve 1: 500 Alexa 555 keçi anti-tavşan IgG (hazır konsantrasyonu 2 mg / ml MEM-RFP tracer etiket). Mağaza 4 ° C&#39;de, folyo tüp kapsayan ışıktan korumak için. </li><li> Seçenek olarak ise, boyama sonrası, birincil ve ikincil antikorlar toplamak ve gelecekteki deneyler yeniden kullanım için 4 ° C&#39;de saklayın. Antikor yeniden kullanım için kaydedilecek ise,% 0.01 sodyum azit ekleyin. </li><li> Yerleşik protokoller 18 kullanılarak embriyolar immunostain. </li></ol> Embriyolar ve Hedeflenen Pronephric Doku Analizi 5. Görselleştirme <ol><li> Doğru blastomere 1X bir floresan stereomikroskop altında tracer floresan görüntüleyerek enjekte edildi doğrulamak için immunohistokimyasal embriyolar Ekran (bütün embriyo görmek için) ve 5X büyütme (böbrek görmek için). biz ile çok iyi bir cam levha yerleştirin embriyolar1x PBT ucu ile bir transfer pipet kullanarak dolu rf kesti. Bir saç döngü ile embriyolar işleyin. Embriyonun sol tarafında pronephros eş enjekte izleyici hediyem var sadece embriyolar kullanın (Şekil 3C, F ve Şekil 4C, F) geninin aşırı ekspresyonu veya demonte analizi için. </li><li> Bir cam şişe içinde embriyoların yerleştirilmesi ve Murray Clear flakon doldurarak: Alternatif olarak, Murray&#39;in Clear embriyolar (1 kısım benzil alkol 2 parça benzil benzoat) temizleyin. Bir cam plaka kullanarak embriyolar gözünüzde canlandırın. Not: Murray Temizle bir organik çözücü ve dikkatle ele alınmalıdır. eldiven giyin ve sadece Murray&#39;nın Clear cam şişeleri ve pipet kullanın. </li><li> 3 hafta - 2 için 4 ° C 1x PBT saklayın embriyolar. embriyoların uzun süreli depolama için, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 100 metanol içinde iki kez yıkanarak embriyolar dihidrat. % 100 metanol içinde -20 ° C&#39;de embriyolar saklayın. </li></ol>

<ol><li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+the+study+of+kidney+development%3A+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li>
<li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li>
<li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol.+Dial.+Transplant%22%5BJournal%5D)">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).</li>
<li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li>
<li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84(2008).</li>
<li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+%28Xenopus+laevis%29+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+Berl%22%5BJournal%5D)">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li>
<li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cleavage+stage+origin+of+Spemann%27s+Organizer%3A+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li>
<li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li>
<li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li>
<li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+expression+of+the+Wilms%27+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis.+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).</li>
<li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li>
<li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li>
<li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li>
<li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Xenopus+pronephric+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).</li>
<li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li>
<li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+%28LFB1%29+during+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li>
<li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li>
<li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li>
<li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+systematical+%26+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li>
<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Xenopus embriyoların geliştirilmesi pronephros Hedefleme belirlenmesi ve doğru blastomer enjekte dayanır. 8 hücreli embriyo V2 blastomer enjeksiyon sol pronephros 18 hedefliyor. Bu bir iç kontrol olarak kontralateral sağ pronephros bırakır. morfolino demonte veya RNA aşırı böbrek gelişimi değiştirmek için kullanıldığı takdirde, kontralateral sağ pronephros sol pronephros gen demonte veya aşırı ekspresyonuna etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu durumda, böyle bir uyumsuz kontrol morfolino...

Xenopus embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimini ve hastalığın incelemek için iyi bir modeldir. Embriyolar, harici olarak geliştirilmesi büyük boyutta, çok sayıda üretilebilir ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi prosedürler ile işlenir. Buna ek olarak, memeliler ve amfibiler böbrek gelişimini yöneten genler korunur. Embriyonik amfibiler bir pronephros var ve yetişkin amfibi bir metanephros varken, pronephros, mesonephros ve metanephros 1: Memeli böbrekler üç aşamadan yoluyla ilerleme. Bu, böbrek formlarının temel filtreleme birimi nefron ve memeli ve amfibi hem nefrogenezisi 2, 3 geçmesi, aynı sinyal iletim ve endüktif olaylar. Xenopus pronephros proksimal, orta ve distal tübülleri bağlayan oluşan tek nefron içerir, ve (memeli glomerulus benzer) glomus 1, 4-6 (Şekil 1 </strong&gt;). Xenopus pronephros tek büyük nefron, bu böbrek gelişim ve hastalık süreçlerinde rol oynayan genlerin incelenmesi için basit bir model olarak uygun hale getirir. Hücre kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulan ve serbestçe Xenbase 7-11 online olarak mevcuttur edilmiştir. Aynı teknik, kalp ya da gözler gibi diğer hedef dokulara adapte edilebilir, ancak burada, gelişmekte Xenopus pronephros hedef soyu izleyicilerin mikroenjeksiyon için bir teknik açıklanmaktadır. Köken izleyiciler erken blastomere enjekte edilebilir, geliştirme sırasında bu hücre soyu görselleştirme sağlayan (vital boyaların, floresan etiketli dekstranlar, histokimyasal tespit enzimler, ve mRNA floresan proteinleri kodlayan dahil) etiketlerdir. Bu protokol MEM-RFP mRNA kodlama membran soy izleyici olarak, kırmızı floresan proteini 12 hedef kullanır. Hedeflenen Mikroenjeksiyon teknolojiBurada tarif edilen 4- ve 8 hücreli embriyolar bireysel blastomerlerin için bir dizi yöntem vasıtasıyla ilgili bir geni fazla-sentezlemek üzere gen ekspresyonunu veya eksojen RNA ile yıkmak morpholinos enjeksiyon için kullanılabilir. ventral, bitkisel blastomer içine enjekte edilerek, öncelikle embriyo pronephros gelişimsel bir kontrol olarak kontralateral pronephros bırakarak, hedeflenecektir. Bir izleyicinin ko-enjeksiyon doğru blastomere enjekte edildi doğrular ve embriyoda dokular gösterir pronephros hedeflenmesi doğrulayarak, enjekte blastomer ortaya çıktı. pronephros immün Pronephric tübüller hedef alınmıştır ne kadar iyi görselleştirme sağlar. Overekspresyonu ve demonte etkiler daha sonra bir gelişimsel kontrol olarak hizmet veren embriyo, kontralateral tarafa karşı gol olabilir ve Pronephric indeksi 13 hesaplamak için kullanılabilir. hücre kaderinin haritaların temini bu hedefli mikroenjeksiyon tekniği oth hedef dokulara kullanılmasına olanaker pronephros ve, bir floresanlı işaretleyici birlikte enjeksiyon dışında her bir dokuya hedeflenmiş mikroenjeksiyon analiz öncesi doğrulanmasına izin verir. Embriyo mikroenjeksiyon sırasında, gelişimsel sıcaklık, sıkı regüle Xenopus gelişme oranı o 14 oranda bağımlı olduğu verilmelidir. Geliştirme süresi yavaşlatılır için 4 ve 8-hücresi enjeksiyonu - (16 ° C 14) Embriyolar daha soğuk sıcaklıklarda inkübe edilmelidir. 22 ° C, evre 1 (1 hücreden) kalkınma anda 16 ° C geliştirme anda 3 yaklaşık 4 saattir sahneye iken 3 (4 hücreleri) yaklaşık 2 saattir sahneledi. Bu 22 ° C&#39;de 8 hücreli (evre 4) embriyo için bir 4-hücreli embriyo gitmek için yaklaşık 15 dakika sürer, ancak 16 ° C&#39;de yaklaşık 30 dakika sürer. Benzer bir şekilde, 22 ° C &#39;de, sadece bir 16 hücreli embriyo (Aşama 5) ilerleme için bir 8-hücreli embriyonun 30 dakika sürer. Bu kez 16 ° C&#39;de 45 dakika için artırılır.refore, embriyolar, 16 hücre aşamasına kadar ilerleme önce, 8-hücre aşamasında enjeksiyon için yeterli zaman sağlamak için embriyo gelişimi hızını yavaşlatmak için yararlıdır. Buna ek olarak, büyüme sıcaklığı hız veya böbrek tam gelişmiş kadar embriyo gelişimini yavaşlatmak için modüle edilebilir. Iribaş aşamalı Xenopus embriyoların epidermis dokusu 15 diseksiyon veya takas olmadan gelişen pronephros kolay görüntüleme için izin nispeten şeffaftır. Nedeniyle Xenopus embriyoların göreli şeffaflık, canlı hücre görüntüleme de 16,17 mümkündür. Sonra Xenopus embriyolar 18-20 gen ifadesinin manipülasyonu hedeflenen Pronephric gelişmenin değerlendirilmesinde izin 40 embriyolar - pronephros görselleştirmek için immün, orta distal proksimal ve sahnenin bağlantı tübül 38 etiket kurulan antikorlarla mümkündür tüm montaj.

<table><tbody><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat ve nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin çözeltisi, 50 mg / ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Sistein,% 99 +</td> <td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri kabı</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Buzdolabı II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Embriyolar için tezgah üstü inkübatör.</td></tr><tr><td>Gap43-RFP plazmidi</td><td></td><td></td><td>İzleyici RNA yapmak için. Referans: Davidson et al., 2006.</td></tr><tr><td>Rhodamine dekstran, 10.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>İzleyici.</td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji sınıfı, USP steril arıtılmış su</td><td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7 "Drummond yedek tüpler</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G / XL</td><td>Mikroenjeksiyon iğneleri.</td></tr><tr><td>İğne çektirme</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>Mikroenjeksiyon iğne ucunu kırmak için.</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Mikroenjektör.</td></tr><tr><td>Mineral yağ, ağır</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>İğneler için yağ.</td></tr><tr><td>27 G Monoject hipodermik iğne</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>Mineral yağı mikroenjeksiyon iğnesine yüklemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>5 ml Luer-Lok şırınga</td><td>BD</td><td>309646</td><td>Mineral yağı mikroenjeksiyon iğnesine yüklemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri kabı</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 mikron Polyester ağ</td><td>Küçük Parçalar</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>Embriyoların transferi için. Embriyoların pipet tarafından kolayca alınması için ucu kesin.</td></tr><tr><td>6 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Vidalı şişe</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>Embriyoları sabitlemek, boyamak ve saklamak için.</td></tr><tr><td>24 oyuklu hücre Kültür plakası</td><td>Nest Biyoteknoloji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzokain</td><td>Spektrumu</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS) 1x toz</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini rocker, model 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu, Yeni Zelanda menşeli</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal 3G8 antikoru</td><td>Avrupa Xenopus Kaynak Merkezi</td><td></td><td>Proksimal etiketlemek için birincil antikor Kamışı.</td></tr><tr><td>Monoklonal 4A6 antikoru</td><td>Avrupa Xenopus Kaynak Merkezi</td><td></td><td>Ara, distal ve bağlantı tübüllerini etiketlemek için birincil antikor.</td></tr><tr><td>anti-RFP pAb, saflaştırılmış IgG / tavşan</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Gap43-RFP izleyiciyi etiketlemek için birincil antikor.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Böbrek tübüllerini etiketlemek için ikincil antikor.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 keçi anti-tavşan IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Gap43-RFP izleyiciyi etiketlemek için ikincil antikor.</td></tr><tr><td>9 Boşluklu nokta plakası</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzil benzoat</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>İsteğe bağlı - embriyoları temizlemek için</td></tr><tr><td>Benzil alkol</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>İsteğe bağlı - embriyoları temizlemek için</td></tr></tbody></table>

gelişmekte olan mikroenjeksiyon hedef tekniği<em&gt; xenopus</em&gt; böbrek

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Xenopus laevis (kurbağa), pronephros, embriyonik böbrek tek nefron oluşur ve böbrek hastalığı için bir model olarak kullanılabilir. Xenopus embriyolar dışarıdan geliştirmek, büyük ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi işlemler tarafından manipüle edilebilir. Buna ek olarak, kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulmuştur. sonuçta bir organa veya ilgili dokuya sebebiyet verecek bağımsız blastomere hedefli mikroenjeksiyon seçici gelişen embriyonun geri kalan ikincil etkilerin azaltılması, aşın ya da, bu sınırlı bölge içinde gen ekspresyonunu yıkmak kullanılabilir. Bu protokol, biz 4 ve 8 hücreli embriyolar belirli blastomer içine mikroenjeksiyon yoluyla gelişen Xenopus böbrek (pronephros), hedef kurulan Xenopus kader haritaları nasıl kullanılacağını açıklar. soy izleyicilerin enjeksiyon enjeksiyon spesifik hedefleme doğrulamasına imkan sağlar.Embriyolar 38 evresine kadar gelişti sonra - 40 tüm montaj immün Pronephric gelişimi görselleştirmek için kullanılır ve pronephros hedeflenen hücrelerin katılım değerlendirilebilir. Aynı teknik pronephros ilave olarak diğer doku tiplerini hedef uyarlanabilir.

MEM-RFP mRNA ile 4 ve 8 hücreli Xenopus embriyoların Microinjections pronephros hedefleme farklı düzeylerde göstermektedir. 4 gösterileri sahne doğru MEM-RFP mRNA ekspresyonu ile 40 embriyolar Şekil. Embriyolar, sol ventral blastomere (Şekil 4A) enjekte ve MEM-RFP mRNA uygun ekspresyon modeli için kriteri edildi. Ara uzak proksimal, MEM-RFP&#39;yi tanımlayan ve böbrek tübülleri bağlanmanın yanı sıra, uygun bir şekilde enjekte ed...

Burada, Xenopus laevis embriyolarının böbreğine yol açan bireysel blastomerlere enjeksiyonları hedeflemek için kader haritalarını ve soy izleyicilerini kullanmak için bir protokol sunuyoruz.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Bu prosedürün genel amacı, mikroenjeksiyonları gelişmekte olan xenopus böbreğine yönlendirmektir. Bu yöntem, böbreğin nasıl oluştuğu ve bu süreç için hangi genlerin önemli olduğu gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mikroenjekte edilen reaktiflerin hedeflenen dokuya iletimini maksimize etmesidir.Bu yöntemin görselleştirilmesi önemlidir çünkü hedeflenen mikroenjeksiyon için doğru blastomerin tanımlanması kritiktir. Bu prosedüre başlamak için, tek bir erkek kurbağadan her iki testis de izole edilir ve 10 millileters testis saklama çözeltisi ile doldurulmuş 60 millimeter çapında bir petri kabına yerleştirilir. Ardından testisleri dört degress Celsius sıcaklıkta saklayın.Ardından, bir dişi kurbağadan 100 milimetrelik bir petri kabına yumurtalar toplandı. Petri kabındaki fazla suyu dökün. Daha sonra, Testis Saklama Solüsyonu içindeki bir testisin dörtte birini kesin.Testis parçasını yumurtaları içeren petri kabına aktarın. Ardından, testis kısmını küçük parçalara ayırın. Yumurtaları kaplayacak şekilde petri kabına Gentamycin eklenmiş MMR ilave edin.Kabı dairesel hareketlerle sallayarak karıştırın ve ardından döllenmenin oda sıcaklığında gerçekleşmesi için yaklaşık 30 dakika bekleyin. Döllenme sonrası embriyoların pigmente olan tarafı yukarı bakmalıdır. Bir transfer pipeti kullanarak petri kabındaki MMR'yi uzaklaştırın ve embriyoları örtecek miktarda de-jelly solüsyonu ekleyin.Ardından, embriyolar üzerindeki jöle tabakasını çözmek için tabağı sonraki birkaç dakika boyunca dairesel hareketlerle sallayın. Embriyolar tabağın merkezinde birbirine iyice değdiğinde, jöle tabakası temizlenmiş demektir. De-jelly solüsyonunu bir transfer pipetiyle uzaklaştırın.Ardından, MMR'yi dikkatlice döküp kabı yeni MMR ile doldurarak, jelden arındırılmış embriyoları Gentamisin eklenmiş MMR ile 3 ila 5 kez yıkayın. Embriyolara zarar verebileceği için kaptaki tüm MMR'yi tamamen boşaltmayın. Bundan sonra, petri kabındaki döllenmemiş yumurtaları veya testis parçalarını temizleyin.Gelişimlerini kademeli hale getirmek için, tek bir döllenmeden elde edilen embriyoların yarısını 14 °C'de tutulan bir petri kabına, diğer yarısını ise 18 °C'de tutulan bir petri kabına yerleştirin. Embriyolar 14 °C'de, 18 °C'ye göre daha yavaş gelişecektir. Bu yöntem, tek bir döllenmiş grup üzerinden birden fazla enjeksiyon seti yapılmasına olanak tanır.nanolitre başına 0,01 nanogram Membranla Bağlı Kırmızı Floresan Protein mRNA içeren enjeksiyon solüsyonunu hazırlayın. Embriyolar 4-hücreli veya 8-hücreli aşamaya gelene kadar bekleyin. Enjeksiyon solüsyonunu kullanana kadar buz üzerinde tutun.Ardından, yedek cam kapiler tüpün üst kısmını iğne çekici kasasının üst kısmıyla hizalayarak yedi inçlik yedek cam kapiler tüpü iğne çekiciye yerleştirin. Isı iki değerini 800 ve çekme değerini 650 olarak ayarlayın ve iğneyi çekmek için çekme düğmesine basın. Bundan sonra, çekilen iğnenin ucunu bir çift Dumont pensiyle kesin.Mikropipet pensini iğnenin arkasına geçirin. Ardından, büyük delikli O-ringi pensin arkasındaki iğnenin arkasına yerleştirin. Şimdi, iğnenin içine hava kabarcığı girmemesine dikkat ederek, 27 gauge hiperdermik bir iğne yardımıyla iğneyi mineral yağ ile doldurun.İğneyi mikroenjektörün pistonuna geçirin ve iğneyi, piston üzerine yerleştirilmiş beyaz plastik ara parçanın geniş deliğine oturtun. Bileziği sıkarak iğneyi sabitleyin. Ardından, iki bip sesi duyulana kadar mikroenjektör kontrol kutusundaki "Empty" düğmesine basılı tutun.Ardından, parafilm üzerine üç µL enjeksiyon çözeltisi pipetleyin. Daha sonra, iğnenin ucunu parafilm üzerindeki enjeksiyon çözeltisi damlasına batırın. Enjeksiyon çözeltisini iğneye çekmek için mikroenjektör kontrol kutusundaki "Fill" düğmesine basılı tutun.Mikroenjeksiyondan önce, xenopus embriyosunun erken hücre bölünmelerini anlamak önemlidir. Tek hücreli embriyo, koyu pigmentli bir animal pol ve beyaz, yumurta sarısı içeren bir vegetal pole sahiptir. İki hücreli embriyoda ilk bölünme tipik olarak embriyonun sol ve sağ tarafları arasında gerçekleşir.Bu hücreler pronefrik soy hattına eşit oranda katkıda bulunur. İkinci bölünme, embriyonun dorsal ve ventral yarılarını ayırarak 4 hücreli bir embriyo oluşturur. Dorsal hücreler, ventral hücrelere göre daha küçüktür ve daha az pigment içerir.4 hücreli bir embriyoya enjeksiyon yapılacaksa, sol böbreği hedeflemek için sol ventral blastomere enjekte edin. Üçüncü bölünme, animal ve vegetal kutupları ikiye ayırarak 8 hücreli bir embriyo ile sonuçlanır.Bu aşamada dört hayvansal blastomer ve dört vejetatif blastomer bulunmaktadır. 8 hücreli bir embriyonun sol böbreğini hedeflemek için sol ventral vejetatif blastomere enjeksiyon yapın. Ardından, 500 mikronluk polyester ağ ile kaplanmış 60 milimetrelik bir petri kabını, Gentamisin eklenmiş MMR içinde yüzde beş fycol ile doldurun.20 ila 30 adet 8 hücreli embriyoyu dikkatlice kaba pipetleyin. Bir saç döngüsü (hair loop) kullanarak, enjekte edilecek blastomer iğneye bakacak şekilde embriyoları manipüle edin. Sol böbreği hedeflemek için, 8 hücreli embriyoların sol ventral vejetal blastomerleri iğneye bakacak şekilde embriyoları hizalayın.Kapta bulunan her embriyonun seçilen blastomerine 10 nanolitre enjeksiyon solüsyonu enjekte edin. Ardından, enjekte edilen embriyoları, %5 fycol içeren MMR artı Gentamycin bulunan bir kültür plağı kuyucuğuna aktarın. Enjekte edilen blastomerlerin iyileşmesi için, enjekte edilen embriyoları yaklaşık bir ila iki saat boyunca 16 °C'de inkübe edin.Ardından, mikroenjekte edilmiş embriyoları, MMR ve Gentamycin ile doldurulmuş kültür plakasındaki yeni kuyucuklara aktarın. Embriyoları evre 38-40'a ulaşana kadar 14 ila 22 derece Celsius'ta inkübe edin. Bu prosedürde, evre 38-40'taki 10 ila 20 embriyoyu bir cam şişeye aktarın.Viyale %5'lik benzokainin %100 etanol içindeki çözeltisinden 10 µL ekleyin. Viyali ters çevirerek karıştırın ve embriyoların anestezi olması için 10 dakika bekleyin. Ardından, MMR'yi viyaleden uzaklaştırın ve viyali MEMFA ile doldurun.Ardından, numuneyi oda sıcaklığında bir saat boyunca üç boyutlu sallayan bir platforma yerleştirin. Bir saat sonra, vialden MEMFA'yı uzaklaştırın ve içine yüzde 100 metanol doldurun. Daha sonra, vialle oda sıcaklığında on dakika boyunca üç boyutlu sallayan bir platforma yerleştirin.Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın ve embriyoları %100 metanol içinde, -20 °C'de gece boyunca saklayın. Embriyolar artık tespit edilmiş durumdadır ve immün boyama için hazırdır. Bu şema, izleyici olarak Membran-bağlı Kırmızı Floresan Protein mRNA kullanılarak, 8 hücreli aşamadaki xenopus embriyolarının sol pronefrosunu hedeflemek için hangi blastomerin enjekte edileceğini göstermektedir.Sol ventral vejetal blastomerine enjeksiyon sonrası izleyici lokalizasyonu kırmızı ile gösterilirken, böbrek yeşil ile işaretlenmiştir. Bu görüntü, böbreğin 3G8 ve 4A6 antikorları ile yeşile boyandığını göstermektedir. Burada, izleyici lokalizasyonunu gösteren böbrek bölgesinin yakın çekim görünümü ve burada, izleyicinin böbrek ile ko-lokalizasyonunu gösteren birleştirilmiş görüntü yer almaktadır.Burada, 3G8 ve 4A6 ile boyanmış ikinci bir embriyonun böbreğinin konfokal görüntüsü gösterilmektedir. Bu, kırmızı izleyicinin böbrekteki ve çevre dokudaki lokalizasyonudur ve bu da böbrekteki 3G8 ve 4A6 izleyicilerinin ko-lokalizasyonunu gösteren birleştirilmiş görüntüdür. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce, erken dönem xenopus embriyosuna aşina olmak önemlidir.Bu, oluşturulmuş xenopus soluklaşma haritası üzerinden mikroenjeksiyonları düzgün bir şekilde hedeflemenize olanak sağlayacaktır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik nöral tüp veya kalp gibi diğer dokuları hedeflemek için uyarlanabilir.

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon...

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri<em&gt; Xenopus laevis</em

Bu videoda, bileşikleri Zebra balığı yumurta sarısı kesesine vermek için bir Embriyo mikroenjeksiyon tekniği açıklanmaktadır.

Embriyo Mikroenjeksiyonu: Zebra Balığı Sarısı İçine Bir Bileşik Verme Tekniği

Bu video, böbrek fonksiyonu üzerindeki kimyasal etkilerini incelemek için nefrotoksinlerin bir zebra balığı embriyosunun kuyruk damarına intravenöz mikroenjeksiyonunu göstermektedir.

Nefrotoksinlerin Zebra Balığı Embriyosuna İntravenöz Mikroenjeksiyonu: Nefrotoksik Ajanları Zebra Balığı Embriyosunun Kan Dolaşımına Verme Tekniği

Morphant embriyolar üretme yöntemleri gelişim düzenleyici mekanizmalarının ve gen ağları incelemek için gereklidir. Deniz yıldızı Patiria miniata bu çalışmalar için gelişmekte olan bir model sistem. Burada bir embriyo kültürleri, gamet elde üretmek için protokol ve bu türlerden zigot hızlı mikroenjeksiyon sunuyoruz.

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem Patiria Minata Zigotların

El yazması burada Xenopus floresan levhası 'ligandların salgılanmasını ve difüzyon analiz yöntemleri basit bir kümesi sağlar. Bu ligand dağılımını değiştirmek için başka proteinlerin yeteneğini test ve morfojen degradeler düzenleyen mekanizmalar içgörü verebilir deneyleri izin verdiği için bir ortam sağlar.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

kemoterapötik antibiyotik arasında değişen ilaçlar yer alır nephrotoxins, kaynaklanacak böbrek yaralanmaları, kimin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır karmaşık bozuklukları oluşabilir. Bu protokol, zebra balığı böbrek koruyucu önlemlerin tanımlanması için uygulanabilir, bu koşullar, hastalık modelleme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

Tek foliküllerin izolasyonu, sitoplazmik RNA mikroenjeksiyonları, çevre hücre tabakalarının çıkarılması ve Xenopus oositlerinde protein ekspresyonu için optimize edilmiş prosedürler anlatılmaktadır. Ek olarak, ligand kapılı iyon kanalları ile yapılan elektrofizyolojik deneylerde hızlı çözelti değişiklikleri için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

Öğrenin Xenopus laevis embriyolarında böbrek gelişimini incelemek için hedefli mikroenjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, organ gelişimindeki gen fonksiyonlarını anlamak için hassas reagent iletimi sağlar.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği

Daha fazla video keşfet