Sitokrom Kapsüllenen

Bu prosedürün genel amacı, sitokrom c'yi Silical sol-jellere hapsetmektir. Bu jelleri, biyoaerojeller oluşturmak için süper kritik işlemden geçirmek ve bu biyoaerojelleri, gaz fazı reaksiyonu aracılığıyla nitrik oksiti hızla tanımak için kullanmaktır. Bu yöntem, yüksek gözenekli bir aerojel içine hapsettiğinde sitokrom c'nin aktif kalması için hangi koşulların gerekli olduğu gibi, biyosensör ve biyoanalitik alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin önemi, proteinlerin genellikle başarıyla kapsüllenemediği bir matris içinde bir proteini kapsüllemek için basit bir prosedür olmasıdır. Bu yöntem sitokrom c hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra, gelecekteki biyanalitik cihazlar için potansiyel öneme sahip olan diğer proteinlerin aerojeller içinde kapsüllenmesine yönelik prosedürel gelişmelere de yol açabilir. 0.7 ile millimolar aralığında bir sitokrom c konsantrasyonuna sahip bir çözelti hazırlayın.

Metin protokolünde açıklandığı şekilde, seyreltilmiş 0.105 millimolar sitokrom c çözeltisinin yanı sıra; ardından, tek kullanımlık 50 millilitre polipropilen bir beheri, Beher A olarak etiketleyin. Beheri analitik bir terazinin kefesine yerleştirin ve bir cam pastör pipeti kullanarak behere 1.88 gram tetra metoksi silan ekleyin. Teraziyi sıfırlayın.

Ardından, Beher A'ya 2.88 gram metanol pipetleyin. Beher A'yı parafilm ile kapatın. Sonra, Beher B olarak etiketlenmiş tek kullanımlık 50 mililitrelik bir polipropilen behere manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve analitik terazinin kefesine yerleştirin. Bir cam pipet kullanarak 0.75 gram su ve 3.00 gram metanol ekleyin, ardından Beher B'yi parafilm ile kapatın.

Bir çeker ocak içindeki manyetik karıştırıcı üzerinde Beaker B'nin içeriğini karıştırmaya başlayın. Ardından, karıştırmaya devam ederken parafilm kapaktan bir şırınga yardımıyla karışıma 5 µL %28,0 ila %30,0'lık amonyum hidroksit çözeltisi ekleyin. Bu adım tamamlanır tamamlanmaz, Beaker A'nın içeriğini Beaker B'ye ekleyin. Karışımı parafilm ile kapalı halde 20 dakika boyunca karıştırın.

Silika sol karışımı karıştırılırken, sekiz veya dokuz adet polipropilen sintilasyon şişesi ve bunlara uygun kapakları temin edin. Jelin üzerinde oluşabileceği düz bir yüzey oluşturmak için şişenin kapak ucuna plastik film yerleştirin ve kapağı üzerine kapatın.

Plastik sargının kapak içinde sağlam kaldığından emin olun. Tüpleri, kapak uçları tezgahın üzerine gelecek ve açık alt kısımları yukarı bakacak şekilde dizin. Ardından, her bir tüpü kapatmak için kullanılacak parafilm parçalarını kesin.

Sol karıştırma işlemi tamamlandığında, sol karışımından 3 mililitreyi temiz, tek kullanımlık 50 mililitrelik polipropilen bir behere ekleyin. Cam bir pasteur pipeti kullanarak, 0.105 milimolar seyreltilmiş sitokrom c çözeltisinden 500 mikrolitreyi, yaklaşık bir dakika boyunca beherin kenarından 3 mililitrelik sol karışımın içine çok yavaşça damlatın. Büyük kırmızı topakların oluşumunu önlemek için sitokrom c eklerken karışımı nazikçe çalkaladığınızdan emin olun.

Elde edilen sitokrom c silika solünden her bir hazırlanmış kalıba 0.5 milliliters pipetleyin. Ayrıca, süper kritik kurutma işlemi sırasında kontrol örnekleri olarak kullanmak üzere, kalan sade silika solünden bir veya iki kalıba 0.5 milliliters pipetleyin. Kalıpların üstte kalan açıklıklarını parafilm ile kapatın ve sol jeller oluşturmak için buzdolabında gece boyunca veya en az 12 saat bekletin.

Kalıpları buzdolabından çıkarın. Sitokrom c sol jel içeren bir kalıbın üzerindeki parafilmi çıkarın; ayrıca alt kısımdaki kapağı ve plastik sargıyı da çıkarın. Bir yıkama şişesinden kalıbın içine bir miktar etanol ekledikten sonra, jeli dikkatlice kalıptan dışarı ve yaklaşık 5 mL etanol içeren temiz bir 20 mililitrelik cam sintilasyon şişesine itmek için bir şırınga pistonunun dairesel disk ucunu kullanın.

Tüm sitokrom c jelleri bir tüpe ve tüm silika jeller ayrı bir tüpe eklenene kadar bu jel çıkarma işlemini tekrarlayın. Ardından tüpleri ağzına kadar etanol ile doldurun. Kapaklarını kapatın ve 2 ile 8 derece santigrat arasinda saklayın.

Gün boyunca her dört saatte bir, jelleri buzdolabından çıkarın. Jellerin üzerindeki etanolü boşaltın ve taze etanol ile değiştirin. Sonraki üç gün boyunca, ıslak sol jelleri asetonun içinde bekletin; asetonu günde üç kez boşaltıp taze aseton ekleyin.

Bağlı olan sirkülatörün sıcaklığını sekiz derece santigrat olarak ayarlayarak, bir kritik nokta kurutma cihazını 10 derece santigrat sıcaklığa kadar soğutun. Cihaz 10 derece santigrat sıcaklığa ulaştığında, metin protokolünde açıklandığı şekilde cihaz üzerinde bir sızdırmazlık testi gerçekleştirin. Cihazın sızdırmaz olduğundan emin olduktan sonra, ıslak jelleri sintilasyon şişelerinden, asetonun büyük bir kısmıyla birlikte transfer teknesinin üç uzun bölümüne dikkatlice boşaltın.

Teknenin cihaz içerisinde mühürlenmesinden önce tüm jellerin tamamen asetona batmış olduğundan emin olmak için gerekirse daha fazla aseton ekleyin. Karbondioksit eklemek için cihazın dolum valfini açın. Karbondioksitin cihaz penceresi üzerinden cihazın tabanına çöktüğü gözlemlendiğinde, beş dakika boyunca asetonu tahliye etmek için tahliye valfini açın.

Asetonun dibe doğru süzülmesi, aparat karbon dioksit ile tamamen dolmadan gerçekleşecektir. Bu nedenle, aparatın dolmaya devam etmesi için tahliye işlemi sırasında dolum valfini açık tutun. Ardından, tahliye valfini kapatın.

Dolum vanasını hafifçe aralık bırakın. Başlangıçta, dışarı süzülen karışım su içerir çünkü aseton susuz (anhidroz) değildir. Tahliye borusunda donma, tıkanma ve basınç artışı meydana gelebilir.

Bir tıkanıklık tespit edilirse, tıkanıklık çözülene kadar tahliye valfini kapatın. Beş dakika sonra, tahliye valfini beş dakika daha açık tutun ve dolum valfini, tüm tahliye süresi boyunca cihazın dolu kalmasını sağlayacak kadar açık olacak şekilde ayarlayın. Beş dakika sonra tahliye valfini kapatın ve dolum valfini hafifçe aralık bırakın.

Ardından, bu tahliye adımını beş dakika sonra bir kez daha tekrarlayın. Tahliye adımları tamamlandığında, dolum valfini kapatın ve sıvı karbondioksiti, seviye cihaz penceresinden bakıldığında teknedeki dişlerin hemen üzerinde görünür kalacak şekilde tahliye edin. Daha sonra, sıvı karbondioksitin kritik sıcaklık ve basıncın üzerine çıktığından emin olmak için cihaza bağlı sirkülatörün sıcaklığını 40 degrees celsius olarak ayarlayın.

Yaklaşık 15 dakika sonra, teknenin dişlerinin üzerindeki sıvı menisküsü kaybolurken, aparat penceresinden sıvının süperkritik akışkana geçişini gözlemleyin. En az 15 dakikalık dengeleme süresinin ardından, süperkritik akışkanın salınımına başlamak için tahliye valfini az miktarda açın. Yaklaşık 45 dakikalık süre boyunca, tahliye edilen akışkanın sabit ancak çok düşük bir tıslama sesi duyulana ve basınç göstergesinin yavaşça sıfıra indiği gözlemlenene kadar tahliye valfini kademeli olarak daha fazla açmaya devam edin.

Cihazın basıncı sıfıra düştükten sonra, cihaz kapağını açın. Kayığı çıkarın. Yeni kurutulmuş aerojelleri pens yardımıyla temiz cam sintilasyon şişelerine yerleştirin.

Metin protokolünde açıklandığı şekilde karakterizasyonun ardından, sitokrom c silika aerojeller artık nitrik oksit gazının varlığını tespit etmek için kullanılmaya hazırdır. 4,4 millimolar, 40 millimolar ve 70 millimolar potasyum fosfat tamponunda 15 mikromolar sitokrom c kapsülleyen aerojeller, bir madeni para ile karşılaştırmalı olarak gösterilmiştir. Burada, tampon içindeki sitokrom c'nin çeşitli koşullar altında aerojellere kapsüllenmiş sitokrom c ile karşılaştırıldığı temsili spektrumlar gösterilmektedir.

Sitokrom c'nin 409 nanometredeki soret piki aerojeller içinde esasen kaymamakta kalır ve biyo aerojeller gaz fazındaki nitrik okside maruz kaldığında karakteristik bir kırmızıya kayma gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, silika sol jellerin nasıl sentezleneceği, sitokrom c'nin bu sol jellere nasıl kapsülleneceği ve bu kompozit sol jellerin aerojeller haline nasıl kurutulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Biyo aerojellerin karakterizasyonu ve gaz fazındaki nitrik oksidi tespit etmek için biyo aerojellerin kullanımı hakkında daha fazla bilgiye metin protokolünden ulaşılabilir.