Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Bu protokolün genel amacı, insan pluripotent kök hücrelerini tam pigmentli, olgun melanositlere farklılaştırmaktır. Bu yöntem, melanosit gelişimi sırasındaki temel faktörlerin belirlenmesine yardımcı olabilir. Ayrıca bu protokol, hastalık gelişimi sırasında ters giden faktörlerin tespit edilmesini sağlamanın yanı sıra, önemli ilaçların taranmasına ve ilaç keşif süreçlerine olanak tanıyacaktır.

Bu protokolün temel avantajı, çok sayıda tam pigmente melanosit üretmemize olanak tanımasıdır. Hastalardan melanosit izolasyonu genellikle nispeten az sayıda hücre ile sonuçlanırken. Jelatinöz proteini alikotlara ayırıp dondurduktan sonra, 1 ml'lik bir alikotu çözün ve 19 ml DMEM f12 içinde resüspande edin.

Ardından, bu karışımdan beş mililitreyi tek bir 10 santimetrelik doku kültürü plağına ekleyin. Bu şekilde birkaç plak hazırladıktan sonra, plakları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, bir kültür plağına mililitre başına 15 mikrogram PO içeren PBS ekleyerek PO, laminin ve fibronektin ile kaplanmış plakları hazırlamaya başlayın.

Ardından plakları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Sonrasında çözeltiyi aspire edin ve kapları üç kez 1X PBS ile yıkayın. 1 µg/mL fare laminin 1 ve 2 µg/mL fibronectin içeren 10 mL PBS ekleyerek kaplama işlemine devam edin.

Ardından, kapları daha önce açıklanan şekilde inkübe edin. Başlangıç olarak, 10 santimetrelik bir kaba PBS içinde %0,1 jelatin ekleyin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.

Bu plak kaplanırken, dondurulmuş fare embriyonik fibroblastlarını (MEF) hızlıca çözdürmek için 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Ardından, kaptaki jelatini aspire edin ve MEF'leri, %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş DMEM içerisinde santimetrekare başına yaklaşık 50.000 hücre yoğunluğunda ekin. Kabı 37 °C'de gece boyunca inkübe ettikten sonra medyumu aspire edin ve hazırlanan MEF plağını 1X PBS ile yıkayın.

Önceden hazırlanmış, hPSC olarak kısaltılan insan pluripotens kök hücreleri içeren 10 mililitre hESC besiyerini 10 santimetrelik bir kaba ekleyin. Hücreleri kap başına 5 milyon hücre yoğunluğunda ektikten sonra, plakları 37 derece Celsius sıcaklıkta ve yüzde beş karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. Hücreleri her gün 10 mililitre taze hESC besiyeri ile beslemeye devam edin.

Diferansiyasyon işlemine başlamadan önce, plakayı diferansiye olmuş hücreler içeren koloniler, düzensiz kenarlar veya şeffaf merkezler açısından kontrol edin. Laminer akışlı bir kabin içindeki diseksiyon mikroskobu altında, bu tür düzensiz kolonileri bir pipet yardımıyla mekanik olarak uzaklaştırın. Matrigel gibi jelatinöz proteinlerle kaplama yapmak için, proteinleri tekrarlayan dondurma-çözme döngülerinden kaçınmak amacıyla önce bir mililitrelik porsiyonlar halinde bölüştürün ve dondurun.

Ardından, dondurulmuş bir mililitrelik bir alikotu çözün ve 19 mililitre DMEM f12 ile yeniden süspande edin. Bu karışımın beş mililitresini 10 santimetrelik bir kaba ekleyerek plaklama işlemini gerçekleştirin ve kapları oda sıcaklığında (RT) bir saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, hücreleri eklemeden hemen önce jelatinimsi proteini aspire edin ve DMEM F12 ile yıkayın. Bu kap kaplanırken, hPSC'lerin yaklaşık %80 konfluens düzeyinde olduğu bir plak seçin.

hESC besiyerini aspire edin. Ardından hücreleri PBS ile yıkayın. PBS'i uzaklaştırdıktan sonra, plağa üç mililitre %0,05 trypsin-EDTA ekleyin.

MEF'lerin tek hücreler halinde ayrılmaya başladıkları mikroskop altında gözlemlenene kadar, kabı iki dakika boyunca yatay olarak kuvvetle çalkalayın. Bu süre zarfında, hPSC kolonilerinin plakaya yapışık kalması beklenir. MEF'ler ayrıldıktan sonra ancak hPSC kolonileri henüz ayrılmadan önce tripsini aspire edin.

Ardından, plakaya 10 µM Y-27632 diklorhidrat (bir ROCK inhibitörü) içeren 10 mililitre hESC medyumu ekleyin. Sonrasında, kolonilerin üzerinden pipetleme yaparak hücreleri ayırın. Daha sonra, jelatinöz protein içeren kaba geri döndürün ve çözeltiyi aspire edin.

Herhangi bir topaklanmayı gidermek için bu kabı DMEM f12 ile yıkayın. Ardından, hPSC'leri 1'e 2 oranında plaka üzerine ekleyin. Sonrasında plakaya, 10 µM Y-27632 dihidroklorür içeren hESC medyumundan toplam 10 mL olacak şekilde ekleyin.

Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Hücreleri günlük olarak ROCK inhibitörü takviyeli besiyeri ile besleyin. hPSC'ler %80 konfluenslikle ulaştığında nöral farklılaştırmayı başlatın ve bu zaman noktasını Gün 0 olarak belirleyin.

Diferansiyasyonu başlatmak için hücreleri 0. Gün ve 1. Gün'de, 100 nanomolar MP inhibitörü LDN-193189 ve 10 mikromolar activin ve Nodal inhibitörü SB 431542 içeren 10 mililitre KSR diferansiyasyon besiyeri ile besleyin. 2. Gün'de, besiyerini BNP ile activin ve Nodal inhibitörlerinin aynı konsantrasyonlarını ve ek olarak üç mikromolar Wnt Agonisti CHIR99021 içeren besiyeri ile değiştirerek devam edin. Ardından, 3. Gün'de, hücreleri yalnızca 10 mikromolar SB 431542 ve üç mikromolar CHIR99021 ile desteklenmiş KSR diferansiyasyon besiyeri ile besleyin.

%75 KSR farklılaşma ortamı ve üç mikromolar Wnt agonisti içeren %25 N2 farklılaşma ortamı karışımı hazırlandıktan sonra, 4. ve 5. günlerde hücrelere bu sıvıdan 15 mililitre verin. Ardından, 6. ve 7. günlerde hücreleri; %50 KSR farklılaşma ortamı ve %50 N2 farklılaşma ortamından oluşan ve ayrıca üç mikromolar CHIR99021, 25 nanogram/mililitre BMP4 ve 100 nanomolar EDN3 ile desteklenmiş 15 mililitre ortam ile besleyin.

Ardından, 8. ve 9. günlerde hücreleri, 6. ve 7. günlerde kullanılan faktör konsantrasyonları ile desteklenmiş 20 mililitre %25 KSR diferansiyasyon medyumu ve %75 N2 diferansiyasyon medyumu ile besleyin. 10. günde, hücreleri üç micromolar CHIR99021, 25 nanograms per milliliter BMP4 ve 100 nanomolar EDN3 içeren 20 mililitre N2 diferansiyasyon medyumu ile besleyerek nöral diferansiyasyona devam edin. 11. günde, önceden PO laminin 1 ve fibronektin ile kaplanmış kaplardaki solüsyonu aspire edin.

Ardından, plakaları tamamen kurumaları için yaklaşık 10 ila 15 dakika boyunca bir doku kültürü davumbazında açık bırakın. 11. gün hücrelerindeki besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Daha sonra, kaba dört mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 25 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, kaba beş mililitre tam melanosit medyumu ekleyin. Hücreler plakadan ayrılana kadar manuel olarak pipetle yukarı aşağı çekerek resüspansiyon yapın. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 200 G'de beş dakika santrifüjleyin. Trypan Blue dışlama yöntemi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saydıktan sonra, hücreleri mililitrede 2X10⁶ yoğunlukta tam melanosit medyumu içinde resüspande edin.

Hücre süspansiyonundan 10 µL'lik damlacıkları kurutulmuş, kaplanmış kapların üzerine damlatın. Damlacıkların birbirine yakın ancak temas etmiyor olduğundan, kenarlarının belirgin olduğundan ve yayılmadığından emin olun. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için damlacıkları oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika bekletin.

Ardından, yapışmış hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek, kaba yavaşça 10 milliliters tam melanosit medyumu ekleyin. Daha sonra kabı inkübatöre yerleştirin. Hücreleri her iki ila üç günde bir tam melanosit medyumu ile besleyin.

İlk haftanın sonunda hücre kümelerinde pigmentasyon gözlemlemeyi bekleyin. Haftada bir kez, hücreleri daha önce açıklanan şekilde önce hücre ayırma çözeltisi ile ilişkilendirerek pasajlayın. Hücreleri toplayıp santrifüjledikten sonra, sade nörobazal besiyeri ile iki kez yıkayın.

Ardından, hücreleri PO, laminin 1 ve fibronektin ile kaplanmış kaplarda, tam melanosit ortamında bir altı oranında yeniden ekleyin. Yaklaşık 30 günlük farklılaşma süresinin sonunda hücreler koyu pigmentli görünecektir; bu durum, yüksek yoğunlukta ekildiklerinde veya pasajlama sırasında çöktürüldüklerinde kolayca gözlemlenebilir.

Burada, hücreler yeniden ekilmeden önce, açıklanan diferansiyasyon protokolünün 11. gününe kadar kültüre edilmiş transgenik psox10 GFP insan embriyonik kök hücre hattından alınan hücrelerin aydınlık alan görüntüsü gösterilmektedir. Bu kültürlerde, hücrelerin oluşturduğu koyu renkli belirgin sırtlar görülmektedir. Bu kültürler GFP sinyali açısından değerlendirildiğinde, koyu sırtların sox10 pozitif hücreler açısından zenginleştiği görülmüştür.

sox10, nöral krest kök hücreleri tarafından yukarı regüle edilen ve melanoblastlarda korunan bir transkripsiyon faktörü olduğundan, bu sonuçlar bu farklılaştırma yönteminin 11. güne kadar nihayetinde melanositlere dönüşecek hücreleri zenginleştirdiğini göstermektedir. Bunun kanıtı olarak, protokolün 20. gününe gelindiğinde kültürler pigmentsiz, olgunlaşmakta olan ve tamamen olgunlaşmış pigmente melanositler içeriyordu. 25. günde, kültürlerde aynı hücre türleri gözlemlenmiştir.

Bu preparatlarda olgunlaşan ve pigmente olmuş melanositlerin varlığı, iki melanin üretim proteini ile boyama yapılarak doğrulanır. Bunlar, hem melanoblastların hem de melanositlerin bir belirteci olan TYRP2 ile yalnızca pigmente olmuş melanositlerde eksprese edilen geç evre melanosit belirteci TYRP1'dir. Uzmanlaşıldığında, bu protokol insan pluripotent kök hücrelerini 25 gün içinde tamamen pigmente olmuş olgun melanositlere farklılaştırmak için kullanılabilir.

Protokol, önce nöral krest evresinden ve ardından melanoblast aşamasından geçerek normal melanosit gelişimi yoluyla ilerler.