Name: Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Öğrenin çocuklardan burun epitel hücreleri yetiştirmeyi ve bunları iPSC'lere yeniden programlamayı. Bu invaziv olmayan yöntem, astım ve solunum hastalıkları araştırmaları için değerli kök hücre kaynağı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Pluripotent Kök Hücre Tesisi ve Cincinnati Çocuk Hastanesi Konfokal Görüntüleme Çekirdek kabul etmek istiyorum. Bu çalışma R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) ve 2U19AI70235 (GKKH) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıdaki protokol kurumları insan araştırma etik komitesinin kuralları takip eder. 1. Burun mukozasının Örnekleme NOT: viral solunum yolu enfeksiyonu belirtileri ücretsiz konulardan örnekler alın. <ol><li> katılımcı ziyareti öncesinde bir 15 ml konik taze hazırlayın ve 2 ml Begm (Bronş Epitel Hücre Büyümesi Orta) artı 20 ul steril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (% 0,01) ekleyin. </li><li> Açık sitoloji sadece örnek almadan önce fırça ve steril fırça tutmak için emin olun ve burun yüzeyleri dışında herhangi bir yüzeye dokunmayın. </li><li> Hala oturup tavana doğru kafasını eğmek için katılımcı isteyin. küçük ya da daha fazla huzursuz çocuklar ellerinde oturmak ve / veya uzak fırça swatting önlemek için yatarken. </li><li> geçit daraltır (küçük kara delik gibi görünüyor) burun arkasındaki fırça yöneltin. aşağı fırça kaydırın ve fırça Nostri kaldırılır olarak bileklerini büküml. </li><li> konik fırça yerleştirin ve Begm daldırın. Fazla fırça kesti ve tüp kapağını kapatın. VORTEKS DO NOT. NOT: katılımcı istekli ise, aynı şekilde ancak ikinci burun deliğine ikinci fırça edinin. Her iki burun deliklerinin bir fırçalama Edinme örnekleme başarılı olacaktır daha yüksek bir olasılıkla sonuçlanacaktır. Aynı burun deliği Örnekleme kanama neden olabilir ve büyük olasılıkla örnek iyileştirmek değil. </li><li> ılık su ile bir beher kullanarak taşıma sırasında mümkün olduğunca 37 ° C kadar yakın örnekleri tutun. </li></ol> 2. Hücre Sayımı ve sitospin <ol><li> Yavaşça Begm fırçayı ajite ve hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı için örnek 10 ul alır. canlı / ölü leke 10 ul ekleyin ve sadece mikroskop altında hücrelerin canlı saymak. </li><li> örnek 50 ul almak ve 1 x PBS ile 200 ul&#39;ye seyreltilmiş. 2 dakika boyunca 300 rpm&#39;de cam slayt ve spin bağlı Sitospin huni ekle. followin kuru O / N ve leke slayt slayt edelimg üreticinin talimatlarına. tercihen karanlıkta, O / N kurumaya bırakın. </li><li> Hema 3 Stain ile Leke Slide <ol><li> Her solüsyonu (; Hema 3 Çözüm I, pembe, Hema fiksatif, açık mavi ve Hema 3 Çözüm II, mavi derinlik) aktarın boyama kabına; Kullanılmadığı zaman kapalı tutun. slayt boyama tekne içine slaytlar ekleme </li><li> Daldırma slaytlar sürekli 30 sn için sabitleyici olarak, daha sonra fazla drenaj sağlar. Daldırma 30 sn için, daha sonra fazla drenaj sağlar Çözüm sürekli olarak kayar. Dip daha sonra fazla süzülmesini bekleyin, 30 saniye boyunca sürekli Çözüm II slaytlar </li><li> Su berrak bitene kadar deiyonize su ile durulayın. Karanlıkta, tercihen O / N kurumaya bırakın </li></ol></li><li> epitel hücrelerinin yüzdesini belirlemek, mikroskop ve sayım hücreleri altında slayt bak. örnekleme iyi ise% 90 veya daha fazla olmalıdır. </li></ol> 3. Tohum Hücreler NOT: Uygun ve sertifikalı doku kültürü tüm hücre kültürü prosedürlerini yürütmekdavlumbaz steril tekniği kullanarak. <ol><li> Sığır dermal kolajen (BDC) ile kaplayın plakaları, tip 1 49.5 mi 1 x PBS içinde seyreltilmiş, 3 mg / ml BDC 0.5 ml ilave edilir. sadece bir kaç plakaları kullanılacak olursa az hazırlayın. Kat 2 saat boyunca 37 ° C &#39;de, bir T25 2 mi BDC şişe ve steril bir başlık O inkübe / N veya gerekirse. </li><li> İnkübasyondan sonra, herhangi bir geri kalan sıvı aspire. steril bir muhafaza içinde 30 dakika, UV ışığına şişeler Açığa. ama bir ay kadar 4 ° C Mağaza şişeler, hücrelerin ekim önce C RT getirmek ya da 37 °. </li><li> Tohum için hazır olana kadar 37 ° C&#39;de Begm fırçayı ve hücreleri tutun. Yavaşça homoseksüel konik içinde fırça, ancak girdap yok. <ol><li> Plaka, bir T25 şişesi içinde 7 x 10 5 hücre. az olması durumunda, daha küçük bir kap, bir 6-yuvalı plaka gibi bir de kullanmak. Bu boyut plakası yaklaşık 3 x 10 5 hücre gerektirir. NOT: Bu birçok hücre yoksa, o devam etmek tavsiye edilmez. </li></ol></li><li> steril Kaputun altında, tüp ve ge dışına fırça almakntly kaplama kazımak için dikkatli olmak, kaplanmış balonun yüzeyi üzerinde fırça döndürün. uygun bir biyolojik tehlikeli atık kabına fırça atın. </li><li> Yavaşça konik dışına ve T25 balona Begm kalan hücrelerin pipetle. mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Dalgalı bir hücre sayısı görülmektedir ve bu aşamada (Şekil 3A) olarak uygun olan burun, çıkan toz olabilir. </li></ol> 4. Hücre Kültürü <ol><li> Hücrelerin ekim sonra, onları kesinti olmadan 48 saat (Şekil 3) razı olsun. 48 saat sonra, yavaş yavaş ve hafifçe 2 ml sıcak Begm ve steril Penisilin / streptomisin / Fungizone (P / S / F) 20 ul ekle. NOT: Medya orijinal 2 ml aspire ETMEYİN. </li><li> Tohumlama sonra 4. gününde, dikkatlice sıvı aspire ve taze 4 ml ile değiştirin, Begm artı 1x Pen / Strep (fungizon artık gerekli değildir) ısındı. Her iki gün medya değiştirin ve takmak için hücreleri değerlendirmekment, büyüme ve izdiham. Hücreler ulaştığında ~% 80 izdiham, genellikle 2-3 hafta içinde, onlar pasajlanır hazırdır. </li><li> Bir T25 şişesi (yaklaşık 2.5 x 10 6 hücre olduğunda konfluent), üç T25 şişelerinde ya da bir T75 şişesi içine geçişli olabilir. İlk geçişten sonra, hücreler her üç günde bir kaynaşmaya eriştikten, sağlam ve sağlıklı olmalıdır. </li></ol> 5. Pasajlanması Hücreler <ol><li> Yavaşça plakadan medya aspire. yaklaşık 4 dakika için inkübatör plaka ve yere T25 şişesi başına 1 ml% 0.05 tripsin solüsyonu ekleyin veya hücreler plaka ayrılana kadar. hücrelerin her 2 dakikada bir dekolmanı seviyesini kontrol edin ve daha uzun 10 dk tripsin bırakmayın. </li><li> enzimi etkisiz hale getirmek 5 ml Tripsin Giderici Çözüm (TNS), ya da serum içeren medya ekleyin. 15 ml konik tüp içinde şişesi ve yerden tüm sıvı ve hücreleri çıkarın. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de (hızlanma 0 yavaşlama 0) Santrifüj, bir hücre peleti elde edilmiştir. aspire SupernaYeni şişelere için gerekli olan hacimde S Begm bölgesindeki + U / tant ve tekrar süspansiyon hücreleri (T75 şişeye bir T25 şişesi 4 mi, 10 mi) </li><li> (2.1) yukarıda açıklandığı gibi bir ölü / canlı boya ile hücre sayımı gerçekleştirin. kaplanmış şişelere Begm ve hücrelerin uygun miktarda ekleyin ve inkübatör dönmek. Yukarıda detaylı Bakım veya ml başına 0.5-2 x 10 6 hücre konsantrasyonunda ortam (% 70 Begm,% 20 FBS ve% 10 DMSO) dondurma cryopreserve. </li></ol> iPSCs 6. yeniden programlanması NOT: iPSCs oluşturmadan önce, nesil ve insan iPSCs kullanımını düzenleyen tüm kurumsal düzenlemelere uyumu sağlamak. Kültür ortamı rutin antibiyotik içermeyen steril bir teknik, iPSC kültürleri için özellikle önemlidir. UEM sağlıklı görünen ve sağlam başarılı yeniden programlama için proliferatif olduğu önemlidir. <ol><li> Plaka 6 gözenekli bir doku kültürü plakasının oyuk başına 5 x 10 5 UEM. 24 saat sonra, polybrene eklemeBegm için ortama Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc ifade lentiviral partikülleri ilave edilmiş 8 ug / ml transdüksiyonu UEM bir nihai konsantrasyona seyreltildi. ~ 5 27 enfeksiyonu (İçişleri) çokluğu sağlamayı hedefliyoruz. <ol><li> İçişleri Bakanlığı belirlenmesi için, konsantre-lentiviral stokunun seri dilüsyonları hazırlamak ve bu seyreltmeleri ile HT1080 hücreleri nakletmek. HT1080 hücrelerinde dTomato ifadenin ilk tümden algıladıktan sonra, dTomato-pozitif hücre / her seyreltme hücrelerin küçük kümeleri sayısını puanlama &quot;ml transducing birim /&quot; sayısını hesaplamak. NOT: Genellikle, çok yüksek dilüsyonları (her şey dTomato pozitif) ve çok düşük (yok ya da pozitif hücrelerin sadece bir çift) olacaktır. </li><li> hücrelerin ayrı ayrı pozitif hücreler / küçük kümeleri tespit edildiği dilüsyonları puanlama gerçekleştirin. Uygun seyreltme faktörü ile birim / ml transducing sayısını düzelterek titresi belirlemek. İB, sonra sayısına oranıdırvirüs partiküllerinin 27 sayısına hücreleri transdüse. NOT: Her dTomato pozitif hücre / küçük yığın, tek bir virüs partikülü kaynaklandığı varsayılmaktadır. </li></ol></li><li> Yaklaşık 3 saat sonrası transdüksiyon, medyayı çıkarın ve taze Begm ile değiştirin. kurumsal onaylı prosedürler kullanılarak lentivirüs içeren ortam atın. 3 gün için kuluçka makinesine geri kalıt UEM dönün. </li><li> 3 gün, taze Begm ile medyayı değiştirmek ve daha sonra başka 3 gün kuluçkaya yatmaktadır. Aspire medya, 1x PBS ile hücreleri yıkayın ve iyice 1 ml% 0.05 tripsin çözüm ekleyin geçirdi. Tripsin ile Passage hücreleri (Bölüm 5) Yukarıdaki yazılı olarak. Dikkatle 4 ml Begm + P / S supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire. Hücreler, işlem bittikten (bir sonraki adıma bakınız) BDC ile kaplanmış bir 6 yuvalı plaka yeni bir oyuğuna geçişli veya MEF kültürlere ilave edilebilir. </li><li> MEF kaplı tabak hazırlayın. 4. günde () +/- Thiazovivin (SPT yerine adım 6.6 kadar) de bir 6 2 oyuklarına (1 ml / oyuk) ve% 0.1 jelatin çözeltisi ilave edilir. Bir sonraki ongün, inaktive MEFS 28 bir şişe çözülme. </li><li> MEF ortamı (DMEM + 1 x NEAA +% 10 dFCS) 10 ml MEFS yerleştirin. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj pelet. MEF medyada süspanse. Aspire 6 plaka jelatin ve jelatin kaplı 6 plaka oyuk başına 1.87 X 10 5 MEFS ekleyin. 37 ° C sıcaklıkta O / N inkübe ya da 24 saat içinde en az. </li><li> Begm Devri 2 mi önceden kaplanmış 6 plaka 2 kuyulara oyuk başına hücreleri transdüse ve / nO inkübe içeren. Bir sonraki gün, 4 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü ihtiva eden, standart HESC ortam oyuk başına 2.5 ml Begm değiştirin. taze hESC medya ile hücrelerin besleyin +/- SPT 10 gün boyunca günde NOT: Bu UEM 23 etkinliği ve yeniden programlama kinetiğini arttırmak için küçük moleküller (SB431542, PD0325901 ve Thiazovivin (SPT) kokteyli) oluşan bir karışımla ilave edilmesi mümkündür. </li><li> On gün sonra, SPT olmadan HESC ortamını kullanarak günlük beslemeye devam ediyor. hESC benzeri koloniler kadar günlük kültürleri beslemek(Şekil 5A, P0 koloni) görünür. sitoplazmik oranı ve belirgin nükleol: yüksek çekirdeği tarafından varsayılan iPSCs barındıran koloniler belirleyin. </li><li> hESC benzeri morfolojisi ile manuel olarak tüketim ve transfer koloniler bir besleyici içermeyen sistemde ayrı satır olarak kültür ve genişleme için kuyu ayırmak için. Eksize koloniler bu koşullara hızla adapte edilmelidir. <ol><li> kaplama eksize koloniler sonra bu ayrık varsayımsal iPSC hatları artık geçit 1 (p1) olarak kabul edilir. Günlük mTeSR1 ile yem kültürleri. Passage ve standart prosedürler kullanılarak iPSC hatları genişletmek. p1 koloniler onlar pasajlanır edilmesi gereken büyüklüğe ulaşması için bir hafta birkaç gün sürebilir. </li></ol></li></ol> 7. Kültür iPSCs bakımı <ol><li> Yem ve günlük kültürleri değerlendirir. El ile özel tüketim alanları steril bir cam pipet veya mikro pipet ile kazıyarak açık farklılaşma sergileyen. Günlük toplama sonra ortamı değiştirin. </li><li> Passage hücreleri approxima sonrately her dört günde: yavaşça aspire ortam, 6-çukurlu bir tablaya (yarısı besleme hacmi) oyuk başına 1 mi, sıcak Dispase (1 mg / ml) ekleyin, sonra yaklaşık 4 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kolonilerin kenarları kolonisi etrafında beyaz bir anahat gibi görünüyor, hangi kaldırmaya başlayacaktır. Yavaşça Dispase aspire ve ısıtılmış DMEM / F12 ile 3x yıkayın. </li><li> 2 ml mTeSR1 ekleyin ve plaka koloniler kaldırmak için bir hücre kaldırıcı kullanmak. koloniler küçük kümeler halinde kırılmış kadar yavaşça hücreleri çiğnemek için 5 ml serolojik pipet veya P1000 mikropipet kullanın. <ol><li> sağkalım ve daha sonra proliferasyon optimal olacak şekilde, çok küçük bir küme veya tek üreten hücrelerin kaçının. koloniler yeniden kaplama yaparken, 1: 4 ile 1: 6 bölünmüş optimum koloni yoğunluğu koruyacaktır. Yavaşça plaka koloniler ve ortamı çıkartın ve yeni, Matrigel kaplı kuyucuklara ekleyin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Guenther, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+gene+expression+programs+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).</li>
<li>Polo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+of+origin+influences+the+molecular+and+functional+properties+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).</li>
<li>Ono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+nasal+epithelial+cells+using+a+Sendai+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector.</a> PloS one. 7 (8), e42855(2012).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li>
<li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multipotent+lung+and+airway+progenitors+from+mouse+ESCs+and+patient-specific+cystic+fibrosis+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs.</a> Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+without+viral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated without viral integration.</a> Science. 322 (5903), 945-949 (2008).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).</li>
<li>Kuperman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+interleukin-13+on+epithelial+cells+cause+airway+hyperreactivity+and+mucus+overproduction+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma.</a> Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).</li>
<li>Braunstahl, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+bronchoprovocation+in+allergic+rhinitis+patients+affects+mast+cell+and+basophil+numbers+in+nasal+and+bronchial+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).</li>
<li>Compalati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+link+between+allergic+rhinitis+and+asthma%3A+the+united+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease.</a> Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).</li>
<li>Crimi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+mechanical+factors+of+allergen-induced+bronchoconstriction+in+mild+asthma+and+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis.</a> Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).</li>
<li>Djukanovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+mucosal+manifestations+of+atopy%3A+a+comparison+of+markers+of+inflammation+between+atopic+asthmatics%2C+atopic+nonasthmatics+and+healthy+controls%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+respiratory+journal+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Clinical+Respiratory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls.</a> The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).</li>
<li>Gaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophils+are+a+feature+of+upper+and+lower+airway+pathology+in+non-atopic+asthma%2C+irrespective+of+the+presence+of+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+allergy+%3A+journal+of+the+British+Society+for+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis.</a> Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).</li>
<li>Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+bacteria%2C+upper+airway%2C+lower+airway%2C+and+systemic+inflammation+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD.</a> Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).</li>
<li>Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upper+and+lower+airways%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22European+respiratory+monograph%22%5BJournal%5D)">Upper and lower airways: similarities and differences.</a> European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).</li>
<li>Lopez-Guisa, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+cells+from+asthmatic+children+differentially+express+proremodeling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).</li>
<li>Doi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+tissue-+and+cancer-specific+CpG+island+shores+distinguishes+human+induced+pluripotent+stem+cells%2C+embryonic+stem+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts.</a> Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).</li>
<li>Poole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+childhood+asthma+with+nasal+transcriptomics+distinguishes+subphenotypes+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2014).</li>
<li>Ji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptional+and+epigenomic+reprogramming+from+pediatric+nasal+epithelial+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).</li>
<li>Guajardo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+profiles+in+nasal+respiratory+epithelium+reflect+stable+versus+acute+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+pluripotent+stem+cells+become+even+more+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+cell+type+can+influence+the+epigenome+and+differentiation+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).</li>
<li>Wicell. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wicell+Feeder+Based+%28MEF%29+Pluripotent+Stem+Cell+Protocols%22">Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols</a>. , (2003).</li>
<li>Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nose+revisited%3A+a+brief+review+of+the+comparative+structure%2C+function%2C+and+toxicologic+pathology+of+the+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium.</a> Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).</li>
<li>Allegrucci, C., Young, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Differences between human embryonic stem cell lines.</a> Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
<li>Pasca, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+iPSC-derived+neurons+to+uncover+cellular+phenotypes+associated+with+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome.</a> Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).</li>
<li>Lai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternate+methods+of+nasal+epithelial+cell+sampling+for+airway+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+chemical+and+genetic+approach+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signature+and+memory+retention+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e7076(2009).</li>
<li>Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+gene+expression+and+epigenetic+memory+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas.</a> Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).</li>
<li>Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Epigenetic+memory%27+phenomenon+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells.</a> Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).</li>
<li>Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+and+preferential+lineage-specific+differentiation+in+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+pancreatic+islet+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).</li>
<li>Jandial, R., Levy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+alchemy%3A+induced+pluripotent+stem+cells+retain+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory.</a> World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Ohi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+DNA+methylation+underlies+a+transcriptional+memory+of+somatic+cells+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burun epitel hücreleri (UEM) havayolu hastalığı eğitimi için erişilebilir bir platform olup, NEC-iPSCs hastalık geliştirme, tedavi ve terapi 1,31,32 keşfetmek için heyecan verici bir cadde sunuyoruz. UEM kolayca stresli ya da potansiyel olarak zararlı prosedürler 6,23 olmadan elde edilebilir. Bizim tecrübelerimize göre, bu protokol açıklandığı gibi nazal mukozanın örnekleme daha az stresli ve daha iyi çocuklar için kan toplama daha algılanan gibi görünüyor. Bu nedenle, bu yöntem havayolu hastalıkla...

insan örneklerinde (hiPSCs) den uyarılmış pluripotent kök hücreler kök hücre araştırmalarının bir hızla gelişen teknolojidir. Onlar çok daha az etik ve ahlaki sakıncaları 1,2 ile embriyonik kök hücre (hESC) araştırma bir alternatif sunuyoruz. Bunlar HESC 3-5 epigenetik özdeş olmayan, ancak hiPSCs gelişimi ve hastalığın fenotipleri modellemek için benzersiz bir yol sunar, ve hastalık durumunun 5-8 ilgili dokulardan elde edilebilir. Üreten hiPSCs yeni yöntemler sürekli transplantasyon için uygun GMP kalite iPSCs hazırlamak ve aynı zamanda yeniden programlama sürecinin 6,9-11 zamanında ve verimliliği artırmak için bir yol olarak, başlamak için en uygun hücre tiplerini belirlemek için araştırılmaktadır. Havayolu epitel hücreleri allerjik inflamasyon 12 gelişiminde kritik ve epitel Immun ile etkileşim yoluyla alerjik tepkiler ve havayolu yeniden önemli bir sürücüE ve stromal hücreler. solunum yolu epitel Kalkış ve astım gibi akciğer hastalıklarının kalıcılığı önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, alt solunum yolu epitel hücreleri, özellikle sağlıklı kontrol ve çocukların, bir klinik ortamında elde edilmesi zordur. Hava kirliliği ve alerjenlere karşı tepkileri okuyan özellikle birkaç çalışmalardan elde edilen veriler, burun mukozasından epitel hücreleri alt solunum yolu epitel hücreleri 13-20 için geçerli ve pratik vekil olduğu öncül desteklemektedir. Burun mukozası% 90&#39;dan fazla kirpikli hava yolu epitel hücreleri oluşur ve diğer hücre / doku örnekleme tekniklerine göre daha az invazif ve olduğu gibi bu burun epitel hücreleri (UEM) örnekleme kolayca yaş dört ya da beş gibi küçük çocuklarda yapılabilir enfeksiyon 20-23 gibi olumsuz olayların en az risk ile ilişkili. Bu, uzun gereksiz ve sıklıkla ağrılı bronkoskopi procedu olmadan sağlıklı ve hastalıklı çocuklara hem de örnek bir hızlı ve basit bir yol sunuyorsedasyon gerektiren res. Daha önceki çalışmalar, astım şiddeti ile ilişkili bir hastalık alt tipleri burun mukozası gibi astım çocuklardan alınan bronş hücre numuneleri hem de ayırt edilebilir olduğunu bulduk, ve iki doku tipleri arasında gen ekspresyonu olmayan yerde gen 22 yaklaşık% 90 benzer olan 24. iPSCs için bir kaynak olarak, UEM diğer sık ​​kullanılan hücre türleri üzerinde avantajlar sağlar. Fibroblastlar genellikle iPSC üretimi için kullanılan, ancak bu hücreler kolayca cilt biyopsisi kültüre olabilir, ancak, bu süreç genellikle lokal anestezi, bir kesi ve dikişler gerektirir ve enfeksiyon bazı riski ile ilişkilidir. Bu nedenle, biyopsi bu tip hastaların bilgilendirilmiş onayını aldıktan 25 zor olabilir. fibroblastlar için bir alternatif periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) &#39;dir. Bununla birlikte, çocuk hastalar arasında iPSC oluşturulması için yeterli derecede kan elde etmek zor olabilir. Buna ek olarak, alt-AP sınırlamalar vardırfibroblast ve kan hücresi kaynaklı iPSCs, belirli hücre tipleri 5,26 özellikle kendi farklılaşma kapasitesi komplikasyonların. Bu nedenle, nispi erişilebilirlik ve kendi koleksiyonu aşağıdaki yan etkileri düşük riski göz önüne alındığında, UEM pediatrik popülasyonların gelen iPSC nesil için ideal bir hücre kaynağını temsil etmektedir. iPSCs yeni hastalık modelleri, insani kalkınmayı okuyan üretmek için bir platform olarak son zamanlarda ilgi çok aldı ve kişiselleştirilmiş tedaviler için hücrelerin potansiyel bir kaynağı olarak var. Bu teknolojinin tam potansiyelini fark edilebilir önce yeniden programlama sürecinin moleküler temellerinin açıklanması gerekir, ama şimdi bu protokol ve içinde belirtilen usuller havayolu maruz odaklanmış araştırmalar ışık tutacaktır için, yanı sıra bir platform sağlamak iPSCs içeren kişiselleştirilmiş tıp etkilerini araştırmak. Birkaç laboratuarları işbirlikçi çalışma Generatio yol açmıştırburun mukozasının örnekleme değil, aynı zamanda UEM kültürlenmesi ve iPSCs 23 bu hücrelerin yeniden programlanması sadece için başarılı bir teknik n. Bu makale optimum örnekleme, kültürleme ve yeniden programlama koşulları için bir protokol bir özeti verilmektedir.

<table><tbody><tr><td>15 ml konik</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Protokolü Adım 1.1.</td></tr><tr><td>BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Protokolü Adım 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep/Fungisit</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15240-062</td><td>Protokolü Adım 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>Protokolü Adım 4.a.</td></tr><tr><td>cytosoft sitoloji fırçası</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protokolü Adım 1.2.</td></tr><tr><td>tripan mavisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Protokolü Adım 2.1.</td></tr><tr><td>hemasitometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protokolü Adım 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Protokolü Adım 2.2.</td></tr><tr><td>Sitoloji Huni Klipsleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Protokolü Adım 2.2.</td></tr><tr><td>cytospin hunisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protokolü Adım 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>A78300003</td><td>Protokolü Adım 2.2.</td></tr><tr><td>boş slayt</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protokolü Adım 2.2.</td></tr><tr><td>hema 3 leke kiti</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protokol Adım 2.2.</td></tr><tr><td>Sığır Dermal Kolagen, tip 1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A1064401</td><td>Protokolü Adım 3.2.</td></tr><tr><td>T25 şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protokol Adım 3.3.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Protokolü Adım 5.2.</td></tr><tr><td>Tripsin Nötralize Edici Çözelti</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protokolü Adım 5.2.</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS), 65 ° C'de ısıyla sterilize edilmiş; 30 dakika için C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Protokolü Adım 5.5.</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit Hybri-Max&trade;, steril filtreli, BioReagent, hibridoma için uygun, &; %</td><td>99.7Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Protokolü Adım 5.5.</td></tr><tr><td>polisistonik lentivirüs*</td><td>ör Millipore</td><td>SCR511</td><td>Protokolü Adım 6.4.&nbsp; Ticari bir yeniden programlama vektörü kaynağı listelenmiştir. Voelkel ve arkadaşları (PMID: 20385817) tarafından bildirilen 4'ü 1 arada plazmidi rutin olarak VSV-G-psödotipli polisistronik yeniden programlama lentivirüsünü kurum içinde oluşturmak için kullanıyoruz. Bu plazmit ile iletişime geçilerek elde edilebilir&nbsp;</td></tr><tr><td>polibrene</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-134220</td><td>Protokolü Adım 6.4.</td></tr><tr><td>Işınlanmış CF1 MEF'ler</td><td>GlobalStem&nbsp;</td><td>GSC-6301G</td><td>Protokolü Adım 6.4.</td></tr><tr><td>hESC ortamı</td> Protokol <td></td><td>Adım 6.11'de</td> <td>yer alan tarife bakın</td>.</tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Protokolü Adım 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Protokolü Adım 6.11.</td></tr><tr><td>Tiazovivin&nbsp;</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Protokol Adım 6.11.</td></tr><tr><td>hESC nitelikli Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Protokolü Adım 6.13.</td></tr><tr><td>Corning plakası, 6 kuyulu</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protokolü Adım 6.13.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre</td><td>5850</td><td>Protokolü Adım 6.13.</td></tr><tr><td>250 ml tek kullanımlık filtre şişesi (0.22 & mikro; m)</td> <td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protokolü Adım 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11320-033</td><td>Protokol Adım 7.3.</td></tr><tr><td>hücre kaldırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protokolü Adım 7.4.</td></tr><tr><td>hESC Ortamı**</td><td></td><td></td><td>Protokol Adım 6.11. bileşenleri karıştırılmalı ve ardından filtre ile sterilize edilmelidir. Medya 4 & derecede tutulabilir; İki haftaya kadar C. Ortamı ısıtırken 37 ° C'de bırakmayın; C 15 dakikadan daha uzun</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 medya</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11330-032</td><td>Son Konsantrasyon</td></tr><tr><td>KO replasman serumu (KO-SR)</td><td>İnvitrojen</td><td>10828-028</td><td>0.2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &szlig;-merkaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>100x esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &mikro; g/ml Bazik-Fibroblast Büyüme Faktörü (b-FGF)</td><td>İnvitrojen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

Çocuklar primary burun epitel hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Nazal epitel hücreleri (NEC'ler), hava yollarının hava kirleticilerine yanıt veren kısmıdır ve solunum yolu virüsleri ile enfekte olmuş ilk hücrelerdir. Ayrıca doğuştan gelen bağışıklık tepkileri ve bağışıklık ve hava yolu stromal hücreleri ile etkileşimleri yoluyla birçok hava yolu hastalığında rol oynarlar. NEC'ler, klinik ziyaretler sırasında erişilebilirlikleri nedeniyle çocuklarda yapılan çalışmalar için özellikle ilgi çekicidir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) birden fazla hücre tipinden üretilmiştir ve insan gelişimini ve hastalığını modellemenin yanı sıra rejeneratif tıptaki potansiyel uygulamaları için güçlü bir araçtır. Bu, araştırma amacıyla pediatrik katılımcılardan türetilen NEC'lerden iPSC'lerin başarılı bir şekilde üretilmesi için yöntemler ortaya koyan ilk protokoldür. Çocuklardan nazal epitel hücrelerinin nasıl elde edileceğini, bu örneklerden birincil NEC kültürlerinin nasıl oluşturulacağını ve birincil NEC'lerin iyi karakterize edilmiş iPSC'lere nasıl yeniden programlanacağını açıklar. Burun mukozası örnekleri, çocuklarda hava kirliliğinin etkileri ile ilgili epidemiyolojik çalışmalarda faydalıdır ve hava yolu hastalığını incelemek için önemli bir araç sağlar. Birincil burun hücreleri ve bunlardan türetilen iPSC'ler, astım ve KOAH araştırmaları da dahil olmak üzere hava yolu epitel biyolojisinin çeşitli alanlarında hastaya özgü araştırmalar için sınırsız materyal sağlamak için bir araç olabilir.

Burun girişinde adı burun ilk kısmı, kıkırdak 29 ile alandır. Fırça burun valfi (ostium iç dünyasıyla, ya da Nare arkasında görülen &quot;kara delik&quot;) ötesinde, burun bu alandaki geçmiş sorunsuz gitmek gerekiyor, ve örnek alt konka (Şekil 1) elde edilir. Burun konkalar, burun 29 yüzey alanını arttırmak örnekleme için onları ideal bir konuma yapma kemiksi yapıları vardır. Alan da yakından alt solunum yollarının balataları benzer ve çevresel maru...

Bu yayın, çocuklardan nazal epitel mukozasının başarılı bir şekilde örneklenmesi ve kültürlenmesi ve bu hücrelerin indüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için yöntemleri göstermektedir.

Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

Bu prosedürün genel amacı, çocuklardan elde edilen nazal epitel hücrelerini büyütmek ve bunları indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlamaktır. Bu yöntem, astmanın nasıl geliştiği gibi havalanmış hastalıklar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, havayolu epitel hücrelerini çocuklardan stresli prosedürlere gerek kalmadan toplamasıdır.Kültür ortamında bunlar homojen bir popülasyon halindedir ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler veya iPSC'ler üretmek için mükemmel bir kaynak görevi görürler. Bu çalışma fikri ilk olarak, Dr. Ji ve Dr. Hershey ile astım ve hava kirliliğindeki epigenetik varyasyonu araştırmak amacıyla çocuklardan mezo-epitel hücre toplama çalışmaları hakkında konuştuğumuzda ortaya çıktı.Burun örneklemesi ve burun epitel hücrelerinin iPSC'lere yeniden programlanması, yerleşik protokollerden ziyade kişisel deneyime dayalı olduğundan öğrenilmesi zor tekniklerdir; bu nedenle bu tekniklerin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Katılımcının ziyareti öncesinde, BEGM olarak kısaltılan iki mililitre taze bronşiyal epitel büyüme ortamını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ardından, bu ortama, son konsantrasyonu 0.01% olacak şekilde 20 mikrolitre penisilin, streptomisin ve amfoterisin b karışımı ekleyin. Katılımcı geldiğinde, onu oturması için bir sandalyeye yönlendirin.Ardından, örneği almadan hemen önce bir sitoloji fırçası açın ve steril kalmasını sağlamak için fırçayı herhangi bir yüzeye temas ettirmeyin. Katılımcıya hareketsiz oturması ve başını tavana doğru yukarı kaldırması talimatını verin. Eğer katılımcı huzursuzsa, fırçayı savuşturmaya çalışmaması için ellerinin üzerine oturmasını sağlayın.Ardından, fırçayı burun pasajının daraldığı arka kısma doğru yönlendirin ve yerleştirin. Sonrasında, fırçayı bileğinizi döndürme hareketiyle aşağı kaydırarak burun deliğinden çıkarın. Fırçayı daha önce hazırlanmış olan konik tüpe yerleştirerek işleme devam edin ve BEGM içinde tamamen daldırıldığından emin olun.Ardından fırçanın fazla kısmını kesin ve tüpün kapağını kapatın. Numune toplandıktan sonra, 37 °C'ye mümkün olduğunca yakın tutulması için numuneyi derhal ılık su dolu bir behere yerleştirin. Daha sonra numuneyi laboratuvara nakledin.Laboratuvar ortamına geçildiğinde, fırçayı BEGM içerisinde nazikçe çalkalayın. Ardından, örnekten 10 µL alın ve buna 10 µL canlı/ölü hücre boyası ekleyin. Bu karışımı bir hemositometre üzerine aktarın.Ve mikroskop altında yalnızca canlı hücreleri sayın. Hücre sayımının ardından, örnekten 50 µL alın ve bunu 1X PBS ile 200 µL'ye seyrelterek devam edin. Seyreltilmemiş hücre karışımının geri kalanını, fırçasıyla birlikte, hücre ekimine kadar 37 °C'ye ayarlanmış bir benmariye aktarın.PBS ile seyreltilmiş örneği, bir lam slayda takılı sitospin hunisine ekleyin. Ardından tüm düzeneği 400 rpm hızda iki dakika boyunca döndürün. İşlem sonrasında huniyi çıkarın ve lamın karanlıkta gece boyunca kurumasına izin verin.Metin protokolünde tartışıldığı üzere, lam Hema 3 ile boyandıktan sonra mikroskop altında inceleyin ve hücreleri sayın. Epitel hücrelerini kendilerine özgü özelliklerinden tanımlayın. Kolon şekli, silya ve tek bir yuvarlak çekirdek arayın ve bu hücrelerin preparattaki yüzdesini belirleyin.Ekimi başlatmak için, sertifikalı bir doku kültürü kabininde fırçayı konik tüpün içinde hafifçe döndürün ve ardından fırçayı tüpten çıkarın. Sonrasında, daha önceden sığır dermal kolajeni ile kaplanmış bir T25 flaskın iç yüzeyinde, kaplamayı çizmemeye dikkat ederek fırçayı hafifçe döndürün. Ardından fırçayı uygun bir biyotehlike atık konteynerine atın.Konik tüpteki BEGM içindeki kalan hücreleri, en az 5 × 10⁵ hücre olacak şekilde, yavaşça T25 flaskına pipetleyin. Hücreleri ters mikroskop altında gözlemlemeye geçin. Metinde açıklandığı şekilde hücreleri kültüre alıp pasajladıktan sonra, altı kuyucuklu bir doku kültürü plağının her kuyucuğuna 2 mL BEGM içerisinde 5 × 10⁵ nazal epitel hücresi ekleyin.Ardından hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 24 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücrelerin güçlü bir şekilde çoğaldığından emin olun. Daha sonra, çeker ocak altında, BEGM içeren her bir kuyucuğa son konsantrasyonu 8 µg/mL olacak şekilde Polybrene ekleyin.Metin protokolünde tartışıldığı üzere, her kuyucuktaki ortama Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc eksprese eden lentiviral partiküller ekleyerek nazal epitel hücrelerinin transdüksiyonuna geçiniz. Transdükse edilen hücreleri yaklaşık üç saat inkübe ettikten sonra, virüs içeren ortamı kurumca onaylanmış prosedürleri kullanarak uzaklaştırınız ve imha ediniz. Ardından bu ortamı BEGM ile değiştiriniz ve transdükse edilen nazal epitel hücrelerini inkübatöre geri yerleştiriniz.Üç gün sonra, besiyerini taze BEGM ile değiştirin. Ardından, transduksiyonu yapılmış hücreleri aynı koşullar altında inkübe edin. Ertesi gün, fare embriyonik fibroblast kaplı plakaların hazırlanmasına başlamak için altı kuyucuklu bir plağın iki kuyucuğuna %0,1'lik jelatin çözeltisi ekleyin.Ardından plakayı uygun kapağıyla kapatın ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Beşinci günde, kısaca MEF olarak adlandırılan, yaklaşık 5 × 10⁵ inaktive mouse embriyonik fibroblast içeren bir viyali çözerek işleme devam edin. Daha sonra bu hücreleri 10 mL MEF ortamına yerleştirin.Ardından, bunları 200 x g hızda beş dakika boyunca santrifüj edin. Sonrasında, süpernatantı aspire edin ve MEF'leri aynı ortamda yeniden süspande edin. Bu hücreler sayıldıktan sonra, önceden hazırlanmış altı kuyucuklu plakadan jelatin çözeltisini aspire edin.Ardından, plakanın jelatin kaplı her bir kuyucuğuna 1,87 × 10⁵ MEF ekleyin ve 37 °C'de minimum 24 saat inkübe edin. Daha sonra, kültürün altıncı gününde, transduksiyonu yapılmış hücrelerdeki kullanılmış medyumu aspire edin ve hücreleri 1X PBS ile yıkayın. Sonrasında, plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL %0,05'lik tripsin çözeltisi ekleyin.Hücreler ayrıştırıldıktan sonra, tripsin nötralizasyon çözeltisi veya TNS ile nötralizasyon işlemine geçin, ardından hücreleri daha önce tartışıldığı şekilde toplayın ve santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından süpernatantı aspire edin ve hücreleri penisilin ve streptomisin ile takviye edilmiş dört mililitre BEGM içinde yeniden süspanse edin. Bu hücre süspansiyonundan ikişer mililitreyi, daha önce hazırlanmış plakanın jelatin ve MEF kaplı kuyucuklarının her birine ekleyerek devam edin.Hücreleri gece boyunca inkübe ettikten sonra, BEGM'yi mililitre başına dört nanogram temel fibroblast büyüme faktörü içeren 2,5 mililitre standart insan embriyonik kök hücresi (kısaca hESC) medyumu ile değiştirin. Kültürlerde, muhtemel indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) barındıran hESC benzeri koloniler gözlemlenene kadar hücreleri kültüre etmeye devam edin ve onları her gün taze hESC medyumu ile besleyin. Bu kolonileri, besleyici hücre içermeyen (feeder-free) bir sistemde ayrı hatlar olarak kültüre etmek ve genişletmek amacıyla manuel olarak kesin ve 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın.Başlangıçta nasal örnekler, hücre tiplerinin ve debrisin bir karışımıdır. Ancak, kültürleme ve besiyeri değişimlerini takiben, hücre pasajından bir gün sonra çekilen bu resimde gösterildiği gibi, bu preparatlarda epitelyal hücreler baskın hale gelir. Burada, konfluens durumuna gelen epitelyal hücreler, büyük çekirdekler ve uzamış sitoplazma sergilemektedir.Bu çalışmada kullanılan lentiviral partiküllerin özellikleri nedeniyle, söz konusu nazal epitel hücreleri transduksiyon edildiğinde, transduksiyondan dört gün sonraki hücrelerin sağ üst görüntüsünde gösterildiği üzere tdTomato floresan belirtecini eksprese ederler. Karşılık gelen bright-field görüntüsü ile yapılan karşılaştırma, alttaki birleştirilmiş görüntüde kanıtlandığı üzere, her hücrenin tdTomato sinyali göstermediğini ortaya koymaktadır. Dolayısıyla, her hücre transduksiyon edilmemiştir.Ancak, transdüksiyon verimliliği yaklaşık %90'dır. Protokolde açıklandığı gibi kültüre edilen transdükte nazal epitel hücreleri, iPSC kolonileri oluşturur. iPSC kolonilerinin hasadını ve standart feeder-free (besleyici hücre içermeyen) koşullarda kültürlenmesini takiben, bu kolonilerdeki tekil hücreler, bu büyütülmüş görüntüde gösterildiği gibi yuvarlak şekil, büyük çekirdek ve yüksek çekirdek-sitoplazma oranı gibi tipik hESC benzeri morfoloji sergilemiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığında bir buçuk saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, örneğin doğru şekilde alınması, hücrelerin 37 °C'de tutulması ve mümkün olan en kısa sürede doğru yoğunlukta ekilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, alerjenlere ve patojenlere nasıl yanıt verdiğimiz gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, primer nazal epitel hücreleri kullanılarak hava-sıvı ara yüzeyinin oluşturulması gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, araştırmacıların astım, KOAH ve kistik fibrozis gibi hastalıkları modellemesinin önünü açmıştır.Bu teknik aynı zamanda, in vitro insan sisteminde çevresel etkilerin akciğer gelişimi üzerindeki çalışmalarına da yardımcı olur. Bu videoyu izledikten sonra, çocuklardan nazal epitel hücrelerinin nasıl kültüre edileceği ve bu popülasyondan iPSC'lerin nasıl üretileceği konusunda iyi bir fikir edinmiş olmalısınız. İnsan embriyonik kök hücreleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler ile çalıştığımız için, kurumsal ve ulusal kılavuzlara her zaman uymayı unutmayın.

cultivate-primary-nasal-epithelial-cells-from-children-reprogram-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz burada, sıçan ve insan burun boşlukları olfaktör mukoza biyopsi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu biyopsiler, beyin hastalıkları moleküler anomaliler tespit edilmesi ya da beyin travması / hastalık hayvan modellerinde hücre nakli için kullanılabilir multipotent yetişkin kök hücreleri izole ya için de kullanılabilir.

Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

Insan gönüllülerin yüzeysel sıyrık biyopsi yoluyla elde edilen nazal epitel hücreleri, doku kültürü ekler üzerine genişletilmiş ve aktarılır. Ortak akışkanlığa eriştikten sonra hücreler, kirpikli olmayan silli hücre kültürleri, sonuçta hava sıvı arayüzü yetiştirilir. Farklılaşmış nazal epitel hücre kültürleri solunum mukozasını eğitim için uygun deneysel modeller sunar.

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

koşullu yeniden programlamayı kullanarak insan pediatrik özofagus epitel hücrelerinin genişlemesi kusurları veya yaralanma tedavi ve tedavi amaçlı testler için bir rezervuar olarak hizmet otolog implantasyon için özofagus yapıları mühendislik için kullanılabilir hücrelerin hastaya özgü nüfusa sahip araştırmacılar sağlar.

Doku Mühendisliği ve Hastalık Soruşturma Kullanılmak Üzere Pediatrik İnsan Özofagus Epitel Hücreleri koşullu yeniden programlanması

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Doğrudan nöronal yeniden programlama başlangıç somatik hücre çağı korumak neurons oluşturur. Burada, indüklenen nöronlar dermal fibroblastlar yetişkin insan bağış elde oluşturmak için tek bir vektör tabanlı yöntemi açıklanmaktadır.

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Burada, hava-sıvı arayüzünde primer insan nazal epitel (HNE) hücrelerinin izolasyonu, amplifikasyonu ve farklılaşması ve güçlendirilmiş HNE'nin başarılı bir şekilde dondurulmasına ve daha sonra çözülmesine izin veren bir biyobankacılık protokolü açıklanmaktadır. Protokol, farklılaşmış HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve farklı modülatör tedavileri üzerine CFTR ile ilişkili klorür sekresyon düzeltmesini analiz eder.

Primer İnsan Burun Epitel Hücreleri: Hassas Tıp Bağlamında Biyobankacılık

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşma protokollerindeki son gelişmeler, organa özgü hücre tiplerinin kademeli olarak türetilmesine izin vermektedir. Burada, iPSC türevi hava yolu bazal hücrelerinin bakımı ve genişlemesi ve hava-sıvı arayüz kültürlerinde mukosiliyer bir epitel halinde farklılaşması için ayrıntılı adımlar sunuyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Hava Yolu Epitel Hücresi Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Öğrenin çocuklardan burun epitel hücreleri yetiştirmeyi ve bunları iPSC'lere yeniden programlamayı. Bu invaziv olmayan yöntem, astım ve solunum hastalıkları araştırmaları için değerli kök hücre kaynağı sağlar.

Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

Daha fazla video keşfet