Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

Bu prosedürün genel amacı, çocuklardan elde edilen nazal epitel hücrelerini büyütmek ve bunları indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlamaktır. Bu yöntem, astımın nasıl geliştiği gibi havalandırılmış hastalık alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, stresli prosedürler olmadan çocuklardan hava yolu epitel hücrelerini toplamasıdır.

Kültürde, bunlar homojen bir popülasyondadır ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler veya iPSC'ler üretmek için mükemmel bir kaynak görevi görür. Bu çalışma için ilk olarak, astım ve hava kirliliğindeki epigenetik çeşitliliği araştırmak için çocuklardan mezo-epitel hücreleri toplama çalışmaları hakkında konuştuğumuzda Dr. Ji ve Hershey ile

Bu tekniklerin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü nazal örnekleme ve nazal epitel hücrelerinin iPSC'lerine yeniden programlama, kişisel deneyime dayandıkları ve yerleşik protokollere dayanmadıkları için öğrenilmesi zor tekniklerdir. Katılımcının ziyaretinden önce, BEGM olarak kısaltılan iki mililitre taze bronşiyal epitel büyüme ortamını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, bu ortama 20 mikrolitre penisilin, streptomisin ve amfoterisin b karışımı ekleyin% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona kadar% Katılımcı geldiğinde, oturmaları için bir sandalyeye yönlendirin.

Daha sonra numuneyi almadan hemen önce bir sitoloji fırçası açın ve steril kalmasını sağlamak için herhangi bir yüzeye dokunmayın. Katılımcıya hareketsiz oturması ve başını tavana doğru eğmesi talimatını vermeye devam edin. Huzursuzlarsa, fırçayı uzaklaştırmaya teşebbüs etmemeleri için ellerinin üzerine oturtun.

Ardından, fırçayı geçidin daraldığı burnun arkasına nişan alın ve yerleştirin. Daha sonra bileği bükme hareketiyle aşağı kaydırarak fırçayı burun deliğinden çıkarın. Fırçayı önceden hazırlanmış konik boruya yerleştirerek devam edin ve BEGM'ye daldırıldığından emin olun.

Ardından fırçanın fazla kısmını kesin ve kapağı tüpün üzerine sabitleyin. Numune toplandıktan sonra, mümkün olduğunca 37 santigrat dereceye yakın tutulması için hemen ılık suyla dolu bir behere koyun. Daha sonra laboratuvara taşıyın.

Laboratuvara girdikten sonra, fırçayı BEGM'de nazikçe çalkalayın. Daha sonra, numunenin 10 mikrolitresini çıkarın ve buna 10 mikrolitre canlı/ölü hücre lekesi ekleyin. Bu karışımı bir hemositometre üzerine vermeye devam edin.

Ve mikroskop altında sadece canlı hücreleri sayın. Hücre sayımını takiben, numuneden 50 mikrolitre alın ve 1X PBS ile 200 mikrolitreye seyreltmeye devam edin. Seyreltilmemiş hücre karışımının geri kalanını, fırça ile birlikte, hücre tohumlanana kadar düzenlenmiş 37 santigrat derece su banyosuna aktarın.

PBS ile seyreltilmiş numuneyi bir cam slayta bağlı bir cytospin hunisine eklemeye devam edin. Ve tüm aparatı iki dakika boyunca 400 rpm'de döndürün. Daha sonra huniyi çıkarın ve sürgünün gece boyunca karanlıkta kurumasını bekleyin.

Slaytı Hema 3 ile boyadıktan sonra, metin protokolünde tartışıldığı gibi, mikroskop altında gözlemleyin ve hücreleri sayın. Epitel hücrelerini benzersiz özelliklerine göre tanımlayın. Sütunlu bir şekil, kirpikler ve bir yuvarlak çekirdek ve bu hücrelerin preparattaki yüzdesini belirler.

Tohumlamaya başlamak için, fırçayı sertifikalı bir doku kültürü başlığı içinde konik içinde hafifçe döndürün ve ardından tüpten çıkarın. Daha sonra, daha önce sığır dermal kollajeni ile kaplanmış bir T25 şişesinin iç yüzeyindeki fırçayı nazikçe döndürün ve kaplamayı çizmemeye dikkat edin. Ardından fırçayı uygun bir biyolojik tehlike kabına atın.

BEGM'de kalan hücreleri konikten T25 şişesine, en az 7 kez 10 ila beşinci hücrelere yavaşça pipetleyin. Hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemlemeye devam edin. Metinde tarif edildiği gibi hücrelerin kültürlenmesinden ve geçirilmesinden sonra, altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasının oyuğu başına iki mililitre BEGM'de beşinci burun epitel hücrelerine 5 kez 10 kez plakaya devam edin.

Daha sonra hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücrelerin sağlam bir şekilde çoğaldığından emin olun. Daha sonra, bir çeker ocak altında mililitre başına sekiz mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar BEGM içeren her bir kuyucuğa Polibren ekleyin.

Metin protokolünde tartışıldığı gibi, her birinde ortama Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc eksprese eden lentiviral partiküller ekleyerek nazal epitel hücrelerini dönüştürmeye devam edin. Dönüştürülen hücreleri yaklaşık üç saat inkübe ettikten sonra, virüs içeren ortamı çıkarın ve kurumsal olarak onaylanmış prosedürleri kullanarak atın. Daha sonra bu ortamı BEGM ile değiştirin ve transdüksiyonlu nazal epitel hücrelerini inkübatöre geri koyun.

Üç gün sonra, ortamı taze BEGM ile değiştirin. Ve sonra dönüştürülen hücreleri aynı koşullar altında inkübe edin. Ertesi gün, fare embriyonik fibroblast kaplı plakaları hazırlamaya başlamak için altı oyuklu bir plakanın iki oyuğuna% 0.1 jelatin çözeltisi ekleyin.

Ardından plakayı karşılık gelen kapağıyla kapatın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Beşinci günde, MEF'ler olarak kısaltılan beşinci inaktive fare embriyonik fibroblastlarına yaklaşık 5 kez 10 içeren bir şişeyi çözmek için devam edin. Daha sonra bu hücreleri 10 mililitre MEF ortamına yerleştirin.

Ve onları beş dakika boyunca 200 x g'da döndürmeye devam edin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve MEF'leri aynı ortamda yeniden süspanse edin. Bu hücreler sayıldıktan sonra, jelatin çözeltisini önceden hazırlanmış altı oyuklu plakadan aspire edin.

Daha sonra, plakanın her bir jelatin kaplı oyuğuna 1.87 kez 10 ila beşinci MEF ekleyin ve en az 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra kültürün altıncı gününde, harcanan ortamı transdüksiyon hücrelerinden aspire edin ve bunları 1X PBS'de yıkayın. Daha sonra, plakanın her bir oyuğuna bir mililitre% 0.05 tripsin çözeltisi ekleyin.

Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsin nötralize edici çözelti veya TNS ile nötralize etmeye devam edin, daha sonra daha önce tartışıldığı gibi hücreleri toplayın ve santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve hücreleri penisilin ve streptomisin ile takviye edilmiş dört mililitre BEGM içinde yeniden süspanse edin. Önceden hazırlanmış plakanın jelatin ve MEF kaplı oyuklarının her birine bu hücre süspansiyonundan iki mililitre sokmaya devam edin.

Hücreleri gece boyunca inkübe ettikten sonra, BEGM'yi mililitre bazik fibroblast büyüme faktörü başına dört nanogram içeren, hESC, orta olarak kısaltılan 2.5 mililitre standart insan embriyonik kök hücresi ile değiştirin. Hücreleri kültürlemeye devam edin ve kültürlerde varsayılan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri veya iPSC'leri barındıran hESC benzeri koloniler gözlenene kadar günlük olarak taze hESC ortamı ile besleyin. Bu kolonileri manuel olarak eksize edin ve besleyici içermeyen bir sistemde ayrı hatlar olarak kültürlemek ve genişletmek için 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyularına aktarın.

Başlangıçta, burun örnekleri hücre tiplerinin ve döküntülerin bir karışımıdır. Bununla birlikte, kültür ve ortam değişikliklerini takiben, bu resimde gösterildiği gibi, hücre geçişinden bir gün sonra epitel hücreleri bu preparatlarda baskın hale gelir. Burada, birleşecek şekilde büyüyen epitel hücreleri, büyük çekirdekler ve gerilmiş sitoplazma gösterir.

Bu çalışmada kullanılan lentiviral partiküllerin özellikleri nedeniyle, bu tür nazal epitel hücreleri transdüksiyon yaptığında, transdüksiyondan dört gün sonra hücrelerin sağ üst görüntüsünde gösterildiği gibi tdTomato floresan markörünü eksprese ederler. Karşılık gelen parlak alan resmi ile yapılan bir karşılaştırma, alttaki birleştirilmiş görüntü tarafından kanıtlandığı gibi her hücrenin tdTomato sinyalini göstermediğini ortaya koymaktadır. Bu nedenle, her hücre dönüştürülmez.

Bununla birlikte, transdüksiyon verimliliği yaklaşık% 90'dırTransdüksiyon nazal epitel hücreleri protokolde tarif edildiği gibi kültürlendiğinde, iPSC kolonilerine yol açarlar. iPSC koloni hasadı ve standart besleyicisiz koşullarda kültürü takiben, bu tür kolonilerdeki tek tek hücreler, bu büyütülmüş görüntüde gösterildiği gibi yuvarlak bir şekil, büyük çekirdek ve yüksek çekirdek-sitoplazma oranı gibi tipik hESC benzeri morfoloji gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir buçuk saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, numuneyi doğru bir şekilde almayı, hücreleri 37 santigrat derecede tutmayı ve mümkün olduğunca çabuk doğru yoğunlukta plakalamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, havanın alerjenlere ve patojenlere nasıl tepki verdiği gibi ek soruları yanıtlamak için birincil nazal epitel hücrelerini kullanarak bir hava-sıvı arayüzü kurmak gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, araştırmacıların astım, KOAH ve kistik fibroz gibi hastalıkları modellemesinin yolunu açtı.

Bu teknik aynı zamanda in vitro insan sisteminde akciğer gelişimi üzerindeki çevresel etkilerin incelenmesine de yardımcı olur. Bu videoyu izledikten sonra, çocuklardan nazal epitel hücrelerinin nasıl yetiştirileceği ve bu popülasyondan iPSC'lerin nasıl üretileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. İnsan embriyonik kök hücreleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerle çalıştığımız için, her zaman kurumsal ve ulusal yönergelere uymayı unutmayın.