Name: Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Keşfedin, genetik olarak kodlanmış yapay amino asit kullanarak nöronal proteinlerin optik kontrolü için geliştirilen bu yöntemi. Hipokampal nöronlarda uygulanan bu teknik, beyin fonksiyonlarındaki protein rollerini yüksek çözünürlükle incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nöron kültürü ve Ca-P transfeksiyonu hakkındaki yararlı tartışması için Dr. S. Szobota'ya teşekkür ederiz. LW, Salk İnovasyon Hibesi, California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (RN1-00577-1) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (1DP2OD004744) destek alır.

Mevcut çalışmada tüm işlemler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Biyolojik Araştırmalar, The Salk Enstitüsü, La Jolla, CA hayvan taşıma için protokolleri onayladı kullanılarak yapıldı 1. UAA Kir2.1 Şirketleşme ve İlköğretim Nöronal Kültür Sonuç Pirk İfadesi <ol><li> DNA İnşaat <ol><li> UAA katılması için Kir2.1 bir hedef site seçin. Işığa cevap UAA Incorporated ile seçilen sitesi Kir2.1 fonksiyon 21 optik modülasyon sağlar, böylece Kir2.1 yapısı ve fonksiyonu hakkında ön bilgi ve bilgi Exploit. </li><li> TAG amber durdurma kodonunun mutasyona seçilen site ile bir rekombinant DNA şifreleyen Kir2.1 gen yapısı. Bir memeli ifade plazması içine Kir2.1-Tag DNA klonlamak için standart klonlama teknikleri 25 kullanın. </li><li> UAA için spesifik olan ve tepki olarak UAA dahil Klon tRNA / sentaz genleriBaşka bir memeli ifade içine TAG durdurma kodonu 21 plazmid. Not: iyi UAA dahil için, (tRNA, sentetaz ve Kir2.1 için), farklı promoterler ve gen kasetlerinin kombinasyonları, değişik plazmid test edilebilir. </li><li> miniprep kullanarak yüksek kaliteli plazmid DNA&#39;lar elde veya üreticinin protokolüne göre ticari kitler Maxiprep. 260/280 oranı 1.9 etrafında saflaştırılmış DNA için en uygunudur. Gerekli olduğunda, prepped DNA 25 saflığını kontrol etmek için bir agaroz jel elektroforezi gerçekleştirin. yüksek saflıkta, süper plazmid DNA&#39;lar nöronal transfeksiyon için en iyisidir. </li></ol></li><li> Kültür Sıçan Hipokampal İlköğretim Nöronlar <ol><li> Talep cam lamelleri (daireler, 12 mm çapında) 24 oyuklu plakalar içerisinde, her bir ilgili bir lamel ve kaplama her bir 0.5 mg, 250 ul / ml poli-D-lisin (100 mM borat tamponu: 1.24 g borik damıtılmış iyonu giderilmiş 400 ml asit ve 1.90 g sodyum tetraborat H2, O ya da GKD 2 </suOda sıcaklığında 10 saat boyunca üzerinde pH 8.5&#39;te b&gt; O) sızdırmaz. yavru başına yaklaşık 10-12 kaplı lamelleri hazırlayın. </li><li> Diseksiyon gününde, izofluran ile anestezi ve decapitating sonra doğum sonrası sıçan yavrularında (1-4 doğum sonrası gün) yenidoğan beyinleri toplamak. izofluran (% 2-4) ihtiva eden bir Anesthetization odası içinde yavrular anestezisi. Onlar bilincini kaybeder ve dokunsal uyaranlara ve pençeleri kısma yanıt vermeyen kadar bekleyin. </li><li> Standart teknik kullanımı 26 (~ 37 ° C), tuzlu su (10 mM HEPES ve Hank dengeli tuz çözeltisi içinde 20 mM D-glukoz), sıcak beyin hippocampi incelemek ve 4.5 ml ılık salin ile konik bir tüp içinde hippocampi toplamak . </li><li> Hipokampuslardan (% 0.25 son tripsin konsantrasyon)% 2.5 tripsin 500 ul ekleyin ve 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde 10 dakika inkübe edilir. </li><li> İyice tuzlu su (3 x 10 mi) ile öğüterek ile doku yıkayın. </li><li> 1 ml w ayrışmış nöronlar kurtarma% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş en az temel ortam (MEM) içeren bir kolu büyüme ortamı, 21.2 mM D-glukoz, 2 mM L-glutamin,% 2 B-27 ve% 0.1 serum uzatıcı içermektedir. Not: yeni büyüme ortamı hazırlamak için diseksiyon gün L-glutamin ve B-27 ekleyin. </li><li> Bir hemasitometre ile nöronların sayın ve 1.0-1.5 x 10 5 hücre 24 oyuklu plakalarda lamelleri üzerine bunları plaka / oyuk 500 ul büyüme ortamı ile yoğunluğu sonra 40 um naylon elekle filtrelenmiştir. </li><li> % 5 CO2 içinde 35 ° C &#39;de nöronal kültür inkübe:% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka 2-3 hafta. En iyi sonuç için, inkübasyon sırasında mümkün olduğunca kültürü rahatsız etmemek. </li></ol></li><li> İlköğretim Nöronal Kültür kalsiyum fosfat (Ca-P) Transfeksiyon <ol><li> 4 ° C&#39;de stok çözelti ve mağaza sağlayın: 0.5 M BES (N, N-bis [2-hidroksi-etil] -2-aminoetansülfonik asit) diretkeni (10x); 150 mM Na-2 HPO 4 (100x); 2.8 M NaCI (10 x); Steril GKD 2 O; Steril 1 N NaOH. </li><li> Transfeksiyon gününde, 0.22 um filtre ile GKD 2 O taze 2.5 M CaCI2 çözeltisi ve steril filtre edin. 0.22 um filtre ile pH 7.00 (NaOH ile pH ayarlanır) ve steril filtre 50 mM BES, 1.5 mM Na 2 HPO 4 ve 280 mM NaCI ihtiva eden taze 2x BES tamponlu tuz (BBS) tampon sağlayın. Not: transfekte edilecek CaCl2 çözeltisi ve lamelleri sayısına bağlı olarak BBS tampon miktarını hesaplayın. Ayrıca 1.3.4 bak. </li><li> 500 ul taze önceden ısıtılmış transfeksiyon büyüme ortamı ile kültür büyüme ortamı değiştirin. (Transfeksiyon ortamı MEM artı 21.2 mM D-glükoz ile yapılabilir). Not: eski medya atmayın. </li><li> GKD 2 O miktarını hesaplayın ve 1.65 ul CaCl2, 0.7 ug DNA ve 16.5-ihtiva eden transfeksiyon solüsyonu (her lamel başına 33 ul) yapmak için eklemek için hazırlamak# 181; l 2x BBS. </li><li> Kültür eklemeden hemen önce transfeksiyon solüsyonu hazırlayın. Yavaş yavaş tüp çalkalanırken hazırlamak için, öncelikle CaCl2 ve GKD 2 O birleştirir. solüsyon içine DNA eklemek yavaş yavaş ajitasyon devam edin ve. ajite ederken Son olarak, 2x BBS tampon damla damla ekleyin. </li><li> Hemen nöronal kültür her lamel transfeksiyon solüsyonu 30 ul ekle. </li><li> 45 dakika-1 saat boyunca bir% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka makinesinde: çözelti karışımı ve% 5 CO2 içinde 35 ° C de inkübe etmek kültür kabı birkaç kez sallayın. nöronlar transfeksiyon solüsyonu ile inkübe edildikten sonra, çok ince bir Ca-P çökeltiler nöronlar kapsayan bir tabaka oluşturmak olacaktır. </li><li> 500 ul önceden ısıtılmış yıkama tamponu (135 mM NaCI, 20 mM HEPES, 4 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, pH 7.3, 10 mM glukoz, steril transfeksiyon ortamı yerine 0.22 um&#39;lik bir filtreden süzüldü) ve 35 inkübe6; C,% 5 CO 2: 15-20 dakika boyunca% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka makinesinde. Ca-P çökeltiler yıkama adımından sonra yok olur. </li><li> 500 ul taze büyüme ortamı ile yıkama tamponu değiştirin. Yine, kaydedilmiş orijinal medya ile büyüme ortamı değiştirin. </li><li> 1 mM nihai konsantrasyon elde etmek kültür (50 ul, sıcak büyüme ortamı içinde önceden karıştırılmış) UAA CMN ekleyin. </li><li> % 5 CO2 içinde 35 ° C &#39;de, transfekte kültürü inkübe:% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka deneylerinden önce 12-48 saat. </li></ol></li><li> Işık Aktivasyon ile tüm Hücre Kaydı <ol><li> Ekstra / hücre içi çözümler hazırlayın. Hücre-içi solüsyon 135 mM potasyum glukonat, 10 mM NaCI, 2 mM MgCI2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2.56 mM K 2 ATP ve pH 7.4&#39;te 0.3 mM Li 2 GTP içerir. Hücre dışı kayıt çözeltisi, 150 mM NaCI, 3 mM KCI, ihtiva eden 5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2, 5 mM glukoz, pH 7.4, 10 mM HEPES. </li><li&gt; Tam hücreli yama sıkma için elektrofizyoloji teçhizat ayarlayın: mikroskop 4X ve 20X hedefleri, diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve mCitrine filtresi ile donatılmış (: 495/10 nm, emisyon: eksitasyon 525/25 nm); manipülatör; patch-kelepçe amplifikatör; sayısallaştırıcı; veri toplama ve analiz yazılımı. <ol><li> 45 ° &#39;lik açıyla 1 cm uzakta odak noktasına ışık sunmak için teçhizat mikroskop ile 385 nm emisyon ile bir ışık yayan diyot (LED) yükleyin. hafif bir güç metre ile LED gücünü kontrol edin. </li></ol></li><li> 3-6 MQ pipet direncine sahip olması ticari bir mikropipet çektirmenin kullanarak cam elektrotlar yama pipetler çekin. mikropipet çektirmenin kurmak için üreticinin talimatlarını izleyin. <ol><li> pipet direnci test etmek için, öncelikle hücre içi solüsyonu ile pipet doldurmak ve elektrot tutucu üzerine yerleştirin. mikroskop p yerleştirilen hücre dışı solüsyonu ile dolu bir 35 mm kültür çanak pipet, Diplatform. Bir devreyi tamamlamak için çanak içine bir toprak elektrot batırın. </li><li> amplifikatör / sayısallaştırıcı açın ve bir veri toplama yazılımı başlatın. Bir zar test protokolü ile pipet direnci izleyin. </li></ol></li><li> inkübatör nöron kültürü bir lamel çıkarın ve hücre dışı çözeltide kez yıkayın. Vakum gres kullanarak, taze hücre dışı solüsyonu ile dolu bir 35 mm kültür çanak ortasında lamel basılı tutun. </li><li> elektrofizyoloji mikroskop platformu üzerinde lamel / çanak yerleştirin. </li><li> Standart yama sıkma teknikleri kullanılarak, mCitrine floresan 27 ile bir nöron yama. Geçerli kelepçesini (I-kelepçe) yöntemi kullanılarak Tutanak nöronal aktivitenin. İlk olarak, küçük bir akım enjekte edilerek etrafında -72 mV dinlenme potansiyelini ayarlayın. Ardından, aksiyon potansiyelinin sürekli ateş (5-15 Hz) ikna etmek için bir adım akımı (10-200 pA) enjekte edilir. </li><li> El ile ya da veri toplama yazılımı kullanarak, bir darbe flaş (bir günahnöron LED ışığı 100 milisaniye -1 sn süresi) ve gle darbe kayıt ve aksiyon potansiyelleri etkilenen olmadığını görmek ise. </li><li> Banyo için 0.5 mM BaCl 2 ekleyin ve aksiyon potansiyelleri kurtarıldı olmadığını kontrol edin. </li></ol></li></ol> 2. UAA Kir2.1 Şirketleşme ve In Vivo Fare Embriyonik Beyin Sonuç Pirk İfadesi <ol><li> DNA İnşaat <ol><li> Adım 1.1 gibi benzer plazmid DNA tasarlayın. In vivo ekspresyon için, örneğin CAG (CMV arttırıcı tavuk beta-aktin promoteri) gibi güçlü bir promoter kullanımı. </li><li> üreticinin protokolüne uygun olarak bir endotoksin içermeyen maksi ticari kit ile DNA saflaştırılır. (2-5 mg / ml kondanse) son derece yüksek kaliteli DNA elde etmek için etanol ile çökeltme 25, ardından fenol-kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Fare Embriyonik Neokortekse utero elektroporasyon Not: Temel Techniutero elektroporasyon için que önce 28 tarif edilmiştir. <ol><li> sodyum pentobarbital (intraperitoneal enjeksiyon, gram vücut ağırlığı başına 50 mg) veya izofluran (inhalasyon,% 2-4) ile embriyonik gün 14.5 (E14.5) bir zaman aşımına hamile fare anestezisi. bilinç kaybı ve dokunsal uyaranlara yanıt kontrol ederek ve pençelerinin sıkıştığı anestezi derinliği izleyin. </li><li> Karın orta hat küçük bir kesi yapmak. Yavaşça forseps ve parmak uçları ile rahim boynuzları maruz kalmaktadır. </li><li> rahim duvarı içeri sokulan bir cam pipet ile, her yavru yanal ventrikül içine 1 ul DNA çözeltisi (her plazmid 2-5 ug / ml, yapısına göre) enjekte edilir. Pek çok durumda, toplam embriyoların yaklaşık% 60-80 enjekte edilir. </li><li> Bir Elektroporatör (33-35 V, 50 msn süresi 950 msn aralık, 4-8 bakliyat) ile embriyolar electroporate. </li><li> için hafifçe karın boşluğuna rahim boynuzları dönmekceps ve parmak uçları. kas duvarını dikin ve daha sonra cerrahi sütür ile cilt embriyoların gelişimi devam etmesi için. </li></ol></li><li> UAA Mikroenjeksiyon <ol><li> E16.5 tekrar karın orta hat küçük bir kesi yapmak ve yavaşça forseps ve parmak uçları ile rahim boynuzları maruz kalmaktadır. </li><li> Elektroporasyona yan veya rahim duvarında sokulan bir cam pipet ile lateral ventrikül her iki taraf için yaklaşık 2-5 | il CMN-Ala (500 mM) enjekte edilir. In vivo 21 Kazablanka teslim dipeptit CMN-Ala (CMN-alanin) kullanın CMN biyoyararlanımını arttırmak için. </li><li> Yine, forseps ve parmak uçlarınızla hafifçe karın boşluğuna rahim boynuzları geri dönün. kas duvarını dikin ve daha sonra cerrahi sütür ile cilt embriyoların gelişimi devam etmesi için. </li></ol></li><li> Akut Beyin Dilimler elde <ol><li> 119 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1.3 mM MgCI2, 2.5 mM CaC ihtiva eden 1 L&#39;lik yapay serebrospinal akışkan (ACSF) yapmak <sub&gt; 2, pH 7.3 1 mM NaH 2 PO 4, 26.2 mM NaHCO 3 ve 11 mM glükoz. </li><li> 20-30 dakika boyunca -80 ° C&#39;de 200 mi ACSF ve hızlı dondurma al. Kabarcık% 5 CO 2 ile ACSF kalan:% 95 O 2 gazı, oda sıcaklığında. </li><li> Hazırlayın ve embriyoların beyinleri hasat cerrahi aletler sterilize. Ayrıca bir kova buz hazırlamak. </li><li> bir mikrodalga içinde ısıtılarak bir şişe içinde ~ 100 mi% 4 düşük erime noktasına sahip agaroz çözeltisi olun. katılaşmaya başlamadan önce yaklaşık 5 dakika boyunca çözelti önce soğumaya. </li><li> CO 2 doz aşımı ile CMN-Ala enjeksiyonundan sonra fare 12-24 saat euthanize. Karın alanda büyük kesiler yapmak ve ince makas ve forseps ile rahim Electroporated / microinjected embriyoların teşrih. </li><li> ince makas ve forseps ile embriyoların hasat beyinleri. </li><li> buz kovası yerleştirilen 10 cm kültür çanak her beyin yerleştirin. Keskin bir bıçak kullanarak iki hemisfer bölün ve her yeryemeğin dibini dokunmadan midsagital uçağı ile yemeğin üzerine yarımkürede. Çabuk (yarımkürede başına 500 ul civarında) beyinleri üzerinde agaroz çözüm dökün. </li><li> Keskin bir bıçak kullanarak, kare bir beyin gömülü agaroz blok yapmak için bir beyin çevresinde agaroz kesti. </li><li> doku yapıştırıcısı kullanarak, vibratome için bir montaj üzerinde agaroz bloğunun midsagital düzlem yüzeyi aşağı tutkal. Önceden soğutulmuş ACSF vibratome odasına doldurun ve 200 mikron sagital beyin dilimleri kesti. </li><li> % 95 O 2 gaz:% 5 CO2 ile kabarcıklar ise 42 dakika boyunca 33 ° C&#39;de 3 mM miyo -inositol, 0.4 mM askorbik asit ve 2 mM sodyum piruvat ile takviye edilmiş ACSF akut dilimleri inkübe edin. </li><li> 42 dakika sonra, ısıtıcıyı kapatın ve köpürme ile oda sıcaklığında dilim inkübe devam ediyor. ısıtıcı kapattıktan sonra tüm hücre yama kaydetmeye en az 15 dakika başlatın. </li></ol></li><li> Işık Aktivasyon ile tüm Hücre Kaydı <ol><li> InTrac hazırlayın130 mM potasyum glukonat, 4 mM MgCI2, 5 mM HEPES, 1.1 mM EGTA, 3.4 mM Na-2 ATP, 10 mM sodyum fosfat, kreatin ve KOH ile ayarlanmış pH 7.3 0.1 mM Na-3 GTP ihtiva ellular çözeltisi. </li><li> 3-6 MQ pipet direncine sahip olması ticari bir mikropipet çektirmenin kullanarak cam elektrotlar yama pipetler çekin. </li><li> tam hücreli yama sıkma için dilim elektrofizyoloji teçhizat kurmak ve 2 ml / perfüzyon pompası ile en az oranda ACSF kayıt odasına superfuse. yaklaşık 33 ° C&#39;ye odası sıcaklığını ayarlamak. Not: Dilim elektrofizyoloji teçhizat bir perfüzyon odasının, bir suya daldırma objektif ve bir sıcaklık kontrolörü ile donatılmıştır. Ayrıca, GFP filtresi (uyarma: 480/30 nm, emisyon: 535/40 nm) ve mCherry filtre (uyarma: 580/20 nm emisyon: 675/130 nm) gereklidir. <ol><li> Bir 45 ° 1 cm uzakta odak noktasına ışık sunmak için teçhizat mikroskop ile 385 nm emisyon LED yükleyinaçısı. hafif bir güç metre ile LED gücünü kontrol edin. </li></ol></li><li> Dikkatle perfüzyon odasında bir cam pipet ve yer ile bir beyin dilim almak. Bir harp ile dilim basılı tutun. </li><li> Neokortikal bölgeden 27 MCherry / GFP floresan ile bir nöron yama. Gerilim kelepçesini (V-kelepçe) yöntemini kullanarak kayıt Pirk etkinliği. İlk olarak, -60 mV membran potansiyeli tutun. Ardından, sabit negatif membran potansiyelleri (-100 mV) veya voltaj rampaları (40 mV -100 mV) rekor akımları. Özellikle, -100 mV Kir2.1 belirli içeri doğru akımlar izlemek. </li><li> El ile ya da veri toplama yazılımı kullanarak, kayıt sırasında nöron LED ışık darbe (100 milisaniye -1 sn süresi, tek bir darbe) yanıp söner ve Pirk proteinleri aktive olmadığını görmek. Pirk aktive edildiğinde, -100 mV&#39;de içeri doğru akımlar önemli ölçüde artacaktır. </li><li> Banyo için 0.5 mM BaCl 2 ekleyin ve Pirk yeniden inaktive olup olmadığını kontrol edin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Stimulation+of+Nerve+Cells+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia.</a> Science. 171 (3974), 907-908 (1971).</li>
<li>Callaway, E. M., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostimulation+using+caged+glutamate+reveals+functional+circuitry+in+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).</li>
<li>Cambridge, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline-dependent+photoactivated+gene+expression+in+eukaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems.</a> Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).</li>
<li>Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+cortical+neurons+form+fine-scale+functional+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks.</a> Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).</li>
<li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+ion+channels+for+remote+control+of+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing.</a> Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).</li>
<li>Volgraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+control+of+an+ionotropic+glutamate+receptor+with+an+optical+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch.</a> Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).</li>
<li>Szobota, S., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Optical control of neuronal activity.</a> Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).</li>
<li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific%2C+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li>
<li>England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+disulfide+connectivity+using+backbone+ester+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis.</a> Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).</li>
<li>Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+caged+cysteine+and+caged+tyrosine+into+a+transmembrane+segment+of+the+nicotinic+ACh+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).</li>
<li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+decaging+leads+to+substantial+membrane+trafficking+during+modulation+of+an+inward+rectifier+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel.</a> J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).</li>
<li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).</li>
<li>Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code of Escherichia coli.</a> Science. 292 (5516), 498-500 (2001).</li>
<li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).</li>
<li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).</li>
<li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+for+cellular+and+neuronal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies.</a> Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).</li>
<li>Kang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+expression+of+a+light-activatable+potassium+channel+using+unnatural+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids.</a> Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).</li>
<li>Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+functional+studies+with+structures+of+inward-rectifier+K%28%2B%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).</li>
<li>Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+synaptic+plasticity+triggered+by+selective+suppression+of+activity+in+individual+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons.</a> Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).</li>
<li>Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+genetic+suppression+of+neuronal+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inducible genetic suppression of neuronal excitability.</a> J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Beaudoin, G. M. III, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%3A+An+Introductory+Guide+To+Patch+Clamp+Electrophysiology%22">Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+protein+phosphorylation+with+a+genetically+encoded+photocaged+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid.</a> Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).</li>
<li>Coin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+chemical+probes+in+cells+reveal+the+binding+path+of+urocortin-I+to+CRF+class+B+GPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR.</a> Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).</li>
<li>Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esterification+of+an+unnatural+amino+acid+structurally+deviating+from+canonical+amino+acids+promotes+its+uptake+and+incorporation+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells.</a> Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).</li>
<li>Parrish, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Genetic+Code+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Bacterial+Aminoacyl-tRNA+Synthetase%2FtRNA+Pairs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs.</a> ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).</li>
<li>Lu, H., Klaassen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+and+thyroid+hormone+regulation+of+Pept1+and+Pept2+mRNA+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents.</a> Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Plaster, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Kir2.1+cause+the+developmental+and+episodic+electrical+phenotypes+of+Andersen%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome.</a> Cell. 105 (4), 511-519 (2001).</li>
<li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+form+of+short+QT+syndrome+%28SQT3%29+is+caused+by+a+mutation+in+the+KCNJ2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene.</a> Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).</li>
<li>Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+mapping+ion+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function.</a> Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).</li>
<li>Hoppmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoding+photoswitchable+click+amino+acids+in+Escherichia+coli+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).</li>
<li>Hoppmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Formation+of+an+Azo+Bridge+on+Proteins+Controllable+by+Visible+Light%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light.</a> J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Etkili fotoğraf modülasyon elde etmek için, önemli ilk adımdır nerede hedef protein ışığa cevap UAA&#39;yı dahil etmek karar vermektir. hedef proteinin yapısal ve işlevsel bilgiler aday sitelerin seçimi rehberlik çok yararlıdır. Aynı zamanda, hafif yönetmeliğin amacı en uygun hangi site belirleyecek. Aday siteleri seçtikten sonra, biz birincil nöronlar ve in vivo geçmeden önce İnsan Embriyonik Böbrek (HEK) kolay kültür ve manipülasyon için hücreler gibi memeli hücre hatlarında siteleri test etmek için tavsiye e...

Geleneksel elektrik stimülasyonu ile karşılaştırıldığında, photostimulation örneklerinin fizyolojik sisteme en az müdahale ile daha zamansal ve uzamsal çözünürlük sunuyor. 1971 1 nöronların teşvik etmek lazerler kullanarak gösteri yana birçok yaratıcı yollar dışsal olarak ışık ile nöronal aktiviteyi kontrol etmek icat edilmiştir. Photocaged agonistlerin Optik sürümü uzun ligandlar 2,3,4 nöronal ağ fizyolojik yanıtı incelemek için kullanılır olmuştur. Bu teknik sayesinde kafesli agonistlerin difüzyon özgünlüğü sınırlıdır. Genetik özgünlüğü ektopik ifade ışığa duyarlı opsin kanalları ile elde ve 5,6,7 pompalar ve başarıyla çeşitli model organizmaların seçilen nöron ağları modüle uygulanmıştır edilir. Bununla birlikte, diğer proteinlere opsin proteinlerden photoresponsiveness aşılama için, optik olarak çeşitli diğer nöronal proteinlerin kontrol etmek için bu yöntemi uygulamak zor olacaktır olacağını gerÇalışmanın altında proteinin doğal özelliklerini değiştirebilir yoğun mühendislik gerektiren d. Kimyasal olarak bir proteine ​​bir ekzojen ışığa ligand kanal proteinlerinin 8,9,10 işlevselliğini kontrol etmek için başka bir yol göstermiştir hayvan zinciri. Ligand sunulan veya azobenzen yarımının fotoizomerleşme yoluyla protein bağlama sahasına geri çekilir. Bağ kimyası hücre tarafı ve hücre içi proteinleri hariç temel olarak zar proteinlerinin hücre dışı tarafına uygulanmasını kısıtlar. Işığa duyarlı UAAS, proteinler dahil edildikten sonra, ışık proteinleri işlemek için genel bir strateji sunar. Photocaged UAAS kendi yapı-işlev ilişkilerinin 12,13,14 ileri düzeyde tanıyorsanız membran reseptörleri ve iyon kanalları 11, içine UAAS dahil etmek Xenopus oosit içine mikroenjeksiyon edildi erken çabalarında, tRNAs kimyasal asile.Bu mikroenjeksiyon yaklaşım esas olarak büyük oosit ile sınırlıdır. Bir UAA&#39;nın Genetik birleşme canlı hücreleri 15,16,17,18 endojen protein çeviri yoluyla UAA içeren bir dikey tRNA / sentetaz çifti kullanarak tRNA asilleme ve mikroenjeksiyon teknik açıdan zor atlar. Nöronal proteinlere UAA birleşme birincil nöronlar ve nöral kök hücreler 19,20 ortaya konmuştur. Daha yakın zamanda, ışığa cevap UAA genetik ilk kez 21 in vivo memeli beyninde nöronal protein içine dahil edilmiştir. Bu gelişmeler kendi ana hücresel ortamda UAAS ile nöronal proteinler incelemek mümkün kılar. Içe doğru doğrulan potasyum kanal Kir2.1 hücre dışına daha içine daha kolay K + akımları geçer güçlü bir doğrultucu olduğunu ve hücre uyarılabilirliği, damar tonusu, kalp atım hızı, yeniden dahil fizyolojik süreçleri düzenleyen esastırnal tuz akışı ve insülin 22 bırakın. Kir2.1 overekspresyonu az uyarılabilir 23,24 olur hedef nöron, membran potansiyelini hiperpolarize. Optik olarak doğal hücrelerde Kir2.1 kontrol etmek için, Kang ve diğ., Genetik olarak Kir2.1 bir foto-duyarlı bir UAA memeli hücreleri, nöronlar ve embriyonik fare beyinleri 21 olarak ifade dahil. ışık kısa bir darbe böylece hedef Kir2.1 proteini aktive doğal bir amino asit Cys içine UAA dönüştürmek mümkün oldu. Bu foto-uyarılabilir içeri doğru rektifiye potasyum (Pirk) kanal proteini sıçan hipokampal primer nöron ifade edildiğinde, ışık aktivasyonuna yanıt olarak nöronal ateşleme bastırılır. Buna ek olarak, Pirk kanalı embriyonik fare neokorteks ifade edildi ve kortikal nöronlar ışık aktif Pirk akımı ölçülmüştür. Memeli beyninde in vivo UAA teknolojisinin başarılı bir şekilde uygulanması optik nöronal proteinleri kontrol etmek için kapıyı açarkendi doğal ortamında, moleküler düzeyde nöronal işlemleri ve mekanizmalarının optik diseksiyon sağlayacak olan. Bu protokolde, kültür ve in vivo olarak embriyonik fare beyninde primer nöronlara UAAS genetik dahil edilmesi için işlemleri açıklar. ışığa cevap UAA CMN ve Kir2.1 sürecini göstermek için kullanılır. Yöntem başarılı UAA katılmasını ve sağlanan nöronal protein aktivitesinin optik kontrolünü değerlendirmek için. Bu protokol, genetik olarak nöronlar ve in vivo UAAS kodlayan ve optik da ışığa UAA ile nöronal protein fonksiyonunu düzenlemek için açık bir kılavuz sağlar. Biz bu protokol nörobilim ve optogenetic biyolojik çalışmalar için in vivo UAA teknolojisinin benimsenmesini kolaylaştırmak için bekliyoruz.

<table><tbody><tr><td>Kapak Camları, Daireler, 12 mm, Kalınlık 0.13-0.17 mm</td><td>Carolina Biologicals</td><td>633029</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td><td>Corning Discovery Labware</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>İris Spatula Kavisli</td><td>Güzel Bilim Aracı</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Bıçağı - İnce Açılı Uç</td><td>Güzel Bilim Aracı</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I Takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Serum Genişletici</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 & m Hücre Süzgeci</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>BES ( N, N-Bis (2-hidroksietil) -2-aminoetansülfonik asit, N, N-Bis (2-hidroksietil) taurin)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B6420</td><td></td></tr><tr><td>LED IŞIK KAYNAĞI &ndash; Siyah LED 385</td><td>Prizmatix Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroz, Düşük Erime Noktası, Analitik Sınıf</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr></tbody></table>

nöronlar bir genetiği kodlanmış doğal olmayan amino asit kullanarak nöronal protein optik kontrol

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Fotostimülasyon, biyolojik olayları mükemmel uzamsal ve zamansal çözünürlükle kontrol etmenin invaziv olmayan bir yoludur. Doğal ortamlarında eksprese edilen endojen proteinleri foto-regüle etmek için yeni yöntemler istenmektedir. Burada, genetik olarak kodlanmış doğal olmayan bir amino asit (Uaa) kullanarak bir nöronal proteinin işlevini doğrudan nöronlarda optik olarak kontrol etmek için bir yaklaşım sunuyoruz. Kehribar kodonunu baskılamak için ortogonal bir tRNA/aminoasil-tRNA sentetaz çifti kullanılarak, foto-reaktif bir Uaa 4,5-dimetoksi-2-nitrobenzil-sistein (Cmn), içe doğru doğrultucu bir potasyum kanalı olan bir nöronal protein Kir2.1'in gözeneğine spesifik olarak dahil edilir. Hacimli Cmn, kanal gözeneğini fiziksel olarak bloke ederek Kir2.1'i iletken hale getirir. Işık aydınlatması, Cmn'yi anında daha küçük bir doğal amino asit Cys'ye dönüştürerek Kir2.1 kanal fonksiyonunu aktive eder. Bu photo-indüklenebilir inward r ektifiyeedici potasyum (PIRK) kanallarını sıçan hipokampal primer nöronlarında ifade ediyoruz ve PIRK'nın ışık aktivasyonunun, aktive edilmiş Kir2.1 kanallarından K + akımının dışarı akışı nedeniyle nöronal ateşlemeyi durdurduğunu gösteriyoruz. Utero elektroporasyon kullanarak, embriyonik fare neokorteksinde in vivo olarak PIRK'yı da eksprese ediyoruz ve neokortikal nöronlarda PIRK'nın ışık aktivasyonunu gösteriyoruz. Genetik olarak kodlayan Uaa, hedef protein tipine veya hücresel konuma herhangi bir kısıtlama getirmez ve farklı doğal amino asit kalıntılarını modüle etmek için bir fotoreaktif Uaas ailesi mevcuttur. Bu nedenle bu teknik, beyindeki farklı süreçlerin optik regülasyonunu sağlamak için genel olarak birçok nöronal proteine uygulanma potansiyeline sahiptir. Mevcut protokol, moleküler düzeyde nöronal protein aktivitesinin foto kontrolünü sağlamak için in vitro ve in vivo nöronlarda karmaşık Uaa katılımı için erişilebilir bir prosedür sunmaktadır.

genetik olarak nöronların bir proteinin bir UAA birleştirmek için birinci önemli bir adım, uygun bir gen sunar ve nöronlarda etkin genleri ifade etmek yapıları tasarlamaktır. UAA dahil edilmesi için, üç genetik bileşen vardır: (1) UAA dahil (2) mutasyona uğramış TAG durdurma kodonu tanımak için bir ortogonal tRNA, ve (3) bir ortogonal aminoasil için seçilen yerinde ortaya TAG amber durdurma kodonu ile hedef genin -tRNA sentetaz dik tRNA üzerine UAA şarj etmek için. Her bir bileşen, uygun...

Burada, foto-reaktif doğal olmayan bir amino asidi, kültürde veya in vivo nöronlarda eksprese edilen bir hedef nöronal proteine genetik olarak kodlayarak kısa bir ışık darbesi ile bir nöronal proteini seçici olarak aktive etmek için bir prosedür sunulmaktadır.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Bu prosedürün genel amacı, nöronlarda genetik olarak kodlanmış, doğal olmayan bir amino asit kullanarak nöronal bir proteinin fonksiyonunu optik olarak kontrol etmektir. Bu yöntem, belirli bir nöronal proteinin beyin fonksiyonundaki nöronal sinyallemeye katkısına dair temel soruların uzaysal ve zamansal çözünürlükle yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çeşitli nöronal süreçlerin optik düzenlemesini sağlamak amacıyla farklı nöronal proteinlere uygulanma potansiyeline sahip olmasıdır.Bu prosedüre, hipokampal nöronları 40 µm naylon mesh üzerinden süzdükten sonra 500 µL büyüme medyumunun bulunduğu 24 kuyucuklu bir plaka içerisindeki lameller üzerine ekerek başlayın. Ardından, nöronal kültürü %5 CO2 ve %95 nemlendirilmiş hava içeren bir inkübatörde 35 °C'de 2 ila 3 hafta boyunca inkübe edin. Transfeksiyon günü, çift distile su içerisinde taze 2,5 M kalsiyum klorür çözeltisi hazırlayın ve bunu 0,22 µm'lik bir filtre ile steril filtreleyin.Ardından, pH 7'de taze 2X BBS hazırlayın ve 0,22 mikrometre filtre ile steril filtrelemeden geçirin. Bundan sonra, kültür büyüme ortamını 500 mikrolitre taze, önceden ısıtılmış transfeksiyon ortamı ile değiştirin ve eski büyüme ortamını atmayın. Kalsiyum klorür ve çift distile suyu, tüpü yavaşça çalkalayarak birleştirip transfeksiyon solüsyonunu kültüre eklemeden hemen önce hazırlayın.Tüpü çalkalamaya devam edin ve çözeltinin içine yavaşça DNA ekleyin. Ardından, 2X BBS tamponu damla damla ekleyin. 2X BBS tamponunun hazırlanması, kalsiyum fosfat transfeksiyonunda kritik bir adımdır ve yeni DNA konstrüktleri veya hazırlıkları için 2X BBS tamponunun optimal pH değerini 6,90 ile 7,15 arasında kalibre etmek iyi bir yaklaşımdır.Ardından, nöronal kültürün her bir lamına derhal 30 µL transfeksiyon çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için kültür kabını birkaç kez sallayın ve 35 °C'de 45 dakika ile bir saat arasında inkübe edin. Yaklaşık bir saat sonra, nöronları kaplayan ince bir kalsiyum fosfat çökelek tabakası gözlemlenmelidir.Ardından, transfeksiyon ortamını 500 µL önceden ısıtılmış yıkama tamponu ile değiştirin ve 35 °C'de 15 ila 20 dakika inkübe edin. Yıkama işleminden sonra kalsiyum fosfat çökelekleri kaybolmalıdır. Şimdi, yıkama tamponunu 500 µL taze büyüme ortamı ile değiştirin.Ardından, büyüme ortamını saklanan orijinal ortamla değiştirin. Daha sonra, kültüre 50 µL ılık büyüme ortamı içinde önceden karıştırılmış, doğal olmayan amino asit Cmn ekleyerek 1 mM son konsantrasyon elde edin. Kayıt yapmadan önce, transfekte edilmiş kültürü 35 °C'de 12 ila 48 saat inkübe edin.Bu prosedürde, hücre dışı ve hücre içi solüsyonları hazırlayın. Kurulumumuzda, odak noktasının bir santimetre uzağına 45 derecelik açıyla ışık iletmek için 385 nanometre emisyonlu LED mikroskobun yanına yerleştirilmiştir. Ardından, bir mikro pipet çekici kullanarak cam elektrot ile bazı patch pipetler çekin.Ardından, inkübatörden bir nöron kültür lameli alın ve bunu hücre dışı solüsyon ile bir kez durulayın. Düzenek hücre dışı solüsyon ile doldurulur. Sonrasında, standart patch clamping teknikleri kullanılarak lamel, elektrofizyoloji mikroskop platformuna yerleştirilir.M-citrine floresanları ile transfekte edilmiş bir nöronu patch yöntemiyle yakalayın. Ardından, akım kenetleme (current clamp) yöntemini kullanarak nöronal aktiviteyi kaydedin. Öncelikle, dinlenme potansiyelini yaklaşık negatif 72 millivolt değerine ayarlayın.Ardından, 5 ila 15 Hertz hızında sürekli aksiyon potansiyeli ateşlemesini indüklemek için basamak akımı enjekte edin. Kayıt sırasında nörona tekli LED darbeleri uygulayın ve aksiyon potansiyellerindeki değişimleri izleyin. Daha sonra, aksiyon potansiyellerini geri kazanmak için banyoya 0.5 millimolar baryum klorür ekleyin.Akut beyin kesiti ortamında, neokortikal bölgeden M-cherry GFP floresanına sahip bir nörona patch yapın. Ardından, voltaj ramp yöntemi kullanarak PIRK aktivitesini kaydedin. Özellikle, -100 milivolt değerindeki Kir2.1'e özgü içe doğru akımları izleyin.Ardından, kayıt yaparken nörona tekil LED darbeleri uygulayın ve PIRK proteinlerinin aktive olup olmadığını izleyin. PIRK aktive olduğunda, -100 milivolt'taki içe doğru akımlar önemli ölçüde artacaktır. Son olarak, banyoya 0.5 milimolar baryum klorür ekleyin ve PIRK'nin inaktive olup olmadığını doğrulayın.Burada sağlıklı sıçan hipokampal nöron kültürlerinin örnek resimleri gösterilmiştir. Dolgun hücre gövdeleri ile belirgin dendrit ve aksonlar sergileyen iki sağlıklı nöron görülmektedir. Bunlar, in vitro ortamda sırat hipokampal nöron kültürlerinin, CMN olmadan PIRK ekspresyonu için transfekte edilmiş DIC ve floresan görüntüleridir.Bir milimolar CMN varlığında, transfekte edilen nöronlar tam uzunluktaki PIRK M-citrine proteinlerini eksprese edebilir ve böylece yeşil floresans gösterirler. Burada, eksprese edilen bir PIRK hipokampal nöronun aktivitesini baskılayan tek bir ışık darbesi örneği yer almaktadır. Fare embriyonik kortikal nöronlarına ait bu floresans görüntüleri, CMN'nin in vivo ortamda GFP ve Kir2.1 proteinlerine başarılı bir şekilde dahil edildiğini göstermektedir.Bu grafikte, fare neokortikal nöronlarından kaydedilen akımlarda PIRK'nın ışığa bağımlı aktivasyonu gösterilmiştir. Bu tekniğin etkileri, belirli nöronal proteinlerin işlev bozukluklarından kaynaklanan beyin hastalıklarının tedavisine, örneğin Andersen sendromundaki mutasyona uğramış Kir2.1'e kadar uzanmaktadır; çünkü bu teknik, hangi beyin devrelerinin Kir2.1 eksikliklerinden etkilendiğinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olur. Uzmanlaşıldığında bu teknik, canlı nöronlarda nöronal proteinlerin fonksiyonlarını ışıkla yüksek özgüllükte kontrol etmek için kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen nöronal proteinlerin foto-kontrolünü sağlamak amacıyla nöronlardaki proteinlere doğal olmayan amino asitlerin nasıl dahil edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

optical-control-neuronal-protein-using-genetically-encoded-unnatural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

ChR2 ifade Yetişkin doğmuş nöronlar, koku alma nöral devrelerin işlevini doğru katkıları incelemek amacıyla dilim elektrofizyolojik hazırlıkları manipüle edilebilir.

Nöronlar Foto-Stimülasyon için uygun fiyatlı LED Diziler

Çok kuyulu bir plakada, ribonükleik asit anti-terminatörünün veya RAT dizisinin akış aşağısında bir floresan raportör geni taşıyan bir plazmit ile dönüştürülmüş bir Corynebacterium glutamicum kültürü alın.Transkripsiyon sırasında, RAT-RNA, RNA polimerazı bloke eden ve raportör gen ekspresyonunu durduran bir kök ilmek yapısı oluşturur.Plazmit ayrıca, RAT-RNA bağlayıcı protein, LicT ve mavi ışığa duyarlı VVD alanını içeren bir füzyon proteini olan LicV'yi yapısal olarak eksprese eder.Karanlıkta,...

Corynebacterium glutamicum'da Gen Ekspresyonunun Optogenetik Kontrolü

Genetik ve optik birleştirmek nörobilim araçlarının son gelişmeler, mekansal ve zamansal çözünürlük görülmemiş bir düzeye ile nöral devre faaliyet üzerinde kontrol sağlayan, "optogenetics" olarak adlandırılır. Burada prefrontal korteks ve subicular piramidal nöronların genetik tanımlanmış alt kümelerinin optogenetic manipülasyon ile vivo kayıtta entegre etmek için bir protokol sağlar.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Bu iletişim kuralı, yapay mikroRNA aracılı RNA müdahale optogenetics özellikle presynaptic boutons selektif gene(s) sağlam nöronal devreler içinde azaltılmış ifade ile uyarmak için birleştirmek bir iş akışı sağlar.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

Belirli nöronal popülasyonların veya beyin bölgelerinin optogenetik manipülasyonu ile, davranış serbestçe hareket eden hayvanlarda yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile değiştirilebilir. Kronik implante optik lifler ile birlikte farklı optogenetik araçlar kullanılarak, nöronal modülasyonlar ve davranışsal testler çeşitli yapılabilir.

SerbestÇe Hareket Eden Farelerde Davranışı Modüle Etmek Için Nöronal Aktivitenin Optogenetik Manipülasyonu

Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Bu protokol, protein aktivitesinin tersinir uzay-zamansal kontrolü için tasarlanmış bir mavi ışıkla aktive edilen allosterik anahtar (LightR) alanının uygulamasını açıklar. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanan bu çalışma, ışık regüle edilmiş Src'yi (LightR-Src) geliştirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yaklaşımın enzim sınıfları arasında çok yönlülüğünü göstermektedir.

Optogenetik Allosterik Regülasyon Yoluyla Protein Aktivitesinin Uzay-Zamansal Kontrolü

Keşfedin, genetik olarak kodlanmış yapay amino asit kullanarak nöronal proteinlerin optik kontrolü için geliştirilen bu yöntemi. Hipokampal nöronlarda uygulanan bu teknik, beyin fonksiyonlarındaki protein rollerini yüksek çözünürlükle incelemeyi sağlar.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Daha fazla video keşfet