Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Bu prosedürün genel amacı, nöronlarda genetik olarak kodlanmış, doğal olmayan bir amino asit kullanarak bir nöronal proteinin işlevini optik olarak kontrol etmektir. Bu yöntem, belirli bir nöronal proteinin uzamsal zamansal çözünürlükle beyin fonksiyonundaki nöronal sinyalleşmeye katkısı hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çeşitli nöronal süreçlerin optik regülasyonunu sağlamak için çeşitli nöronal proteinlere uygulanma potansiyeline sahip olmasıdır.

Bu prosedüre, 40 mikrometrelik bir naylon ağdan süzüldükten sonra, 500 mikrolitre büyüme ortamı içeren 24 oyuklu bir plakada hipokampal nöronları kapak fişlerine kaplayarak başlayın. Bundan sonra, nöronal kültürü 35 derece Celcius'ta yüzde beş karbondioksit, yüzde 95 hava ile nemlendirilmiş inkübatörde 2 ila 3 hafta boyunca inkübe edin. Transfeksiyon gününde, çift damıtılmış suda taze 2,5 molar kalsiyum klorür çözeltisi hazırlayın ve 0,22 mikrometrelik bir filtre ile steril olarak filtreleyin.

Ardından, pH 7'de taze 2X BBS yapın ve 0,22 mikrometrelik bir filtre ile steril olarak filtreleyin. Bundan sonra, kültür büyüme ortamını 500 mikrolitre taze, önceden ısıtılmış transfeksiyon ortamı ile değiştirin ve eski büyüme ortamını atmayın. Tüpü yavaşça çalkalarken, kalsiyum klorür ve çift damıtılmış suyu birleştirerek kültüre eklemeden hemen önce transfeksiyon çözeltisini hazırlayın.

Tüpü çalkalamaya devam edin ve yavaşça çözeltiye DNA ekleyin. Ardından, damla damla 2X BBS arabelleği ekleyin. 2X BBS tamponunun hazırlanması, kalsiyum fosfat transfeksiyonunda kritik bir adımdır ve yeni DNA yapıları veya hazırlıkları için 2X BBS tamponu için optimum pH'ı 6.90 ila 7.15 arasında kalibre etmek iyi bir fikirdir.

Ardından, nöronal kültürün her bir kapak kaymasına hemen 30 mikrolitre transfeksiyon solüsyonu ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için kültür kabını birkaç kez sallayın ve 35 derece Cantius'ta 45 dakika ila bir saat arasında inkübe edin. Yaklaşık bir saat sonra, nöronları kaplayan bir ince kalsiyum fosfat çökeltisi tabakası gözlenmelidir.

Ardından, transfekte edici ortamı 500 mikrolitre önceden ısıtılmış yıkama tamponu ile değiştirin ve 35 derece Cantius'ta 15 ila 20 dakika inkübe edin. Kalsiyum fosfat çökeltileri yıkamadan sonra kaybolmalıdır. Şimdi, yıkama tamponunu 500 mikrolitre taze büyütme ortamı ile değiştirin.

Daha sonra, büyüme ortamını kaydedilen orijinal ortamla değiştirin. Daha sonra, kültüre 50 mikrolitre ılık büyüme ortamında önceden karıştırılmış, doğal olmayan amino asit Cmn ekleyin, bu da bir milimolar nihai konsantrasyon ile sonuçlanır. Kopyalanan kültürü kayıttan önce 12 ila 48 saat boyunca 35 derece Cantius'ta inkübe edin.

Bu prosedürde, hücre dışı ve hücre içi çözeltileri hazırlayın. Kurulumumuzda, 385 nanometre emisyonlu LED, ışığı odak noktasından bir santimetre uzağa 45 derecelik bir açıyla iletmek için mikroskobun yanına yerleştirilmiştir. Ardından, bir mikro pipet çektirme kullanarak bir cam elektrotlu bazı yama pipetlerini çekin.

Daha sonra, inkübatörden bir nöron kültürü lamel alın ve hücre dışı solüsyonda bir kez durulayın. Teçhizatı hücre dışı çözelti ile doldurun. Daha sonra, standart yama sıkıştırma tekniklerini kullanarak lamel elektrofizyoloji mikroskobu platformuna yerleştirin.

M-sitrin floresanları ile transfekte edilmiş bir nöronu yamalayın. Ardından, mevcut kelepçe yöntemini kullanarak nöronal aktiviteyi kaydedin. İlk olarak, dinlenme potansiyelini yaklaşık eksi 72 milivolta ayarlayın.

Ardından, beş ila 15 Hertz'de aksiyon potansiyellerinin sürekli ateşlenmesini sağlamak için bir adım akımı enjekte edin. Kayıt sırasında, nörona tek LED darbeleri iletin ve aksiyon potansiyellerindeki değişiklikleri izleyin. Ardından, aksiyon potansiyellerini geri kazanmak için banyoya 0,5 milimolar baryum klorür ekleyin.

Akut beyin dilimi ayarında, neokortikal bölgeden M-kiraz GFP floresanları ile bir nöron yamalayın. Ardından, voltaj rampası yöntemini kullanarak PIRK etkinliğini kaydedin. Spesifik olarak, Kir2.1'e özgü iç akımları negatif 100 milivoltta izleyin.

Ardından, kayıt sırasında nörona tek LED darbeleri verin ve PIRK proteinlerinin aktive olup olmadığını izleyin. PIRK etkinleştirildiğinde, negatif 100 milivolttaki iç akımlar önemli ölçüde artacaktır. Sonunda, banyoya 0,5 milimolar baryum klorür ekleyin ve PIRK'nın etkisiz hale getirilip getirilmediğini doğrulayın.

Burada sağlıklı sıçan hipokampal nöronal kültürlerinin örnek resimleri gösterilmektedir. Ve dolgun hücre gövdeleri ve belirgin dendritler ve aksonlar sergileyen iki sağlıklı nöron. Bunlar, in vitro olarak sıçan hipokampal nöron kültürlerinin DIC ve floresan görüntüleridir ve CMN olmadan PIRK ekspresyonu için transfekte edilmiştir.

Bir milimolar CMN varlığında, transfekte nöronlar tam uzunlukta PIRK M-sitrin proteinlerini eksprese edebilir, böylece yeşil floresan gösterir. Ve burada, PIRK tarafından ifade edilen bir hipokampal nöronun aktivitesini baskılayan tek bir ışık darbesi örneği verilmiştir. Fare embriyonik kortikal nöronlarının bu dalgalanma görüntüleri, CMN'nin in vivo olarak GFP ve Kir2.1 proteinlerine başarılı bir şekilde dahil edildiğini göstermektedir.

Bu grafikte, PIRK'nın ışığa bağlı aktivasyonu, fare neokortikal nöronlarından kaydedilen akımlarda gösterilir. Bu tekniğin sonuçları, örneğin Andersens sendromunda mutasyona uğramış Kir2.1 gibi spesifik nöronal proteinlerin arızalanmasından kaynaklanan beyin hastalıklarının tedavisine kadar uzanır, çünkü bu teknik, hangi beyin devresinin Kir2.1 eksikliklerinden etkilendiğini ortaya çıkarmaya yardımcı olur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, canlı nöronlarda yüksek özgüllükte ışıkla nöronal proteinlerin işlevini kontrol etmek için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen nöronal proteinler üzerinde fotoğraf kontrolü sağlamak için doğal olmayan amino asitlerin nöronlardaki proteinlere nasıl dahil edileceğini iyi anlamış olmalısınız.