Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Bu deneylerin genel amacı, antimikrobiyal aktivite için enzimleri hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmektir. Mikroslayt difüzyonu ve boya salınım testi, ilgilenilen patojenik bir bakteri gibi spesifik hedeflere karşı litik aktiviteye sahip yeni antimikrobiyallerin fonksiyonel keşfi için faydalıdır. Bu tekniklerin temel avantajları, uygulanmasının basit olması, deneysel parametrelerin varyasyonu için esneklik sağlaması ve çoğu mikrobiyoloji laboratuvarında yaygın olarak bulunan laboratuvar ekipmanlarıyla gerçekleştirilebilmesidir.

Mikroslayt difüzyon testine başlamadan önce, değerlendirilecek antimikrobiyal enzimin konsantrasyonu, üreticinin protokolüne göre bir BCA protein test kiti kullanılarak belirlenmelidir. Reaksiyon tamponu olarak PBS kullanarak antimikrobiyal enzimin seri seyreltmesini gerçekleştirin. Proteini ayrı mikrofüj tüplerine dağıtın ve PBS kullanarak hacimleri 20 mililitreye ayarlayın.

Daha sonra, 0.25 gram agarozu 50 mililitre PBS içinde çözerek% 0.5'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Agaroz tamamen eriyene kadar bu çözeltiyi kaynatın. Erime işlemi sırasında kaybedilen suyu ağırlıkça belirleyin ve çözeltiye geri ekleyin.

Testin inkübasyonu sırasında kirletici bakteri üremesini engellemek için, agaroz çözeltisine suya 15 mikrolitre% 10 sodyum azid ekleyin ve çözeltinin sıcaklığını bir su banyosunda 50 santigrat dereceye ayarlayın. Substrat olarak canlı hücreler kullanılıyorsa, agaroz çözeltisinden sodyum azidi atlayın. Isıyla öldürülen bakteri substratını buz üzerinde çözün.

Bakteriyel substratı, 2.0 McFarland eşdeğerlik bulanıklık standardının bulanıklığına yaklaşık olarak uyacak şekilde 12 mililitre agaroz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Çözeltiler boyunca beyaz bir arka plan üzerinde siyah bir çizgi görselleştirerek, yaklaşık bulanıklık elde edilene kadar agaroza bakteri substratı ekleyerek çözeltilerin bulanıklıklarını karşılaştırın. Hemen ama dikkatli bir şekilde, her bir mikro slayta üç mililitre agaroz substrat solüsyonu pipetleyin ve solüsyonun mikroslayttan taşmadığından emin olun.

Slaytlar katılaştıktan sonra, her bir mikro lamın agaroz substrat tabakasında üç kuyu açmak için 4.8 milimetre çapında bir mantar delici kullanın. İlgili kuyucuklara her ayarlanmış protein seri seyreltmesinden 20 mikrolitre ekleyin. Negatif kontrol kuyusunda sığır serum albümini kullanın.

Pozitif bir kontrol olarak, lizozim gibi substrat için uygun bilinen bakteriyolitik enzimleri kullanın. Slaytları 37 santigrat derecede veya enzimin optimal aktivite sıcaklığında bir nem odasında inkübe edin. İnkübasyon uzunluğu, antimikrobiyal enzimin konsantrasyonuna ve spesifik aktivitesine bağlıdır.

Tipik bir reaksiyon süresi yaklaşık 16 saattir. İnkübasyon tamamlandığında, dolaylı ışık altında slaytları gözlemleyin ve gelişmekte olan tahlilin görüntülerini yakalayın. Yaklaşık 30 santimetre odak mesafesinde 60 milimetre lensli dijital tek lensli refleks kamera kullanın.

Bir sonraki segmentte gösterilecek olan boya salım testinde, substrat Remazol Brilliant Blue R boyası veya RBB ile kovalent olarak bağlanır. Bu protokole 200 miliMolar RBB çözeltisi yaparak başlayın. 1.25 gram RBB'yi taze hazırlanmış bir sodyum hidroksit çözeltisi içinde çözün.

Daha sonra, ısıyla öldürülen bakteri hücrelerini, 30 mililitre RBB çözeltisi içinde 0.5 gram ıslak ağırlık konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Saflaştırılmış peptidoglikan için, peptidoglikanı 30 mililitre RBB çözeltisinde 0.3 gram ıslak ağırlık konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Sonraki adımlar aynı olduğundan, kullanılan substrattan bağımsız olarak, etiketleme yalnızca bakteri hücreleri için gösterilecektir.

Reaksiyon karışımını, hafifçe karıştırarak 37 santigrat derecede altı saat boyunca dönen bir platformda inkübe edin. Altı saat sonra, reaksiyon karışımını dört santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın ve hafifçe karıştırarak 12 saat daha inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, boyalı substratı 30 dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.

Boya çözeltisini substrat peletinden boşaltın. Peletleri Tip I suda iyice tekrar süspanse edin ve ardından santrifüjleyin. Kovalent bağlı olmayan çözünür boyayı substratlardan çıkarmak için boya etiketli hücreleri bu şekilde üç ila beş kez sulayın.

Son yıkamalar için, boya salım tahlilinde kullanılacak olan pelet kısmını 1,5 mililitrelik mikrofüj tüplerine aktarın. Alt tabaka mavi kalırken son yıkamanın süpernatantı berrak olmalıdır. Boyalı alt tabakayı, kullanıma hazır olana kadar minimum miktarda suda 20 santigrat derecede asılı olarak saklayın.

Boya salım testine hazırlanmak için, donmuş boyalı substratın oda sıcaklığına dönmesine izin verin ve enzim için ampirik olarak belirlenen test tamponu ile iki kez yıkayın. Bu durumda PBS kullanılır. 200 mikrolitrelik reaksiyon hacmini, gerçekleştirilecek boya salma testlerinin sayısı ile çarparak ihtiyaç duyulan substrat süspansiyonunun hacmini hesaplayın.

Alt tabaka süspansiyonunu hazırlamak için, önce boyalı alt tabakayı uygun PBS hacmine ekleyin. Bire bir seyreltme yapın ve PBS'yi boş olarak kullanarak 595 nanometrede optik yoğunluğun ilk ölçümünü yapın. 595 nanometrede 2.0'lık bir optik yoğunluk elde edilene kadar boyalı alt tabakanın artımlı miktarlarını süspansiyona ekleyin.

Bu demonstrasyonda, bir protein antimikrobiyal için en uygun inkübasyon koşullarını belirlemek için boya salım testi kullanılacaktır. İlk olarak, protokol metninde açıklandığı gibi PBS kullanarak konsantrasyonu mililitre başına bir miligrama ayarlayarak bir stok protein antimikrobiyal süspansiyonu hazırlayın. Daha sonra stok protein antimikrobiyal süspansiyonunu mikrolitre başına 100 nanogram konsantrasyona seyreltin.

Bu konsantrasyon, tahlil reaksiyonuna eklenen hacim başına bir mikrogram proteinin nihai reaksiyon kütlesini verir. Değerlendirilecek termal aralık için reaksiyon testlerini 0.5 mililitrelik mikrofüj tüplerinde gerçekleştirin. Her termal koşul için, 200 mikrolitre hazırlanmış substrat süspansiyonuna 10 mikrolitre stok protein ekleyin.

Saatte bir kez ters çevirerek karıştırarak sekiz saat boyunca bir termal döngüleyicide inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir mikrofüj tüpüne 25 mikrolitre etanol ekleyerek reaksiyonları durdurun. Sindirilmemiş çözünmeyen substratı çıkarmak için, iki dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyin.

Bundan sonra, sindirilmemiş substratın peletini bozmamaya dikkat ederken, her reaksiyon karışımı için 150 mikrolitre reaksiyon süpernatantını 96 oyuklu düz tabanlı bir mikroplakaya aktarın. Enzimatik aktiviteyi ölçmek için, süpernatantın absorpsiyonunu 595 nanometrede ölçmek için bir mikroplaka spektrofotometresi kullanın. Etiketli substrattan süpernatan salınan çözünür boya tarafından artan absorbans, enzimatik aktivitenin kantitatif bir ölçümüdür.

Mikroslayt difüzyon testi, ısıyla öldürülmüş Salmonella enterica tam hücre substratına karşı bilinmeyen bir protein antimikrobiyalin aktivitesini kalitatif olarak değerlendirmek için kullanıldı. Antimikrobiyal, A'dan F'ye kadar olan kuyulardan artan miktarlarda eklendi ve negatif kontroller için PBS kullanıldı. Altı saat sonra, her bir kuyu etrafında oluşan berrak hidroliz bölgesinin boyutu gözlendi.

Yüksek enzimatik aktivite niteliksel olarak daha büyük bir bölge ile ilgilidir, düşük enzimatik aktivite ise niteliksel olarak daha küçük bir bölge ile ilgilidir. Kantitatif boya salım testi, bir protein antimikrobiyal için optimal reaksiyon sıcaklığını belirlemek için kullanıldı. Reaksiyon süpernatantlarındaki mavi renk miktarlarından ve 595 nanometredeki absorbans ölçümlerinden elde edilen aktivite birimlerinden görüldüğü gibi, 35 santigrat derece optimum sıcaklıktır.

Boya salım testi, Bacillus subtilis ısıyla öldürülen substrata karşı bilinmeyen bir protein antimikrobiyalin aktivite aralığını belirlemek için de kullanıldı. Alfa-kimotripsinin aktivite aralığı ile yapılan bir karşılaştırma, bilinmeyen antimikrobiyal enzimin substrat için neredeyse iki kat daha fazla afiniteye sahip olduğunu ortaya koydu. Ek olarak, alfa-kimotripsinin aktivitesi 0.3 mikrogram civarında plato yapmaya başlarken, bilinmeyen enzimin aktivitesi tüm enzim miktarlarında artmaya devam etti.

Bir kez ustalaştıktan sonra, mikroslayt difüzyon testi 30 dakika içinde tamamlanabilir. Boya salınım testi bir saat içinde tamamlanabilir. Her tahlil için kuluçka süreleri, enzim aktivitesine ve konsantrasyonlarına bağlı olacaktır.

Bu prosedürleri genişleterek, boya salma yöntemi, reaksiyonun tampon pH'ı ve tuzluluk gibi yönlerini manipüle ederek antimikrobiyal enzimin enzimatik aktivitesini etkileyen kimyasal etkileri belirlemek için modifiye edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, mikroslayt difüzyon ve boya salım deneylerini kullanarak antimikrobiyal aktivite için enzimlerin nasıl hızlı bir şekilde taranacağını ve karakterize edileceğini iyi anlamış olmalısınız.