Name: Farklılaşma ve Apoptoz Homeostazis sayesinde Yetişkin Organizmalar içinde Adiposit Numaraları Yönetmeliği Mekanizması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Öğrenin, fare modellerinde hipoksi ve adiposit apoptoz mekanizmalarını incelemek için histolojik analiz ve immünohistokimya yöntemlerini kullanarak metabolik hastalıklara yönelik yeni tedavi stratejileri geliştirmeyi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarların gibi yazının redaksiyon için veri ve Dr. B. Grötsch hazırlamak için Dr. J. Luther ve K. Ubieta teşekkür ederim. Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).</li>
<li>Gong, Z., Muzumdar, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+function%2C+type+2+diabetes%2C+and+metabolism+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging.</a> Int J Endocrinol. , 320482(2012).</li>
<li>Deng, Y., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines+as+novel+biomarkers+and+regulators+of+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome.</a> Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).</li>
<li>Rezaee, F., Dashty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adipose+Tissue+in+Metabolic+System+Disorders+Adipose+Tissue+is+the+Initiator+of+Metabolic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases.</a> J Diabetes Metab. , 008(2013).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+fat+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of fat expansion.</a> J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).</li>
<li>Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+adipocyte+differentiation+in+different+fat+depots%3B+implications+for+pathophysiology+or+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1(2015).</li>
<li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+adipocyte+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metab. 4, 263-273 (2006).</li>
<li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Fra-1+expression+causes+severe+lipodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy.</a> J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).</li>
<li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fra-2%2FAP-1+controls+adipocyte+differentiation+and+survival+by+regulating+PPARgamma+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia.</a> Cell Death Differ. , (2014).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+O2+homeostasis+by+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).</li>
<li>Kim, W., Kaelin, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+protein%3A+new+insights+into+oxygen+sensing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).</li>
<li>Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensors+at+the+crossroad+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensors at the crossroad of metabolism.</a> Cell Metab. 9, 11-22 (2009).</li>
<li>Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+ameliorates+adipose+tissue+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction.</a> Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).</li>
<li>Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipogenesis+and+lipolysis+in+the+mouse+upon+selective+ablation+of+the+retinoid+X+receptor+alpha+mediated+by+a+tamoxifen-inducible+chimeric+Cre+recombinase+%28Cre-ERT2%29+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).</li>
<li>Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+hormones+determine+sensitivity+to+central+leptin+and+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin.</a> Diabetes. 55, 978-987 (2006).</li>
<li>Haluzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+%28C57BL%2F6J+versus+FVB%2FN%29+strongly+influences+the+severity+of+diabetes+and+insulin+resistance+in+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Planat-Benard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+human+adipose+lineage+cells+toward+endothelial+cells%3A+physiological+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives.</a> Circulation. 109, 656-663 (2004).</li>
<li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoNEET-driven+alterations+in+adipocyte+mitochondrial+activity+reveal+a+crucial+adaptive+process+that+preserves+insulin+sensitivity+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity.</a> Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).</li>
<li>Trajcevski, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+lipid+oxidation+and+maintenance+of+muscle+insulin+sensitivity+despite+glucose+intolerance+in+a+diet-induced+obesity+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model.</a> PLoS One. 8, 71747(2013).</li>
<li>Montgomery, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain-dependent+variation+in+obesity+and+glucose+homeostasis+in+response+to+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding.</a> Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).</li>
<li>de Queiroz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+driving+retroperitoneal+adipocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+response+to+a+high-sugar+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet.</a> Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+adipose+tissue+hypoxia+in+obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance.</a> Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+corticotropin-releasing+hormone+receptor+2+signalling+pathway+partly+mediates+hypoxia-induced+increases+in+lipolysis+via+the+cAMP-protein+kinase+A+signalling+pathway+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue.</a> Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).</li>
<li>Bozec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+size+is+controlled+by+Fra-2+through+LIF%2FLIF-receptor+signalling+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia.</a> Nature. 454, 221-225 (2008).</li>
<li>Varia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimonidazole%3A+a+novel+hypoxia+marker+for+complementary+study+of+tumor+hypoxia+and+cell+proliferation+in+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma.</a> Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).</li>
<li>Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D1+protein+coordinates+dynamic+assembly+of+HIF-1alpha-PHD-VHL+to+regulate+HIF-1alpha+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability.</a> Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).</li>
<li>Tennant, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivating+HIF+prolyl+hydroxylases+under+hypoxia+results+in+metabolic+catastrophe+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death.</a> Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).</li>
<li>Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1alpha+Upregulation+due+to+Depletion+of+the+Free+Ubiquitin+Pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+medical+science%22%5BJournal%5D)">HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool.</a> Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).</li>
<li>Amelio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+opposes+tumor+angiogenesis+by+promoting+hypoxia-inducible+factor+1alpha+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).</li>
<li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+remodeling+under+ischemia%3A+death+of+adipocytes+and+activation+of+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells.</a> Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> J Diabetes Res. 2015, 970375(2015).</li>
<li>Keuper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inflammatory+micro-environment+promotes+human+adipocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis.</a> Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).</li>
<li>Sera, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+origin+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+hematology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell origin of adipocytes.</a> Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
<li>Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+from+lipid+storage+compartment+to+endocrine+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ.</a> Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Adipositler nedeniyle aşırı enerji depolama tarafından uyarılan adiposit hiperplazisi ve hipertrofisi, ifşa, büyüklüğü, sayısı ve alanı ile fenotipik karakterize aşırı beslenme 5. Yağ asidi düzensizliklerine ve sonraki metabolik sendromların neden bu olaylar aynı zamanda &quot;sağlıklı&quot; yağ genleşme olarak adlandırılır korunmuş metabolizması ile artmış yağ kitlesinin devletler vardır. Örneğin, Kusminski ve ark., 21 büyük yağ genişleme ile fareler bu yağ genleşme mutlaka metabolik sendromlar bağlantılı ve adipositlerin özelliklerini değerlendirmek için dikkatli bir şekilde kararlı olması gerekir değil düşündüren, metabolik sağlıklı kalmasını gösterdi. adipoz dokusu (AT), vücut metabolizmasının düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. AT dislipidemi, ateroskleroz, hiperinsülinemi ve hiperglisemi 3 etkileyebilecek en büyük endokrin organdır. homeostasis ve moleküler m AT değerlendirilmesiBunu düzenleyen echanisms metabolik sistemi bozuklukları daha iyi anlaşılmasını izin verebilir. Bu nedenle, adiposit farklılaşması düzenleyen mekanizmaların açıklığa kavuşturulması, adiposit büyüklüğü ve yağ yastığı kütlesi obezite bozuklukları için yeni tedavi tedavi geliştirmek için yardımcı olacaktır. In vivo ve in vitro yöntemler kullanarak, adiposit farklılaşması ve aktivitesi Gıda ve gen ekspresyonu etkilerin rolünü tespit etmek mümkündür. Bizim protokol glukoz ve insülin metabolik yanıtı 22-24 analiz kadar önemlidir tarafından önerilen adiposit farklılaşması, çoğalması ve apoptoz arasındaki dengeyi belirleyen, AT homeostazı belirlemek. İfade profil birincil adipositlerdeki adipogenesis, lipojenez, lipoliz, yağ asidi alımı, hipoksi, apoptoz ve çoğalması yer alan genlerin analizleri ve visseral AT adiposit homeostazında ve bunların olası işlev bozukluğu üzerine genel bir bakış elde etmek için yüksek verimli bir yöntemdir.Ilginç adaylardır western blot veya immünohistolojik boyama ile protein seviyesinde analiz edilmelidir. Simetrik olmayan siyanin boyalar kullanarak gerçek zamanlı PCR sistemi ile optimum sonuçlar elde etmek için, 1&#39;den 10 ng arasında değişen cDNA konsantrasyonları ve 50 900 nM arasında değişen optimum astar konsantrasyonları spesifik olmayan amplifikasyon en aza indirmek için test edilmelidir. kritik bileşenleri primerler şunlardır; Her bir çalışma için, erime eğrileri katı özgüllük sağlamak ve primer dimerlerin oluşumunu hariç tutmak için kontrol edilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, bunun yerine cDNA&#39;nın H2O ile bir negatif kontrol kullanımı tavsiye edilmektedir. Ayrıca, ticari olarak temin edilebilen simetrik olmayan siyanin boyalar (örneğin, ROX) pasif bir referans boya içeren bir iç referans bir sinyal sağlamak için ana karışımı olarak temin edilmiştir. cDNA sinyali hali-kuyu sinyal dalgalanmaları düzeltmek için ROX sinyallerine veri analizi sırasında normalize edilir. Başka bir nokta, bir goo kurmak için dikkate alınması gerekend qPCR sistemi temizlik geninin seçimdir. Her durum için, birden fazla temizlik genler kullanılır, örneğin, HPRT β-aktin, GAPDH, β-2-Mg veya HSP90. Hipoksik koşullar ile stabilize HIF proteinler ana sadece adipositler yaşamda kalmasını saptamak düzenleyiciler, aynı zamanda, örneğin glukoz, insülin tolerans ve lipid metabolizması 11,25,26 gibi metabolik değişiklikler vardır. yağ yastığı hipoksik alanlarını tespit etmek için, HIF-1α immünohistokimyasal olarak bölümlerde AT belirlenir. HIF proteinleri hızlı bir şekilde normoksik koşullar altında 5 ila 10 dakika içinde bozulmuş olması nedeniyle, prosedür ve histolojik analiz için yağ yastığı sabitleme sıkı geçen süre önlemek için kontrol edilmelidir. Bu nedenle, sadece HIF boyamasıyla hipoksi sağlamak için, pimonidazol AT hipoksik alanlarının belirlenmesi için kullanılır. Zaten kemik 27&#39;de görüldüğü gibi pimonidazol, dokulara dağıtmak mümkünVe etkin bir şekilde daha da spesifik antikor 28 bağlanarak histolojik bölümlerde tespit edilir, özellikle hipoksik hücrelerde tiol içeren proteinlere bağlanarak hipoksik alanları işaretleyin. Bununla birlikte, diğer belirteçler ve yöntemler hipoksi yol analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, hidroksillenmiş prolinlerin tanır ve proteozomal HIF aracılık etmek için poli-dağılmasını teşvik normoksi altında prolin artıkları hidroksilasyonunu neden prolil hidroksilaz (PHD) enzim, yanı sıra, von Hippel-Lindau (VHL) protein, katılımı bozulma, yolu 29,30 tam bir bakış açısından analiz edilmesi gerekir. Ayrıca, HIFs her yerde tespiti de 31,32 değiştirebilir olabilir protein istikrar ve parçalanmasını belirleyecek. Ayrıca, TÜNEL lekelemesi ile Ki67 çoğalmayı ve apoptozis histolojik kesitlerin boyamasıyla in vivo olarak belirlenir. Ki67 ve a ile proliferasyon miktarının belirlenmesiAkışkan sitometri analizi ile TÜNEL ya Annexin V boyama ile poptosis da 33 üzerinden gerçekleştirilir. Proliferasyon elbette bu Ki67 pozitif hücrelerin ölçümüyle bahsedilmeyen adiposit hücre döngüsü, analizi gibi teknikler ile ölçülebilir. FACS apoptosis hücre ölümü süreci karşı nekroz düzeylerini belirleyecek Annexin V ve TOP-PR-3 analizleri ile Dahası, TUNEL tarafından apoptoz çalışması tamamlanabilir. Apoptoz AT homeostazı için önemli olan hücre ölümü programının için temel süreçtir. Nitekim, adiposit apoptoz düzensizliği obeziteye katkıda süreçlerde daha önce karıştığı ve 34 Lipodistrofi edilmiştir. Ayrıca, 2011 yılında, Keuper ve ark. Adiposit apoptozis yağ dokusu iltihabı bağlı. Makrofajlar da makrofajlar çekmek preadipositlerin ve adipositler, apoptoza neden olduğunu göstermiştir. makrofaj işe iltihabı, hangi Contr hızlandırırglikoz ve insülin toleransı 35 gibi metabolik sendromlar ibutes. Ancak, adiposit apoptoz kötü okudu fenomen kaynaklı adiposit apoptoz kilo azalmasına neden olabilir hipotezi rağmen, halen devam etmektedir. Mevcut protokol, in vivo çoğalması, apoptoz ve hipoksi gibi farklı fenomen incelemek için immünohistokimyasal yaklaşımlar kullanır. Bu nedenle, doku kritik bir adımdır% 4 formaldehit ile tespit edildi. Genişletilmiş bir doku tespit süresi antikor olmayan erişilebilir hale epitoplara, değişmesine yol açar. Bunun aksine, kısa bir sabitleme süresi reaktiflere epitop duyarlılığını arttırır. tespitin tavsiye en uygun zaman 24 saattir. Ayrıca, bölümlerin kalınlığının ayrıca epitoplara bağlanan antikorlar etkiler; Optimal kalınlığı 2 um ile 5 arasında bir. 5 um daha kalın kesitler artan bağlama sitelere yalancı pozitif sonuç verecektir. Bunun aksine, sections ince 2&#39;den mikron daha az bağlayıcı siteleri içeren ve olumlu alanlarda iyi tanımlanmış değildir. Bundan başka kritik faktörler epitoplara spesifik bağlanma kalitesini etkileyen antikorun kendisi, kuluçkalama süresi, konsantrasyon ve eşit bir ısı vardır. Bu nedenle, bir antikor konsantrasyon ve inkübasyon zamanı doğrulamak her durum için gereklidir. Etüdün tamamlanması için, farklı tedaviler, uyarılması ya da ko-kültürler ile uzatılabilir bir in vitro adiposit farklılaşma protokolünü sağlar. Nitro adiposit kültürlerinde kullanılarak, adiposit farklılaşması ve işlevleri kusurları tespit etmek mümkündür. tüm primer hücreler için olduğu gibi, ADSCs ve adipositlerin sağlıklı davranış ve görünüm oldukça önemlidir, güvenilir sonuçlar elde etmek. ayrıntı, sitoplazmik vakuolleşmeye ve / veya dekolmanı birincil yetersiz orta, mikrobiyal kontaminasyonu veya yaşlanmayı gösteren bozulma belirtileri vardırHücreler. Diğer protokoller 36 tarafından tarif edildiği gibi, kemik iliğinden izole mezenkimal kök hücre kullanmak da mümkündür, oysa bu protokol, yağ yastığı dokusundan izole adipositlerin kullanıyor. En son adiposit farklılaşması çok erken aşamada ortaya çıkan ek farklılaşma sorunları yansıtıyor olabilir stromal progenitör hücreler içerir, bu mevcut protokolde cevapsız olabilir. Ayrıca, ADSCs hızla (bir hafta içinde 10 kereden daha fazla) genişletilebilir ve bazı pasajlar sonra uzun süreli kültür ADSCs hala mezenkimal pluripotensini 37,38 saklayın. ADSCs kullanmanın bir diğer avantajı ADSCs basit ve minimal invaziv bir yöntemdir liposuction ile hastalardan hasat edilebilir çünkü kolayca, insana geçiş olabilir. AT endokrin şekilde birkaç diğer organları etkiler gibi protokol adipokinlerin şekilde genişletilmelidir. leptin, adiponektin, tümör nekroz faktör-α (TNF) a olarak Adipokinler,adipositler tarafından salgılanan nd resistin yağ metabolizması, enerji homeostazisini ve insülin duyarlılığını 39 kontrol ederek metabolik hastalıkların etkilediği bilinmektedir. Bu nedenle, serum ve adiposit secretome analizleri yapılmalıdır. IL-6 gibi, AT fonksiyon bozukluğu, adipokinlerin ve pro-inflamatuar sitokinlerin, durumunda, örneğin karaciğer ve pankreas ve kas fonksiyonunun 4 gibi organların bozulması neden olur. sistemik organ işlev bozukluğu bertaraf etmek için, hayvan modelleri ya da hücre kültürleri uyarılması ve alımını glikoza tepki açısından test edilebilir. Burada AT ve in vivo adipositlerin temel durumunu analiz etmek için bir protokol sağlar ve in vitro adiposit homeostazı ve işlevsellik moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak için.

Dünya Sağlık Örgütü 2014 raporuna göre, dünyanın yetişkin nüfusunun% 39 aşırı kilolu ve% 13 1 obez olduğunu. Yakın gelecekte, kilolu insanların yaşlı nüfusun önemli bir bölümünü oluşturacaktır. Obezite ve yaşlanma önemli bir özellik morbidite ve mortalite 2 ile ilgili olarak yağ düzensizliği olduğunu. Adipokinler, adipoz dokuda (AT) tarafından salgılanan proteinler, obezite gibi metabolik sendromlar tetikleyebilir ve 2 diyabetin 3 yazabilirsiniz. Metabolik hastalıklar çoğunlukla genişleme 4 AT sonuçlanır adipositlerin lipid damlacıkları aşırı enerji depolama, kaynaklanır. Bu nedenle kontrol etmek fırsatları bulmak için nedenleri ve AT genişleme moleküler mekanizmaları belirlemek için ilgi çekicidir. Aşırı beslenme iki olay tarafından düzenlenir AT genişleme yol açar: aşırı enerji depolama adipositlerin lipid damlacıkları halinde, bir süreçAyrıca, adiposit hiperplazisi 5 olarak bilinen (adiposit boyutunda bir artış) ve artan adipogenesis, hipertrofiye neden olur. Adipogenesis adipositlere multipotent mezenkimal kök hücreler (MSC), farklılaşma, bir işlemdir. Birincisi, MKH taahhüt aşamasında preadipositlerden dönüşür. İkincisi, Preadipositler daha olgun ve işlevsel adipositlerin 6 özelliklerini elde etmek için ayırt. Çeşitli transkripsiyon faktörleri, örneğin çinko parmak protein 423 (Zfp423) ve erken B hücre faktör 1 (Ebf1) halinde preadiposit tespiti için ana düzenleyici olarak tanımlanmıştır. Zfp423 erken bağlılık indükler ise, Ebf1 adiposit progenitörlerin 6 üretimi için gereklidir. Terminal farklılaşma sıkı peroksizom proliferatör ile aktive olan reseptör γ (PPARy) esas transkripsiyon faktörü 7, burada bir transkripsiyon kaskadı ile kontrol edilmektedir. Bundan başka önemli transkripsiyon faktörleri (Cı CCAAT / güçlendirici bağlayıcı protein olan/ EBP) ailesi üyeleri (C / EBPα C / EBPβ ve C / EBPδ) Kruppel benzeri faktör (KLFs) cAMP karşılık elemanı bağlama proteini (CREB) ve erken gelişme tepkisi 20 (Krox20) 6. Son zamanlarda, aktive edici protein-1 (AP-1) Aile adiposit farklılaşması işlemi 8,9 rol oynadığı gösterilmiştir. AP-1 Aile Fos, Haz ve / veya aktive edici transkripsiyon faktörü (ATF) üyeden oluşan bir dimerik protein kompleksi ile oluşturulur. Fos-ilgili bir antijen 1 ve 2 (Fra-1 ve Fra-2) adiposit farklılaşmasını regüle edebilirler. Fra-1 Fra-2 kontrol adiposit devir 9 ise, / EBPα 8 C inhibe adiposit farklılaşmasını bozar. Fra-2, böylece sadece adiposit farklılaşması sırasında PPARγ2 ifadesini bastırmak yoluyla adiposit sayısını azaltır, aynı zamanda hipoksi-indüklenebilir faktör (HIFs) ifade doğrudan baskı yoluyla adiposit apoptoz azalır. HIF aile HETE olduğunuHIF-1 a, 2a, HIF-HIF-1 p oluşan rodimeric transkripsiyon faktörü kompleksi. Heterodimerler bir oksijen duyarlı HIF-α protein (HIF-1α HIF-2α) ve oksijen duyarsız HIF-1β alt-biriminin 10 oluşur. Normoxia sırasında, HIF-α proteinler poli ubiquitinylated ve nihayet proteazomlar 11 tarafından yıkılırlar. genleşme sırasında meydana gelen hipoksik koşullar altında HIF-α proteinler artık hidroksillenmiş vardır. Bu nedenle yapısal olarak ifade HIF-1 p ile stabilize ve form dimerleri olur. HIF yanıt elemanları ile kontrol genlerin transkripsiyonel aktivasyon anjiyojenez, metabolizma ve enflamasyon 12 düzenlenmesi ile ilgili. Gerçekten de, HIF-1α, glukoz tolerans indükte enerji sarfiyatını ve lipit çevresel kullanımı engellenmesi, hem de tarafından leptin seviyesi ve HFD kaynaklı hepatik steatoz 13 arttırarak disfonksiyonu teşvik eder. Ayrıca, HIF-1α adipocy düzenlerte apoptoz, in vivo ve in vitro 9. Mevcut protokol erişkin farelerde adiposit homeostazının moleküler özelliklerini çözülmeye durumu AT çalışmak için yöntemleri açıklar. Bu apoptoz, çoğalması ve in vivo ve in vitro olarak, adipositlerin farklılaşmasının hipoksi ile kontrol edilebilir gösterir. Bunu yapmak için, Fabp4-CreERT fareler 9 Fra-2 floxed alelleri taşıyan farelerin geçerek oluşturulan Fra-2&#39;nin adiposit belirli bir silinen fareler kullanır. Fabp4-Cre ERT fareler kullanılarak, silme adiposit tamoksifen enjeksiyon 14 belirli ve indüklenebilir. Yetişkin modeli için, tamoksifen periton içine enjeksiyonlarla 6 haftalıkken itibaren 5 ardışık gün boyunca gerçekleştirilir. Analiz yapılmadan önce Böylece, fareler 6 hafta boyunca normal bir diyet veya yüksek yağ içeren bir diyete tabi tutulur. Bu çalışmada kullanılan fare erkek gibi östrojenler gibi kadınlık hormonları, önlemek için bir C57BL6 arka dayanmaktadırVücut yağ dağılımı 15 düzenleyen gösterilmiştir. Başka genetik arka plan kullanarak da lipid yönetiminde 16 suş ile ilgili farklılıklara, metabolik fenotip değiştirebilir. Bu protokol histoloji kullanarak hipoksi altında AT nasıl analiz ve immünohistokimyasal ve profil analizleri geni kullanılarak in vivo adiposit apoptoz, çoğalmasını ve farklılaşmasını ölçmek için nasıl gösterir. Çalışma hipoksi maruz kalma değişmiş birincil adiposit farklılaşması ve apoptoz nasıl analiz edileceğini gösteren in vitro deneyler ile tamamlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>RNAlater çözeltisi</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>RNA stabilizasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>4472908</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Fare Anti-İnsan Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>Klonu B56 (RUO)</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Fare Anti-İnsan Ki-67 Klonu B56 (RUO)</td><td>550609</td><td>Proliferasyon belirteci</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>BioLegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Bölünmüş Kaspaz-3 Tavşan mAb</td><td>Hücre sinyali</td><td>9664S</td><td>Klon 5A1E</td></tr><tr><td>Bölünmüş Kaspaz-3 (Asp175) (5A1E) Tavşan mAb</td><td>9664</td><td>Apoptoz belirteci</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin2000 Reaktif&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 İyodür</td><td>T3605</td><td>Nükleer karşı boya, Monomerik siyanin nükleik asit boyası, Uyarma ve frasl; Emisyon: 642&frasl; 661 deniz mili</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s hemalum</td><td>Merck</td><td>109249</td><td>hematoksilen</td></tr><tr><td>pegGOLD TriFast</td><td>Peqlab</td><td>30-2030</td><td>TRIzol, guanidin izotiyosiyanat ve fenolün tek fazlı çözeltisi</td></tr><tr><td>Percellys Seramik Kiti 1.4&nbsp; mm</td><td>91-PCS-CK14</td><td>seramik boncuk içeren tüpler (1,4 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>91-PCS24</td><td>homojenizatör</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alfa Antikoru</td><td>Pierce</td><td>PA1-16601</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alfa Antikoru, 16H4L13</td><td>700505</td><td>Hipoksi marker</td><td></td></tr><tr><td>In Situ Hücre Ölümü Tespit Kiti, Floresein</td><td>Roche</td><td>11 684 795 001</td><td>TdT aracılı dUTP-biotin nick end etiketleme (TUNEL)&nbsp;</td></tr><tr><td>Eozin</td><td>Sigma</td><td>318906</td><td></td></tr><tr><td>DNaz I Çözeltisi (1&nbsp; birim/&mikro; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>biyotinile anti fare IgG (H + L)</td> <td>Vektör Laboratuvarları</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>biyotinile anti fare IgG (H + L)</td> <td>BA-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kiti</td><td>PK-4000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD DAPI</td><td>H-1200</td><td></td><td></td> ile Montaj Ortamı</tr></tbody></table>

farklılaşma ve apoptoz homeostazis sayesinde yetişkin organizmalar içinde adiposit numaraları yönetmeliği mekanizması

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Yağ dokusunun (AT) endokrin bir organ olduğu düşünülürse tüm vücut metabolizmasını etkileyebilir. Aşırı enerji depolanması, adipositlerin düzensizliğine yol açar ve bu da adipokinlerin anormal salgılanmasına neden olarak obezite, dislipidemi, hiperglisemi, hiperinsülinemi, insülin direnci ve tip 2 diyabet gibi metabolik sendromları tetikler. Bu nedenle, adiposit disregülasyonunun arkasındaki moleküler mekanizmaların araştırılması, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Protokolümüz, yetişkin farelerde adiposit apoptozu ile ilişkili olan AT'nin hipoksik koşullarından etkilenen moleküler mekanizmayı değerlendirme yöntemlerini açıklamaktadır. Bu protokol, hipoksik hücrelerin veya HIF-1α proteininin boyanması yoluyla tespit edilen, hipoksi maruziyeti sırasında adiposit farklılaşması, proliferasyonu ve apoptozun histolojik analizinin yanı sıra gen ekspresyonu profillemesi yoluyla AT'nin in vivo olarak nasıl analiz edileceğini açıklar. Ayrıca, adiposit farklılaşmasının ve çeşitli uyaranlara verdiği yanıtların in vitro analizi, metabolik sendromlara yol açan olası adiposit disfonksiyonunun arkasındaki moleküler yolların karakterizasyonunu tamamlar.

Bu örneği kullanılarak, in vivo ve in vitro adiposit homeostazı belirleme göstermek Fra-2 fl / FL vahşi tür littermates göre Fabp4-CreERT fareleri. Bizim protokol artan adiposit apoptosis ile belirtildiği gibi hipoksi artarak HIF ifade adiposit disfonksiyonu ile ilişkilidir nasıl tanımlar. yüksek yağlı diyet Artan adiposit büyüklüğü ve alanı (YYD) uygulanan fareler Aşırı beslenme, diğer faktörlerin yanı sıra, lipid damlacıkları aşırı enerji depolama kaynaklanan adiposit hipertrofisi ile sonuçlanır. adiposit boyutu ve alan hipertrofisi bir göstergesidir. Normal yağ yastığı Bölümleri (ND; Şekil 6a) ve yüksek yağlı diyet (YYD Şekil 6b) 6 hafta sonra adiposit büyüklüğü ve bölgenin fareler yanı sıra sayımsal açıkça göstermektedir adiposit hipertrofisiHFD tedavi edilen farelerde (Şekil 6c, d) artmış adiposit boyutu ile gösterilir YYD, s. Yetişkin adipoz dokusu (AT) artan hipoksi Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT fareler artmış HIF-1α seviyesi ve adiposit apoptosise neden olur AT hipoksi in vivo durumunu belirlemek için, Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT farenin 12 haftalıkken Fra-2 silme işleminden sonra 6 hafta analiz ve vahşi tip littermates ile karşılaştırılmıştır. Pimonidazol intraperitonal etkili hipoksi belirteci olarak farelere tatbik edilir; o toksik olmayan ve AT içine dağıtmak yapabiliyor. In vivo AT hipoksik adipositler immünohistokimyasal antikor boyama (Şekil 7a) tarafından tanımlanır. Bundan başka, farelerin AT artan hipoksik durumu artan HIF-1α pozitif ADIP eşlikHIF-1α ifade seviyeleri ve hedef genlerin 9 miktarının ile teyit edilir immünohistokimyasal boyama Şekil 7B), gösterildiği gibi ocytes. Buna ek olarak, Fra-2 bölümlerin arasında, TÜNEL lekelemesi fl / fl Fabp4-CreERT fare ve kontrol litermatlarının (Şekil 7c) adiposit apoptoz hipoksi ve HIF-1α ifade ile korele artış gösterir. hipoksi nedenli adiposit apoptoz yoluyla primer adipositler HIF-1α ifade artışı Başka bir yerde, 20 tarif edilen şekilde in vitro adiposit apoptoz analiz etmek için deri altı yağ pedleri elde adipositler kullanımı. Beklendiği gibi, adipositlerde HIF-1α sentezleme hipoksi (Şekil 8a) 24 saat sonra artmıştır. ayrıca HIF-1α faaliyetleri, HIF hedef RNA düzeylerinin analiz etmekBu Inos (uyarılabilir nitrik oksit sintaz) genler qPCR nicelendirilir. 8b hipoksik koşullar altında HIF-1α artmış ekspresyonu Inos mRNA düzeyleri artan yol açar göstermektedir. Daha önce adipositlerde HIF-1α ekspresyonunda artış adiposit apoptoz ile ilişkilidir artmış in vivo (Şekil 8) &#39;de gösterilen bu yana, apoptoz da hipoksik koşullar altında Annexin V boyama ile in vitro kültürlerinde ölçülür. İn vivo veriler (Şekil 7) ile uyumlu olarak, artmış bir HIF-1α seviyesi hipoksik koşullar neden olduğu artan adiposit apoptoz ile (Şekil 8b) eşlik eder. Ayrıca, bu hipoksik kaynaklı apoptosisi kanıtlamak için, HIF-bağlıdır; HIF-1α HIF-2α yabani tip veya Fra-2 eksik farelerde elde edilen adipositler RNA müdahalesi ile susturulur. Annexin gösterildiği gibi artan adiposit apoptoz HIF-1α veya HIF-2a susturma tarafından restore<html> Hipoksi sensörü HIF-α adiposit apoptoz düzenleyen kanıtlayan Şekil 8b V boyama. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" /> Şekil 6: Yüksek yağlı diyet (HFD) farelerde adiposit boyutu ve alan artışı normal diyet (ND) ile beslenen erkek doğal tipte farelerin perigonadal yağ yastığı alınan kesitlerin (A, B), H &amp; E boyama, (a) ya da yüksek. -FAT diyet (HFD), (b) 6 hafta. Barlar 500 mikron temsil etmektedir. (C, d) (b) 6 hafta boyunca ND: (a) ya da YYD ile beslenen doğal tipte farelerin perigonadal yağ pedi adiposit boyutu (c) ve alan (d) sayımsal. n = 10. Veri ± SEM ortalama değerler olarak gösterilmektedir. İstatistiksel analiz Student t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *** P &lt;0.0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" /> Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT fareler yetişkin adipositlerde artmış HIF-1α düzeyi ve apoptosis: Şekil 7. Hipoksi (a) ve HIF-1α erkek Fra-2 fl / fl Fabp4-creERT fare ve kontrol litermatlarının erkek, 6 hafta sonra tamoksifen enjeksiyon AT (b) boyama. Büyütme 20X, 40X yerleştirin. Siyah oklar hipoksik alanları ve HIF-1α pozitif hücreler göstermektedir. (C), TÜNEL lekelemesi Fra-2 fl / FL tamoksifen enjeksiyondan 6 hafta sonra Fabp4-CreERT fare ve kontrol litermatlarının. Büyütme 20X, 40X yerleştirin. Siyah oklar TUNEL pozitif hücreler gösterir. Bu rakam Luther et modifiye edilmişark. 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" /> Şekil 8:. Hipoksi ile birincil adipositlerde artmış HIF-1α ekspresyonu ve adiposit apoptoz hipoksik odalarına yerleştirilir primer adipositler HIF-1α ve HIFs hedef Inos mRNA seviyelerinin, (a) Gerçek zamanlı PCR analizi, belirtilen zaman noktalarında analiz edilmiştir. Izole edilen primer adipositlerde Annexin V FACS lekelenmesi ile apoptozun (b) Niceleme Fra-2 fl / FL SH kontrol veya HIF-1α HIF-2a karşı SH plazmid ile transfekte edilmiş ve hipoksi altına Fabp4-CreERT fareleri ya da vahşi-tipli kontrollerden 24 saat boyunca (% 1 O 2). Bu rakam, Luther ve diğ modifiye edilmiştir. <sup&gt; 9. Veri SD İstatistiksel analizler Student t-testi kullanılarak yapıldı ± ortalama değerler olarak gösterilmektedir. * P &lt;0.05 ve ** p &lt;0.01 anlamlı olarak kabul edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Yağ dokusu (AT) tüm vücut homeostazını etkileyebilir, bu nedenle adiposit farklılaşması ve fonksiyonunun moleküler mekanizmalarını anlamak önemlidir. İndüklenmiş adiposit apoptozu için bir model olarak adiposit homeostazı, farklılaşması ve hipoksi maruziyetini analiz ederek bu süreçlere yeni bakış açıları kazandırmak için bir protokol sunuyoruz.

Farklılaşma ve Apoptoz Homeostazis sayesinde Yetişkin Organizmalar içinde Adiposit Numaraları Yönetmeliği Mekanizması

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Bu deneylerin genel amaçları, adiposit homeostazını ve farklılaşmasını analiz etmek ile hipoksi ve adiposit apoptozu mekanizmalarını incelemektir. Bu yöntem, obezite ve tip II diyabet gibi metabolizma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kullandığınız özel çalışma modelinde adiposit biyolojisinin analizine yönelik temel ve düşük maliyetli prosedürler sunmasıdır.Laboratuvarımdan doktora öğrencisi Nicole Hannemann prosedürleri uygulamalı olarak gösterecektir. İn vivo hipoksiyi nicelleştirmek için öncelikle farenin vücut ağırlığını belirleyin. Ardından, vücut ağırlığının kg başına 60 mg katı pimonidazole hyrochloride'i intraperitonal olarak enjekte edin.45 dakika sonra hayvanın ekstremitelerini sabitleyin ve periton boşluğunu açın. Boşluktan sol ve sağ perigonadal yağ yastıklarını çıkarın ve yağ yastıklarından gonadal dokuları uzaklaştırın. Ardından, vücut ağırlığına göre yağ yastığı oranını gram cinsinden belirlemek için dokuyu tartın.Adiposit homeostazının histolojik analizini gerçekleştirmek için, öncelikle adipoz doku kesitlerini ksilen ile beşer dakikalık üç yıkama ile deparafinize edin; ardından %100 etanol ile ikişer dakikalık iki rehidrasyon ve %96 etanol ile ikişer dakikalık iki rehidrasyon uygulayın. Daha sonra kesitleri beş dakika boyunca distile su ile yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hematoksilin ile boyayın. İnkübasyonun sonunda kesitleri beş dakika daha su ile yıkayın ve ardından 30 saniye boyunca eozin çözeltisi ile boyayın.Kesitleri az önce gösterildiği gibi yıkayın. Ardından kesitleri, her biri iki dakika süreyle ikişer kez %96 etanol ve %100 etanol ileydehidre edin. Bunu takiben, beşer dakikalık üç ksilen inkübasyonu gerçekleştirin.Ardından kesitleri susuz bir kapatma ortamı ile kapatın. Dokuların immünohistokimyasal analizi için kesitleri az önce gösterildiği gibi deparafinize edin ve ardından 37 °C'de 30 dakika boyunca proteinaz K çalışma çözeltisi ile sindirime bırakın. Sindirim sonunda dokuları PBS ile durulayın ve endojen peroksidazı PBS içindeki %3 hidrojen peroksit ile 10 dakika boyunca bloke edin.PBS ile art arda yapılan iki adet beş dakikalık yıkamanın ardından, PBS içindeki %10 serum ile spesifik olmayan antikor bağlanmalarını bloke edin. Ardından, dokuları ve ilgili antikorları dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah kesitleri PBS ile üç kez beşer dakika yıkayın.Ardından dokuları, uygun biyotinillenmiş sekonder antikorlar ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Sekonder antikor etiketleme süresinin son 30 dakikasında, her kesit için 50 µL avidin çözeltisini 50 µL biyotinillenmiş peroksidaz H ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dengeleyin. Sonrasında kesitleri PBS içinde beşer dakikadan iki kez yıkayın ve dokuları oda sıcaklığında 100 µL avidin biyotin ABC kompleksi ile işleme tabi tutun.45 dakika sonra kesitleri iki kez PBS ile yıkayın ve boyama uygun yoğunluk seviyesine ulaşana kadar dokuları peroksidaz substrat çözeltisinde inkübe edin. Şimdi kesitleri beş dakika boyunca distile su ile yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hematoksilin ile karşı boyayın. Karşı boyamadan sonra dokuları tekrar suyla yıkayın.Ardından kesitleriy suyunuz ve örnekleri lamellerle sabitlemek için susuz bir montaj maddesi kullanın. Kesitler daha sonra bir aydınlık alan mikroskobu altında değerlendirilebilir. İşleme, yetişkin erkek farenin derisini üst bacak, bel ve yan bölgelerden ayırarak ve deri çıkarılırken iğneleyerek başlayın.Ardından, adipositlerin kültürü için arka bacakların tabanında yer alan inguinal lenf düğümlerini çevreleyen posterior subkütan adipoz dokuyu toplayın. Adipojenik farklılaşmayı analiz etmek için, farklılaşmış adipoz hücre kültürünü bir çeker ocak altına yerleştirin ve hücreleri PBS ile nazikçe yıkayın. Daha sonra hücreleri 60 dakika boyunca 2 mL %10 formalinde sabitleyin.Fiksasyonun sonunda hücreleri su ile yıkayın ve kültürü beş dakika boyunca iki mililitre %60 isopropanol ile, ardından iki mililitre Oil Red O çalışma çözeltisi ile işleme tabi tutun. Beş dakika sonra, su berraklaşana kadar hücreleri musluk suyuyla durulayın. Ve hücreleri az önce gösterildiği gibi hematoksilin ile karşıt boyamaya tabi tutun.Hücreler daha sonra 100 kat büyütmede faz kontrast mikroskobu altında değerlendirilebilir. Adipositlerin lipidleri kırmızı, çekirdekleri ise mavi görünecektir. Burada, normal ve yüksek yağlı diyetle beslenen farelerden alınan yağ yastığı kesitleri gösterilmektedir.Adiposit boyutunun ve alanının nicelleştirilmesi, yüksek yağlı diyetle tedavi edilen hayvanlarda artan adiposit boyutundan anlaşıldığı üzere, altı haftalık yüksek yağlı diyet sonrasında adiposit hipertrofisini açıkça göstermektedir. Hipoksik belirteç pimonidazol ile tedavi edilen farelerde, adipoz dokunun artan hipoksik durumuna HIF1 alfa pozitif adipositlerdeki artış eşlik etmektedir. Ayrıca, nakavt ve kontrol grup kardeşlerinden alınan adipoz kesitlerin TUNEL boyaması, adiposit apoptozundaki artışın hipoksi varlığı ve hipoksi ile indüklenebilir faktör 1 alfa ekspresyonu ile korele olduğunu göstermektedir.Beklendiği üzere, adipositlerde Hif1a ekspresyonu 24 saatlik hipoksiden sonra artış gösterir. Ayrıca, QPCR ile Hif hedef genlerinin kantifikasyonu, hipoksik koşullar altında artan Hif1a ekspresyonunun, Inos mRNA ekspresyonunda bir artışa yol açtığını göstermektedir. Bununla birlikte, RNA interferansı ile Hif1 veya 2 alfa'nın susturulması, adipositleri hipoksik koşullar altında apoptozdan kurtarmaktadır; bu durum, Hif alfa'nın adiposit apoptozundaki hipoksi duyarlı düzenleyici rolünü doğrulamaktadır.Bu prosedürlerin ardından, metabolik değişim ve adiposit disfonksiyonu hakkındaki ek soruları yanıtlamak için glukoz ve insülin direnci belirleme gibi tüm analizler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, adiposit apoptozu ve hipoksi çalışmalarının histolojik analizinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

mechanism-regulation-adipocyte-numbers-adult-organisms-through

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Farelerde beyaz adipoz dokulardan izole İlköğretim beyaz preadipositlerden bej / brite hücrelerine ayırt edilebilir. Burada sunulan beyaz yağ "esmerleşme" moleküler düzenlenmesi okumak için güvenilir hücresel modeli sistemidir.

Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

Burada Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MCS) kullanarak Perivasküler Adipoz Doku (PVAT) Adiposit Progenitör Hücre (APC) popülasyonlarının izolasyonu için bir yöntem rapor. Bu yöntem, floresan-Aktive Hücre Ayırma (FACS) ile karşılaştırıldığında, yağ dokusunun gramı başına APC'nin artan bir izolasyonuna izin verir.

Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku&#39;ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) kültür olgun insan adipositler için yeni bir yöntemdir. Burada insan yağlarından adipositleri nasıl izole edebileceğimizi ve MAAC'ı nasıl kurabileceğimizi ayrıntılarıyla anlatıyoruz.

Membran Olgun Adiposit Agrega Kültürleri (MAAC) Kullanarak İnsan Olgun Adipositlerin İzolasyon ve Kültürü

Bu rapor, birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. İzole hücreler kültürde yetiştirilebilir ve tamamen olgun beyaz ve kahverengi adipozitlere farklılaşmaya teşvik edilebilir. Yöntem, kültürdeki primer yağ hücrelerinin genetik, moleküler ve fonksiyonel olarak karakterizeini sağlar.

Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması

Protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) saf bir adiposit popülasyonunun üretilmesine izin verir. Retinoik asit, iPSC'leri adiposit üretmek için kullanılan mezenkimal kök hücrelere (MSC'ler) ayırmak için kullanılır. Daha sonra, saf adipositler elde etmek için Nil kırmızısı boyamaya dayalı bir sıralama yaklaşımı kullanılır.

Adipositle İlişkili Bozuklukları İncelemek için İnsan iPSC'lerinin Saf Bir Adiposit Popülasyonuna Sağlam Farklılaşması

Bu protokol, fare preadipositlerinin deri altı yağdan izolasyonunu, olgun adipositlere farklılaşmasını ve insülin direncinin indüklenmesini açıklar. İnsülin etkisi, batı lekesi boyunca insülin sinyal yolunun üyelerinin fosforilasyonu / aktivasyonu ile değerlendirilir. Bu yöntem, primer adipositlerde insülin direncinin/duyarlılığının doğrudan belirlenmesini sağlar.

Primer Kültürde Diferansiye Fare Adipositleri: İnsülin Direncinin Bir Modeli

Preadipositler, yenidoğan farelerden alınan interskapular kahverengi yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir ve lipid damlacıkları biriktiren, moleküler belirteçleri eksprese eden ve olgun kahverengi adipositlerin mitokondriyal morfolojisini gösteren hücrelere farklılaşır. Bu hücreler ayrıca immünofloresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile analiz edilir.

Yenidoğan Farelerden İnterskapular Yağ Dokusunun Stromal Vasküler Fraksiyonundan Kahverengi Adipositlerin Farklılaşması ve Görüntülenmesi

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Olgun adipositlerin büyüklüğü ve kırılganlığı, çalışmaları ve izolasyonları için mevcut teknik ve araçları sınırlamıştır. Burada, farklı yağ depoları ve fare diyetleri için kolayca uyarlanabilen olgun murin adipositlerinin izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır.

Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Bu çalışmada, zebra balığı larvaları üzerinde Evans Mavi Boya (EBD) analizi yapmak için basit bir yöntem açıklıyoruz.  Bu teknik, iskelet kası bütünlüğünün karakterizasyonu ve zebra balığı kas distrofisi modellerinin tanımlanması için güçlü bir araçtır ve yeni terapötiklerin geliştirilmesi için değerli bir yöntemdir.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

Öğrenin, fare modellerinde hipoksi ve adiposit apoptoz mekanizmalarını incelemek için histolojik analiz ve immünohistokimya yöntemlerini kullanarak metabolik hastalıklara yönelik yeni tedavi stratejileri geliştirmeyi.

Farklılaşma ve Apoptoz Homeostazis sayesinde Yetişkin Organizmalar içinde Adiposit Numaraları Yönetmeliği Mekanizması

Daha fazla video keşfet