Farklılaşma ve Apoptoz Homeostazis sayesinde Yetişkin Organizmalar içinde Adiposit Numaraları Yönetmeliği Mekanizması

Bu deneylerin genel amacı, adiposit homeostazını ve farklılaşmasını analiz etmek ve hipoksi ve adiposit apoptozu mekanizmalarını araştırmaktır. Bu yöntem, obezite ve tip II diyabet gibi metabolik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, temel ve ucuz prosedürler olmalarıdır, bu da adiposit biyolojisinin kendi çalışma modelinizde analiz edilmesidir.

Laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Nicole Hannemann prosedürleri gösterecek. Hipoksiyi ölçmek için: in vivo önce farenin vücut ağırlığını belirleyin. Daha sonra intraperitoneal olarak vücut ağırlığının kg'ı başına 60 mg katı pimonidazol hidroklorür enjekte edin.

45 dakika sonra, hayvanın uzuvlarını sabitleyin ve periton boşluğunu açın. Sol ve sağ perigonadal yağ yastıkçıklarını boşluktan toplayın ve gonadal dokuları yastıklardan çıkarın. Daha sonra, vücut ağırlığı başına yağ yastığını gram cinsinden belirlemek için dokuyu tartın.

Adiposit homeostazının histolojik analizini yapmak için önce yağ dokusu bölümlerini ksilen içinde üç beş dakikalık yıkama ile deparafinize edin, ardından %100 etanolde iki adet iki dakikalık rehidrasyon ve %96 etanolde iki adet iki dakikalık rehidrasyon uygulayın. Daha sonra bölümleri damıtılmış suda beş dakika yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika hematoksilen ile boyayın. İnkübasyonun sonunda, bölümleri beş dakika daha suda yıkayın, ardından eozin çözeltisi ile 30 saniyelik bir leke yapın.

Bölümleri gösterildiği gibi yıkayın. Daha sonra bölümleri %96 etanol ve %100 etanol içinde ikişer dakika boyunca ikişer kez kurutun. Bunu üç adet beş dakikalık ksilen inkübasyonu izledi.

Ardından bölümleri susuz bir montaj maddesi ile monte edin. Dokuların immünohistokimyasal analizi için, az önce gösterildiği gibi kesitleri deparafinize edin, ardından 37 santigrat derecede proteinaz K çalışma çözeltisi ile 30 dakikalık bir sindirim yapılır. Sindirimin sonunda dokuları PBS'de durulayın ve endojen peroksidazı PBS'de% 3 hidrojen peroksit ile 10 dakika bloke edin.

PBS'de birbirini takip eden iki beş dakikalık yıkamadan sonra, PBS'de% 10 serum ile spesifik olmayan herhangi bir antikor bağlanmasını bloke edin. Daha sonra dokuları ve ilgilenilen antikorları gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, bölümleri PBS'de üç beş dakikalık yıkama ile durulayın.

Daha sonra dokuları uygun biyotinile edilmiş ikincil antikorlarla oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İkincil antikor etiketleme süresinin son 30 dakikasında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bölüm başına 50 mikrolitre biyotinile peroksidaz H ile 50 mikrolitre avidin çözeltisini dengeleyin. Daha sonra bölümleri PBS'de her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın ve dokuları oda sıcaklığında 100 mikrolitre avidin biotin ABC kompleksi ile tedavi edin.

45 dakika sonra, bölümleri PBS'de iki kez yıkayın ve boyama uygun yoğunluk seviyesine ulaşana kadar dokuları peroksidaz substrat çözeltisinde inkübe edin. Şimdi bölümleri damıtılmış suyla beş dakika yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hematoksilen ile lekeleyin. Karşı boyamadan sonra dokuları tekrar suda yıkayın.

Daha sonra bölümleri kurutun ve numuneleri lamel ile monte etmek için susuz bir montaj maddesi kullanın. Kesitler daha sonra parlak alan mikroskobu altında değerlendirilebilir. Yetişkin erkek farenin derisini üst bacak, bel ve böğürden ayırarak başlayın ve deri çıkarılırken iğneleyin.

Daha sonra, adipositlerin kültürü için arka bacakların tabanında bulunan kasık lenf düğümlerini çevreleyen arka deri altı yağ dokusunu toplayın. Adipojenik farklılaşmayı analiz etmek için, farklılaşmış yağ hücresi kültürünü bir davlumbaz altına yerleştirin ve hücreleri PBS ile nazikçe yıkayın. Daha sonra hücreleri 60 dakika boyunca iki mL% 10 formalin içinde sabitleyin.

Fiksasyonun sonunda, hücreleri suda yıkayın ve kültüre beş dakika boyunca iki mililitre% 60 izopropanol uygulayın, ardından iki mililter yağ kırmızısı O çalışma çözeltisi uygulayın. Beş dakika sonra, su berraklaşana kadar hücreleri musluk suyuyla durulayın. Ve hücreleri az önce gösterildiği gibi hematoksilen ile boyayın.

Hücreler daha sonra 100 kat büyütmede bir faz kontrast mikroskobu altında değerlendirilebilir. Adipositlerin lipitleri kırmızı görünecek ve çekirdekler mavi görünecektir. Burada normal ve yüksek yağlı diyet farelerinden alınan yağ yastığının bölümleri gösterilmektedir.

Adipositlerin boyutunun ve alanının ölçülmesi, yüksek yağlı diyetle tedavi edilen hayvanlarda artan adiposit boyutunun kanıtladığı gibi, altı haftalık yüksek yağlı bir diyetten sonra adiposit hipertrofisisini açıkça göstermektedir. Hipoksik belirteç pimonidazol ile tedavi edilen farelerde, yağ dokusunun artmış hipoksik durumuna HIF1 alfa pozitif adipositlerde bir artış eşlik eder. Ayrıca, nakavt ve kontrol altlığı eşlerinden yağ kesitlerinin tünel boyaması, adiposit apoptozundaki bir artışın hipoksi ve hipoksik indüklenebilir faktör 1 alfa ekspresyonu varlığı ile ilişkili olduğunu göstermektedir.

Beklendiği gibi, adipositlerdeki Hif1a ekspresyonu 24 saatlik hipoksiden sonra artar. Dahası, Hif hedef genlerinin QPCR ile miktar tayini, hipoksik koşullar altında Hif1a'nın artan ekspresyonunun Inos mRNA ekspresyonunda bir artışa yol açtığını gösterir. Bununla birlikte, Hif1 veya 2 alfa'nın RNA interferansı ile susturulması, hipoksik koşullar altında adipositleri apoptozdan kurtarır ve adiposit apoptozunda Hif alfa'nın hipoksi duyusal düzenleyici rolünü doğrular.

Bu prosedürleri takiben, metabolik değişim ve adiposit disfonksiyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için glukoz ve insülin direncinin belirlenmesi gibi tüm testler yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, adiposit apoptozu ve hipoksi çalışmalarının histolojik analizinin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.