Video Görüntüleme ve Spatiotemporal Haritalar Fare Gastrointestinal Motilite Analiz

Bu tekniğin genel amacı, video görüntüleme kullanarak farelerde kolonik motilitenin nöral düzenlemesindeki değişiklikleri belirlemektir. Bu teknik, nöronal genlerdeki hafif genetik mutasyonların kolonik motiliteyi etkileyip etkilemediği gibi enterik nörobilim alanı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, dokunun merkezi sinir sistemi girdisi olmadan bir kist formunda olmasıdır ve sonuç olarak bu yöntem, gastrointestinal motilitenin kontrolünde enterik sinir sisteminin rolünün araştırılmasına olanak tanır.

Bu teknik, beyindeki sinaptik fonksiyonu değiştiren gen mutasyonlarının bağırsak motilitesini de değiştirebilmesi nedeniyle, otizm gibi nörogelişimsel hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır. Alt karın kas tabakalarının üzerindeki epidermiste diseksiyon pensi ve makas kullanarak bir insizyon yaparak başlayın. Karın boşluğunu orta hat boyunca sternuma kadar açın.

Dokuyu fizyolojik serum fizyolojik ile nemlendirin ve forseps kullanarak sekumu abdomenin dört ila beş santimetre üzerine nazikçe kaldırın. Ardından, ince diseksiyon makası kullanarak, gastrointestinal dokuyu tutmamaya, germemeye veya kesmemeye dikkat ederek mezenteriyi kırpın. Mesaneyi, testisleri ve diğer tüm fazla dokuları uzaklaştırın.

Ardından, kaba diseksiyon makası kullanarak, kolonun her iki yanında pelvik kemiğe doğru orta hattan yaklaşık 0,5 santimetre uzaklıkta iki dikey insizyon yapın ve rektumu bitişik pelvik dokudan ayırmak için ince makas kullanın. Mezenteri kolondan kesin ve tam uzunluktaki kolon dokusunu fizyolojik salin içeren bir beherde durulayın. Fekal pelletleri ve diğer bağırsak içeriklerini temizlemek için, önce 200 µL'lik bir pipetin ucundan yaklaşık bir santimetre kesin ve pipeti, fizyolojik salin ile doldurulmuş beş mL'lik bir şırıngaya takın.

Ardından, sekum ve rektum çıkarıldıktan sonra, dokuyu yönlendirmek için mukozadaki çizgilenmelerin görünür olduğu kolonun en proksimal ucuna bir böcek iğnesi yerleştirin. Şimdi, dokuyu proksimal ucundan nazikçe kavrayın, pipet ucunu lümene yerleştirin ve salini kolon boyunca bir atık konteynerine boşaltın. Sonrasında, aynı şırınga ve pipet ucuyla, iki bölmeli bir organ banyosuna bağlı olan tüplerdeki tüm kalıntıları taze fizyolojik salin ile yıkayarak temizleyin.

Organ banyosunu, odacıkların sürekli olarak karbogen ile havalandırılmış fizyolojik salin ile süperfüze edileceği şekilde ayarlayın ve salin sıcaklığının 33 ile 37 derece santigrat arasında kaldığını düzenli olarak doğrulamak için bir sıcaklık probu kullanın. Giriş rezervuarındaki basıncı korumak için merkezinden beş milimetre iç çaplı bir cam tüp yerleştirilmiş bir kauçuk tıpa kullanın. Ardından, beş ila yedi santimetrelik bir kolon parçasını tamamen organ banyosu odacığına daldırın; kolonun proksimal ucunu giriş tüpüne, distal ucunu ise çıkış tüpüne kanüle etmek için pens ve standart pamuklu dikiş ipi kullanın.

Kolonun proksimal ve distal kanülasyonları arasındaki temel mesafe belirlendikten sonra, dokuyu 30 dakika boyunca fizyolojik salin içerisinde dengeleyin. Bağırsak hareketlerini kaydetmek için, kolon aklimatize olurken, bir video kamerayı standart bir laboratuvar deney standı üzerinde organ banyosunun 10 ila 15 santimetre üzerine yerleştirin ve uygun video yakalama yazılımını kurun. Kamera hazır olduğunda, kontrol koşulları altındaki kolonun 15 dakikalık dört video segmentini kaydedin.

Ardından, ilgilenilen ilacı organ banyosuna 30 ila 60 dakika boyunca süperfüze edin ve bu sırada 15 dakikalık dört video segmenti daha kaydedin. Son olarak, tedavi solüsyonunu taze fizyolojik salin ile değiştirin ve bir saatlik yıkama süreci boyunca 15 dakikalık dört video segmenti daha kaydedin. Böylece, farklı tedavi dönemlerine yanıt olarak kolonun spatiotemporal haritaları oluşturulabilir.

Sinaptik mutasyonların, enterik sinir sistemi farmakolojik olarak bozulduğunda kolon migratuar motor komplekslerini (CMMC'ler) değiştirip değiştirmediğini değerlendirmek amacıyla, bu deneyde beş HT3 ve 4 reseptör antagonisti olan tropisetron, kolon preparasyon organ banyosu haznesine eklenmiştir. Tropisetron varlığında, NL3R451C fareleri, vahşi tip kardeşlerine kıyasla CMMC frekansında bir azalma göstermiştir. Kontrollü koşullar altında vahşi tip ve NL3R451C kontraktilitesi arasında anlamlı bir fark gözlemlenmese de, tropisetron hem vahşi tip hem de NL3R451C farelerinde CMMC frekansını anlamlı şekilde azaltmıştır.

Ayrıca, tropisetronun NL3R451C farelerdeki CMMC frekansı üzerindeki etkisi, vahşi tip hayvanlara kıyasla daha belirgin olmuştur. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde dört saat içinde tamamlanabilir. Bu tekniği uygularken, organ banyosunun sabit bir sıcaklıkta tutulduğundan, sürekli karbogen beslemesi olduğundan ve fizyolojik salin taşmasının bir vakum tarafından önlendiğinden emin olun.

Bu prosedürün ardından, kolon motilitesinde değişim gösteren farelerde nöronal oranlarda veya hücre sayılarında değişiklikler olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için immünositokimya gibi diğer teknikler uygulanabilir. Bu yöntemle geliştirilmiş olması; guinea pig, tavşan, sıçan ve diğer türlerde, özellikle de bu vakada farelerde bağırsak motilitesine ilişkin çeşitli çalışmalara olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, video görüntüleme kullanarak kolon motilitesinin nöronal düzenlemesindeki değişikliklerin nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.