bir Böcek Modeli fotoreseptör hücre spektral Duyarlılık Belirlenmesi İn Vivo Hücre içi Kayıtlar

Bu hücre içi kayıt yönteminin genel amacı, bir böcek bileşik gözünde in vivo olarak tek tek fotoreseptör hücrelerinin spektral duyarlılığını belirlemektir. Bu yöntem bize, bir hücrenin duyarlı olduğu ışığın dalga boylarının filtreleme pigmentlerinden etkilenip etkilenmediğini söyleyebilir. Bu tekniğin temel avantajı, bireysel fotoreseptörlerin spektral hassasiyetlerini bilerek, bir hayvanın hangi renk aralığını görebileceğini tahmin edebilmemizdir.

Kayda hazırlanmak için, deneyden en az 45 dakika önce ksenon lambasını açın ve cam elektrotları çekmeden en az 30 dakika önce mikroelektrot çekicisini açın. Ardından, tüm kayıt ekipmanlarını açın. Deklanşörün varsayılan olarak kapalı olduğundan emin olun, böylece fiber optik kablodan ışık geçmez.

Ardından, mikroelektrot çekiciyi kullanarak ince borosilikat cam mikroelektrotları çekin. Elektrotları üç molar potasyum klorür ile doldurun. Numuneyi hazırlamak için, mikroskop altında, sıcak balmumu içeren küçük bir plastik tüpün içine tek bir kelebek yapıştırın, böylece kafa hareketsiz kalır ve tüpün bir ucundan çıkıntı yapar.

Ardından hortumu, antenleri ve kanatları balmumu ile yapıştırın. Bundan sonra, karnı kuru bir balmumu parçası ile tutun. İçine, numunenin karnının arkasına ıslak bir doku yerleştirerek tüpü nemli tutun.

Numunenin tamamen hareketsiz olduğundan emin olun. Daha sonra, küçük bir balmumu parçası kullanarak tüpü, manyetik bir tabana tutturulmuş bir bilye ve soket eklemi olan küçük bir platforma monte edin. Diseksiyon mikroskobu altında, referans elektrot olarak ağız kısmından kafaya gümüş bir tel yerleştirin.

Deneyden önce, teli platforma kalıcı olarak sabitleyin. Ardından, bir tıraş bıçağı kullanarak sol korneada küçük bir delik açın ve kurumasını önlemek için deliği Vazelin ile kapatın. Kornea kesildikten sonra, kayıt elektrodunu mümkün olan en kısa sürede göze yerleştirin, çünkü gözdeki hemolenf hızla sertleşecek ve elektrot yerleştirmeyi imkansız hale getirecektir.

Mümkünse, diseksiyonu kaydın yapılacağı teçhizatta gerçekleştirin. Ardından, timsah klipslerini kullanarak kafa aşaması topraklama kablosunu numune platformundaki referans elektroduna bağlayın. Elektrodu elektrot tutucusuna monte edin.

Daha sonra, gümüş teli mikroelektrottaki potasyum klorür çözeltisine yerleştirin. Elektrodu göze indirirken numuneyi bir stereoskop altında aydınlatmak için kaz boynu ekleri olan bir ışık kaynağı kullanın. Elektrot tutucuyu, mikroelektrot doğrudan korneada daha önce kesilen deliğin üzerinde olacak şekilde ayarlayın.

Ardından, bir devre tamamlanana kadar mikromanipülatörü kullanarak mikroelektrodu göze indirin. Göze girdikten sonra, stereoskopu Faraday kafesinin dışına sallayın. Numuneyi aydınlatan ışık kaynağını kapatın ve karanlığa adaptasyon için böceği 10 ila 20 dakika karanlıkta bırakın.

Bir nanoamper akım uygulayarak ve voltajdaki değişikliği not ederek elektrotun direncini kontrol edin. Direnç tipik olarak 100 ila 250 megaohm arasında olmalıdır. Ardından, deney süresince bir ışık parlaması sağlamak için darbe üretecini etkinleştirin ve fiber optik kabloyu göze doğru yönlendirin.

Her ışık yanıp söndüğünde osiloskopta voltaj değişimi olup olmadığını kontrol edin. Voltajdaki negatif bir değişiklik, elektrotun henüz hücreye girmediğini gösterir. Maksimum voltaj tepkisi gözlenene kadar fiber optik kabloyu numunenin etrafında hareket ettirin.

Depolarize edici bir ışık tepkisi oluşturmak için, mikromanipülatörü ileri geri döndürün, bu da elektrotun küçük dikey hareketlerine neden olurken, elektrot tutucunun tabanına hafifçe vururken veya ön üzerindeki vızıltı işlevini kullanırken.ampkaldırıcı. Osiloskopta depolarize edici bir ışık tepkisi görünene kadar küçük ayarlamalar yapmaya devam edin. Ardından, en büyük depolarize edici sinyali bulmak için fiber optik kabloyu ayarlayın.

Bir mikromanipülatör ile küçük ayarlamalar yapın ve elektrotun hücreyi kararlı bir şekilde kaydettiğinden emin olmak için amplifikatördeki vızıltı işlevini gerektiği gibi kullanın. Kararlı bir kayıt, dinlenme potansiyelinde, düşük arka plan gürültüsünde ve sürekli olarak büyük bir depolarize edici tepkide çok az değişiklik olmalı veya hiç değişiklik yapmamalıdır. Dinlenme membran potansiyelinin gürültülü olmadığı ve zamanla değişmediği stabil bir kayda sahip olmak çok önemlidir.

Yanıtlar büyük ve pozitif olmalı, hiperpolarizasyon olmamalıdır. Kurulum kararlı hale geldiğinde, yazılımı açın ve dört kanallı bir açılır pencere açmak için "Deneyler Galerisi" adlı iletişim kutusunu kapatın. Yazılım penceresinin sağ üst köşesindeki voltaj ölçeğini 500 milivolt olarak ayarlayın.

Ardından, kayda başlamak için sağ alt köşedeki Başlat'a tıklayın. Üçüncü ve dördüncü kanalları simge durumuna küçültün ve X ve Y ölçeğini ayarlayın. Ardından, yazılımın deney süresince çalışmasına izin verin.

Beyaz ışık stimülasyonu için, ND filtre tekerleği hala bir yanıt ortaya çıkaran en yüksek OD'ye ayarlanmış olarak 10 adede kadar ayrı yanıt kaydedin. Burada, yanıttaki değişiklik 3.0 OD ve 2.0 OD'de gösterilir. Ardından, bir yanıt günlüğü yoğunluk eğrisi sağlamak için her kombinasyonda 3,5 ila 0,0 OD arasında aynı sayıda yanıtı kaydedin. Girişim filtrelerini kullanarak hücrenin tüm dalga boylarına verdiği yanıtı kaydetmeden önce, önce tepe dalga boyunu hızlı bir şekilde bulun.

Işık yolunda herhangi bir ND filtresi olmadan, oraya bir UV ileten filtre yerleştirin ve tepki genliğini kısaca gözlemleyin. Prosedürü mavi bir verici filtre, yeşil bir verici filtre ve kırmızı bir verici filtre ile tekrarlayın, bu da en yüksek yanıtın nerede olacağı hakkında bir fikir vermelidir. Başka bir girişim filtresine geçmeden önce maksimum yanıtı veren filtre dalga boyunun altında kayıt yapın.

Sonraki filtrelerle kayıt arasında, tepe yanıtının zaman içinde bozulup bozulmadığını izlemeye yardımcı olmak için, hücrenin ışık yolunda herhangi bir filtre olmadan bir ila iki beyaz ışık yanıp sönmesine yanıt vermesine izin verin. Ardından, diğer parazit filtreleriyle kayıt yapın ve filtre başına en fazla 10 yanıta izin verin. Bu, bir hücreye girmeden hemen önce görülen büyük bir negatif voltaj değişiminin bir örneğidir.

Burada, çok az arka plan gürültüsü ve tipik olarak en az 40 milivoltluk büyük bir depolarize edici yanıtı olan temiz bir kayıt gösterilmektedir. Ve burada, ana zirveden sonraki negatif potansiyel değişimi nedeniyle kötü bir kayıt örneği verilmiştir. Bu, kötü bir kaydın başka bir örneğidir.

Dinlenme potansiyeli büyük dalgalanmalara maruz kalıyor ve büyük miktarda arka plan gürültüsü yanıtın genliğini gizleyebilir. Bu, tek bir kayıttan türetilen spektral duyarlılığın temsili bir örneğidir. Hücre tipleri, benzer bir dalga boyundaki tepe hassasiyetine ve hassasiyet spektrumunun genel şekline göre sınıflandırılır.

Daha sonra aynı hücre tiplerinin ortalaması alınır ve ortalama duyarlılık, her dalga boyunda standart hata çubuklarıyla çizilir. Bu grafik, bir böcekte bulunan üç tipik hücre tipinin spektral duyarlılıklarını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık iki saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, tüm fotoreseptör hücre tiplerinin renk ayrımına katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için davranışsal deneyler yapılabilir.