Name: bir Böcek Modeli fotoreseptör hücre spektral Duyarlılık Belirlenmesi İn Vivo Hücre içi Kayıtlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin böcek bileşik gözünde hücre içi kayıt yöntemiyle fotoreseptör hücrelerinin spektral duyarlılığını belirlemeyi. Bu teknik, kelebeklerin renk görüş aralığını tahmin etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz teşvik için, bize ekipman kredi için kardan kol çevresini, Kimberly Jamison, Matthew McHenry ve Raju Metherate imalatı için geç Rudy Limburg teşekkür ve Almut Kelber ve Kentaro Arikawa. Bu çalışma ADB için bir Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Bilimsel Araştırma KJM için Bursu ve NSF hibe IOS-1257627 tarafından desteklenen

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Hücre içi kayıt nedeniyle ilgili pek çok teknik adımlara ana zor bir teknik olabilir. Başarılı deneyler için birkaç önemli noktalar dikkate alınmalıdır. İlk olarak, deney gerçekleştirilmiştir edildiği bir düzgün titreşimli izole tablo önemlidir. Birçok araştırmacı, tamamen üstün titreşim yalıtımı sağlayan, tabandan masanın üzerinde ayrı hava tabloları kullanın. Bizim kurulum mikromanipülatör / elektrot tutucu / numune sahne cihazı yerleştirildiği üstüne bir sandbox, kalın bir mermer tablo içerir. Bu içi gaz veya basınçl...

nöronlar gibi hücrelerinin elektriksel özellikleri voltaj ve akım bir değişiklik olarak hücre zarlarından iyon akışını ölçmek sureti ile görülür. elektrofizyolojik teknikler çeşitli hücrelerde biyo etkinliklerini ölçmek için geliştirilmiştir. hayvanların gözlerine bulunan Nöronlar erişilebilir ve devre elektrofizyolojik çalışma için bu hücreleri iyi adaylar yapım, beyinde genellikle daha az karmaşıktır. Gözde elektrofizyoloji yaygın uygulamalar elektroretinografi (ERG) 1,2 ve mikroelektrot hücre içi kayıt bulunmaktadır. ERG, ya da bir hayvanın gözüne bir elektrot yerleştirme hafif bir uyan uygulamak ve yakındaki hücrelerin 3-6 tepkilerin bir toplamı olarak gerilim değişikliği ölçülmesini kapsar. tek bir kişi fotoreseptör hücrelerinin spektral hassasiyetlerini karakterize, özellikle ilgilenen varsa, genellikle birden fazla hücre tipleri aynı anda belirli bir uyarana farklı güçlerde de tepki; böylece onugözde spektral-benzer fotoreseptör hücrelerinin birkaç farklı türü vardır özellikle ERG verileri belirli hücre tiplerinin hassasiyetlerini belirlemek zor olabilir. Bir potansiyel çözelti göz çoğunluğu R1-6 hücrelerinde eksprese ilgi fotoreseptör (opsin) geni ile Drosophila oluşturmak ve sonra ERGler 7 yapmaktır. Bu yöntemin olası sakıncaları fotoreseptör protein 8 düşük ifadesine hayır ve transgenik hayvan üretimi ve tarama için uzun bir zaman dilimi bulunmaktadır. Spektral farklı fotoreseptör daha az çeşit gözlerde için, renkli filtreler ile gözün uyum böylece ERG bazı hücre tiplerinin katkı düşürücü spektral duyarlılık maxima 9 tahminini izin yardımcı olabilir. Hücre içi kayıt ince bir elektrot bir hücreyi impales başka tekniktir ve bir uyarıcı uygulanır. elektrot kayıtları sadece o individual hücrenin tepkisi kayıt ve çoklu bireysel hücrelerin analiz fizyolojik farklı hücre tipleri 10-14 spesifik hassasiyetlerini verim böylece. Bizim protokol spektral duyarlılık analizi üzerinde duruluyor olsa da, keskin elektrotlar ile kayıt hücre içi temel ilkeleri diğer uygulamalar için değiştirilebilir vardır. Örneğin, bir numune farklı hazırlanmasını kullanarak, ve keskin kuvars elektrotlar kullanılarak, tek bir isteniyor soruya bağlı olarak, beyindeki optik lob veya diğer bölgelerde daha derin kayıt olabilir. Örneğin, bireysel fotoreseptör hücrelerinin 15 yanıt süreleri, optik hücre aktivitesi 19 da benzer teknikler ile kaydedilebilir veya renk uyaranlar kutuplaşma 20 ile değiştirilir olabilir 16 (lamina, medullayı veya lobula 17), beyin 18 veya diğer ganglion loblar -22 veya hareket 23,24 uyaranlara. Fototransdüksiyon, süreç hangi ışık tarafındanEnerji absorbe edildi ve bir elektrokimyasal sinyaline dönüştürülür, hemen hemen tüm bugünkü hayvan fila 25 ortak eski bir özelliktir. fotoreseptör hücrelerinde bulunan ve görsel fototransdüksiyon başlatmaktan sorumludur görsel pigmenti rodopsin olduğunu. Tüm hayvanlarda Rhodopsins retina veya benzer molekül 26,27 türetilen bir opsin proteini, 7 transmembran G-protein kenetli reseptör ailesinin bir üyesi ve bir birleşik kromoforun oluşur. Amino asit dizisi ve kromofor yapısı opsin ışığın farklı dalgaboylarına karşı rodopsin absorbansı etkiler. Foton kromofor tarafından absorbe edildiğinde rodopsin sonuçta zara bağlı iyon kanalları 28 açılmasına neden olur hücrede bir G-proteini başlatarak, aktif hale gelir. En nöronlar farklı olarak, fotoreseptör hücrelerinin ışık uyarısına cevap değişen amplitüdünde görece bir değişiklik olarak ölçülebilir kademeli potansiyel değişimler geçirirler. Tipik olarak, belirli birfotoreseptör tipi tek opsin genini ifade (istisnalar 8,10,29-31 mevcut olsa da). Sofistike renk görme, birçok omurgalılarda ve eklembacaklılar bulunan türden, her biri veya bazen daha fazla rodopsin türlerini ifade fotoreseptör hücrelerinin yüzlerce ya da binlerce karmaşık bir gözle elde edilir. Görsel bilgi renk ve hareket ile tam bir görüntünün algılanması sonucu, göz ve beyinde karmaşık aşağı nöral sinyalizasyonu ile fotoreseptör mozaik üzerinde yanıtları karşılaştırarak yakalanır. hücre içi kayıt yoluyla ışığın farklı dalga boylarında bir fotoreseptör hücre ham tepkilerini ölçmek sonra, onun spektral duyarlılığı hesaplamak mümkündür. Bu hesaplama fotoreseptör hücre yanıtı ancak 32 emer fotonların belirli özelliklerine, o emer fotonların sayısına bağlı olduğunu ifade Univariance İlkesi dayanmaktadır. Abso olan herhangi bir fotontepkiyi neden olacaktır rodopsin tarafından rbed. Uygulamada, bu hücrenin ham tepki genlik (rodopsin yüksek olasılık olduğu dalga boyu emici) (absorbe daha fazla foton) ışık şiddeti bir artış ya bağlı artış, ya da zirveye hassasiyeti doğru dalga boyunda bir kaymaya anlamına gelir. Biz bilinen yoğunluğu ve farklı dalga boylarında tepkiler aynı dalga boyunda ve aynı yoğunlukta ama bilinmeyen bağıl duyarlılık hücresel yanıtları ile ilgili bu prensip faydalanmak. Hücre tipleri genellikle dalga boyunda kendi duyarlılık doruklarına tarafından tespit edilir. Burada geniş bir araştırma topluluğuna bu yöntem daha erişilebilir hale odaklanarak, hücre içi kayıt ve kelebek gözünde fotoreseptör spektral duyarlılık analizi için bir yöntem göstermektedir. Hücre içi kayıt, özellikle böcekler renk görme ile ilgili olarak, literatürde yaygın kalmakla birlikte, Tha buldukmateryal ve yöntemler t açıklamaları genellikle tekniğin yeniden üretimi için izin vermek için çok kısa bulunmaktadır. Biz onun daha kolay çoğaltma izin amacı ile video formatında bu yöntem mevcut. Biz de kolay elde ve uygun fiyatlı ekipmanlar kullanılarak tekniği açıklar. Biz yeni ve karmaşık teknik optimize ederken araştırma yavaşlatmak sık sık rapor değil ortak uyarılar, adres.

<table><tbody><tr><td>Kelebek pupaları</td><td></td><td></td><td>Birkaç yerel tür mevcuttur, nakliye için USDA izinlerine ihtiyaç duyar. Carolina Bio Supply, ek izinlere ihtiyaç duymadan ABD'de sipariş edilebilecek birkaç böcek türüne sahiptir</td></tr><tr><td>Büyük plastik silindir</td><td></td><td></td><td>Nemlendirilmiş kalan herhangi bir oda çalışacaktır</td></tr><tr><td>Böcek pimleri, boyut 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>%100 Çöl Mesquite Bal Tüccarı</td><td>Joe'nun</td><td></td><td>Herhangi bir bal veya sükroz çözeltisi işe yarayacaktır</td></tr><tr><td>Xenon Ark Lambası</td><td>Cumba Aletler</td><td>66003</td><td>Oriel artık Newport Corporation'ın bir parçası</td></tr><tr><td>Evrensel Güç Kaynağı</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel artık Newport Corporation'ın bir parçası</td></tr><tr><td>Optik Parça</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel artık Newport Corporation'ın bir parçası</td></tr><tr><td>Demiryolu Taşıyıcısı, Büyük (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel artık Newport Corporation'ın</td></tr> <tr><td>bir parçasıRaylı Taşıyıcı, Küçük (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel artık Newport Corporation'ın bir parçası</td></tr><tr><td>Diş Adaptörü, 8-32 Erkek - 1/4-20 Erkek, 10'lu paket</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Optik Montaj Direği, 1,0 inç, 0,5 inç Çap Paslanmaz, 8-32 & 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaymaz Optik Direk Tutucu, 2 inç, 0,5 inç. Çap Direkleri, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Sabit lens yuvası, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Sabit lens yuvası, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Kondenser lens düzeneği</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Dışbükey silika lens, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Altı Konumlu Filtre Tekerleği, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Tekerleği Montaj Göbeği</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>İçbükey silika lens, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Kolimatör tutucusu</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Kolimasyonlu ışın probu</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Yüksük Dönüştürücü, 11 mm Standardına Kadar SMA Sonlandırma Yüksük</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>Bu adaptör, fiber optiğin kolimatör tutucusuna sığmasını sağlar&nbsp;</td></tr><tr><td>600 &mu; m çaplı UV-vis fiber obtik kablo</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel artık Newport Corporation'ın bir parçası</td></tr><tr><td>Tahrik üniteli panjur</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV Sigortalı Silika Metalik ND Filtre, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UV Sigortalı Silika Metalik ND Filtre, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV Sigortalı Silika Metalik ND Filtre, 0.5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>UV Sigortalı Silika Metalik ND Filtre, 1.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>UV Sigortalı Silika Metalik ND Filtre, 2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>UV Sigortalı Silika Metalik ND Filtre, 3.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal lamba</td><td>Okyanus Optiği</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometresi</td><td>Okyanus Optiği</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Yazılımı</td><td>Okyanus Optiği</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 300 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 310 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 320 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 330 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 340 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 350 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 360 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 370 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 380 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 390 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 400 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 410 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 420 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 430 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 440 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 450 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 460 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 470 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 480 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 492 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 500 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 510 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 520 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 532 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 540 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 550 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 560 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 570 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 580 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 589 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 600 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 610 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 620 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 632 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 640 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 650 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 660 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 671 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 680 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 690 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>Girişim bant geçiren filtre, 700 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td></td><td></td><td>Topraklanabilen ve deney düzeneğine uyan herhangi bir metal yapı çalışacaktır.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop, 6X, 12X, 25X, 50X büyütme</td><td>Vahşi Heerbrugg</td><td>Vahşi M5</td><td>Herhangi bir Stereomikroskop yapacak</td></tr><tr><td>Sallanan kollu ve ağır tabanlı mikroskop standı</td><td>McBain Aletleri</td><td></td><td>Kolu olan herhangi bir ağır taban</td></tr><tr><td>Kardan kolu</td><td></td><td></td><td>Özel yapım, Bkz. <güçlü>Şekil 4</güçlü></td></tr><tr><td>Fiber-lite yüksek yoğunluklu aydınlatıcı</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>Aydınlatma örneği için</td></tr><tr><td>Fiber-lite kaz boynu ışık kılavuzu</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>Herhangi bir kaz boynu ışık kılavuzu yapacaktır</td></tr><tr><td>Mermer masa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yükseltilmiş ahşap masa</td><td>Kum havuzunun altındaki mermer masanın</td><td></td><td></td> üzerine dayanabilmesi için bu masadan delik açılmalıdır</tr><tr><td>Kumla</td><td></td><td></td> doldurulmuş ahşap kutu <td>Özel yapım, kumlu</td></tr> <tr><td>herhangi bir kutuManipülatör</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrot tutucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Numune aşaması</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topraklama</td><td></td><td></td><td></td>için timsah klipsi telleri</tr><tr><td>İzoleli bakır tel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gümüş tel, 0,125 mm çap</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>BNC kabloları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Headstage ile ön yükseltici</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug Gürültü azaltıcı</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Osiloskopu, 30 MHz, 2 CH, Çift İzleme, Alt tetiklemeli, probsuz</td><td>EZ Dijital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adaptörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab donanımı 2/20</td><td>ADI cihazları</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Labchart yazılımı</td><td>ADI cihazları</td><td>Grafik 5</td><td></td></tr><tr><td>10 MHz Darbe Jeneratörü</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Cam pipet çektirme Sutter</td><td>Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Filamentli borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oluklu plastik tüp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime sıcaklığı balmumu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lehimleme Demir</td><td>Weller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top ve soket manyetik tabanlı platform</td><td>Hama fotoğraf ve video</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift kenarlı karbon çeliği, kırılabilir tıraş bıçağı</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Vazelin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir böcek modeli fotoreseptör hücre spektral duyarlılık belirlenmesi<em&gt; İn vivo</em&gt; hücre içi kayıtlar

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Hücre içi kayıt tek bir hücre belirli bir uyarana tepki nasıl belirlemek için kullanılan güçlü bir tekniktir. vizyon araştırmada, hücre içi kayıt tarihsel bugün hala kullanılmakta olan farklı ışık uyaranlara karşı bireysel fotoreseptör hücrelerinin hassasiyetlerini incelemek için kullanılan ortak bir teknik olmuştur. Ancak, göz hücre içi kayıt deneyleri çoğaltmak isteyen araştırmacılar için literatürde detaylı metodoloji bir eksiklik kalır. Burada daha genel göz fizyolojisini incelemek için bir model olarak böceği sunuyoruz. Böcek fotoreseptör hücreleri gözün yüzeyine yakın bulunan ve bu nedenle ulaşmak kolay ve vizyonu katılan mekanizmaların birçok hayvan filumlarında boyunca korunduğu vardır. Biz e az önce deneyimi olan araştırmacılara bu teknik daha erişilebilir hale getirmek amacı ile, bir kelebeğin gözünde fotoreseptör hücrelerinin in vivo hücre içi kayıt için temel prosedür açıklanmaktadırlectrophysiology. Biz tek bir hücreye bir cam mikroelektrot ve nihayet kayıt işlemini kendisi nasıl takılacağını, kayıt için canlı kelebek nasıl hazırlanacağını, gerekli temel donanımları tanıtmak. Biz de bireysel hücre tiplerinin spektral duyarlılığı belirlemek için ham tepki verilerinin temel analizini açıklar. Bizim protokol spektral duyarlılığı belirleyen odaklanır rağmen, diğer uyaranlara (örneğin, polarize ışık) ve yöntemin varyasyonları bu kurulum için geçerlidir.

Kayıt kurulum birçok unsuru, bir yazılı açıklama yeterli ayrıntı sağlamaz. Şekil 1 tam kayıt kurulumu katılan bileşenlerin şematik olarak göstermektedir. Şekil 2&#39;de, spektrumları bir düzeltme faktörü gereklidir neden sens ve ne bu düzeltme hesaplamak için gerekli olan vermek üzere, beyaz bir ışık ve her bir girişim filtresi için çizilir. 3 fotoğraf ve bunlar için kullanılan kardan kolun bir diyagramını göstermektedir deneyler. Şekil...

hücre içi kayıt elektrofizyolojik teknik gösterdi ve bir kelebeğin bileşik gözünde tek fotoreseptör hücrelerinin spektral hassasiyetlerini belirlemek için kullanılır.

bir Böcek Modeli fotoreseptör hücre spektral Duyarlılık Belirlenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre içi Kayıtlar

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Bu hücre içi kayıt yönteminin genel amacı, bir böcek bileşik gözündeki tekil fotoreseptör hücrelerin spektral duyarlılığını in vivo olarak belirlemektir. Bu yöntem, bir hücrenin duyarlı olduğu ışık dalga boylarının filtreleme pigmentlerinden etkilenip etkilenmediğini anlamamızı sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, tekil fotoreseptörlerin spektral duyarlılıkları bilindiğinde, bir hayvanın hangi renk aralığını görebileceğinin tahmin edilebilmesidir.Kayıt hazırlığı için, deneyden en az 45 dakika önce xenon lambayı ve cam elektrotları çekmeden en az 30 dakika önce mikroelektrot çekicisini açın. Ardından, tüm kayıt ekipmanlarını çalıştırın. Fiber optik kablodan ışık geçmemesi için dekapanşörün varsayılan olarak kapalı olduğundan emin olun.Ardından, mikroelektrot çekici kullanarak ince borosilikat cam mikroelektrotlar çekin. Elektrotları üç molar potasyum klorür ile geri doldurun. Örneği hazırlamak için, mikroskop altında, tek bir kelebeği küçük bir plastik tüpün içine sıcak mumla sabitleyin; böylece baş kısmı hareketsiz kalsın ve tüpün bir ucundan dışarı çıksın.Ardından, hortumu, antenleri ve kanatları balmumu ile sabitleyin. Bundan sonra, abdomeni kuru bir balmumu parçasıyla bastırarak tutun. Tüpün içine, örneğin abdomeninin arkasına ıslak bir mendil yerleştirerek tüpü nemli tutun.Numunenin tamamen hareketsiz olduğundan emin olun. Ardından, tüpü küçük bir parça balmumu kullanarak, manyetik bir tabana bağlı, mafsallı küçük bir platforma sabitleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, referans elektrot olarak ağız kısmı üzerinden kafaya bir gümüş tel yerleştirin.Deneyden önce, teli platforma kalıcı olarak sabitleyin. Ardından, bir ustura bıçağı kullanarak sol korneada küçük bir delik açın ve kurumayı önlemek için deliği Vazelin ile mühürleyin. Kornea kesildikten sonra, kayıt elektrodunu mümkün olan en kısa sürede göze yerleştirin; çünkü gözdeki hemolenf hızla sertleşecek ve elektrodun yerleştirilmesini imkansız hale getirecektir.Mümkünse, diseksiyonu kayıt işleminin gerçekleştirileceği düzenekte yapın. Ardından, timsah klipleri kullanarak kafa aşaması toprak telini numune platformundaki referans elektroda bağlayın. Elektrodu elektrot tutucuya monte edin.Ardından, gümüş teli mikroelektrot içindeki potasyum klorür çözeltisine yerleştirin. Elektrodu göze indirirken, örneği bir stereoskop altında aydınlatmak için kaz boynu bağlantılı bir ışık kaynağı kullanın. Elektrot tutucuyu, mikroelektrot daha önce korneada açılmış olan deliğin tam üzerine gelecek şekilde ayarlayın.Ardından, bir devre tamamlanana kadar mikroelektrodu mikromanipülatör kullanarak gözün içine indirin. Elektrot göze yerleştikten sonra, stereoskopu Faraday kafesinin dışına doğru kaydırın. Numuneyi aydınlatan ışık kaynağını kapatın ve böceği karanlığa adaptasyon için 10 ila 20 dakika boyunca karanlıkta bırakın.Bir nanoamp akım uygulayıp voltajdaki değişimi kaydederek elektrodun direncini kontrol edin. Direnç tipik olarak 100 ile 250 megaohm arasında olmalıdır. Ardından, deney süresince bir ışık flaşı sağlamak için puls jeneratörünü aktifleştirin ve fiber optik kabloyu göze yönlendirin.Her ışık flaşıyla birlikte osiloskopta voltaj değişimini kontrol edin. Voltajdaki negatif değişim, elektrodun henüz hücreye girmediğini belirtir. Maksimum voltaj yanıtı gözlemlenene kadar fiber optik kabloyu numunenin etrafında hareket ettirin.Depolarize eden bir ışık yanıtı oluşturmak için, elektrodun küçük dikey hareketler yapmasını sağlayacak şekilde mikromanipülatörü ileri geri döndürürken, elektrot tutucunun tabanına hafifçe vurun veya preamplifikatördeki buzz fonksiyonunu kullanın. Osiloskopta depolarize eden bir ışık yanıtı görünene kadar küçük ayarlamalar yapmaya devam edin. Ardından, en büyük depolarize sinyali bulmak için fiber optik kabloyu ayarlayın.Elektrodun hücreyi stabil bir şekilde kaydettiğinden emin olmak için mikromanipülatör ile küçük ayarlamalar yapın ve gerektiğinde amplifikatördeki buzz fonksiyonunu kullanın. Stabil bir kayıtta, dinlenme potansiyelinde çok az değişim veya hiç değişim olmamalı, arka plan gürültüsü düşük olmalı ve tutarlı bir şekilde yüksek bir depolarizasyon yanıtı alınmalıdır. Dinlenme membran potansiyelinin gürültülü olmadığı ve zamanla değişmediği stabil bir kayıt elde etmek esastır.Yanıtlar, hiperpolarizasyon olmaksızın geniş ve pozitif olmalıdır. Düzenek stabilize olduğunda yazılımı açın ve dört kanallı bir açılır pencereyi açmak için "Experiments Gallery" adlı diyalog kutusunu kapatın. Yazılım penceresinin sağ üst köşesindeki voltaj ölçeğini 500 millivolt değerine ayarlayın.Ardından, kaydı başlatmak için sağ alt köşedeki Start butonuna tıklayın. Üçüncü ve dördüncü kanalları küçültün ve X ve Y ölçeklerini ayarlayın. Daha sonra, yazılımın deney süresince çalışmasına izin verin.Beyaz ışık stimülasyonu için, hala bir yanıt uyandıran en yüksek OD değerine ayarlanmış ND filtre çarkı ile 10 adede kadar bireysel yanıt kaydedin. Burada, yanıttaki değişim 3,0 OD ve 2,0 OD değerlerinde gösterilmektedir. Ardından, bir yanıt log yoğunluk eğrisi sağlamak amacıyla, 3,5'ten 0,0 OD'ye kadar olan tüm kombinasyonlarda aynı sayıda yanıt kaydedin. Girişim filtrelerini kullanarak hücrenin tüm dalga boylarına verdiği yanıtı kaydetmeden önce, ilk olarak pik dalga boyunu hızlıca belirleyin.Işık yolunda herhangi bir ND filtresi bulunmadığında, oraya UV geçiren bir filtre yerleştirin ve yanıt genliğini kısaca gözlemleyin. İşlemi; pik yanıtın nerede olabileceğine dair bir fikir verecek olan mavi geçiren filtre, yeşil geçiren filtre ve kırmızı geçiren filtre ile tekrarlayın. Başka bir interferans filtresine geçmeden önce, maksimum yanıtı veren filtre dalga boyunu kaydedin.Ardışık filtrelerle yapılan kayıtlar arasında, pik yanıtın zamanla azalıp azalmadığını izlemek amacıyla, ışık yolunda herhangi bir filtre olmadan hücrenin bir veya iki beyaz ışık flaşına yanıt vermesini sağlayın. Ardından, diğer girişim filtreleri ile kayıt yapın ve filtre başına en fazla 10 yanıta izin verin. Bu, bir hücreye girmeden hemen önce görülen büyük bir negatif voltaj değişimine örnektir.Burada, çok az arka plan gürültüsü olan ve tipik olarak en az 40 milivolt değerinde, geniş bir depolarizasyon yanıtı gösteren temiz bir kayıt gösterilmektedir. Burada ise, ana pikten sonra meydana gelen negatif potansiyel değişimi nedeniyle kötü bir kayıt örneği yer almaktadır. Bu da kötü bir kayda dair bir başka örnektir.Dinlenme potansiyeli büyük dalgalanmalar göstermektedir ve yüksek miktardaki arka plan gürültüsü, yanıtın genliğini maskeleyebilir. Bu, tek bir kayıttan elde edilen spektral hassasiyetin temsili bir örneğidir. Hücre tipleri, benzer bir dalga boyundaki pik hassasiyetlerine ve hassasiyet spektrumunun genel şekline göre sınıflandırılır.Ardından aynı hücre tiplerinin ortalaması alınır ve her dalga boyundaki ortalama hassasiyet, standart hata çubuklarıyla birlikte grafiğe dökülür. Bu grafik, bir böcekte bulunan üç tipik hücre tipinin spektral hassasiyetlerini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik yaklaşık iki saatte tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından, tüm fotoreseptör hücre tiplerinin renk ayrımına katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için davranışsal deneyler gerçekleştirilebilir.

determination-photoreceptor-cell-spectral-sensitivity-an-insect-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, hareketsiz hale getirilmiş bir Drosophila'nın gözündeki fotoreseptör aktivitesinin elektrofizyolojik kaydı için protokolü ana hatlarıyla belirtir ve ışık uyaranlarına yanıt olarak voltaj değişikliklerinin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Drosophila Retinal Fotoreseptörlerinin Işık Uyaranlarına Voltaj Yanıtlarının Elektrofizyolojik Kaydı

Video, bir tam hücre konfigürasyonu oluşturarak Drosophila'nın ommatidiumunun fotoreseptör nöronlarındaki elektriksel aktivitenin kaydedilmesini göstermektedir. Geçici reseptör potansiyel kanallarının ışık darbeleri ile aktivasyonunu vurgular ve ölçülebilir kuantum çarpmalarına neden olur.

Drosophila Fotoreseptörlerinden Tüm Hücre Voltaj Kelepçesi Kayıtları

Bu video, bir kelebeğin gözündeki fotoreseptör hücrelerinin in vivo hücre içi kaydı ve tek tek hücre tiplerinin spektral duyarlılığının belirlenmesi prosedürünü göstermektedir. Bu teknik, bireysel fotoreseptör hücrelerinin farklı ışık uyaranlarına duyarlılıklarının incelenmesini sağlar.

Bir Kelebekte Fotoreseptör Hücre Spektral Duyarlılığının İn Vivo Hücre İçi Kaydı

Kaynak: Wagner, K.  et al., eGFP Etiketli Proteinler Kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein kaçakçılığının incelenmesi. J. Vis. Uzm. (2022). Bu video, eGFP etiketli TRPL proteinleri kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein trafiğinin görselleştirilmesini göstermektedir. Görüntüleme için transgenik sineklerin hazırlanmasını, fotoreseptör hücrelerinin floresan görüntülerinin yakalanmasını ve rabdomerelerde nispi eGFP floresansının ölçülmesiyle...

Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein kaçakçılığının incelenmesi

Keskin mikroelektrotlar, canlı Drosophila'da fotoreseptörün ve görsel internöron çıkışının doğru elektrofizyolojik karakterizasyonunu sağlar. Burada, tek tek hücrelerin kontrollü ışık stimülasyonuna yüksek kaliteli voltaj tepkilerini kaydetmek için bu yöntemin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu yöntem, böcek bileşik gözlerinde nöral bilgi işlemeyi incelemek için idealdir.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Burada sayı ve Drosophila melanogaster fotoreseptör sinaptik aktif bölgelerin mekansal dağılımını ölçmek için nasıl göstermek, genetik olarak kodlanmış moleküler işaretleyici ile vurgulanır ve ışığa uzun süreli maruz kalma sonrasında kendi modülasyonu.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Kerevit fotoreseptörlerinin sirkadiyen zamanın bir fonksiyonu olarak duyarsızlaştırma ve duyarlılık geri kazanımı için bir protokol sunulmuştur.

Bir Işık Uyaranteslimi Üzerine Kerevit Fotoreseptörlerinin Duyarsızlaştırılması ve İyileştirilmesi

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Bu video E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem gösteriyor. Disosiye commissural nöronların akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için yararlıdır.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Öğrenin böcek bileşik gözünde hücre içi kayıt yöntemiyle fotoreseptör hücrelerinin spektral duyarlılığını belirlemeyi. Bu teknik, kelebeklerin renk görüş aralığını tahmin etmeye yardımcı olur.

bir Böcek Modeli fotoreseptör hücre spektral Duyarlılık Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet