Name: Glokom uyaran bir de Prosedürü İn Vivo Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Öğrenin, sıçan modelinde episkleral ven enjeksiyonu ile glokom benzeri koşulları indükleyerek retinal gangliyon hücre kaybını nasıl oluşturacağınızı. Bu yöntem, glokom ve nöral koruma stratejilerini araştırmak için etkili bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C. Linn, bir NIH hibesi (NIH NEI EY022795) tarafından desteklenmektedir.

hayvan denekleri kullanan tüm işlemler Western Michigan Üniversitesi&#39;nde Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Enstitüsü standartlarına uygun olmuştur. 1. Hayvanlar <ol><li> Bu çalışmada, erkek ve dişi sıçanlarda 3 aylık kullanın. </li><li> yiyecek ve suya serbest erişim ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde hayvanları tutun. </li></ol> Hayvan Anestezi için KAX Kokteyli 2. Hazırlık <ol><li> 1 mi asepromazin (10 mg / ml) damıtılmış su, 3 ml ile 5 mi, ketamin (100 mg / ml) içinde ksilazin (20 mg / ml), 50 mg eritin. İyice karıştırın. </li><li> bir şırınga filtresi ile sterilize ve 10 mi, serum şişeye bu çözüm saklayın. </li></ol> 3. KAX Enjeksiyon <ol><li> hayvan (g) tartılır ve enjeksiyon için hazır olana kadar kafesin geri dönün. </li><li> 28 G iğne ile 1 ml insülin şırıngası kullanılarak, intraperitonal 0.1 mi KAX / 100 g hayvan vücut ağırlığına enjekte edilir. </li><li> İzin vermekhayvan için bilinçsiz olmak. ayak ve kuyruk kısma refleksleri kontrol edin. </li><li> Ameliyat süresince güvenle laboratuarında tüm hayvanları tutun. </li><li> Post-cerrahi, kafeslerine hayvanlar yerine ve bilinç sağlanıncaya kadar RT rahat tutun. Sadece hayvanlar uyandırmak zaman hayvan tesisine hayvanları dönmek ve normal davranış devam edin. </li></ol> Cerrahi ve Microneedle Meclisi 4. Hazırlık <ol><li> Steril 2 M NaCl çözeltisi olun. </li><li> İki ince konik cam microneedles (Şekil 1D, Şekil 1E) içine bir 0.86 mm iç çap ağır cilalı standart ve ince duvarlı borosilikat tüp çekmek için bir mikroelektrot çektirmesi (Şekil 1C) kullanın. </li><li> 2 M tuz, bir dolgu şırınga iğnesi ve 1 ml şırınga (Şekil 1B) kullanılarak önceki adımda elde edilen bir mikroiğne Dolgu. elektrot ucu hava kabarcıklarını dışarı dokunun. </li><li> 2 M ile ikinci 1 ml şırınga doldurunNaCI ile yıkanmıştır. 18 G iğne bağlayın ve sonra polietilen boru (Şekil 1A) bir uzunluğa (yaklaşık 10 inç) ekleyin. iğne ile tuzlu su ile polietilen boru doldurmak için şırınga pistonu kullanın. </li><li> microneedle ve tüp hem de tuzlu su ile dolu olduğunda, dikkatli bir şekilde birbirine bağlamak. Aralarında bağlantı (Şekil 2) herhangi bir havayı ortadan kaldırın. </li><li> İnce bir ders kağıt havlu tahıl karşı çok hafifçe kazıyarak Mikroiğnenin ucu konik. </li><li> yavaşça sıvının ince bir dere kağıt havlu üzerine görülebilir kadar şırınga pistonu iterek Mikroiğnenin direncini kontrol ediniz. sıvı akıntısı 0.5 mm daha büyük olmalıdır. </li></ol> Animal 5. hazırlanması <ol><li> 2 damla kornea topikal anestetik (Proparakain hidroklorür Oftalmik Solüsyon USP,% 0.5) - 1 uygulayın. Hiçbir göz refleks oluşuncaya kadar bekleyin. </li><li> makasla bıyıkları kesin. </li><li> SDeneysel göz çevresinde betadin çözüm ve çubukla alanına sahip bir pamuk uçlu aplikatör aturate. </li><li> Bir mikroskop kullanarak, göz şişkinliği Episkleral ven ortaya çıkarmak ve göz hareketi kısıtlamak için alt göz kapağı kelepçe bir hemostat ekleyin. (Şekil 3, ok başı) </li></ol> 6. Glokom uyaran Tuzlu Enjeksiyon <ol><li> microneedle montaj ve hayvan hazırlandıkları zaman, enjeksiyon başlar. </li><li> Hayvan ayak / kuyruk tutam tepkisiz olması teyit edildiğinde, dikkatlice ven (Şekil 3, beyaz ok) 10 ve 20 derece arasında düşük bir açıda gelerek microneedle ile Episkleral ven delin. Kan mikroiğne (Şekil 3, siyah ok) ucu girer damar içine başarılı bir lastik belirgindir. </li><li> Yavaş ve el damar içine yaklaşık 50 ul tuzlu su enjekte edilir. Bu, yaklaşık 10 sn almalıdır. Damarlar olacak tuz uçtan bir uca dolaşır olarak mazur beyazugh damar (Şekil 4, ok başı). Bazı bölgeler kan kırmızı bir görünüm (Şekil 4, ok) muhafaza edebilir. <ol><li> tam retina ganglion hücre tabakası tam retina hasarı sağlamak için, karşısındaki ilk site, damar içine ikinci bir enjeksiyon gerçekleştirin. Not: Tuz damar sistemi aracılığıyla dolaşır olarak dakika içinde, bir gözün iris yoluyla ayrı bir bulutlu bir görünüm görmelisiniz. </li></ol></li><li> Bir iç kontrol olarak kullanılmak üzere muamele edilmemiş karşı gözü terk. </li></ol> 7. Hayvan Kurtarma <ol><li> hemostat çıkarın. </li><li> hemostatla tarafından ve enjeksiyon sitelere kenetlenmiş siteye üçlü antibiyotik merhem (basitrasin çinko, neomisin sülfat, polymysin B sülfat) uygulamak için bir pamuk aplikatör kullanın. Göz çevresinde doku hasarı hemostat kullanarak oluşmaz. </li><li> &gt; Bir dolaşan sıcak su battaniye kafeslerine Place anestezi hayvanların prev içinent hipotermi. bilinç ve normal bir davranış kazanmış kadar gözlem altında hayvanları tutun. geri hayvan koloniye uyanık hayvan taşıyın. Hayvanlar kurban zamanına kadar koloni kalır. </li></ol> 8. Hayvan Kurban ve Retina Kaldırma <ol><li> Glokom ikna etmek için prosedürü izleyerek Bir ay, hayvanlar CO 2 boğulma ve ikincil göğüs ponksiyon ile ötenazi. <ol><li> odasında hayvan koyun ve güvenli kapağı koydu. </li><li> % 20 hacmi / dk CO 2 deplasman izin CO 2 ve gaz regülatörü vanaları açın odasındaki oksijen. </li><li> Hayvan sona erecek dört ila 5 dakika bekleyin. </li><li> Her iki vanaları kapatın. </li><li> odasından gelen hayvan çıkarın ve steril bir bisturi ile ikincil göğüs delik gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Ötenazi sonra, göz, bei çevreleyen orbita boşluğuna bağ dokusu kesmek için bir neşter kullanabilirsinizng dikkatli küresi kendi içine kesmek için değil. </li><li> Dikkatle sağlam gözü ayıklamak için optik siniri ve kalan doku kesmek için kavisli kenar makas kullanın. Taze PBS içeren steril bir 60 mm x 15 mm atılabilir bir petri ekstre gözün yerleştirin. </li><li> göz küresi bir göz yuvasını yapın. Bunu yapmak için, neşter ile küçük bir kesi sadece iris ve sklera arasındaki sınır posterior olun. göz küresi kornea yarımkürede kaldırmak için küçük yaylı makas ile göz çevresine bu kesi izleyin. optik sinir bağlı hemisfer kalır. </li><li> ötenazi hayvandan Göz yuvası içinde çok ince pembe / bej retina bulun. Göz yuvası stabilize etmek için körleşmiş forseps ile retinanın pigmentli tabakası tutun. çok yavaşça gözün arka kapalı bütün dokunulmamış retina kızdırmak için kapalı forseps başka bir çift kullanın. , Kısma çekerek, ya da doğrudan retinaya asılarak kaçının. </li><li> kesmek için küçük yaylı makas kullanınOptik sinir hala retinaya bağlı olduğu alan. </li><li> retinadan herhangi bir kalıntı pigment epitel ya da skleral doku kesip emin olun. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak, çok yavaşça taze PBS içeren 35 mm x 10 mm petri kaplı temiz bir sylgard izole retina aktarın. </li></ol> 9. Tüm Montaj Retina Hazırlık <ol><li> Bir kez Sylgard çanak, yerinde retina pin forseps ve bir kaktüs iğne kullanın. yukarı bakacak şekilde retina ganglion hücre tabakası tutun ve aşağı optik sinir. retinanın yarım küre şekli bile tespit sonrasında dikkat çekicidir. retinal ganglion hücre tabakası arzu edilen bir doğrultuda olduğunda retina kavis tavana doğru kıvrılmasına olacaktır. </li><li> optik sinir başı yayılan dört yapraklı yonca şeklini verme, dört parçaya bölünür retina kesmek için küçük bir makas kullanın. </li><li> Mümkün witho olarak retina gibi düz hale getirmek için ek kaktüs iğne ile retina kadran pingerme ut (Şekil 5). </li><li> % 4 paraformaldehid O / oda sıcaklığında N 3 ml Sylgard çanak tutturulmuş retina sabitleyin. </li></ol> Retina 10. Antikor Boyama Not: Birincil ve ikincil antikorlar ile Leke sabit retina retina (Şekil 6) nöronların görüntüleme için. <ol><li> PBS içinde sabit, düz monte retina 2 dakika boyunca üç kez yıkayın. </li><li> 60 dakika boyunca PBS içinde% 1 fetal bovin serumu ile% 1 Triton X-100 ile retina geçirgenliği. </li><li> Durulama PBS içinde üç kez 2 dakika her biri, retina. </li><li> PBS içinde% 0.1 Triton X-100, yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> 45 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 1 Triton X-100 ve% 1 fetal inek serumu ile inkübe edin. </li><li> PBS içinde% 0.1 Triton X-100, yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> PBS içinde 3 mi% 1 fetal inek serumu, her retina inkübesaflaştırılmış fare anti-fare CD90 / fare CD90.1 (1: 300 seyreltme) O / oda sıcaklığında N. </li><li> 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile bir kez retina durulayın. </li><li> PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> İkincil Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG&#39;si ile 3 ml PBS (Resim FBS) her bir retina inkübe (1: 300) O / oda sıcaklığında N. </li><li> liberal PBS ile retina yıkayın. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak dikkatli bir şekilde retinanın kaktüs iğneleri çıkarın. </li><li> Yavaşça bir transfer pipet yardımıyla mikroskop lamı üzerine retina aktarın. tavana bakacak şekilde retina ganglion hücre tabakası ile yönünü korumak için emin olun. retinanın yarım küre şekli bile tespit sonrasında dikkat çekicidir. retinal ganglion hücre tabakası arzu edilen bir doğrultuda olduğunda retina kavis tavana doğru kıvrılmasına olacaktır. </li><li> KimWipe ya da diğer emici madde ile herhangi bir aşırı PBS emer. retina emmek için dikkatli olun. </li><li> ½ gliserol 5 damla ilave edin ve am ağırlık olarak PBS ½tutarlı medya. </li><li> hava kabarcıkları kaçınarak, lamel ile retina örtün. </li><li> net oje, tutkal veya başka bir yapıştırıcı kullanarak güvenli lamel. </li></ol>

Yazarların ifşa edecek çelişkili veya çatışan çıkarları yoktur.

Bu protokol, bir in vivo sıçan modelinde glokom gibi koşulların oluşturulması için bir yöntem tarif eder. Bu prosedür 29, 32. Skar dokusu geliştirilmesi ön kamarada basıncı artar sulu mizah çıkışı tıkar trabeküler ağda yara izi ikna etmek için hipertonik salin enjeksiyonu kullanır. azalmış çıkış ve basınç kurmak ile, elastik ligaman tarafından askıya objektif geri vitreus odasına iter. Vitreus mizah sonra kırılgan retina nöronlar zarar retina üzerine basınç uygular. Bu yordamı kullanarak elde ettiğim...

Glokom özel olarak ise, retinal ganglion hücre 1-2, retina nöronlarını etkileyenler göz hastalıklarının grubudur. Bu hücrelerin aksonları vizyon algılanan beyine görsel bilgileri taşıyan optik sinir olmaya birleşir. RGCs ve akson hasar dolayısıyla görsel kusurları neden olur. glokom bozuklukları ile ilişkili birincil özellikler RGC dejenerasyonu ve ölümü, artan göz içi basıncı (GİB) ve optik diskin çukurluğu ve atrofi vardır. Bu özellikler görme alanı kaybı ya da tam geri dönüşü olmayan körlüğe yol açar. Şu anda, glokom, dünya çapında 70 milyon insanın 3 körlük neden olmuştur. Bunun gibi, körlük 4 dünyanın en büyük üçüncü nedenidir. Glokom RGC kesin ölüm mekanizması bilinmemektedir. Çok araştırma gizem kilidini açmak için yapılmıştır. Glokom birincil risk faktörü bir artış i Bununla birlikte, bilinennedeniyle gözün ön kamarasında sulu mizah (AH) düzensiz dolaşımına n göz içi basıncı. AH gözün avasküler ön kamara kan saydam ve renksiz bir yedek olarak işlev görür. Bu, çevredeki hücreleri besler metabolik süreçler salgılanan atık ürünler kaldırır, nörotransmitter nakil ve patolojik devletlerin 1 sırasında uyuşturucu ve gözün içinde inflamatuar hücrelerin dolaşımını sağlar. Sulu mizah dolaşım bakım siliyer cisim ve trabeküler ağı içerir. Sulu mizah siliyer cisim tarafından üretilir. Daha sonra göz dokusunun genel sağlığını korumak için ön kamaraya akar. 75 - Sıvı siliyer kasta süngerimsi doku üç katmandan süzülür zaman sulu mizah çıkışı% 80 aktif olmayan pigment siliyer epitel içinden salgılanır. trabeküler ağ yoluyla ve hangi satınalmada öncelikli Schlemm Kanalı aracılığıyla sıvı çıkar20 Kalan kan sistemi 5 hayranlarıyla içine ler - çıkışı% 25 trabeküler ağı atlar ve pasif uveo-skleral yolu ile ultrafiltrasyon ve difüzyon tarafından salgılanır. Bu yol göz içi basıncı 1 nispeten bağımsız olduğu görülmektedir. aköz üretimi ve çıkış dengesi olduğunda, basınç gözün içindeki kurar. Belirtildiği gibi, göz içi basıncının bu artış glokom gelişiminde en önemli risk faktörüdür. Bu baskı, gözün arkasındaki retina nöronlarının karmaşık tabakalar hasara neden olur. optik sinir retina ganglion hücre aksonları hasar artık doğru bir görsel bilgi almak için beyin neden olur. Bunun bir sonucu olarak, görüş algılama kaybolur ve tam körlük olabilir. Bugüne kadar, glokom için tedavisi yoktur. Farklı tedavi yöntemleri öncelikle göz içi basıncını azaltmak amacı vardır. Bu harici,Bu beta1-adrenerjik reseptör blokerleri, ya da topik prostaglandin analogları olarak ilaç sınıfları. Beta blokerler sulu mizah 7 üretimini azaltarak göz içi basıncını azaltır. Prostaglandinler sulu mizah 8-14 akışını artırarak GİB&#39;in azaltmak için çalışır. Alfa adrenerjik agonistler, karbonik anhidraz inhibitörleri, aynı zamanda tedavi ikincil yöntem olarak kullanılmaktadır. Alfa adrenerjik agonistler uveoskleral yolunun 15-17 ile çıkışı artar. Karbonik anhidraz inhibitörleri enzimatik inhibisyon 18 ile AH üretimini azaltır. Çok daha invaziv girişimler aynı zamanda glokom tedavisinde kullanılmaktadır. Lazer trabeküloplasti sulu mizah 19 çıkış artırmak için kullanılır. Trabekülektomi adlı başka bir cerrahi tedavi, geleneksel trabeküler yolu 20-21 bloke olduğunda AH filtrelemek için alternatif bir drenaj sitesi oluşturur. Bu tedavi seçenekleri eff bilinmektedirectively Göz içi basıncını düşürmek. Ancak, glokom hastalarının% 40&#39;a varan daha tam tedavi yöntemleri için bir ihtiyaç gösteren, normal GİB göstermektedir. 22,23 Ek olarak başlar ve güncel tedaviler hastalığın ilerlemesini bitmiyor kez glokom görülen retina ganglion hücre ölümü geri döndürülemez 24-28. Bu nöronların kendilerini hayatta hedefleyen etkili nöroprotektif tedaviler gerekliliğini göstermiştir. glokom modellerinin geliştirilmesi, bu gelişimi için çok önemlidir. Bu çalışmada, ilk olarak Morrison 29 ile belirtilen bir tadil edilmiş bir prosedür kullanılarak, yetişkin Long Evans sıçanlarda glokom gibi etkileri başlatmak için bir yöntem gösteriyorlar. Bu prosedürde, episkleral venöz pleksus içine 2 M hipertonik salin enjeksiyonları göz içi basınç artışı ve RGCs önemli bir kayıp w yol açan trabeküler ağda sulu mizah çıkışı azaltmak için doku yara izi ile glokom gibi koşullar indüklerprosedür 30-31 bir ay ithin. Böyle Burada anlatılan biri olarak Glokom uyaran prosedürleri, glokom tedavisinde yeni gelişmeler çözmenin anahtarı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Ksilazin hidroklorür, Minimum% 99</td> <td>Sigma, Yaşam Bilimleri</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin hidroklorür enjeksiyonu, USP, 100mg / ml & nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml şişe</td></tr><tr><td>Asepromazin Maleat, 10mg / ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml şişe</td></tr><tr><td>Serum şişesi, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilikat cam</td></tr><tr><td>1 ml insülin şırıngası&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G iğne&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Çözelti&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroelektrot Çektirme&nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Ağır Cilalı Standart ve İnce Cidarlı Borosilikat Boru</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>filamentsiz, 0,86 mm</td></tr><tr><td>Mikropipetleri doldurmak için mikrofil şırınga iğnesi</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge Luer-Lock iğnesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Şırınga iğnesi</td></tr><tr><td>Esnek Polietilen Boru</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0.034 inç çapında, yaklaşık 10 inç&nbsp;</td></tr><tr><td>Proparakain Hidroklorür Oftalmik Çözelti, USP, %0.5</td> <td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&nbsp; steril şişe&nbsp;</td></tr><tr><td>Kavisli Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica&nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Kanama Durdurucu Kelepçe&nbsp;</td><td>Kavisli kenarlı</td><td>1310912</td> <td>Güzel Bilim</td></tr><tr><td>Araçları Üçlü Antibiyotik Merhem&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Neşter sapı</td><td>Güzel Bilim Araçları&nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçağı #11</td><td>Güzel Bilim Aletleri&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Tek Kullanımlık Petri Kabı</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su 10x Konsantre</td><td>Sigma, Yaşam Bilimleri&nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x seyreltme&nbsp;</td></tr><tr><td>Bahar</td><td>Makas Güzel Bilim Araçları&nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Forseps (2), Dumont # 5</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipetleri, polietilen, steril olmayan</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 veya 52947-948</td><td>1 ve 2 ml derecelendirmeler</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Kolay Kavramalı Petri Kabı&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Kaktüs İğneleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>PX0055-3 veya 818715.0100</td><td>%4'lük bir çözelti haline getirildi&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Hem %1 hem de %0.1'lik çözelti haline getirilmiştir&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Fare Anti-Rat CD90/fare CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat</td><td>554892 1:300 seyreltme&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 keçi anti-fare&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 seyreltme&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G5516-100 ml&nbsp;</td><td>Ağırlıkça %50 gliserol ila %50 PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapak camı&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Kalınlık 1 22 x 50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>C2 Tutulma Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glokom uyaran bir de prosedürü<em&gt; İn vivo</em&gt; rat modeli ve tüm montaj retina hazırlık

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glokom, retinal bez hücrelerin (RGCs) etki eden, merkezi sinir sisteminin bir hastalığıdır. optik sinir oluşturan RGC aksonlar görsel algı için beyne görsel girdi taşırlar. RGCs ve akson hasar görme kaybı ve / veya körlüğe yol açar. glokom spesifik nedeni bilinmemekle birlikte, hastalığın birincil risk faktörü yüksek bir göz içi basıncı. hayvan modellerinde Glokom uyaran prosedürler RGC ölüm mekanizmasını çalışan araştırmacılar için değerli bir araçtır. Bu tür bilgiler görme kaybının önlenmesinde yardımcı olabilir etkili bir nöro-koruyucu tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. 2 M hipertonik salin 50 ul episkleral venöz pleksus enjekte edilir, bir in vivo sıçan modelinde koşulları gibi - bu yazıda protokolü glokom teşvik etmek için bir yöntem tarif eder. damarların Ağartma başarılı bir enjeksiyon gösterir. Bu prosedür glokom simüle etmek için RGCs kaybına neden olur. takip eden bir ayenjeksiyonu, hayvanlar kurban edilmiş ve gözler uzaklaştırılır. Sonraki, kornea, lens ve vitreus bir göz yuvasını yapmak için kaldırılır. Retina sonra gözün arka soyulmuş ve kaktüs iğneler kullanılarak Sylgard yemekleri üzerine tutturulmuş. Bu noktada, retina nöronlarının analizi için boyandı. Bu laboratuvarda elde edilen sonuçlar iç kontroller ile karşılaştırıldığında RGCs yaklaşık% 25&#39;i prosedürü bir ay içinde kaybolur olduğunu göstermektedir. Bu prosedür, bir in vivo sıçan glokom modelinde retinal ganglion hücresi ölümü kantitatif analizi sağlar.

Bu bölüm, bir in vivo sıçan glokom modelinde glokom gibi koşullar uyarılması için kullanılan aygıt bileşenlerini ve prosedürü görüntülemektedir. Biz göz içi basıncı bir artışa neden bir hipertonik salin enjeksiyonu gerçekleştirmek için kullanılan bireysel araç ve gereçleri gösterir. Biz onun karakteristik haşlama etkisi ve sonuçları ön kamara bulutlu görünümü ile episkleral venöz pleksus içine enjeksiyon göstermektedir. Biz de retina kaldırma ve kayıp RGCs analizi için düz monta...

Glokom, retinal ganglion hücrelerinin hasar görmesi ile karakterizedir. Hayvan modellerinde glokomu indüklemek, bu hastalığın incelenmesi hakkında fikir verebilir. Burada, bir in vivo sıçan modelinde RGC kaybını indükleyen ve analiz için tam montajlı retinaların hazırlanmasını gösteren bir prosedürü özetliyoruz.

Glokom uyaran bir de Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Bu prosedürün genel amacı, glokom benzeri durumlar oluşturarak sıçan retinasında belirgin bir retinal ganglion hücresi kaybı meydana getirmektir. Bu yöntem, glokom ve nöral koruma alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, insan glokomunda görülene benzer şekilde retinal ganglion hücrelerinin kademeli kaybına yol açmasıdır.Bu prosedüre başlamak için, mikroelektrot çekici kullanarak ağır cilalı standart ince duvarlı Borosilikat Tüpten iki adet ince uçlu cam mikroiğne çekin. Ardından, bir mililitrelik bir şırınga kullanarak mikroiğnelerden birini iki molar salin ile doldurun. Elektrot ucundaki hava kabarcıklarını vurarak dışarı çıkarın.Ardından, ikinci bir bir mililitrelik şırıngayı iki molar NaCl ile doldurun. Bunu 18 gauge'lik bir iğneye bağlayın ve ardından iğneyi 10 inçlik polietilen tübe takın. Polietilen tübü, iğne aracılığıyla salin ile doldurmak için şırınga pistonunu kullanın.Hem mikroiğne hem de tüp saline ile doldurulduğunda, ikisini dikkatlice birbirine bağlayın. Hava kabarcıklarını vurarak dışarı çıkarıp bağlantıdaki tüm havayı giderin. Ardından, mikroiğne ucunu hafifçe bir kağıt havluya sürterek ince bir eğim oluşturun.Kağıt havlu üzerinde ince bir sıvı akıntısı görülene kadar şırıngadaki pistonu nazikçe iterek mikroiğnenin direncini kontrol edin. İğne ucunun uygun bütünlüğünden emin olmak için sıvı akıntısının genişliği 0.5 millimeter'den fazla olmamalıdır. Bu prosedürde, hayvanı KAX kokteyli ile anestezi ettikten sonra, hayvanın bilinçsiz olduğundan emin olmak için ayaklarını veya kuyruğunu çimdikleyerek refleksleri kontrol edin.Ardından, bıyıkları makasla kırpın. Sonrasında, bir pamuklu çubuk ucunu betadine çözeltisi ile doyurun ve deney gözünün etrafındaki alanı silin. Mikroskop altında, gözü dışarı çıkarmak, episkleral veni açığa çıkarmak ve göz hareketini kısıtlamak için alt göz kapağını bir hemostata ile sıkıştırın.Ardından, mikroiğneyi vene 10 ila 20 derece arasındaki bir açıyla dikkatlice batırarak episkleral veni delin. Kanın mikroiğnenin ucuna girdiği gözlemlendiğinde ven punkasyonu başarılı olmuş demektir. Vene yavaşça 50 µL salin enjekte edin.Tuz vaskülatur boyunca dolaştıkça damarlar beyazlaşır, ancak bazı bölgeler kan kırmızısı görünümünü koruyabilir. Bu prosedürdeki en kritik tek adım, iki molar salinin enjeksiyonu sırasında gerçekleşir. Başarılı bir sonuç elde etmek için vaskülaturda beyazlaşmanın meydana gelmesi zorunludur.Bu işlem için iğnenin sabit tutulması ve 20 derecelik bir açının korunması kritik öneme sahiptir. Ardından, retinal ganglion hücre tabakasının tamamen hasar görmesini sağlamak için vene ikinci bir enjeksiyon gerçekleştirin. Tuz vasküler sistemde dolaşmaya başladıkça, birkaç dakika içinde gözün irisi üzerinden belirgin, bulutlu bir görünüm görülmelidir.Şimdi, göz küresinin kendisine zarar vermemeye dikkat ederek, orbital kavite içindeki gözü çevreleyen bağ dokusunu bir skalpel yardımıyla kesin. Ardından, sağlam göz küresini çıkarmak için optik siniri ve kalan tüm dokuları kavisli uçlu makasla dikkatlice kesin. Çıkarılan göz küresini, taze PBS içeren steril bir petri kabına yerleştirin.Ardından, iris ile sklera arasındaki sınırın hemen arkasından skalpel ile küçük bir insizyon yaparak göz küresinden bir göz çukuru oluşturun. Kornea hemisferini göz küresinden ayırmak için insizyonu göz çevresi boyunca devam ettirin. Göz çukurunu sabitlemek için retinanın pigmente tabakasını pensle tutarken, başka bir pens kullanarak pembemsi-bej renkli, bütün ve sağlam retinayı gözün arka kısmından nazikçe ayırın.Ardından, optik sinirin retinaya tutunduğu bölgeyi kesin veya koparın. Retinadan kalan tüm pigment epitelyumunu veya sklera dokusunu temizlediğinizden emin olun. Daha sonra, izole edilen retinayı taze PBS içeren, Sylgard kaplı temiz bir petri kabına nazikçe aktarın.Sylgard kabına yerleştirildikten sonra, retinayı iğneleyerek sabitleyin. Retinal ganglion hücre tabakasının yukarıya, optik sinirin ise aşağıya bakmasını sağlayın. Ardından, retinayı optik sinir başından dışarıya doğru yayılan dört yapraklı yonca şeklinde dört kadran olacak şekilde kesin.Ardından, retinayı germeden mümkün olduğunca düz hale getirmek için retina kadranlarını ek kaktüs iğneleriyle sabitleyin. Sonrasında, standart boyama prosedürlerini uygulamadan önce, iğnelenmiş retinayı Sylgard kabı içerisinde oda sıcaklığında gece boyunca 3 mL %4 paraformaldehit ile fikse edin. Burada, glokom indükleyici salin enjeksiyonunun uygulanmasından bir ay sonra, kontrol amaçlı işlem görmemiş göz ile deneysel gözün karşılaştırması yer almaktadır.Retinal ganglion hücreleri Thy 1.1'e karşı bir antikor ile işaretlenir. Bu prosedür, RGC sayısında azalmaya, aksonların ana akson demetlerinden ayrılmasına (defasikülasyon) ve kalan RGC'lerin daireselliğinin bozulmasına yol açar. Bunlar, salin enjeksiyonu sonucunda ortaya çıkan karakteristik defasiküle aksonlardır.Retina içinde bir kan damarı ve bunlar da akson demetleri gösterilmektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem doğru şekilde gerçekleştirilirse 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, her zaman yeni, keskin ve eğimli bir mikroiğne kullanmayı hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından; retinal ganglion hücre kaybının hayvanların görme keskinliğini nasıl etkilediği gibi glokomla ilişkili ek soruları yanıtlamak için immünositokimya, Western Blot, in situ hibridizasyon, mRNA sekanslama veya davranışsal analiz gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik geliştirildikten sonra, glokom alanındaki araştırmacıların sıçanlarda nöroprotektif stratejileri keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, episkleral vene hipertonik salin enjeksiyonu kullanarak sıçanlarda nasıl belirgin bir retinal ganglion hücresi kaybı oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Bosco, A.,  et al.  Nörodejenerasyon Sırasında Retinal Mikroglial Aktivasyonun İn Vivo Dinamiği: Fare Glokomunda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre Morfometrisi. J. Vis. Uzm. (2015) Bu video, bir fare glokom modelinde retinal mikroglianın in vivo görüntülemesini göstermektedir. Floresan protein eksprese eden retinal mikrogliaya sahip transgenik bir fare, bir oftalmoskop altına yerleştirilir. Kızılötesi aydınlatma, optik sinir başını (ONH) bulmak için kullanılır ve odak düzlemi,...

Glokomun Fare Modelinde Retinal Mikroglia'nın İn vivo Görüntülenmesi

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

İmmünohistokimya protokolleri retinada, spesifik bir proteinin lokalizasyonu incelemek için kullanılır. Kalsiyum görüntüleme teknikleri retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamiklerini incelemek için istihdam edilmektedir.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Burada, glokom görüldüğü gibi, retinal ganglion hücre kaybına neden murin göz oküler hipertansiyon uyarılması için bir protokol mevcut. Manyetik mikroboncuklarının ön kamaraya enjekte ve sulu mizah çıkışı engellemek için bir mıknatıs kullanarak iridokorneal açı çekti.

Bir Manyetik microbead Oklüzyon Modeli Farelerde Glokom Oküler Hipertansiyon Bağımlı tetikleyebilecek

Aşağıdaki rapor, uygun boya, kontakt lens ve lazer parametreleri kullanılarak nonarteritik anterior iskemik optik nöropatinin (rNAION) kemirgen modelinin nasıl çoğaltılacağını açıklamaktadır. Ayrıca rNAION lezyonunu in vivo olarak değerlendirmek için uygun adımları da ortaya koyuyoruz.

Nonarteritik Anterior İskemik Optik Nöropati Kemirgen Modeli (rNAION)

Bu iletişim kuralı ile nörotransmitter Glutamat wholemount sıçan retina vitro kimyasal neurostimulation bir tür inceleme için bir roman yöntemi açıklar. Kimyasal neurostimulation konvansiyonel elektrik neurostimulation retina nöronların tarafından photoreceptor dejeneratif hastalıklara neden geri dönüşü olmayan körlük tedavisinde umut verici bir alternatiftir.

Biomimetic kimyasal Neuromodulation, sıçan retina nörotransmitter Glutamat Vitro ile için metodoloji

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Kronik oküler hipertansiyon circumlimbal dikiş sıçanlar ve fareler, Retina ganglion hücrelerinin glokom ile tutarlı fonksiyonel ve yapısal bozulma yol uygulayarak indüklenen.

Manken Circumlimbal dikiş sıçanlar ve fareler tarafından indüklenen glokom

Oksijen kaynaklı retinopati (OIR), prematürite retinopatisi ve proliferatif diyabetik retinopati gibi iskemik retina hastalıklarını modellemek ve neovasküler hastalıklar için antianjiyojenik ilaçların değerlendirilmesinde kavram kanıtı çalışmaları için bir model görevi görmek için kullanılabilir. OIR, retinada ölçülebilen sağlam ve tekrarlanabilir neovaskülarizasyona neden olur.

Kemirgenlerde İskemik Retina Hastalıkları için Oksijen Kaynaklı Retinopati Modeli

Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Histoloji, kan-retinal bariyer parçalanma testi ve floresan anjiyografi, retinanın patofizyolojisini anlamak için değerli tekniklerdir ve bu da diyabetik retinopatiye karşı etkili ilaç taramasını daha da artırabilir.

Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme

Bu protokolün amacı, subakut oküler hipertansiyonu indükleyen limbal vasküler pleksusun 360° termik koterizasyonuna dayanan yeni bir glokomatöz nörodejenerasyon modelini karakterize etmektir.

Kemirgenlerde Cerrahi Olarak İndüklenen Glokom için Limbal Vasküler Pleksusun Tam Daire Koterizasyonu

Öğrenin, sıçan modelinde episkleral ven enjeksiyonu ile glokom benzeri koşulları indükleyerek retinal gangliyon hücre kaybını nasıl oluşturacağınızı. Bu yöntem, glokom ve nöral koruma stratejilerini araştırmak için etkili bir model sunar.

Glokom uyaran bir de Prosedürü

Daha fazla video keşfet