Name: Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Keşfedin düşük kaliteli tümör biyopsilerinde hedefli nesil dizileme için ıslak ve kuru laboratuvar süreçlerinin entegrasyonunu. Bu biyoinformatik destekli yöntem, kanser araştırmalarında doğru DNA varyant analizleri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz yazının incelenmesi için Dr. Annette Schlageter teşekkür ederim. Bu çalışma Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü (: GJL PI) hibe CP120017 tarafından kısmen desteklenmiştir.

Not: Bu protokol, MiSeq NGS Sistemi kullanılarak numune eş zamanlı olarak işleme tarif etmektedir, ancak kişisel Genom makinesi (PGM) enstrüman için uyarlanabilir. 400 amplifiye şablonu kopya tavsiye edilen minimum DNA girişi için, deney 318 çip üzerinde PGM kullanılarak 24 numune için NGS çalışma başına 96 örneğin her biri için en az 3000X defa ortalama kapsamı ve eşdeğer kapsamı derinliği üretebilmektedir. Yöntem aynı zamanda, gerçek zamanlı bir PCR cihazı kullanılmasını gerektirir. 1. DNA Fonksiyonel sayısallaştırılması ve Kalite Kontrol (QC) <ol><li> Çözülme reaktifler: 2x ana karışım, Primer prob karışımı, önlenmesi Primer prob karışımı, 6-karboksi-X-rodamin (ROX), seyreltici ve dört insan genomik DNA &#39;kalibrasyon eğrisi standartları (DNA&#39;sı, standart (50 ng / | il), DNA standart (10 ng / | il), DNA standart (2 ng / | il) ve DNA, standart (0.4 ng / ml)) (Tablo 1). 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için tüm reaktifler içeriğini toplamak için Vortex.buz üzerinde 2x ana karışımı tutun. </li><li> Test edilecek numune sayısı için ana karışımı yeterli miktarda hazırlayın ve pipetleme nedeniyle kıtlığı önlemek için% 10 daha fazla hacim bulunmaktadır. numune başına aşağıdaki miktarlar kullanılarak mikrosantrifüj tüp içinde master karışımı hazırlayın: 5 ul 2x Master Mix, 0.5 ul Primer Probe Mix, 0.5 ul İnhibisyon Astar Probe Mix, 0.05 ul ROX ve 2.95 ul Seyreltici. 10 sn içeriğini toplamak için maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için vorteks. </li><li> 96 çukurlu bir plaka gözlerine 9 ul ana karışımı ekleyin. </li><li> Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için iki kez DNA standartları 1 ul ekle. yukarı-aşağı 5 kez pipetleme karıştırın. </li><li> nükleik asit örnek Kullanmadan önce iyice karışmış olduğundan emin olun. Ve aşağı yukarı 5 kez ana karışımı 1 ul örnek ekleyin ve pipetleme karıştırın. </li><li> içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için plaka, vorteks Seal. </li><li> PCR Sistemine plaka koyun. FAM (Fonksiyonel miktar) ve VIC (Fonksiyonel inhibisyon), üreticinin talimatlarına uygun olarak, her bir numune için bir detektör de atama. (95 ° C, 60 ° C de 1 dakika 15 saniye), 95 ° C&#39;de 10 dakika PCR döngüleri gerçekleştirin ve 40 döngü. </li><li> yazılım protokolleri kullanarak yinelenen DNA standartlarının her biri için bir lineer regresyon arsa üreterek qPCR verileri analiz edin. </li><li> X-ekseni üzerinde, her bir DNA standart ve y-ekseni üzerinde karşılık gelen FAM Cı Q değeri kopya sayısının 10 günlük çizilir. </li><li> daha sonra DNA Standartları kalibrasyon eğrisinin dinamik aralığında nükleik asit örnek sonbaharda sonuçları ve referans standart eğrisi üzerinde karşılık gelen konumundan ul başına &quot;işlevsel&quot; veya büyütülebilir kopya sayısında bilinmeyen DNA konsantrasyonu hesaplamak onaylayın. Şekil 1 geçti ve başarısız kalibrasyon eğrileri örneklerini göstermektedir. &lt;/ Li&gt; <li> Amplifikasyon VIC kanal, insan olmayan bir hedef amplikonun olmadığını kontrol ederek, her bir reaksiyon oluştu, belirler. Not: Bir pozitif kontrol olarak, inhibisyon Primer prob karışımı, insan dışı bir ekzojen hedef ve karşılık gelen şablon için spesifik primerler içerir. İnhibisyon Primer prob karışımı hedef içermeyen kontrol (NTC) de dahil olmak üzere, her bir reaksiyonun ilave edilir ana karışımı bir bileşenidir. inhibitörünün yokluğunda, insan olmayan bir hedef için PCR ürünü, her zaman VIC kanalında tespit edilmelidir. VIC kanal için bir örnek bir &quot;tespit edilmemiş&quot; Cı q işleme devam etmeden önce numunesinin daha sonraki temizlik çalışmaları yararlanabilir PCR inhibitörlerinin varlığını gösterir. </li></ol> 2. Kütüphane Hazırlık: Gen-spesifik (GS) PCR <ol><li> Test edilecek numune sayısı için ana karışımı yeterli miktarda hazırlayın ve% 10 pipett nedeniyle kıtlığı önlemek için daha fazla hacim dahiling. Numune başına aşağıdaki birimleri kullanarak bir mikrosantrifüj tüp GS PCR master karışımı hazırlayın: 5 ul 2x Amplifikasyon Master Mix (Tablo 1) ve 1 ul Pan Kanser Astar Paneli (Tablo 1). içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için yukarı ve aşağı, girdap pipet ile karıştırın. </li><li> 96 çukurlu bir plaka gözlerine 6 ul GS PCR ana karışımı kısım. bireysel çukurlar halinde her bir nükleik asit örneği 4 ul ekle. Diğer kuyulara, FFPE Kontrol 4 ul (Tablo 1), birden fazla varyasyon kontrolü (Tablo 1) 4 ul ve usul NTC için nükleaz içermeyen su 4 ul ekle. Her ek için, ve aşağı yukarı 5 kez pipetleme karıştırın. </li><li> içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için plaka, vorteks Seal. </li><li> Aşağıdaki PCR döngü boyunca PCR plakayı: 5 dak 95 ° C,2 devir (95 ° C&#39;de 15 saniye, 60 ° C&#39;de 4 dakika), 23 devir (95 ° C, 72 ° C de 4 dakika 15 saniye) ve 72 ° C&#39;de 10 dakikalık son bir uzatma. 4 ° C&#39;de tutun. Not: Aşama 2.4 tamamlanmasından sonra, plaka GS PCR plaka şu şekilde de ifade edilecektir. </li></ol> 3. kütüphane preparasyonu: Etiket PCR <ol><li> Çözülme reaktifler: 2x Endeksi Master Mix (Tablo 1) ve Dizin Kodları (Tablo 1). 10 sn içeriğini toplamak için maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için vorteks. Not: Endeks Kodları her numune için eşli endeksleri (barkod) eşsiz bir dizi sağlamak için önceden karıştırılır. </li><li> Ve aşağı yukarı 5 kez 96-plaka, iyi belirlenmiş bir 2x Endeksi Master Mix 7.5 ul ve Dizin Kanunu&#39;nun 5.5 ul ekleyin ve pipetleme karıştırın. </li><li> Dikkatle GS PCR plakasını açın ve ana karışımı ile yeni plaka 2 uL GS PCR ürünü ekleyin. yukarı-aşağı 5 kez pipetleme karıştırın. Her numune için, Numune Kimliği ve ilgili ikili Endeks Kodları kaydedin. içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için plaka, vorteks Seal. </li><li> Ve 72 ° C&#39;de 10 dakikalık son bir uzatma (95 ° C, 30 55 ° C, 72 ° C de 1 dk sn 30 saniye), 95 ° C, 10 çevrim 5 dakika boyunca ısıl ve PCR plakasını ° C. 4 ° C&#39;de tutun. Not: Aşama 3.4 tamamlanmasından sonra, levha Etiket PCR plaka şu şekilde de ifade edilecektir. </li></ol> 4. Kütüphane Arıtma ve Boyut Seçimi <ol><li> 2-8 ° C Kütüphane Saf Hazırlık manyetik boncuk (Tablo 1) ve elüsyon tamponu (Tablo 1) kaldırmak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmeye gelmeye bırakın. Yıkama Tamponu (Tablo 1) konteyner, kap 9.6 ml% 100 etanol ilave edin ve şişeyi, birkaç kez baş aşağı çevirerek kanştınn. </li><li> Vortex manyetik 10 saniye boyunca boncuk ve 9 ayrı kuyu içine 11 ul6-çukurlu plaka. </li><li> Etiket PCR plakasını açın ve boncuk ve pipet karışımı 5 kez Etiket PCR ürünü 10 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 4 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> 4 dakika için manyetik stand (Tablo 1) 96 oyuklu plaka koyun. stand de 96 gözlü plaka, çıkarın ve pipet ile süpernatant atılır. </li><li> Ve aşağı yukarı 5 kez manyetik stand 96-plaka çıkarın ve her kuyuya 100 ul etanol içeren Yıkama Buffer ekleyin ve pipetleme karıştırın. 2 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> 2 dakika süreyle manyetik stand 96-plaka koyun sonra çıkarın ve bir pipet ile süpernatant atın. </li><li> İkinci yıkamadan sonra mümkün olduğunca yıkama solüsyonu çıkarma 2 etanol yıkar toplam adımı yineleyin 4.5,. </li><li> Manyetik stand 96 oyuklu plaka, daha sonra, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca boncuk kuru standından plakasını çıkarın. </li><li> Her wel 20 ul elüsyon tamponu eklenerek boncuk tekrarl ve pipet 5 kez ve aşağı yukarı. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> geri 4 dakika süreyle manyetik stand 96-plaka yerleştirin ve dikkatlice çıkarın ve iyi bir yeni açık süpernatant 18 ul aktarın. Not: Prosedür güvenli -15 -30 ° C&#39;de saklanır, bu aşamada ve örnekler de durdurulabilir. , Yeniden devam etmeden önce buz üzerinde donmuş örnekleri Çözülme. </li></ol> 5. Kütüphane Niceleme <ol><li> Çözülme Kütüphane Quant (LQ) reaktifler: 2x LQ Master Mix, LQ Primer / Prob Mix, LQ Standart LQ Pozitif Kontrol, LQ Diluent ve LQ ROX (Tablo 1). 10 sn içeriğini toplamak için maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için vorteks. </li><li> saflaştınldı kütüphanesi ürünleri kullanılarak, LQ Seyreltici içinde her bir numunenin bir seri seyreltme yerine getirir. <ol><li> 198 ul LQ Diluent 2 ul (kütüphane saflaştırılmış ürün) ekleyin ve yukarı ve aşağı bir pipet ile 10 kez karıştırın. </li><li> 1: (100 seyreltme 1) 2 ul ekle98 ul LQ Dilüent ve bir pipet 10 kez ile yukarı ve aşağı karıştırın. </li></ol></li><li> Test edilecek numune sayısı için LQ ana karışımı yeterli miktarda hazırlayın ve pipetleme nedeniyle kıtlığı önlemek için% 10 daha fazla hacim bulunmaktadır. numune başına aşağıdaki miktarlar kullanılarak mikrosantrifüj tüp içinde LQ Master Mix hazırlayın: 5 ul 2X LQ Master Mix, 2 ul LQ Primer / Prob Mix, 0.5 ul LQ Standart ve 0.5 ul LQ ROX. içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj için yukarı ve aşağı, girdap pipet ile karıştırın. </li><li> Optik 96 oyuklu plaka iyi 8 ul LQ ana karışımı ekleyin. </li><li> Ayrı kuyu, 2 ul seyreltilmiş kitaplık, 2 ul LQ Pozitif Kontrol ve 2 ul LQ Sulandırıcısı (NTC) ekleyin ve-ve-aşağı yukarı 5 kez pipetleme karıştırın. içeriğini toplamak için 10 saniye boyunca 400 x g&#39;de 10 saniye ve santrifüj için optik yapışkan film, vorteks ile plaka mühür. </li><li> FAM ve VIC Detecto iki atamaHer numune için rs. (95 ° C, 60 ° C de 1 dakika 15 saniye), 95 ° C de 5 dakika bisiklet koşulları kullanılarak PCR büyütmesi gerçekleştirmek ve 40 döngü. </li><li> Karşılaştırmalı C q yöntemi kullanılarak her bir örnek (nM) konsantrasyonunu belirler. Bilinmeyen kitaplığı (C q FAM) karşı bilinen LQ Standardı (C q VIC) farkını hesaplayın. Seyreltilmiş örnek (pM) konsantrasyonu, aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır: [Konsan lib] nM = 12.5 x 2 Δ Cq 10.000 dışındaki bir seyreltme faktörü kullanıyorsanız, 10.000 hedef seyreltme faktörü oranını hesaplamak ve 5.7 denklemin sonucu bu faktör çarpın. </li></ol> 6. Kütüphane Normalleştirme ve Numune havuzu <ol><li> tüm örnekleri arasında medyan konsantrasyonunu (nM) (her biri benzersiz bir ikili indeksi içeren) toplanmış olması belirleyin. </li><li> Bireysel örnek volum belirleyine (ul) bireysel konsantrasyon (nM) bölünmesiyle sonra, 5 ile tüm örnekleri arasında medyan konsantrasyonunu çarpılarak havuza. en yakın tam sayıya ortaya çıkan değer yuvarlak. Yuvarlak değerleri ile hacimleri &lt;2 ul 2 ul ve hacimleri&gt; 15 ul 15 ul. </li><li> Örnek havuzu oluşturmak için tek bir mikrosantrifüj tüpüne her bir örnek için normalize hacmi (ul) eklenir. </li><li> yuvarlak tamsayı değerlerini kullanarak her bir örnek için yeni konsantrasyonu hesaplayın ve sonuçları kaydedin. </li><li> Örnek havuzu konsantrasyonunu belirlemek için, her bireysel konsantrasyonlarının toplamı hesaplanır ve elde edilen değer (nM) kaydedin. </li><li> Sıralama Dilüent (Tablo 1) kullanılarak 1.25 nM örnek havuzu sulandırmak. Not: Prosedür güvenli -15 -30 ° C&#39;de saklanır, bu aşamada ve örnekler de durdurulabilir. , Yeniden devam etmeden önce buz üzerinde donmuş örnekleri Çözülme. </li></ol> 7. Sıralama <ol><li> DenatURE Aşağıdaki ekleyerek phix kontrol V3 (Tablo 1) varlığında Örnek havuzu: 1.25 nM Örnek havuzu, 0.5 nM phix 3 ul 1 N NaOH 2 ul 15 ul. Vortex kısa kısa bir santrifüj, ardından ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> buz üzerinde denatüre örnek havuzu yerleştirin. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüp önceden soğutulmuş HT1-HYB tampon 992 ul denatüre kütüphane 8 ul ekleyin. Vortex kısa toplanmasını kısa bir santrifüj, ardından karıştırın. buz üzerinde tutun. </li><li> reaktif kartuşunun 17. konumlandırmak için denatüre ve seyreltilmiş kütüphane 600 ul ekleyin. </li><li> Çözülme 1 ile sıralama primerleri (Tablo 1), Dizin Gör sıralama primerleri (Tablo 1) ve oku 2 sıralama primerleri (Tablo 1). mikrosantrifüj tüpleri içinde, ayrı ayrı 636 ul HT1-Hyb tamponu ile 4 ul sıralama primerleri seyreltin. Not: HT1-HYB tampon sağlanan zekâh sıralama reaktif kiti (Tablo 1). </li><li> toplanmasını 10 sn için maksimum hızda 10 saniye ve santrifüj girdap oluşturarak karıştırın. sıralama reaktif kartuşunun 18. konumlandırmak için seyreltilmiş Oku 1 Sıralama Astar 600 ul ekleyin, seyreltilmiş Endeks Okuma Astar 600 ul 20. konumlandırmak için 19. ve seyreltilmiş Oku 2 Sıralama astar 600 ul konumlandırmak için. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak NGS cihazı (Tablo 1) ve sırası ile reaktifler yükleyin. eşleştirilmiş uç 2 x 150 devir sıralama çalıştırması yapın. </li></ol> 8. Veri Analizi Not: NGS enstrüman yazılımı, her numune için (.fastq.gz *) dosyalarını baz çağrıları ve kalite puanları küme görüntüleri dönüştürür ve bireysel gzip sıkıştırılmış fastq oluşturmak için ikili endeksleri ayrıştırır. Çoklaması dosyalarını analiz öncesinde, okuyucu (Tablo indirmek ve ilişkili biyoinformatik yazılımı yüklemeniz gerekir1). Yazılım tüketici sınıf, Windows PC üzerinde monte edilebilir ve uzman bilgisayar donanım veya veri analizini gerçekleştirmek için bir internet bağlantısı gerektirmez. <ol><li> yazılım masaüstü simgesini çift tıklatın. </li><li> Yazılım kılavuzunda verilen kullanıcı adı ve şifreyi kullanarak sisteme giriş yapabilirsiniz. </li><li> Proje panosunu açın ve &quot;New Project&quot; i tıklayın. <ol><li> proje adı ve isteğe bağlı proje açıklamasını. Hedeflenen NGS paneli tipi ve NGS enstrüman türünü seçin. &quot;Kaydet ve devam&quot; tıklayın. </li><li> ileri sıkıştırılmış fastq dosyaları yükleyin ve okur ters. Bu Demultiplex başarısız okur içeriyor &quot;atanmamış&quot; FASTQs, yüklemeyin. &quot;Kaydet ve devam&quot; tıklayın. </li><li> Giriş DNA, fonksiyonel miktar deneyi (yukarıda Adım 1 e bakınız) ile tespit edildiği üzere, her bir kütüphane hazırlanması için kullanılan fonksiyonel giriş kopya sayısı. El ile bir yayılma değerleri veya kopyalama ve yapıştırma değerleri ekleyinaçıklama tabloya levha. &quot;Kaydet ve devam&quot; i tıklayın. </li><li> analiz için yüklendi açıklamalı kütüphaneleri inceleyin ve analiz başlatmak için &quot;analizi Gönder&quot; i tıklayın. </li></ol></li><li> Proje gösterge tablosu üzerinden görüntülenen analiz ilerlemeyi izlemek. Not: Sonuçlar incelenmek üzere hazır olduğunda bir analiz tam durum göstergesi sunulmuştur. </li><li> Yüzdesini kütüphanesinde başına toplam kapsama dahil örnek QC ölçümleri için analiz sonuçları gözden geçirerek filtreleri, amplikon kapsama derinliğini ve tekdüzelik okur. varyant dbSNP Kozmik, 1000 genomları ve fonksiyonel ve nüfus düzeyi açıklama diğer kaynakları ile her sıralı kitaplık için çağrıda inceleyin. </li><li> tamamlayıcı bilişim araçları ile uzun süreli depolama veya alt analizler için özet tablo tablolar, * .bam dosyaları ve * .vcf dosyaları gibi çiğ sonuçları ihracat. </li></ol>

<ol><li>Medicines in Development for Cancer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-cancer-report.pdf ">http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-cancer-report.pdf </a> 1-103 (2014).</li>
<li>Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M. T., Eshleman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+deamination+is+a+major+cause+of+baseline+noise+in+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Cytosine deamination is a major cause of baseline noise in next-generation sequencing.</a> Mol Diagn Ther. 18 (5), 587-593 (2014).</li>
<li>Choudhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+integrated+clinical+workflow+for+targeted+next-generation+sequencing+of+low-quality+tumor+DNA+using+a+51-gene+enrichment+panel%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an integrated clinical workflow for targeted next-generation sequencing of low-quality tumor DNA using a 51-gene enrichment panel.</a> BMC Med Genomics. 7, 62(2014).</li>
<li>Sah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+DNA+quantification+guides+accurate+next-generation+sequencing+mutation+detection+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tumor+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies.</a> Genome Med. 5 (8), 77(2013).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+cancer+gene+mutations+in+clinical+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+colorectal+tumor+specimens+using+targeted+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing.</a> Oncologist. 19 (4), 336-343 (2014).</li>
<li>Latham, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tumor+biopsies%3A+navigating+the+perils+of+old+and+new+technology+to+advance+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies: navigating the perils of old and new technology to advance cancer diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 13 (8), 769-772 (2013).</li>
<li>Crawford, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+business+of+genomic+testing%3A+a+survey+of+early+adopters%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">The business of genomic testing: a survey of early adopters.</a> Genet Med. 16 (12), 954-961 (2014).</li>
<li>Smith, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+technology+platform+for+the+rapid+analysis+of+clinically+actionable+genetic+alterations+and+validation+for+BRAF+p.V600E+detection+in+1549+cytologic+and+histologic+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens.</a> Arch Pathol Lab Med. 138 (3), 371-378 (2014).</li>
<li>Thomas, F., Desmedt, C., Aftimos, P., Awada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tumor+sequencing+on+the+use+of+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Impact of tumor sequencing on the use of anticancer drugs.</a> Curr Opin Oncol. 26 (3), 347-356 (2014).</li>
<li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+a+next-generation+sequencing+screen+for+mutational+hotspots+in+46+cancer-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes.</a> J Mol Diagn. 15 (5), 607-622 (2013).</li>
<li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+highly+multiplexed+PCR+with+semiconductor-based+sequencing+for+rapid+cancer+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Combining highly multiplexed PCR with semiconductor-based sequencing for rapid cancer genotyping.</a> J Mol Diagn. 15 (2), 171-176 (2013).</li>
<li>McCall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+positives+in+multiplex+PCR-based+next-generation+sequencing+have+unique+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">False positives in multiplex PCR-based next-generation sequencing have unique signatures.</a> J Mol Diagn. 16 (5), 541-549 (2014).</li>
<li>Schleifman, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+MUT-MAP%2C+a+high-sensitivity+high-throughput+microfluidics+chip-based+mutation+analysis+panel%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Next generation MUT-MAP, a high-sensitivity high-throughput microfluidics chip-based mutation analysis panel.</a> PLoS One. 9 (3), e90761(2014).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 7, 23(2014).</li>
<li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+measurement+of+hotspot+mutations+in+tumor+DNA+in+blood+using+error-suppressed+multiplexed+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing.</a> Cancer Res. 72 (14), 3492-3498 (2012).</li>
<li>Hagemann, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+next-generation+sequencing+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Clinical next-generation sequencing in patients with non-small cell lung cancer.</a> Cancer. 121 (4), 631-639 (2015).</li>
<li>Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+somatic+genetic+alterations+in+tumor+specimens+by+exon+capture+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing.</a> J Vis Exp. (80), e50710(2013).</li>
<li>Simen, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+next-generation-sequencing+cancer+panel+for+use+in+the+clinical+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory.</a> Arch Pathol Lab Med. 139 (4), 508-517 (2015).</li>
</ol>

JH, AH, RZ, BCH ve GJL çalışanları ve Asuragen, Inc. RZ, BCH stok sahipliğini ve GJL her numune için belirlenen büyütülebilir kopya numarası bilgilerini kullanarak aradığınız varyantı geliştirmek için bir patent başvurusu üzerine ortak mucitler vardır.

NGS teknolojileri klinik ortamlarda 9 tümör biyopsisi moleküler profillerini sorgulamak için beklentileri yeniden tanımlamıştır. Hedeflenen NGS panellerin bir dizi klinik örneklerden 3,5,10-15 çok tip değerlendirmek için araştırma teknolojileri, laboratuvar geliştirilen testler ve piyasada bulunan ürünler ve özel panelleri gibi geliştirilmiştir. Birden fazla çalışmaların raporları genomik değişikler 3,10-12,14 saptanması için hassas ve özgün bir klinik bir araç gibi NGS değeri göstermiştir. Oysa çalışmalar aynı zamanda FFPE 2-5,12,14 örneklerinde olduğu gibi zorlu kanser biyopsilerinden yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir eserler riskini göstermiştir. Buna ek olarak, yeni yayınlar düşük giriş DNA 12 kullanımı ile ağırlaştırılmış ticari hedeflenen NGS panelleri ile 16 ve yalancı pozitif aramalar onkoloji kullanarak NGS için yüksek başarısızlık oranları numuneler sermiştir. Bunun bir sonucu olarak, bazı laboraMuhafazakârlar ya değiştirilmiş ya da ticari olarak temin hedeflenen NGS teknolojileri doğruluğunu sağlamak veya biyoinformatik 5,10,11 analizleri bulguları doğrulamak için sık sık, performansını artırmak için ek kontroller ve dengeler ekledik. 21-gen paneli (Şekil 2) gibi FFPE ve FNA tümör biyopsisi gibi zorlu örnek türlerinde kanıta dayalı, eyleme mutasyonlar sorgulamak için kapsamlı bir NGS sistemi için hedeflenen içerik olarak geliştirilmiştir. Iş akışı bir dizi fayda vardır: üniforma amplikon kapsama (Şekil 3 ve 4, Tablo 3) sağlayarak 1) tutarlılık; 2) kolaylığı kullanımı sağlayarak, optimize edilmiş reaktif setleri önceden formüle ve biyoinformatik gereksinimleri basitleştirilmesi; iş akışını kolaylaştırarak ve diğer ticari NGS yöntemlere kıyasla pipetle çalışma aşamasına sayısını azaltarak 3) verim; Amplifi değerlendirmek için bir DNA QC tahlil birleştirerek ve 4) doğruluğumümkün DNA kopya sayısı kabul edilebilir şablon çeşitliliği sağlamak ve varyant tespiti 4 stokastik dalgalanmaları önlemek için. biyoinformatik analizi ile pre-analitik QC verilerinin entegrasyonu FFPE DNA&#39;nın düşük girişler için izin verir. Bu gerçeğin bağımsız önlemlerle 400 FFPE örneklerinin arasında DNA girişi farklı işlevsel kopyalarını kullanarak bir karar ağacı algoritması eğitim ve biyoinformatik yazılımı içine bu algoritmayı katarak elde edildi. Bunun bir sonucu olarak, FFPE DNA ~ 5-20 ng tipik olarak eşdeğer 400 amplifiye kopyalarının önerilen girişi, FFPE DNA ~ 250 ng 17,18 önerilir melezleştirme tabanlı zenginleştirme dahil olmak üzere diğer yöntemler 10-12 ile karşılaştırıldığında olumlu . teknik MiSeq platformu üzerinde kullanım için tarif edilmiş olmasına rağmen, diğer NGS platformlarda dizi analizi sağlamak için cihaza özel bağdaştırıcılar etiketleyin PCR primerleri kullanılarak modifiye edilebilir. Birkaç adım başarı sağlamak için kritik öneme sahiptirusul. pre-analitik QC tahlil DNA ve raporlar fonksiyonel inhibisyonu büyütülebilir kopya sayısını belirler. 400&#39;den az amplifikasyona tabi tutulabilen DNA kopyası PCR zenginleştirme aşamasında kullanılan, ancak, düşük yoğunluklu mutasyonlar ile numune bir yalancı negatif çağrısı (Şekil 6) bir artış riski vardır. Buna ek olarak, bakım yıkama veya yıkama aşamaları sırasında manyetik boncuk aşırı kurumasını önlemek için kütüphane saflaştırma sırasında alınmalıdır. Bundan başka, başarılı bir kütüphane miktar kütüphane DNA doğru seyreltme oldukça bağımlıdır. En iyi sonuç için, qPCR farkı ≤3.3 Cq olmalıdır örnek kütüphane LQ Standardı (Cq VIC) ile karşılaştırıldığında (Cq FAM) için sonuçları. farklılık daha büyük 3.3 Cq yeniden seyreltme ve numunenin test ise tavsiye edilir. mükemmel bir ilişki, bu rekabetçi qPCR yöntem ve ticari kitler ile gözlenmiştir, ancak bir standart eğri kullanılarak, mutlak kantifikasyon sunanDiğer yöntemler, klonal amplifikasyon aşaması, nispeten kitaplık giriş ofset optimal tohum yoğunluğu elde etmek için gerekli olabilir. Bazı kanser örnekleri, özellikle çünkü DNA izolasyonu sonra devam inhibitörlerinin sıralamak için zorlamaktadır. Kütüphane hazırlık öncesinde bu örnekleri belirlemek için, qPCR QC deneyi de bir iç kontrol ve fonksiyonel inhibisyonu için bir nöbetçi hem de hizmet veren bir eksojen şablonu dahil ederek amplifikasyon inhibe algılar. Sözgelimi, bir melanom, DNA örneği mt önceden sekanslama QC inhibisyonu geçemediğini ve daha sonra dizisi çıkarıldı edilebilir bir kitaplık oluşturmak için başarısız olan Şekil 3&#39;te gösterilmektedir. arıza olasılığı FFPE DNA izolasyon aşamasından taşınan melanin kirlenme, bilinen bir PCR inhibitörü, bir sonucudur. QC tahlili ile tespit numuneler ekstra temizlik adım t yoluyla kurtarılabileceği edilebilir amplifikasyon yetmezliği riski altında olduğuo potansiyel inhibitörleri kaldırın. Hedeflenen 21-gen paneli kanıta dayalı gen noktaları üzerinde duruluyor ve DNA QC, pre-analitik &quot;işlevsel&quot; DNA miktar sonuçları tarafından bilgilendirilir NGS ve biyoinformatik yazılımı için optimize edilmiş reaktifler ve kontrolleri ile komple bir sistem sağlar. yöntem doğru düşük giriş DNA&#39;dan baz ikame mutasyonlar ve indellerin algılar ve bu CNVs gibi ek türevlerini algılamak için ve hedeflenen RNA sıralaması için adapte edilebilir, panel içeriği genişletmek için seçeneği ile bir NGS sisteminin bir örnek sağlar.

Hassas tıp hastaları için tanı ve tedavi seçenekleri bireyselleştirilmesi dayanır. özel tedavilerin söz moleküler tanı ve hedefli tedavilerin bağlantıyı bilgilendirebilir hastalık yollarının daha iyi anlaşılması doğrudan bir sonucudur. Örneğin, moleküler hedefli tedavilerin kullanılması 2013 1 2003 den% 46% 11 yükselmiştir ve vemurafenib ve krizotinib gibi anti-kanser ilaçları arkadaşı tanısal testler ile FDA silinir. doğru son derece çoklanmış örnek setleri arasında düşük bolluk dizisi hedefleri kurtarmak için onun yeteneği ile yeni nesil dizileme (NGS) kanseri ile ilişkili genetik anormallikleri değerlendirmek ve hassas tıp moleküler hedeflerin belirlenmesi için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Moleküler test için en yaygın solid tümör biyopsileri formalin ile fikse dahil, parafine gömülü (FFPE) ve ince iğne aspirasyon (FNA) specimens. Bu örnekler, düşük miktar ve / veya düşük kaliteli doğru NGS 2-5 kıymetlendirmeler meydan nükleik asitler ile doludur. Bu örneklerin analizi için günümüzde piyasada NGS yöntemleri farklı reaktifler, protokoller ve sürekli iyileştirmeler hareketli hedefleri temsil bilişim araçları patchwork dayanmaktadır. Örneğin, tahlil kimyaları ve / veya yazılım değişiklikleri en sık kullanılan hedef NGS kitleri 6 her 1-2 ayda bir meydana geldi. Bu istikrarsızlık oluşturmak ve özellikle kanser testi için, zorlu örnek türleri için bir birleşik NGS sistemi doğrulamada tutarlılık eksikliği yansıtır ve örnek-to-sonuçlarından optimize edilmiştir yapışkan protokolleri geliştirmek için laboratuvarlar üzerine aşırı yük koyar. Nitekim, NGS kullanıcılarından biri son anket kurulan tıbbi dava içerik, kemikleşmiş biyoinformatik uzmanlığı, bir solidifi için gereksinimleri ile birlikte, bu &quot;hızlı değişen&quot; teknolojileri zorluklar vurgulananişbaşı eğitim 7 kolaylaştıran ed ve hızla uygulanabilir entegre prosedür ve aerodinamik iş akışları ve basitleştirilmiş protokolleri. Bu makalede, hedeflenen NGS için kapsamlı bir sistem bu boşlukları giderir tarif edilmektedir. sunulan metodoloji klinik ile ilgili kanser geni loci NGS için hedef ölçümü ve algılama doğruluğu, duyarlılığı ve güvenilirliğini artırmak için ıslak ve kuru hem banklar pre-analitik post-analitik tüm prosedürel adımlar bütünleştirir. Bu yaklaşım, DNA kalitesini değerlendirmek çok düşük şablon kopya sorgulama kaynaklanabilecek yanlış pozitif çağrılarına karşı PCR zenginleştirme aşamasında girdi ve bekçi rehberlik &quot;işlevsel&quot; DNA 4 miktarının ile başlar. Tek tüp multipleks PCR sonra NGS usin için platforma özel dizilerinin katılmasıyla ardından, sadece 400 çoğaltılabilir DNA kopyalarını kullanarak 46 lokus 21 kanser genleri için zenginleştiriyorg ortak bir masaüstü sıralama aletleri. Kütüphaneler basit bir manyetik boncuk prosedür kullanılarak saflaştırılmış ve bir roman, kalibrasyon gerektirmeyen qPCR testi ile ölçülür. Çağrı performansını artırmak için örnek DNA QC sonuçları haberdar Bir bağımsız biyoinformatik paketi, NGS aşağıdaki dizisi analiz sağlar. Biz baz ikame mutasyonlar, ekleme / silmeler (indeller) ortaya çıkarmak için hedeflenen NGS için bu sistem yaklaşımı kullanarak verileri sunmak ve sayısı, FFPE ve İİA örneklerinde ve çalışma gibi düşük kaliteli ve düşük miktar tümör biyopsilerinde (CNVs) varyantları kopyalama kontrol eder.

<table><tbody><tr><td>2x Quantidex Master Mix</td><td>Asuragen</td><td>145345</td><td></td></tr><tr><td>Quant Primer Prob Karışımı</td><td>Asuragen</td><td>145336</td><td></td></tr><tr><td>İnhibisyon Primer Prob Karışımı</td><td>Asuragen</td><td>145344</td> ROX Asuragen 145346 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Seyreltici Asuragen</td></tr><tr><td></td><td></td><td>145339</td><td></td></tr><tr><td>DNA Standardı (50)</td><td>Asuragen</td><td>145340</td><td></td></tr><tr><td>DNA Standardı (10)</td><td>Asuragen</td><td>145341</td><td></td></tr><tr><td>DNA Standardı (2)</td><td>Asuragen</td><td>145342</td><td></td></tr><tr><td>DNA Standardı (0.4)</td><td>Asuragen</td><td>145343</td><td></td></tr><tr><td>2X Amplifikasyon Master Karışımı</td><td>Asuragen</td><td>145348</td><td></td></tr><tr><td>Pan Kanser Primer Paneli</td><td>Asurajen</td><td>145347</td><td></td></tr><tr><td>Pan Kanseri FFPE Kontrolü</td><td>Asuragen</td><td></td><td></td>145349</tr><tr><td>Pan Kanseri Çok Varyantlı Kontrol</td><td>Asuragen</td><td>145350</td><td></td></tr><tr><td>Kütüphanesi Saf Hazırlık Boncukları</td><td>Asuragen</td><td>145351</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama Tamponu</td><td>Asuragen</td><td>145352</td><td></td></tr><tr><td>Elüsyon Tamponu</td><td>Asuragen</td><td>145353</td><td></td></tr><tr><td>2X LQ Master Mix</td><td>Asuragen</td><td>145358</td><td></td></tr><tr><td>LQ Seyreltici</td><td>Asuragen</td><td></td><td></td>145354</tr><tr><td>LQ Pozitif Kontrol</td><td>Asuragen</td><td>145355</td><td></td></tr><tr><td>LQ Standart</td><td>Asurajen</td><td>145356</td><td></td></tr><tr><td>LQ Primer/Prob Karışımı (ILMN)</td><td>Asuragen</td><td>145357</td><td></td></tr><tr><td>LQ ROX</td><td>Asuragen</td><td>145359</td><td></td></tr><tr><td>İndeks Kodları (ILMN) - Set A, AIL001 - AIL048 (48)</td><td>Asuragen</td><td>150004</td><td></td></tr><tr><td>İndeks Kodları (ILMN) - Set B, AIL049 - AIL096(48)</td><td>Asuragen</td><td>150005</td><td></td></tr><tr><td>2x Index Master Mix</td><td>Asuragen</td><td>145361</td><td></td></tr><tr><td>Okuma 1 Sıralama Primerleri</td><td>Asuragen</td><td>150001</td><td></td></tr><tr><td>İndeksi Okuma Sıralama Primerleri</td><td>Asuragen</td><td>150002</td><td></td></tr><tr><td>Okuma 2 Sıralama Primerleri</td><td>Asuragen</td><td>150003</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Seyreltici</td><td>Asuragen 145365</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v3 (600 döngülü)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Nano Kiti v2 (300 döngülü)</td><td>Illumina</td><td>MS-103-1001</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Kontrolü v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Stand-96 (Veya eşdeğer cihaz)</td><td>Ambion</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Quantidex Reporter Yazılımı</td><td>Asuragen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

düşük kaliteli ve düşük miktar tümör biyopsilerinde ve islak ve kuru bench süreçleri entegrasyonu hedefli optimize eder nesil sıralama

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

Tüm yeni nesil dizileme (NGS) prosedürleri biyoinformatik boru hatları ( &quot;kuru tezgah&quot;) kullanılarak gerçekleştirilmiştir analizleri ( &quot;ıslak tezgah&quot;) ve veri laboratuar tezgah yapılan tahliller yer alıyor. Her iki element klinik laboratuvarlar için özellikle kritik olan doğru ve güvenilir sonuçlar üretmek için gereklidir. Hedeflenen NGS teknolojileri giderek önceden hassas ilaç hedeflerine ulaşmasına yardımcı olmak için onkoloji uygulamalarında lehine bulduk, ama yöntemler genellikle kesilir ve ıslak ve kuru tezgah iş akışları ve koordinasyonsuzluk reaktif setleri değişkendir barındırır. Bu yazıda, dizi kapsamlı hedef NGS sisteminin bir örnek olarak, 21 gen paneli olan kanser örnekleri zorlu için bir yöntem tarif eder. Sistem bağımsız biyoinformatik paketi ile analitik-doğrulanmış, tek kaynaklı reaktifler kullanılarak fonksiyonel DNA miktarının ve yeterlilik, tek tüp mültipleksli PCR zenginleşme ve kütüphane arınma ve normalleşme bütünleştirir.Sonuç olarak, doğru varyantı aramalar düşük kaliteli ve düşük miktar formalin ile fikse, parafine gömülü (FFPE) ve ince iğne aspirasyon (FNA) tümör biyopsileri elde edilebilir. yöntem rutin 400 çoğaltılabilir DNA kopyası bir girişten kanserle ilişkili varyantları değerlendirmek ve yeni gen içeriğine uygun olarak tasarım modüler olduğunu. analitik tanımlanmış kontroller iki farklı türde klinik olarak ilgili örnekleri ile kalite güvencesi ve yardım koruma çağrısı doğruluğunu sağlamak. Esnek &quot;etiket&quot; PCR adımı ortak tezgah NGS enstrümanları ile örnek barkod ve uyumluluk sağlamak için platforma özel adaptörler ve endeks kodlarını gömer. Önemlisi, protokol aerodinamik ve tek bir gün içinde 24 dizi hazır kütüphaneleri üretebilir. Son olarak, yaklaşım mutasyon tespit doğruluğunu geliştirmek ve yalancı negatif ve indeterm ayırt etmek için algoritmalar çağıran varyantı doğrudan pre-analitik numune kalite kontrol sonuçları birleştirerek ıslak ve kuru tezgah süreçlerini bağlantılarrafinat aramalar. Bu hedef NGS yöntemi wetware ve yüksek derinlik, çoklanmış sıralama ve teşhis uygulamaları için heterojen kanser örneklerinin hassas analiz elde etmek yazılım hem de gelişmeleri kullanmaktadır.

Pozitif ve negatif kontrolleri, daha önceden, özelliği hücre çizgileri ve artık klinik FFPE tümör biyopsileri gösteren 90 numune (74 benzersiz) toplam sekansı adaptörleri, barkod ile etiketlenmiş amplifikasyona tabi tutulabilen DNA, multipleks PCR zenginleşmeyi girişi için değerlendirildi ve tek analiz edildi 19.1 M üretilen masa üstü NGS enstrüman çalıştırmak (Şekil 2) filtreyi geçen okur. Eşmolar Örnek havuzu yüksek derinliği sekanslama (3,692x okuma) ve düzgün içerisinde (ortalama okuma derinliği 5 kat içinde bulundurulması amplikonların% 97.8) ile sonuçlanmıştır. Aykırı hiçbir şablon kontrolleri, büyük bir kopya sayısı büyütmesi ile bir hücre hattı DNA ve pre-analitik QC deneyi ile PCR inhibisyonu için işaretlendi bir FFPE DNA (Şekil 3) oluşur. 46 amplikonlarının bir şekilde kapsama homojenliği (üç farklı operatörler (Şekil 4A) ve farklı düşük kaliteli FFPE DNA örnekleri kullanılarak muhafaza edilmiştir <stRong&gt; Şekil 4B). artık klinik örneklerden karışımından formüle bir FFPE tümör DNA kontrolü, 3.9, 5.3 bollukları hedef BRAF mutasyon bildirilmiştir (damlacık dijital PCR ile ölçülebilir)% 5 BRAF V600E ulaşmak ve üç operatör tarafından% 6,5 kullanarak 400 amplifiye kopya (ve dolayısıyla sadece 20 mutant kopya) (Şekil 4B ve ilave tablosunun &quot;FFPE3&quot;) bir giriş. % 17 ortalama allel frekansı (Tablo 2) - Dahası, her bilinen bir &quot;sürücü&quot; baz ikame mutasyonu temsil 12 sentetik DNA şablonları bir karışımı 9 amaçlanan aralığında beklenen mutasyonlar saptandı. Kopyalama sayılı büyütmeleri hücre-hattı ve FFPE DNA örnekleri seyreltilmesi EGFR ve Kras sırasıyla (Şekil 5) varyantları için doz-bağımlılığı göstermiştir. Önemlisi, FFPE DNA girişi yalancı pozitif olmadan birkaç 50 büyütülebilir kopya veya toplu DNA 1.2 ng bilinen mutasyonların tespiti koruyarak düşürüldü olabiliraramalar (Şekil 6). DNA girişleri en az 50.000 çoğaltılabilir kopya (Tablo 3) 100 kat aralığında kadar üzerinde ağırladı. Bu ve benzeri deneylerde, varyant 22 FFPE çağırır ve 20 FNA örnekleri paylaşılan mutasyon kapsama (Tablo 4) ile bağımsız yöntemleri ile anlaşma bildirilmiştir. tahlil için duyarlılık ve pozitif öngörü değeri taze dondurulmuş FFPE, FNA, ve hücre-line DNA ve 195 sıralama sonuçları olmak üzere toplam 97 örneklerinin, bir analizinden belirlendi. % 99.7 ve pozitif prediktif değer (PPD) (% 95 CI: Sonuçlar 365 gerçek pozitif varyant aramaları, 4 yanlış negatif aramaları ve% 98.9 duyarlılık (97,1-99,7%% 95 CI) için 1 yanlış pozitif çağrı ortaya : 98,2-99,99%). indellerin analizleri 93.9% bir hassasiyet gösteren, 33 numune ishal iki ortak EGFR varyantlar (p.E746_A750delELREA ve p.V769_D770insASV) için yapılmıştır (% 95 CI: 78,4-98,9%) ve% 100 (% 95 CI bir PPV: 86,3-100%) varyantlarıyla 2,4-84,8% aralıklarında tespit edildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53836/53836fig1.jpg" /> Şekil 1:. Geçiş ve Fail QC Kriterleri (A) geçen standart eğri DNA Niceleme Kalibrasyon Eğrisi Bir ​​Örnek. (B) başarısız standart eğri. Bu durumda, başarısızlık düşük giriş DNA standardının yinelenen pipetleme neden oldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53836/53836fig2.jpg" /> Şekil 2: Onkoloji Uygulamaları için Hedefli Kapsamlı NGS Sistemi Genel Bakış Ön analitik entegrediğerleri, Analitik ve Post-analitik iş akışları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53836/53836fig3.jpg" /> Şekil 3: Okuma Kapsamı ve tekdüzeliği Bozulmamış Hücre-line DNA ve Kontroller ile karşılaştırıldığında düşük kaliteli FFPE DNA Kanser Genler Hedefli NGS için artık klinik FFPE (kapalı daireler), hücre satırı dahil 90 numunelerin toplam (açık daireler. ) ve sentetik kalıp DNA (artı semboller), tek tüp içinde, 21 gen multipleks PCR zenginleştirme kullanılarak işlendi. Her bir amplikon kütüphanesi 2.5 nM&#39;lik bir konsantrasyonda bir tat çift göstergesi miktarı, arıtılmış, kod ve normalize edilmiş olan barkodlanmaktadır NGS alet için adaptör dizileri ile etiketlendi. DNA kütüphanesi tamamlayıcı biyoinformatik yazılımı tarafından sıralandı ve analiz edilmiştir. örnek devikus büyük EGFR kopya sayısı amplifikasyonu (üst, noktalı daire içindeki açık dikdörtgenler) kayda değer bir sayı üretmek için başarısız kapsamı bütünlüğü ve bir melanom FFPE örnek bozuk bağlı okuma açısı, MDA-MB-468 hücre hattı DNA bir seyreltme serisi dahil DNA ekstraksiyon PCR inhibitörlerinin yıkanmaya. melanom örnek yetmezliği (alt, noktalı daire) pre-analitik qPCR DNA QC testi ile tahmin edilmiştir. NTC, no-şablon kontrolü (x semboller). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53836/53836fig4.jpg" /> Şekil 4: Amplikon-by-Amplikon Oku Kapsama, Düzgünlüğü ve Kalıntı Klinik FFPE Tümör DNA&#39;daki Varyant Algılama. (A) ölçülen temsili FFPE DNA örneğinde tüm zenginleştirilmiş loci genelinde kapsama OkuÜç farklı operatörler arasında. Operatör 1, Op1 (mavi bar); Operatör 2, Op2 (yeşil çubuklar); Operatör 3, OP3 (siyah çubuklar). Bilinen% 5 BRAF c.1799T&gt; A mutasyonu oluşan bir kontrol karışımı (FFPE3, gri barlar ve metin dahil) üç FFPE tümör örnekleri kullanılarak değerlendirildi (B) Kapsam düzgünlüğü ve varyant aramaları. FFPE1 (mavi bar ve metin), FFPE2 (turuncu bar ve metin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53836/53836fig5.jpg" /> Şekil 5:. Da iyi karakterize edilmiş EGFR kopya sayısı amplifikasyonu olan hücre hattı ve FFPE DNA, MDA-MB-468 hücre hattı DNA kopya sayısı Türevler doza bağımlı algılama kademeli referans mutasyona uğramamış hücrenin arka içinde seyreltilmiştir line DNA kopya sayısı değişikliği düşüşü göstermek içinseyreltme işlevi. Her bir hücre hattı DNA örneği yüzdesi bir tat hattı (0, 12.5, 25, 50 ve% 100) gösterilmektedir. Bilinen bir KRAS büyütmesi ile bir yumurtalık tümörü FFPE numunesinin seyreltilmesi aynı titrasyon serilerini kullanarak benzer bir profil ortaya ama iki üst hatlar için% 100 FFPE DNA çoğaltır ile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53836/53836fig6.jpg" /> Şekil 6: doğru mutasyon saptanması ve nicelenmesine Dökme 50 ng DNA Amplifiye FFPE DNA kopyası ya da 1.2 FFPE DNA qPCR tabanlı QC analizi ile belirlenen bir kolon kanseri büyütülebilir kopya sayısı, ve AS 25 kopya 400 seyreltilmiştir. sekanslama önce çoklu PCR zenginleşmeyi girişi. biyoinformatik boru hattı doğru bilinen Varian hem deniraşağı 50 kopya ya da ~ 10 mutant şablonları eşdeğer ts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Malzeme / Malzeme Adı </td><td> şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 2x Quantidex Master Mix </td><td> Asuragen </td><td> 145.345 </td></tr><tr><td> Quant Astar Probe Mix </td><td> Asuragen </td><td> 145.336 </td></tr><tr><td> İnhibisyon Astar Probe Mix </td><td> Asuragen </td><td> 145.344 </td></tr><tr><td> ROX </td><td> Asuragen </td><td> 145.346 </td></tr><tr><td> Seyreltici </td><td> Asuragen </td><td> 145.339 </td></tr><tr><td> DNA Standart (50) </td><td> Asuragen </td><td> 145.340 </td></tr><tr><td> DNA, standart (10) </td><td> Asuragen </td><td> 145.341</td></tr><tr><td> DNA, standart (2) </td><td> Asuragen </td><td> 145.342 </td></tr><tr><td> DNA Standart (0.4) </td><td> Asuragen </td><td> 145.343 </td></tr><tr><td> 2x Amplifikasyon Master Mix </td><td> Asuragen </td><td> 145.348 </td></tr><tr><td> Pan Kanser Astar Paneli </td><td> Asuragen </td><td> 145.347 </td></tr><tr><td> Pan Kanser FFPE Kontrolü </td><td> Asuragen </td><td> 145.349 </td></tr><tr><td> Pan Kanser Multi-Varyant Kontrolü </td><td> Asuragen </td><td> 145.350 </td></tr><tr><td> Kütüphane Saf Hazırlık Boncuk </td><td> Asuragen </td><td> 145.351 </td></tr><tr><td> yıkama Tamponu </td><td> Asuragen </td><td> 145.352 </td></tr><tr><td> Elüsyon Tamponu </td><td> Asuragen </td><td> 145.353 </td></tr><tr><td> 2x LQ Master Mix </td><td> Asuragen </td><td> 145.358 </td></tr><tr><td> LQ Seyreltici </td><td> Asuragen </td><td> 145.354 </td></tr><tr><td> LQ PozitifKontrol </td><td> Asuragen </td><td> 145.355 </td></tr><tr><td> LQ Standart </td><td> Asuragen </td><td> 145.356 </td></tr><tr><td> LQ Primer / Prob Mix (ILMN) </td><td> Asuragen </td><td> 145.357 </td></tr><tr><td> LQ ROX </td><td> Asuragen </td><td> 145.359 </td></tr><tr><td> Endeks Kodları (ILMN) - Set A </td><td rowspan="2"> Asuragen </td><td rowspan="2"> 150.004 </td></tr><tr><td> AIL001 - AIL048 (48) </td></tr><tr><td> Endeks Kodları (ILMN) - Set B </td><td rowspan="2"> Asuragen </td><td rowspan="2"> 150.005 </td></tr><tr><td> AIL049 - AIL096 (48) </td></tr><tr><td> 2x Endeksi Master Mix </td><td> Asuragen </td><td> 145.361 </td></tr><tr><td> 1 sıralama primerleri oku </td><td> Asuragen </td><td> 150001 </td></tr><tr><td> Indeksi okunur sıralama primerleri </td><td> Asuragen </td><td> 150.002 </td></tr><tr><td> 2 sıralama primerleri oku </td><td> Asuragen </td><td> 150.003 </td&gt; </tr><tr><td> Ardışık Seyreltici </td><td> Asuragen </td><td> 145.365 </td></tr><tr><td> Illumina MiSeq </td><td> Illumina </td><td></td></tr><tr><td> MiSeq Reaktif Kiti v3 (600 döngü) </td><td> Illumina </td><td> MS-102-3003 </td></tr><tr><td> MiSeq Reaktif Nano Kiti v2 (300 döngüsü) </td><td> Illumina </td><td> MS-103-1001 </td></tr><tr><td> Phix Kontrol v3 </td><td> Illumina </td><td> FC-110-3001 </td></tr><tr><td> Manyetik Stand-96 (Ya eşdeğer cihaz) </td><td> Ambion </td><td> AM10027 </td></tr><tr><td> Quantidex Reporter Yazılım </td><td> Asuragen </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Reaktifler ve Setleri ROX ilk kullanımı üzerine 2-8 ° C&#39;de flakon saklayın. dondurursam etmeyin. Yazılım www.asuragen.com adresinden indirilebilir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Gene </td><td> KOZMİK varyant </td><td> KOZMIK amino asit </td><td> % Varyant </td></tr><tr><td> NRAS </td><td> c.182A&gt; G </td><td> p.Q61R </td><td> 13.3 </td></tr><tr><td> NRAS </td><td> c.35G&gt; A </td><td> p.G12D </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> HRAS </td><td> c.182A&gt; G </td><td> p.Q61R </td><td> 17.8 </td></tr><tr><td> HRAS </td><td> c.35G&gt; A </td><td> p.G12D </td><td> 9.2 </td></tr><tr><td> KRAS </td><td> c.182A&gt; G </td><td> p.Q61R </td><td> 13.5 </td></tr><tr><td> KRAS </td><td> c.35G&gt; A </td><td> p.G12D </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> PIK3CA </td><td> c.1633G&gt; A </td><td> p.E545K </td><td> 9.3 </td></tr><tr><td> PIK3CA </td><td> c.3140A&gt; G </td><td> p.H1047R </td><td> 9.1 </td></tr><tr><td> KIT </td><td> c.2447A&gt; T </td><td> p.D816V </td><td> 14.6 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> EGFR </td><td> c.2369C&gt; T </td><td> p.T790M </td><td> 11.3 </td></tr><tr><td> EGFR </td><td> c.2573T&gt; G </td><td> p.L858R </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> BRAF </td><td> c.1799T&gt; A </td><td> p.V600E </td><td> 17.3 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Bir Toplanmış Sentetik Kontrol 9-17% Bolluk de nicel olan 12 &quot;Sürücü&quot; Kanser Gen Varyantı oluşur 12 farklı mutasyonları taşıyan 12 farklı çift sarmallı sentetik şablonlar bir karışımı sıralama aşağıdaki değerlendirildi.. Tüm varyantlar doğru hiçbir yanlış pozitif ile çağrıldı. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> numune No </td><td nowrap="nowrap"> fonksiyonel cps </td><td> Gen </td><td> KOZMİK varyant </td><td> KOZMIK amino asit </td><td&gt;% Varyant </td><td> Medyan okuma derinliği </td><td> Medyan 5x içinde% </td></tr><tr><td> BCPAP </td><td> 400 </td><td> BRAF </td><td> c.1799T&gt; A </td><td> p.V600E </td><td> 99.5 </td><td> 3289 </td><td> % 96 </td></tr><tr><td> BCPAP </td><td> 10.000 </td><td> BRAF </td><td> c.1799T&gt; A </td><td> p.V600E </td><td> 99.7 </td><td> 4040 </td><td> % 98 </td></tr><tr><td> BCPAP </td><td> 25.000 </td><td> BRAF </td><td> c.1799T&gt; A </td><td> p.V600E </td><td> 99.4 </td><td> 3687 </td><td> % 96 </td></tr><tr><td> BCPAP </td><td> 50.000 </td><td> BRAF </td><td> c.1799T&gt; A </td><td> p.V600E </td><td> 99.7 </td><td> 4611 </td><td> % 93 </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Kapsama ve Varyant Arama DNA Girdi a&gt; 100 kat Range fazla korunmuş olan. </strong&gt; bir BCPAP hücre hattından Amplifiye DNA 400 50.000 kopya ve sıralı de multipleks PCR zenginleştirme girdi oldu. Oku derinliği, kapsama düzgünlüğü, mutasyon belirleme ve mutasyon doğruluğu giriş aralığında korundu. <img alt="Tablo 4" src="/files/ftp_upload/53836/53836table4.jpg" /> Tablo 4: Varyant 22 FFPE ve 20 FNA Tümör Biyopsilerinde Aramalarının Bağımsız Mutasyon Tahliller gelen Sonuçlar katılıyorum önceden dik hedeflenen NGS deneyleri tarafından belirlenen mutasyon statüsüne sahip 22 FFPE tümör DNA kümesi PCR zenginleşmeyi 400 2928 için çoğaltılabilir kopya olarak giriş oldu. adım ve 21-gen Pan Kanser panelini kullanarak sıralandı. Buna ek olarak, 20 FNA DNA örnekleri bir kohort önceden 8 PCR 156 36080 giriş çoğaltılabilir kopyaları ve sıralı kullanılarak amplifiye bir sıvı boncuk dizisi mutasyon deneyi kullanılarak karakterize edilmiştir. Pan Kanser NGS paneli ve refere arasındaki tüm çakışan çağrılarnce yöntemleri anlaşmaya vardı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836table4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Bu prosedürün genel amacı, ıslak laboratuvar reaktiflerini, standartlaştırılmış kontrolleri ve bağımsız bir biyoinformatik paketini birleştiren, zorlayıcı kanser örneklerinin dizilemesi için kapsamlı bir sistemi tanımlamaktır. Bu yöntem, doğru DNA varyant analizleri ve yorumları elde etmek için düşük miktarlı ve düşük kaliteli tümör biyopsilerinin nasıl dizileneceği gibi kanser alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, dizilenmesi zor olan ve yalnızca sınırlı miktarda DNA'ya sahip olan örneklerin, tek kaynaklı reaktifler ve kontroller ile tam entegre biyoinformatik yazılımları kullanılarak hızlı ve güvenilir bir şekilde analiz edilebilmesidir.Genellikle bu yöntemde yeni olan kişiler, hedefli NGS'nin karmaşıklığı nedeniyle zorluk yaşarlar; ancak bu yöntem söz konusu süreci kolaylaştırmaktadır. Bununla birlikte, tüm örnek kütüphanelerinde homojen kapsama alanı elde etmek için kütüphane miktar tayini ve örnek havuzlama prosedürleri özel dikkat gerektirir. Bu protokol, zorlayıcı kanser örneklerinin dizilenmesi için ıslak ve kuru laboratuvar süreçlerini entegre etmektedir.İlk adım, gerçek zamanlı PCR ile amplifiye edilebilecek DNA kalıp kopyalarının sayısını belirlemek için DNA'nın nicel ve nitel analizidir. Bir mikrocentrifüj tüpünde yeterli miktarda master mix hazırlayarak örnek nicelendirme ve kalite kontrol işlemine başlayın. Örnek başına şu hacimleri kullanın: 5 µL 2x master mix, 0,5 µL primer prob karışımı, 0,5 µL inhibisyon primer prob karışımı, 0,05 µL ROX ve 2,95 µL seyreltici.Bir 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna dokuz µL master mix ekleyin. DNA standartlarından bir µL'yi çift örneklü olarak ekleyin ve pipetle beş kez yukarı-aşağı çekerek karıştırın. Nükleik asit örneğinin iyice karıştığından emin olduktan sonra, master mix'e bir µL örnek ekleyin ve pipetle beş kez yukarı-aşağı çekerek karıştırın.Kapatılmış plakayı PCR sistemine yerleştirin. 95 °C'de 10 dakika boyunca PCR döngülerini gerçekleştirin, ardından 95 °C'de 15 saniye ve 60 °C'de bir dakika şeklinde 40 döngü uygulayın. Her bir çift DNA standardı için doğrusal regresyon grafiği oluşturarak qPCR verilerini analiz edin.Bilinmeyen DNA'nın mikrolitre başına fonksiyonel veya amplifiye edilebilir kopya sayısı konsantrasyonu, protokol metninde açıklandığı şekilde hesaplanır. Örnek miktar tayini ve kalite kontrolünden sonraki adım, tek tüplü multipleks PCR ile kanser sıcak nokta sekanslarının zenginleştirilmesidir. 21 kanser genindeki 46 lokusu zenginleştirmek için gene özgü veya gsPCR gerçekleştirilecektir.Numune başına 5 µL 2x amplifikasyon master mix ve 1 µL pan-kanser primer paneli kullanarak, bir mikro santrifüj tüpünde yeterli miktarda gsPCR master mix hazırlayın. 96 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa 6 µL gsPCR master mix paylaştırın. Ayrı kuyucuklara her bir nükleik asit numunesinden 4 µL ekleyin.Beş kez pipetleyerek karıştırın. Uygun kontrolleri ekleyin. Kapalı plakayı aşağıdaki PCR döngüleri için termosikletöre yerleştirin.95 °C'de beş dakika. 95 °C'de 15 saniye ve ardından iki döngü boyunca 60 °C'de dört dakika. 95 °C'de 15 saniye ve ardından 23 döngü boyunca 72 °C'de dört dakika.72 °C'de 10 dakikalık nihai bir uzatma aşaması ve ardından 4 °C'de bekletme uygulanır. Gene özgü PCR sonrası, yeni nesil dizileme ile uyumluluk için platforma özgü adaptörleri dahil etmek amacıyla 10 döngü tag-PCR gerçekleştirin. 96 kuyucuklu bir plakanın belirtilen kuyucuğuna 7,5 µL 2x indeks master mix ve 5,5 µL indeks kodu ekleyin ve pipetle beş kez yukarı-aşağı çekerek karıştırın.gsPCR plakasını dikkatlice açın ve master mix içeren yeni plakaya iki mikrolitre gsPCR ürünü ekleyin. Kapatılmış plakayı şu PCR döngüleri için termosikletöre yerleştirin: 95 °C'de beş dakika, 10 döngü boyunca 95 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de bir dakika, ardından 72 °C'de 10 dakikalık final uzatma. Sonrasında 4 °C'de bekletin.Tag-PCR sonrası kütüphane saflaştırması ve boyut seçimi, manyetik boncuk kimyası kullanılarak gerçekleştirilir. Bu prosedüre, 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına 11 µL library pure prep manyetik boncuğu ekleyerek başlayın. Tag-PCR plakasını açın, boncukların üzerine 10 µL tag-PCR ürünü ekleyin ve pipetle beş kez aşağı yukarı çekerek karıştırın.Karışımı oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin. 96 kuyucuklu plakayı dört dakika boyunca manyetik standa yerleştirin. 96 kuyucuklu plaka hala stand üzerindeyken, süpernatanı bir pipet yardımıyla çekerek uzaklaştırın ve atın.Protokol metninde açıklandığı şekilde boncukları yıkama tamponu içeren etanol ile iki kez yıkadıktan sonra, boncukları oda sıcaklığında iki dakika boyunca kurutun ve ardından plakayı stanttan çıkarın. Her kuyucuğa 20 µL elüsyon tamponu ekleyip beş kez pipetleyerek boncukları yeniden süspande edin. Oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkübe edin.96 kuyucuklu plakayı dört dakika boyunca manyetik stant üzerine geri yerleştirin ve berrak süpernatanttan 18 µL dikkatlice alarak yeni bir 96 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Bu protokoldeki bir sonraki adım, her bir saflaştırılmış örnek kütüphanesinin relatif kompetitif gerçek zamanlı PCR ile kantifikasyonudur. Bu prosedüre başlamak için, bir mikrosantrifüj tüpünde örnek başına şu hacimleri kullanarak yeterli miktarda LQ master mix hazırlayın: 5 µL 2x LQ master mix, 2 µL LQ primer prob karışımı, 0.5 µL LQ standart ve 0.5 µL LQ ROX.Optik 96 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna 8 µL LQ master mix ekleyin. Ayrı kuyucuklara, kütüphanenin seri dilüsyondan 2 µL, 2 µL LQ pozitif kontrol ve 2 µL LQ dilüent ekleyin ve pipetle beş kez yukarı aşağı çekerek karıştırın. Mühürlenmiş plakayı PCR sistemine yerleştirin ve her örnek için hem FAM hem de VIC detektörlerini atayın.Aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin: 95 °C'de beş dakika, ardından 40 döngü boyunca 95 °C'de 15 saniye ve 60 °C'de bir dakika. Ardından her örneğin konsantrasyonu, protokol metninde açıklandığı şekilde hesaplanır. Kütüphane miktar tayininin ardından, her bir örnek kütüphanesi ölçülen konsantrasyonuna göre normalize edilir ve dizileme için tek bir tüpte birleştirilir.Kütüphane normalizasyonu ve örnek havuzlama hesaplamalarını kolaylaştırmak için basitleştirilmiş bir analiz modülü kullanılır. Kütüphaneyi normalize etmek için, öncelikle havuzlanacak benzersiz bir çift indeks içeren tüm örneklerdeki nanomolar cinsinden medyan konsantrasyonu belirleyin. Ardından, tüm örneklerdeki medyan konsantrasyonu beşle çarpıp ardından örneğin kendi konsantrasyonuna bölerek, havuzlanacak bireysel örnek hacmini mikrolitre cinsinden belirleyin.Örnek havuzunu oluşturmak için her bir örnek için normalize edilmiş hacmi tek bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin. Örnek havuzunu, sekanslama dilüenti kullanarak 1,25 nanomolar seviyesine seyreltin. Phix kontrol V3 varlığında denatüre ederek örnek havuzunu sekanslamaya hazırlayın. Şunları birleştirin: 15 mikrolitre 1,25 nanomolar örnek havuzu, üç mikrolitre 0,5 nanomolar phix ve iki mikrolitre 1N sodyum hidroksit.Kısa bir vorteks ve santrifüj işleminin ardından, oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Bir mikrosantrifüj tüpü içerisindeki 992 µL önceden soğutulmuş HT1 yüksek tamponuna, denatüre edilmiş kütüphaneden 8 µL ekleyin. Denatüre edilmiş ve seyreltilmiş kütüphaneden 600 µL'yi reaktif kartuşunun 17 numaralı konumuna ekleyin.Mikrosantrifüj tüplerinde, her bir sekanslama primerinin dört mikrolitresini 636 mikrolitre HT1 yüksek tampon ile ayrı ayrı seyreltin. Seyreltilmiş read-1 sekanslama primerlerinden 600 mikrolitreyi sekanslama reaktif kartuşunun 18 numaralı konumuna ekleyin. Seyreltilmiş indeks okuma primerlerinden 600 mikrolitreyi 19 numaralı konuma ve seyreltilmiş read-2 sekanslama primerlerinden 600 mikrolitreyi 20 numaralı konuma ekleyin.Reaktifleri yeni nesil dizileme cihazına yükleyin ve üretici talimatlarına göre eş uçlu (paired end), 2x150 döngülü bir dizileme çalışması gerçekleştirin. Son olarak, dizileme verilerini beraberindeki biyoinformatik yazılımını kullanarak analiz edin. Masaüstü bir dizileyici kullanılarak tek bir NGS çalışmasında toplam 90 örnek işlenebilmektedir.Gösterilen veri seti için örnekler; hücre hattı, kalıntı klinik formal ve fikse edilmiş parafin gömülü veya FFPE ve sentetik şablon DNA'yı içermiş olup, yüksek derinlikli dizileme ve homojen kapsama ile sonuçlanmıştır. Aykırı değerler; şablon kontrolsüzleri (NTC), büyük kopya sayısı amplifikasyonuna sahip bir hücre hattı DNA'sının dilüsyon serisini ve preanalitik qPCR tabanlı kalite kontrol (QC) testi tarafından PCR inhibisyonu nedeniyle işaretlenen bir FFPE DNA'sını kapsamaktaydı. 46 amplikon boyunca kapsama homojenliği, üç farklı operatör tarafından ve farklı düşük kaliteli FFPE DNA örnekleri için korunmuştur.Bilinen %5 BRAF V600E mutasyonuna sahip FFPE tümör DNA kontrol karışımında, 400 amplifike edilebilir kopya girdi kullanan üç operatör tarafından hedef BRAF mutasyonunun ortalama %5,2 ± 1,3 bollukta olduğu rapor edilmiştir. Hücre hattı ve kopya sayısı amplifikasyonları olan FFPE DNA örneklerinin dilüsyonları, EGFR ve KRAS amplifikasyonu için doz bağımlılık göstermiştir. Önemli bir nokta olarak, FFPE DNA girdisi 50 amplifike edilebilir kopya veya 1,2 nanogram bulk DNA kadar düşük seviyelere indirilebilmiştir.Bilinen mutasyonların saptama kapasitesini korurken, herhangi bir yanlış pozitif sonuç oluşmasını engeller. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde, sefer başına 24 örneklik bir grup için yaklaşık üç buçuk saatlik aktif çalışma süresiyle toplam 11 saatte tamamlanabilir.

integration-wet-dry-bench-processes-optimizes-targeted-next

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Bu el yazması, iki yeni nesil dizileme paneli için klinik protokolleri açıklamaktadır. Bir panel hematolojik maligniteleri sorgularken, diğer panel solid tümörlerde sıklıkla mutasyona uğrayan genleri hedef alır. İnsan malignitelerindeki sürücü mutasyonlarının moleküler sınıflandırması, değerli prognostik ve öngörücü bilgiler sunar.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

Yüksek kaliteli genomik DNA tümör dokulardan alma genetik değişiklikler sonraki nesil sıralama kullanarak analiz etmek için önemli bir ilk adım olduğunu. Bu makalede, biz tümör hücreleri zenginleştirmek ve bozulmamış DNA touch Künye Sitoloji numune almak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Solid tümör dokularının kantitatif immün profillerini belirlemek ve immün-onkoloji biyomarker keşfi için klinik kohortlardan yararlanmak için RNA tabanlı bir yaklaşımın kullanımı moleküler ve enformatik protokollerle açıklanmıştır.

Solid Tümörlerin Prediktif İmmün Modellemesi

Otomatik doku diseksiyonu ile dijital ek açıklama, düşük tümör içerikli vakalarda tümörü zenginleştirmek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar ve hem parafin hem de dondurulmuş doku tiplerine uyarlanabilir. Açıklanan iş akışı doğruluğu, tekrarlanabilirliği ve verimi artırır ve hem araştırma hem de klinik ortamlara uygulanabilir.

Düşük Tümör İçeriği Dokularında Tümör Zenginleştirme için Otomatik Diseksiyon Protokolü

Protokol, doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere 10x Genomik platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar.

Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

Bu makale, biyobankacılık, kişiselleştirilmiş tıp ve diğer araştırma uygulamaları için faydalarını optimize etmek üzere tasarlanmış meme kanseri örneklerinin toplanması için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Meme biyopsisi ve mastektomi prosedürleri de dahil olmak üzere numune toplama iş akışı, doku hasarını en aza indirmeye ve numune kalitesini en üst düzeye çıkarmaya odaklanarak ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Meme Biyopsisi ve Mastektomi Örnek Toplama İşlemlerinin Biyobankacılık, Kişiselleştirilmiş Tıp ve Araştırma Uygulamaları için Optimizasyonu

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda hedeflenebilir genomik değişiklikleri tespit etmek için otomatik, ISO15189 onaylı yeni nesil dizileme iş akışını açıklar.

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hedeflenebilir Değişikliklerin Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak Saptanması

Keşfedin düşük kaliteli tümör biyopsilerinde hedefli nesil dizileme için ıslak ve kuru laboratuvar süreçlerinin entegrasyonunu. Bu biyoinformatik destekli yöntem, kanser araştırmalarında doğru DNA varyant analizleri sağlar.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama (Video) | JoVE Journal

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Daha fazla video keşfet