Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Bu prosedürün genel amacı, ıslak laboratuvar reaktiflerini, standartlaştırılmış kontrolleri ve biyoinformatik paketi boyunca bir standı birleştiren zorlu kanser örneklerini sıralamak için kapsamlı bir sistemi tanımlamaktır. Bu yöntem, doğru DNA varyant analizleri ve yorumları elde etmek için düşük miktarda ve düşük kaliteli tümör biyopsilerinin nasıl sıralanacağı gibi kanser alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, dizilenmesi zor olan numunelerin, yalnızca sınırlı DNA miktarlarına sahip olan numuneler olması, tek kaynaklı reaktifler ve kontroller ve tam entegre biyoinformatik yazılımı kullanılarak hızlı ve güvenilir bir şekilde analiz edilebilmesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bu yöntemin basitleştirdiği hedeflenen NGS'nin karmaşıklığı nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bununla birlikte, kitaplık niceleme ve örnek havuzlama prosedürleri, tüm örnek kitaplıklarında tek tip kapsama elde etmek için özel dikkat gerektirir. Bu protokol, zorlu kanser örneklerinin dizilimi için ıslak ve kuru tezgah işlemlerini entegre eder.

İlk adım, gerçek zamanlı PCR ile amplifiye edilebilecek DNA şablon kopyalarının sayısını belirlemek için DNA'nın nicelleştirilmesi ve kalifikasyonudur. Bir mikrosantrifüj tüpünde yeterli miktarda ana karışım hazırlayarak numune miktar tayini ve kalite kontrolü prosedürüne başlayın. Numune başına aşağıdaki hacimleri kullanın, 5 mikrolitre 2x ana karışım, 0.5 mikrolitre primer prob karışımı, 0.5 mikrolitre inhibisyon primer prob karışımı, 0.05 mikrolitre ROX ve 2.95 mikrolitre seyreltici.

96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dokuz mikrolitre ana karışım ekleyin. DNA standartlarının bir mikrolitresini iki kopya halinde ekleyin ve beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Nükleik asit numunesinin iyice karıştığından emin olduktan sonra, numunenin bir mikrolitresini ana karışıma ekleyin ve beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Mühürlü plakayı PCR sistemine yerleştirin. 95 santigrat derecede 10 dakikalık PCR döngüleri, ardından 95 santigrat derecede 15 saniyelik 40 döngü ve 60 santigrat derecede bir dakika PCR döngüleri gerçekleştirin. Yinelenen DNA standartlarının her biri için doğrusal bir regresyon grafiği oluşturarak qPCR verilerini analiz edin.

Bilinmeyen DNA'nın mikrolitre başına fonksiyonel veya çoğaltılabilir kopya sayısındaki konsantrasyonu daha sonra protokol metninde açıklandığı gibi hesaplanır. Numune miktar tayini ve kalite kontrolünden sonraki adım, kanser sıcak nokta dizilerinin tek tüplü multipleks PCR ile zenginleştirilmesidir. Gen spesifik veya gsPCR, 21 kanser geninde 46 lokus zenginleştirmek için yapılacaktır.

Örnek başına aşağıdaki hacimleri, beş mikrolitre 2x amplifikasyon ana karışımını ve bir mikrolitre pan-kanser primer panelini kullanarak bir mikrosantrifüj tüpünde yeterli miktarda gsPCR ana karışımı hazırlayın. Altı mikrolitre gsPCR master karışımı, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna karıştırılır. Her nükleik asit örneğinden dört mikrolitre ayrı ayrı oyuklara ekleyin.

Beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Uygun denetimleri ekleyin. Aşağıdaki PCR döngüleri için kapalı plakayı termodöngüleyiciye yerleştirin.

95 santigrat derecede beş dakika. 95 santigrat derecede 15 saniye, ardından iki döngü için 60 santigrat derecede dört dakika. 95 santigrat derecede 15 saniye, ardından 23 döngü için 72 santigrat derecede dört dakika.

72 santigrat derecede 10 dakikalık son bir uzatma ve ardından dört santigrat derecede tutma. Gene özgü PCR'den sonra, yeni nesil dizileme ile uyumluluk için platforma özel adaptörleri dahil etmek için 10 döngü etiket-PCR gerçekleştirin. 7,5 mikrolitre 2x indeks ana karışım ve 5,5 mikrolitre indeks kodunu 96 oyuklu bir plakada belirtilen bir kuyucuğa ekleyin ve beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

gsPCR plakasını dikkatlice açın ve ana karışımla birlikte yeni plakaya iki mikrolitre gsPCR ürünü ekleyin. Kapalı plakayı aşağıdaki PCR döngüleri için, 95 santigrat derecede beş dakika, 95 santigrat derecede 30 saniye, 55 santigrat derecede 30 saniye ve 10 döngü için 72 santigrat derecede bir dakika ve 10 santigrat derecede 72 dakikalık son uzatma için termosiklere yerleştirin. Ardından dört santigrat derecede tutmak.

Tag-PCR'yi takiben, kütüphane saflaştırması ve boyut seçimi, manyetik boncuk kimyası kullanılarak gerçekleştirilir. Bu prosedüre, 96 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına 11 mikrolitre kütüphane saf hazırlık manyetik boncukları ekleyerek başlayın. Etiket-PCR plakasını açın ve boncuklara 10 mikrolitre etiket-PCR ürünü ekleyin ve beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Karışımı oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin. 96 oyuklu plakayı dört dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin. 96 oyuklu plaka hala standın üzerindeyken, süpernatanı bir pipetle çıkarın ve atın.

Boncukları protokol metninde açıklandığı gibi etanol içeren yıkama tamponu ile iki kez yıkadıktan sonra, boncukları oda sıcaklığında iki dakika kurutun ve ardından plakayı standdan çıkarın. Her bir oyuğa 20 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyerek ve beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek boncukları yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin.

96 oyuklu plakayı dört dakika boyunca manyetik standa geri yerleştirin ve 18 mikrolitre şeffaf süpernatantı dikkatlice çıkarın ve yeni bir 96 oyuklu plakadaki bir kuyuya aktarın. Bu protokoldeki bir sonraki adım, her bir saflaştırılmış numune kütüphanesinin göreceli rekabetçi gerçek zamanlı PCR ile miktarının belirlenmesidir. Bu prosedüre başlamak için, numune başına aşağıdaki hacimleri kullanarak bir mikrosantrifüj tüpünde yeterli miktarda LQ ana karışımı hazırlayın: beş mikrolitre 2x LQ ana karışımı, iki mikrolitre LQ primer prob karışımı, 0,5 mikrolitre LQ standardı ve 0,5 mikrolitre LQ ROX.

8 mikrolitre LQ ana karışımını optik 96 kuyulu bir plakanın kuyusuna ekleyin. Ayrı kuyucuklarda, iki mikrolitre kütüphanenin seri seyreltilmesi, iki mikrolitre LQ pozitif kontrol ve iki mikrolitre LQ seyreltici ekleyin ve beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Kapalı plakayı PCR sistemine yerleştirin ve her numune için hem FAM hem de VIC dedektörleri atayın.

Aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak, 95 santigrat derecede beş dakika ve 95 Santigrat'ta 15 saniye, ardından 60 döngü için 60 santigrat derecede bir dakika olmak üzere PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin. Her bir numunenin konsantrasyonu daha sonra protokol metninde açıklandığı gibi hesaplanır. Kütüphane nicelemesinin ardından, her numune kütüphanesi ölçülen konsantrasyonuna göre normalleştirilir ve sıralama için tek bir tüpte toplanır.

Kitaplık normalizasyonu ve örnek havuzu oluşturma hesaplamalarını kolaylaştırmak için basitleştirilmiş bir analiz modülü kullanılır. Kitaplığı normalleştirmek için, önce her biri havuzlanacak benzersiz bir çift yönlü indeks içeren tüm numunelerde nanomolar cinsinden medyan konsantrasyonu belirleyin. Ardından, tüm numunelerdeki medyan konsantrasyonu beş ile çarparak ve ardından bireysel konsantrasyona bölerek toplanacak mikrolitre cinsinden bireysel numune hacmini belirleyin.

Numune havuzunu oluşturmak için her numune için normalleştirilmiş hacmi tek bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Sıralama seyrelticisi kullanarak numune havuzunu 1.25 nanomolar'a seyreltin. Numune havuzunu phix kontrolü V3 varlığında denatüre ederek sıralama için hazırlayın. Aşağıdakileri, 15 mikrolitre 1.25 nanomolar numune havuzunu, üç mikrolitre 0.5 nanomolar phix'i ve iki mikrolitre 1N sodyum hidroksiti birleştirin.

Kısa bir girdap ve santrifüjlemeden sonra, oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Bir mikrosantrifüj tüpünde 992 mikrolitre önceden soğutulmuş HT1 yüksek tamponuna 8 mikrolitre denatüre kütüphane ekleyin. Reaktif kartuşunun 600 numaralı konumuna denatüre edilmiş ve seyreltilmiş kütüphaneden 17 mikrolitre ekleyin.

Mikrosantrifüj tüplerinde, her bir sıralama astarının dört mikrolitresini 636 mikrolitre HT1 yüksek tampon ile ayrı ayrı seyreltin. Sıralama reaktif kartuşunun 600 numaralı konumuna 1 mikrolitre seyreltilmiş okuma-18 sıralama astarı ekleyin. 600 mikrolitre seyreltilmiş indeks okuma primerleri 19 numaralı pozisyona ve 600 mikrolitre seyreltilmiş okuma-2 sıralama primerleri 20 numaralı pozisyona kadar.

Reaktifleri yeni nesil dizileme cihazına yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre iki x 150 döngülü dizileme çalıştırması olmak üzere eşleştirilmiş bir uç gerçekleştirin. Son olarak, eşlik eden biyoinformatik yazılımını kullanarak sıralama verilerini analiz edin. Bir tezgah üstü sıralayıcı kullanılarak tek bir NGS çalışmasında toplam 90 numune işlenebilir.

Gösterilen veri seti için, numuneler hücre hattı, kalıntı klinik formal ve sabit parafin gömülü veya FFPE ve sentetik şablon DNA'yı içeriyordu ve yüksek derinlikte dizileme ve tek tip kapsama ile sonuçlandı. Aykırı değerler, şablon kontrolü yok, büyük bir kopya sayısı amplifikasyonuna sahip bir hücre hattı DNA'sının bir seyreltme serisi ve preanalitik qPCR tabanlı QC testi ile PCR inhibisyonu için işaretlenen bir FFPE DNA'sından oluşuyordu. 46 amplikon boyunca kapsama homojenliği, üç farklı operatör kullanılarak ve farklı düşük kaliteli FFPE DNA örnekleri için korunmuştur.

FFPE tümöründe, bilinen% 5 BRAF V600E mutasyonundan oluşan DNA kontrol karışımının, 400 çoğaltılabilir kopyadan oluşan bir girdi kullanan üç operatör tarafından ortalama 5.2 artı veya eksi yüzde 1.3 bollukta hedef BRAF mutasyonuna sahip olduğu bildirilmiştir. Hücre hattı ve FFPE DNA örneklerinin kopya sayısı amplifikasyonları ile seyreltilmesi, EGFR ve KRAS'ın amplifikasyonu için bağımlılık olduğunu göstermiştir. Önemli bir şekilde, FFPE DNA girişi, 50 kadar çoğaltılabilir kopyaya veya 1.2 nanogram toplu DNA'ya indirgenebilir.

Herhangi bir yanlış pozitif çağrı olmadan bilinen mutasyonların tespitini korurken. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, bir seferde 24 numunelik bir parti boyutu için yaklaşık üç buçuk saatlik uygulamalı olarak 11 saat içinde yapılabilir.