Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Bu prosedürün genel amacı, toplu genomik DNA'dan retroviral entegrasyon bölgelerini PCR amplifiye etmek ve elde edilen DNA kitaplığını, kesin entegrasyon konumlarının bir referans genoma eşlenebilmesi için sıralamaktır. Bu yöntem, bir konak genomu boyunca entegrasyon bölgelerinin dağılımını analiz ederek temel ve klinik retrovirolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, DNA dizileme derinliği ve birçok örneğin tek bir dizileme çalışmasında çoğullanabilmesidir.

Transfeksiyondan bir gün önce, beş adet 100 milimetrelik tabağın her birinde 10 mililitre takviyeli Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unda 10 ila altıncı HEK293T hücreye 3.3 kez plakalayın. Ertesi gün, tam uzunlukta retroviral moleküler klonlar taşıyan 10 mikrogram plazmit veya dokuz mikrogram zarflı elitli tek yuvarlak vektörler artı bir mikrogram VSV-G ekspresyon yapısı ile hücreleri transfekte etmek için ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri veya kalsiyum fosfat kullanın. Karışımı hücre ortamına damla damla ekleyin.

Transfeksiyonu takiben,% 5 karbondioksit ile nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Yaklaşık 48 saat sonra, virüs içeren hücre ortamını hacimsel bir pipet kullanarak toplayın ve yerçekimi akışıyla 0,45 mikronluk bir filtreden geçirin. Daha sonra, virüsü dört santigrat derecede bir saat boyunca 200.000 Gs'de ultrasantrifüjleme ile konsantre edin.

Santrifüjlemeyi takiben, yaklaşık 500 mikrolitre DMEM FPS kalana kadar süpernatanı çıkarın ve virüs peletini yeniden süspanse edin. 20 ünite DNaz ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Üreticinin talimatlarına göre bir HIV-1 p24 antijen yakalama kiti kullanarak p24 konsantrasyonunu belirleyin.

Enfeksiyondan bir gün önce, altı oyuklu bir plakada oyuk başına 2.5 mililitre DMEM FPS'de hücrelere 3.0 kez 10 ila beşinci HEK293T plaka koyun ve gece boyunca bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. Hücreleri, 500 mikrolitre taze DMEM FPS'de mililitre başına 500 nanogramlık son viral p24 konsantrasyonu ile enfekte edin. Bir doku kültürü inkübatöründe iki saat inkübe edin.

İki saat sonra, her bir oyuğa 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış iki mililitre DMEM FPS ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun. Enfeksiyondan 48 saat sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri iki mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış 0,5 mililitre Tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri hasat edin ve birkaç saniye sonra, hücre yerinden çıkması için kuyucukları görsel olarak inceleyin.

Daha sonra iki mililitre önceden ısıtılmış DMEM FPS ekleyin ve hacimsel bir pipetle 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin. Çözeltiyi 18 mililitre önceden ısıtılmış DMEM FPS içeren 75 santimetre karelik bir doku kültürü şişesine aktarın ve doku kültürü inkübatörüne geri dönün. Enfeksiyondan en az beş gün sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi hasat edin ve pipetleme ile beş mililitre önceden ısıtılmış DMEM FPS'de yeniden süspanse edin.

Çözeltiyi oda sıcaklığında 2.500 Gs'de beş dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı aspire edin ve atın. Son olarak, ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak hücre peletinden genomik DNA'yı çıkarın. Verilen iyon değişim kolonundan DNA'yı pH 8.5'te 200 mikrolitre milimolar Tris-HCL ile elute edin.

Genomik DNA'nın sonikasyonundan sonra, bir PCR saflaştırma kiti kullanarak sonikasyonlu DNA'yı saflaştırın. Ardından, bir son onarım kiti kullanarak DNA'yı onarın. DNA'nın daha önce olduğu gibi saflaştırılmasından sonra, A, Klenow Exo-Minus enzimini kullanarak DNA'yı kuyruğuna alır.

Alternatif olarak, restriksiyon endonükleaz sindirimi ile parçalanma için, genomik DNA'yı 5'TA çıkıntıları oluşturan bir enzim kokteyli ve ayrıca yukarı akış viral LTR'den aşağı akışta parçalanan BglII gibi uyumsuz bir enzim ile kesin. 100 mikrolitrelik son hacimde 10 mikrogram genomik DNA kesin. Gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Son DNA'nın PCR saflaştırma kiti kullanılarak temizlendiğinden emin olun. Sonikasyonlu DNA ile kullanılacak bağlayıcı, uyumlu bir T 3'çıkıntı içermeli, MseI sindirilmiş DNA için bağlayıcı ise uyumlu bir 5'TA çıkıntısı içermelidir. Kısa ve uzun bağlayıcı ipliklerin 10 mikromolarını 35 mikrolitre Tris-HCL EDTA tamponunda 90 santigrat dereceye kadar ısıtarak ve dakikada bir santigrat derecelik adımlarla yavaşça oda sıcaklığına soğutarak tavlayarak başlayın.

Daha sonra, 50 mikrolitrelik bir son hacimde 1.5 mikromolar bağlanmış bağlayıcı, bir mikrogram parçalanmış DNA ve 800 birim T4 DNA ligaz içeren genomik DNA örneği başına en az dört paralel ligasyon reaksiyonu hazırlayın. Gece boyunca 12 santigrat derecede şarj edin. Sonikasyon ile hazırlanan numuneler için, saflaştırılmış ligasyon reaksiyonunu, yukarı akış LTR'den aşağı akışta ayrılan bir kısıtlama enzimi ile sindirin.

Üreticinin tavsiye ettiği koşullar altında gece boyunca 100 ünite uygun enzim kullanın. Nihai ürünlerin bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırıldığından emin olun. Burada gösterilen reaktifleri kullanarak ilk tur PCR'leri hazırlayın.

Aşağıdaki parametreleri kullanarak ilk tur PCR'yi çalıştırın: iki dakika boyunca 94 santigrat derece, ardından 15 saniye boyunca 94 santigrat derece 30 döngü, 30 saniye boyunca 55 santigrat derece, 45 saniye boyunca 68 santigrat derece. 10 dakika boyunca 68 santigrat derece ile bitirin. İlk tur reaksiyonları bir araya getirin ve DNA'yı daha önce olduğu gibi saflaştırın.

Ardından, burada gösterilen reaktifleri içeren ikinci tur PCR'leri hazırlayın. İlk tur PCR ile aynı döngü parametrelerini kullanın. DNA'yı ikinci tur reaksiyondan bir araya getirdikten ve saflaştırdıktan sonra, kalite kontrol ve yeni nesil dizileme yapın ve protokolün yazılı kısmındaki ayrıntılı talimatları kullanarak entegrasyon bölgelerini analiz edin.

Solda gösterildiği gibi kısıtlama enzimleri ile sindirim veya sağda gösterildiği gibi sonikasyon ile hazırlanan kütüphanelerden entegrasyon siteleri, web logo yazılımı kullanılarak hizalandı. Titrasyon serisindeki her seyreltme, şeklin üst kısmındaki saf DNA'dan, alt kısımdaki maksimum bir ila 15.625 seyreltmeye kadar tasvir edilmiştir. Enfekte hücre DNA'sının artan seyreltilmesi ile kesinlik derecesi azalır.

Bu görüntü, 50.000 benzersiz genomik bölgenin eşleştirilmiş rastgele kontrolü için dizi logosunu göstermektedir. Buna karşılık, MRC veri kümesinden hizalanan rastgele sitelerin, kayda değer düzeyde temel tercihler oluşturamadığını unutmayın. Bir kez ustalaştıktan sonra, entegrasyon sitesi kütüphaneleri genomik DNA'dan üç gün içinde hazırlanabilir.

Bu nedenle, ilk enfeksiyondan tamamlanmış biyoinformatiğe kadar entegrasyon sahası haritalaması yaklaşık iki hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, binlerce hatta milyonlarca benzersiz retroviral entegrasyon bölgesi kataloglanabilir ve yerleştirme bölgeleri ile genomik açıklamalar arasındaki ilişkileri ölçmek için çeşitli analizler yapılabilir.