Name: Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Öğrenin retroviral entegrasyon sitelerini PCR ile amplifiye etme, yeni nesil dizileme ve referans genoma haritalama yöntemlerini. Bu biyoinformatik protokol, retrovirüslerin konak genomlarıyla etkileşimlerini analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Engelman laboratuarında retroviral entegrasyon sitesi sıralama için NGS protokolünü kurmak için kritik meslektaşlarımızla Stephen Hughes ve tavsiye için Henry Levin minnettarız. Bu çalışma AI039394 ve (ANE kadar) AI052014 ve AI060354 (AIDS Araştırma Harvard Üniversitesi Merkezi) ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Genomik dağılım örnekleri eşleme yoluyla başlangıç ​​virüs enfeksiyonu aşama retroviral entegrasyonu sitelerinin analizi için bir protokol, tarif edilmektedir. Bu protokol, bir retrovirüs ve bir infectable hücre tipine uygulanabilir. Bundan başka, deney boru hattı 6.4 x 10 -5 MOI ile başlatılmış bir enfeksiyon edilene Genomik DNA, eşdeğer seri seyreltmeleri benzersiz entegrasyon sitelerinden tatmin edici bir dizi geri potansiyeline sahip, çok hassastır. hücrelerin sadece küçük bir bölümü, entegre provirüsünü ...

konakçı hücre genomuna viral DNA (vDNA) Entegrasyon retroviral yaşam döngüsünde önemli bir adımdır. Entegrasyon stabil eklenen Provirüsün 1 kurulmasına yol açan iki ayrı katalitik işlemlerini yürütür viral enzim integraz (IN) tarafından gerçekleştirilir. Alt birimlerin bir in multimer 2-4 tarafından bir arada tutulan uçları vDNA ile üst düzey intasome oluşturan, ters transkripsiyon yoluyla üretilen doğrusal vDNA uçlarını meşgul. Yararak İÇİNDE 3&#39;-işleme olarak bilinen bir süreçte dizilerin 3 &#39;aşağı değişmez 5&#39;-CA-3 den vDNA uçları&#39;, &#39;3 girintili bırakarak her vDNA terminalinde 5-8 reaktif hidroksil grupları ile sona erer. Intasome sonradan ev sahibi büyük bir montaj parçası ve preintegration kompleksi (PIC) 9-11 olarak bilinen viral proteinler gibi çekirdek içine alınır. hücresel hedef DNA (T-DNA) rastladığında, 3&#39;-hidroksil gro vDNA kullanırUPS zikzaklı bir şekilde T-DNA üst ve alt şeritlerin ayrılması ve eş zamanlı olarak şerit aktarma 12,13 sürecinde T-DNA 5 &#39;fosfat gruplarına vDNA katılır için. yerel ve küresel ölçeklerde retrovirüsler sergi entegrasyon sitesi tercihleri. Yerel olarak, uzlaşma entegrasyon siteleri yaklaşık beş vDNA ekleme sitelerinden 14,15 den yukarı bp ve aşağı on dan yayılan zayıf korunmuş palindromic T-DNA dizilerinin oluşmaktadır. Küresel olarak, retrovirüsler özel kromatin açıklamaları 16 hedef. epsilon, Lenti ve spuma yoluyla alfa - yedi farklı retroviral cins vardır. Gammaretroviruses tercihen transkripsiyon başlangıç ​​siteleri (TSSler) ve aktif artırıcı bölgelerine 18-20 entegre ederken HIV-1 içeren lentiviruses, aktif transkripsiyonu genler 17 bünyelerinde entegrasyonu lehine. tam tersine, spumavirus kuvvetle heterochrom karşı önyargılı olduğunuBu tür gen kötü lamina-ilişkili alanlar 21 olarak problemlerle bölgeler. Yerel T-DNA baz tercihleri ​​IN ve T-DNA 13,22,23 arasındaki nukleoprotein temasların özel ağlar tarafından dikte büyük ölçüde vardır. Lentiviruses ve gammaretroviruses için genomik ek açıklamalar entegrasyon göreli IN ve soydaş hücresel faktörlerin 24-27 arasındaki etkileşimler tarafından yönetilen büyük bir kısmı yer almaktadır. Faktör etkileşimleri 25-27,29-32, sırasıyla yerel ve küresel düzeylerde entegrasyonu yeniden hedefleme stratejileri kanıtlanmış IN-host IN-T-DNA etkileşimi ağının 13,22,23,28 özelliklerini değiştiren ve bozan veya yeniden mühendislik. retroviral entegrasyon siteleri katalog için kullanılan DNA dizi prosedürlerinin gücü geçmiş yıllarda son derece artmıştır. Entegrasyon siteleri Çalışma 33,34 başına benzersiz sitelerin sadece bir avuç elde etmek zahmetli arınma ve manuel klonlama teknikleri kullanılarak öncü çalışmalar ele alındı.Binlerce 17 birkaç yüz artan eksojen doku kültürü hücre enfeksiyonları elde sitelerin sayısı ile, alan dönüştürülmüş insan ve fare taslak genomları bireysel entegrasyon siteleri harita yeteneği ile LTR-konakçı DNA kavşaklarından LM-PCR amplifikasyonu kombinasyonu 18. NGS metodolojisi ile LM-PCR daha yeni kombinasyon kütüphane derinlik fırlayan gönderdi. Kütüphaneler eşsiz dizilerin 19-21,39 milyonlarca verebilir DNA kümeleme kullanımı yoluyla sıralı ise Özellikle, piro, onlarca benzersiz entegrasyon sitelerinden 30,35-38 binlerce sırasına vermiştir. Burada yükselterek ve DNA kümeleme NGS kullanarak retroviral entegrasyon siteleri sıralanması için optimize edilmiş LM-PCR protokol açıklar. yöntem, ve böylece sequen önce ek bir bağdaştırıcı bağlama adımı ihtiyacını engelleyen, büyütülmüş DNA moleküllerine dolayısıyla doğrudan PCR primerleri içine adaptörü dizileri gerekli birleştirir40 dans ediyorum. biyoinformatik analizi boru hattı, genomik özellikleri formüller verilmiştir özgü entegrasyon sitelerinden eşleme LTR-konakçı DNA birleşme için ham dizileme veri çözümlenmesinden, ayrıca genel olarak tarif edilmektedir. Bu alanda 36,38,41-43 önceki metodolojik protokollerden kurulan öncelik doğrultusunda, özel komut biyoinformatik boru hattı belirli adımların tamamlanmasına yardımcı olmak amacıyla geliştirilebilir. yardımcı ve protokol duyarlılığı enfeksiyonun yaklaşık çokluğu 1.0 (İB), hem de bu DNA&#39;nın bir titrasyon serisi enfekte doku kültürü hücreleri, HIV-1 entegrasyon sitesi, yükseltme dizilemesi ve eşleyerek Örnek verilerle gösterilmektedir 6.4 x 10 -5 yaklaşık eşdeğer İçişleri Bakanlığı vermek üzere 15.625: enfekte olmamış hücresel DNA ile seyreltilmiş 1 maksimum seyreltme adımları 5 kat.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>HEK293T hücrelerle uyumlu standart hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Optimal viral üretim için farklı serum lotlarının ön taramaya tabi tutulması gerekebilir</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td> DMEM Fosfat Tamponlu salin <td>Mediatech'e eklenecek antibiyotikler</td></tr><tr><td></td><td></td><td>21-040-CV</td><td>Hücreleri yıkamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Tripsin EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Doku kültürü plakalarından yapışan hücreleri ayırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratuvarları</td><td>SL100688</td><td>DNA transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>0.45 &mikro; m Filtreler</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Virüs partikülü içeren hücre kültürü ortamını filtrelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Virüs stoklarından taşınan plazmid DNA'yı parçalamak için kullanılır</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antijen Yakalama Testi</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Virüs üretiminin verimini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Doku Kiti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Hücrelerden genomik DNA'yı saflaştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>Bu sonikatör modeli ile iki tur görev döngüsü gerçekleştirin,% 5; yoğunluk, 3; patlama başına döngü, 200; süre, 80 sn</td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>Numune çapraz kontaminasyon olasılığını azaltmak için ticari olarak temin edilebilen su önerilir</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Saflaştırması Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Kütüphane yapımı sırasında DNA'yı saflaştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Sonikasyonlu DNA örneklerinin DNA uçlarını onarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Klenow Parçası (3'-5' ekzo&ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>dATP ile A kuyruğuna onarılmış DNA fragmanları için kullanılır</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Deoksiadenozin trifosfat</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Genomik DNA bölünmesi için kısıtlama endonükleazı</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Yukarı akış HIV-1 U5 dizisi T4 DNA Ligazının amplifikasyonunu baskılamak için kısıtlama endonükleazı</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Uyumlu DNA uçlarının kovalent birleştirilmesi için enzim</td></tr><tr><td>DNA Oligonükleotidler</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel</td><td>Şirketin oligoları saflaştırmasını sağlayın. HPLC saflaştırma DNA'lar için yeterlidir < 30 nükleotid; SAYFA daha uzun DNA'ları saflaştırır&nbsp;</td></tr><tr><td>Avantaj 2 Polimeraz Karışımı</td><td>Clontech</td><td>639202</td> PCR dNTP'ler <td>için DNA polimeraz içeren ticari karışım</td></tr><tr><td>(100 mM çözeltiler)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Her biri 2,5 mM'lik ara konsantrasyonlara ulaşmak için buz üzerindeki dört kimyasalı steril su ile seyreltin DNA</td></tr><tr><td>konsantrasyonunun</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>belirlenmesi için dNTP NanoDrop Thermo Scientific NanoDrop 2000 SpektrofotometreQubit Florimetre</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Qubit&reg; 3.0</td><td>Entegrasyon sitesi kitaplığını doğrulamak için kullanılan florometre DNA konsantrasyonu</td></tr><tr><td>2200 TapeStation Sistemi</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Entegrasyon sitesi kitaplığını doğrulamak için bant tabanlı test DNA boyut dağılımı</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>NGS için kullanılır</td></tr></tbody></table>

retroviral entegrasyon siteleri amplifikasyon, yeni nesil sıralama ve genomik dna haritalama

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

hem yerel hem de küresel ölçeklerde retrovirüsler sergi imza entegrasyonu tercihleri. Burada, ligasyon aracılı PCR (LM-PCR) amplifikasyonu ve yeni nesil dizileme (NGS) kullanılarak retroviral entegrasyon sitelerin çeşitli kütüphanelerin (1) nesil için ayrıntılı bir protokol, (2) Her virüs- genomik konumunu haritalama sunuyoruz kavşak BEDTools kullanarak ve (3) İstatistiksel alaka için verileri analiz ev sahipliği yapmaktadır. enfekte olmuş hücrelerden özütlendi genomik DNA sınırlama enzimleri ile ya da sonikasyon ile sindirme ile parçalanır. uygun bir DNA son tamir sonra çift şeritli bir DNA bağlayıcılar uçlarına bağlanır ve yarı iç içe PCR virüsü uzun terminal tekrar (LTR) sonu ile bağlanmış bağlayıcı DNA hem de tamamlayıcı primerler kullanılarak gerçekleştirilir. PCR primerleri ayrı adaptör ligasyonu ihtiyacını inkâr NGS sırasında DNA kümeleme için gereken dizileri taşırlar. Kalite kontrol (KK) DNA fragmanı boyutu dağılımına değerlendirmek ve uyum için yapılırNGS önce bir DNA dahil edilmesini er. Dizi çıkış dosyaları LTR içeren okur için filtre edilir ve LTR ve bağlayıcı tanımlayan diziler uzakta kırpılır. Ayıklanmış konakçı hücre dizileri blat kullanarak bir referans genom eşlenir ve referans genom içinde benzersiz bir noktaya minimum% 97 kimlik filtrelenir. Benzersiz entegrasyon siteleri çeşitli genomik özelliklere bitişik nükleotid (nt) sekansı ve dağıtım akrabası için irdelenmektedir. Bu protokol kullanılarak, yüksek bir karmaşıklık entegre edilen kütüphaneler üç günde genomik DNA&#39;dan yapılabilir. entegre edilen analiz duyarlı doku kültürü hücreleri eksojen viral enfeksiyon kapsamına almaktadır, tüm protokol, bu nedenle, yaklaşık bir ila iki hafta içinde yapılabilir. Bu teknolojinin son uygulamalar, HIV ile enfekte olmuş hastalardan alınan entegrasyon sitelerinden uzunlamasına analizi ile ilgilidir.

Tablo 4, bir temsili örneğin sonuçları tarafından enfekte olmuş hücrelerin bir kültüründen entegrasyon sitesi geri kazanılması için NGS duyarlılığını göstermek için. Enfekte olmamış hücresel DNA seri ortalama her bir hücre, bir entegrasyon 40 ihtiva eden bir enfeksiyon genomik DNA seyreltmek için kullanıldı. 15.625: Seyreltiler 1 bir maksimum seyreltme beş adımda hazırlanmıştır. titrasyon serisinin Genomik DNA daha sonra sonikasyon ile parçalanmış ya da kısıtl...

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Bu prosedürün genel amacı, toplu genomik DNA'dan retroviral entegrasyon bölgelerini PCR ile amplifiye etmek ve sonuçta oluşan DNA kütüphanesini dizileyerek, kesin entegrasyon konumlarının bir referans genoma eşlenmesini sağlamaktır. Bu yöntem, entegrasyon bölgelerinin bir konak genomu boyunca dağılımını analiz ederek temel ve klinik retrovirolojideki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, DNA dizileme derinliği ve birçok örneğin tek bir dizileme çalışmasında çoklanabilmesidir (multiplexing).Transfeksiyondan bir gün önce, beş adet 100 milimetrelik tabağın her birine, destekleyici maddeler eklenmiş 10 mililitre Dulbecco's Modified Eagle's Medium içerisinde 3,3 x 10⁶ HEK293T hücresi ekleyin. Ertesi gün, ticari olarak mevcut transfeksiyon reaktiflerini veya kalsiyum fosfatı kullanarak hücrelere, tam uzunluktaki retroviral moleküler klonları taşıyan 10 mikrogram plazmid veya 9 mikrogram zarflı elide tek tur vektör artı 1 mikrogram VSV-G ekspresyon konstrüktü transfekte edin. Karışımı hücre ortamına damla damla ekleyin.Transfeksiyonun ardından, hücreleri %5 karbon dioksit içeren, nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de inkübe edin. Y

amplification-next-generation-sequencing-genomic-dna-mapping

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Doğrusal amplifikasyon aracılı (LAM)-PCR genomu içinde entegre viral vektörlerin tam konumlarını belirlemek için geliştirilen bir yöntemdir. Teknik gen tedavisi hastaların, vb roman vektör teknolojileri, T-hücresi çeşitlilik, kanser kök hücre modelleri, biyogüvenlik klonal dinamiklerini incelemek için üstün bir yöntem olarak gelişmiştir...

Doğrusal Amplifikasyon Dolayımlı PCR - Bilinmeyen Yollardan DNA Genetik Elemanları ve Karakterizasyonu lokalizasyonu

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Burada, insan hücrelerinde Moloney fare lösemi virüsü tabanlı retroviral vektörlerin entegrasyon alanlarının genom çapında haritalanması için bir protokolü açıklıyoruz.

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Biz yeni tüp bebek modelleri üretimi için seçili genomik sitelerdeki proviral tümleştirme özetlemek HIV-1 enfeksiyonu için genom mühendislik iş akışı mevcut. HIV kaynaklı gazetecilere hedefleme CRISPR-Cas9-aracılı, siteye özgü genom manipülasyon tarafından yönetilir. Detaylı iletişim kuralları tek hücreli klon üretimi, tarama ve doğru hedefleme doğrulama için sağlanan.

HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik

Insersiyonel mutajenez, fonksiyonel genomik elementleri tanımlamak için ileri genetikte önemli bir araçtır. Burada, lentivirüs tabanlı bir ekleme mutajenez hücre kütüphanesi içindeki lentivirüs entegrasyon bölgelerini tespit etmek için bir yöntem olan İşlevsel Öğeler ve Transkriptler için Yerleştirme Tabanlı Ekranı (InSET) açıklıyoruz.

Bir İnsersiyonel Mutajenez Hücre Kütüphanesinde İşlevsel Olarak İlgili Lentivirus Entegrasyon Bölgelerinin Tanımlanması

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Pooled DNA dizi büyük kohortlarında karmaşık fenotipleri ile ilişkili nadir türevlerini algılamak için hızlı ve maliyet-etkin bir stratejidir. Burada SPLINTER'da yazılım paketi kullanarak 32 kanser ilişkili genlerin havuzlu, yeni nesil dizileme sayısal analiz açıklanmaktadır. Bu yöntem, ölçeklenebilir ve menfaat fenotipi için geçerlidir.

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

Öğrenin retroviral entegrasyon sitelerini PCR ile amplifiye etme, yeni nesil dizileme ve referans genoma haritalama yöntemlerini. Bu biyoinformatik protokol, retrovirüslerin konak genomlarıyla etkileşimlerini analiz eder.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Daha fazla video keşfet