Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Bu prosedürün genel amacı, toplu genomik DNA'dan retroviral entegrasyon bölgelerini PCR ile amplifiye etmek ve sonuçta oluşan DNA kütüphanesini dizileyerek, kesin entegrasyon konumlarının bir referans genoma eşlenmesini sağlamaktır. Bu yöntem, entegrasyon bölgelerinin bir konak genomu boyunca dağılımını analiz ederek temel ve klinik retrovirolojideki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, DNA dizileme derinliği ve birçok örneğin tek bir dizileme çalışmasında çoklanabilmesidir (multiplexing).

Transfeksiyondan bir gün önce, beş adet 100 milimetrelik tabağın her birine, destekleyici maddeler eklenmiş 10 mililitre Dulbecco's Modified Eagle's Medium içerisinde 3,3 x 10⁶ HEK293T hücresi ekleyin. Ertesi gün, ticari olarak mevcut transfeksiyon reaktiflerini veya kalsiyum fosfatı kullanarak hücrelere, tam uzunluktaki retroviral moleküler klonları taşıyan 10 mikrogram plazmid veya 9 mikrogram zarflı elide tek tur vektör artı 1 mikrogram VSV-G ekspresyon konstrüktü transfekte edin. Karışımı hücre ortamına damla damla ekleyin.

Transfeksiyonun ardından, hücreleri %5 karbon dioksit içeren, nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de inkübe edin. Yaklaşık 48 saat sonra, virüs içeren hücre ortamını hacimsel bir pipet kullanarak toplayın ve yer çekimi akışıyla 0,45 µm'lik bir filtreden geçirin. Ardından, virüsü 4 °C'de bir saat boyunca 200.000 ×g'de ultrasantrifüjle konsantre edin.

Santrifüjden sonra, yaklaşık 500 microliter DMEM FPS kalana kadar süpernatantı uzaklaştırın ve virüs peletini yeniden süspande edin. 20 units DNase ekleyin ve 37 degrees Celsius'de bir saat boyunca inkübe edin. Üretici talimatlarına uygun olarak, bir HIV-1 p24 antijen yakalama kiti kullanarak p24 konsantrasyonunu belirleyin.

Enfeksiyondan bir gün önce, altı kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 2,5 mililitre DMEM FPS içerisinde 3,0 × 10⁵ HEK293T hücresi ekleyin ve bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin. Hücreleri, 500 mikrolitre taze DMEM FPS içerisinde 500 nanogram/mililitre nihai viral p24 konsantrasyonu ile enfekte edin. Bir doku kültürü inkübatöründe iki saat boyunca inkübe edin.

İki saat sonra, her bir kuyucuğa 37 °C'ye önceden ısıtılmış iki mililitre DMEM FPS ekleyin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Enfeksiyondan 48 saat sonra, medyumu uzaklaştırın ve hücreleri iki mililitre fosfat tamponlu salin ile yıkayın. 37 °C'ye önceden ısıtılmış 0,5 mililitre Trypsin-EDTA ekleyerek hücreleri hasat edin ve birkaç saniye sonra, hücrelerin yerinden ayrılıp ayrılmadığını kuyucukları görsel olarak kontrol ederek inceleyin.

Ardından, iki mililitre önceden ısıtılmış DMEM FPS ekleyin ve hücreleri bir volümetrik pipetle nazikçe 10 kez yukarı-aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Çözeltiyi, 18 mililitre önceden ısıtılmış DMEM FPS içeren 75 kare santimetrelik bir doku kültürü flaskına aktarın ve doku kültürü inkübatörüne geri koyun. Enfeksiyondan en az beş gün sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi hasat edin ve pipetleme yoluyla beş mililitre önceden ısıtılmış DMEM FPS içinde yeniden süspanse edin.

Çözeltiyi oda sıcaklığında 2, 500 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, ardından süpernatantı aspire ederek atın. Son olarak, ticari olarak mevcut bir kit kullanarak hücre peletinden genomik DNA'yı ekstrakte edin. DNA'yı, sağlanan iyon değişim kolonundan pH 8.5'te 200 microliter millimolar Tris-HCL ile elüe edin.

Genomik DNA sonikasyonundan sonra, sonike edilmiş DNA'yı bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Ardından, bir uç onarım kiti kullanarak DNA'yı onarın. Daha önce yapıldığı gibi DNA saflaştırmasını gerçekleştirdikten sonra, Klenow Exo-Minus enzimi kullanarak DNA'ya A kuyruğu ekleyin.

Alternatif olarak, restriksiyon endonükleaz sindirimi ile fragmantasyon için, genomik DNA'yı 5'TA çıkıntıları oluşturan bir enzim kokteyli ile birlikte, yukarı akışa yönelik viral LTR'nin aşağı akışından kesim yapan BglII gibi uyumsuz bir enzimle kesin. 100 µL son hacimde 10 µg genomik DNA'yı kesin. 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Final DNA'nın PCR saflaştırma kiti kullanılarak temizlendiğinden emin olun. Sonikasyon uygulanmış DNA ile kullanılacak bağlayıcı (linker) uyumlu bir T 3' çıkıntısı içermeli, MseI ile sindirilmiş DNA için kullanılacak bağlayıcı ise uyumlu bir 5'TA çıkıntısı içermelidir. 10 µM kısa ve uzun bağlayıcı zincirleri, 35 µL Tris-HCl EDTA tamponu içinde, 90 °C'ye ısıtılıp ardından dakikada bir °C'lik basamaklarla oda sıcaklığına yavaşça soğutularak tavlayarak başlayın.

Ardından, her genomik DNA örneği için; 50 microliters nihai hacimde 1.5 micromolar ligat linker, bir microgram fragmente DNA ve 800 units T4 DNA ligaz içeren en az dört paralel ligasyon reaksiyonu hazırlayın. 12 degrees Celsius'de gece boyunca ligasyon yapın. Sonikasyonla hazırlanan örnekler için, saflaştırılmış ligasyon reaksiyonunu upstream LTR'nin aşağısında kesen bir restriksiyon enzimi ile sindirin.

Üreticinin önerdiği koşullar altında, uygun enzimin 100 ünitesini gece boyunca kullanın. Nihai ürünlerin bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırıldığından emin olun. İlk tur PCR'ları burada gösterilen reaktifleri kullanarak hazırlayın.

İlk tur PCR'yi şu parametreleri kullanarak gerçekleştirin: iki dakika boyunca 94 °C, ardından 30 döngü boyunca 15 saniye 94 °C, 30 saniye 55 °C, 45 saniye 68 °C. İşlemi 10 dakika boyunca 68 °C ile sonlandırın. İlk tur reaksiyonlarını birleştirin ve DNA'yı daha önce yaptığınız gibi saflaştırın.

Ardından, burada gösterilen reaktifleri içeren ikinci tur PCR'ları hazırlayın. İlk tur PCR ile aynı döngü parametrelerini kullanın. İkinci tur reaksiyondan elde edilen DNA'yı havuzlayıp saflaştırdıktan sonra, kalite kontrol ve yeni nesil dizileme işlemlerini gerçekleştirin ve protokolün yazılı kısmındaki ayrıntılı talimatları kullanarak entegrasyon bölgelerini analiz edin.

Solda gösterilen restriksiyon enzimleri ile sindirim veya sağda gösterilen sonikasyon ile hazırlanan kütüphanelerden elde edilen entegrasyon bölgeleri, web logo yazılımı kullanılarak hizalanmıştır. Titrasyon serisindeki her bir dilüsyon, şeklin üst kısmındaki saf DNA'dan alt kısımdaki 1/15.625 maksimum dilüsyona kadar tasvir edilmiştir. Enfekte hücre DNA'sının dilüsyonu arttıkça kesinlik derecesi azalmaktadır.

Bu görüntü, 50.000 benzersiz genomik bölgenin eşleşmiş rastgele kontrolü için sekans logosunu göstermektedir. Buna karşılık, MRC veri setinden hizalanan rastgele bölgelerin belirgin düzeyde baz tercihleri oluşturamadığına dikkat ediniz. Teknik uzmanlık kazanıldıktan sonra, genomik DNA'dan entegrasyon bölgesi kütüphaneleri üç gün içinde hazırlanabilir.

Böylece, ilk enfeksiyondan biyoinformatik analizlerin tamamlanmasına kadar olan entegrasyon bölgesi haritalama işlemi yaklaşık iki hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, binlerce hatta milyonlarca benzersiz retroviral entegrasyon bölgesi kataloglanabilir ve ekleme bölgeleri ile genomik açıklamalar arasındaki ilişkileri nicelleştirmek için çeşitli analizler yürütülebilir.