Name: İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde E. E. coli, X ışını Kristallografi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Öğrenin, insan norovirüsü çıkıntılı P domaininin E. coli'de hızlı üretimi, saflaştırılması ve kristalleştirilmesi için bu protokolü. Yüksek saflıkta protein, X-ışını kristalografisi ve yapısal analizler için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmanın finansmanı CHS vakfı tarafından sağlanmıştır. Kristal taraması için Heidelberg Üniversitesi'nin mükemmellik kümesi CellNetworks içindeki protein kristalizasyon platformunu ve senkrotron radyasyon tesislerinin sağlanması için Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi'ni kabul ediyoruz.

1. P Alan Klonlama <ol><li> Norovirus soylarının dizi hizalama P etki kodlama bölgesini belirlemek (örneğin, GII.10 suşu, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) 6. Ayrıca, p alan (Şekil 2A) C-terminal ucunda, esnek bölümünün ayrılması. E için DNA kodon-optimize E. coli ekspresyonu ve BamHI alt-klonlamak için (N-terminal) ve Notl (C-ucu) sınırlama sitelerini pMalc2x sentezleme vektörü 6,7 bölgeyi kodlayan P alanı bulunmaktadır. Not: P alan kodlama bölgesi optimize edilmiş ve ticari bir hizmet tarafından sentezlenir. bölge (insert) kodlama P etki yaklaşık 1 uzunluğunda kb ve standart bir transfer vektörü teslim olduğunu. </li><li> Her 1 ul, BamHI (20,000 U / ml) ve Notl (10,000 U / ml) sınırlama üreticisi tamponlar birlikte 37 ° C &#39;de 1 saat boyunca enzimler ile transfer vektörü 2 ug Digest. </li><li> bir% 1 agaroz jeli üzerinde sindirildi insert Ayrıve 135 V&#39;da 20 dakika boyunca, bir ticari kit kullanılarak kolloidden uç DNA arındırmak. </li><li> her biri 1 ul BamHI (20,000 U / ml) ve Notl (10,000 U / ml) bir kısıtlama, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca enzimleri bu vektörün 2 ug sindirerek pMalc2x ekspresyon vektörü hazırlanır. (1.3) yukarıda tarif edildiği gibi bir agaroz jelinden vektör saflaştınlır. Not: her iki numune (1.2 ve 1.4) -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) (Şekil 2B ve 2C), 15 dakika boyunca 1 ul T4 DNA ligazı (400,000 U / mL) ile, BamHI ve Notl sınırlama mevkilerinde sindirilmiş pMalc2x vektörüne saflaştırılmıştır ekleme Arter. uç oranı 1: 3 (molekül ağırlığı) pMalc2x vektör ve bir vektör, en az 20 ng kullanımı. Bağlama karışımı genellikle ~ 20 ul. </li><li> 50 ul kimyasal yeterli E. içine ligasyon karışımı 2 ul Transform E. coli DH5α standart transformasyon protokolü (buz üzerinde 10 dakika, ısı şoku 42 ° C&#39;de 45 saniye) kullanarak, bakteri hücreleri ve 600 büyür37 ° C&#39;de 1 saat boyunca ul SOC ortamı. Santrifüj dönüştürülmüş hücreler 1,000 xg&#39;de 3 dakika boyunca, supernatant atmak ve SOC ortamı 30 ul pelletini. <ol><li> seçimi için, 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB-agar plakaları üzerinde bir dönüşüm karışımı plakası ve 37 ° C&#39;de gece boyunca büyür. en az beş koloni seçin. </li></ol></li><li> Beş kolonilerin her biri için, 50 ug / ml ampisilin (amp LB-) ile desteklenmiş LB-ortamı 2-3 ml kültürü inoküle ve 37 ° C&#39;de 160 rpm&#39;de bir gece boyunca çalkalanarak büyür. </li><li> ticari bir kit kullanılarak gece boyunca kültürden plazmidler ekstrakte edin. Bir pMalc2x ileri primer (5&#39;-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;) ile dizilenerek P alanı, ek maddenin varlığını doğrulamak ve ters primer (5&#39;-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> 2. P Alan İfade <ol><li> MBP-His-P etki alanı için pMalc2x vektör kodlama - (400 ng / ml 150 ng / ul) 1 ul Transformyeterli E., 50 ul olarak füzyon proteini, Standart bir transformasyon protokolü (buz üzerinde 10 dakika, ısı şoku 42 ° C&#39;de 45 saniye) kullanılarak E. coli BL21 hücreleri ve 37 ° C &#39;de 1 saat süre ile 600 ul SOC ortamında büyür. gece boyunca 160 rpm&#39;de ve 37 ° C&#39;de LB-amp 120 ml Alt kültür. </li><li> Altkültür (: 100 1) ile LB-amp (1.5 L ortamı ile her örneğin 6 x 5 L şişeleri), dokuz litre aşılamak. 0.6 - OD600 0.4 ulaşana kadar 160 rpm&#39;de ve 37 ° C de çalkalanarak hücrelerin büyütün. Daha sonra, yaklaşık 1 saat boyunca 22 ° C&#39;ye kadar sıcaklık daha düşük ve daha sonra izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid 0,66 mM (IPTG) 8 protein ifadesini teşvik eder. gece boyunca 22 ° C (~ 18 saat) hücreler büyütün. Sıcaklık, çeşitli olabilir, ancak, 22 ° C veya daha düşük kullanımı önerilir: edin. </li><li> santrifüj ile (10.543 xg, 15 dakika, 4 ° C) hücreler hasat edilir. Süpernatantı atın ve -20 ° C&#39;de hücre pelletini dondurmak. </li></ol>1. saflaştırma adımı ve proteaz parçalama <ol><li> deneylerin tekrarlanabilirliği ve istikrarı garanti altına almak için hisse senedi çözümlerinden protein saflaştırma adımları sırasında kullanılan tamponlar hazırlamak. hareketsiz metal iyonu yakınlık kromatografisi için dört farklı tamponlar (IMAC), imidazol farklı bir konsantrasyonunu ihtiva eden her bir (10 mM, 20 mM, 50 mM ve 250 mM) hazırlayın. SEC için, daha yüksek bir tuz konsantrasyonuna sahip bir jel filtrasyon tamponu (GFB) maddesinin hazırlanması, ancak imidazol yoktur. iyonu giderilmiş su kullanarak ve 0.45 um&#39;lik bir gözenek büyüklüğüne sahip kullanımdan önce tüm tamponları filtre. Not: detaylı tampon hazırlanması Şema için Tablo 1 &#39;e bakın. </li><li> dokuz litrelik kültür hücre pelletini çözülme ve 4 ° C&#39;de 150 mi, PBS içinde çözülür. Hücreleri bozmaya hücre süspansiyonu 2 dakika (güç 130 W, genlik% 20, darbe frekansı% 50) için üç kez sonikasyon. sonikasyon sırasında buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li><li> SantrifüjGE sonike hücre süspansiyonu (43.667 xg, 30 dakika, 4 ° C) olarak tanımlanan bir proteini ihtiva eden yüzer hücre artıkları ayırmak için. Süpernatant toplayın ve pelet atın. </li><li> Yıkama ve Nikel (Ni), bir kromatografi kolonu 10 mM imidazol tamponu -NTA agaroz boncuklar 10 ml (= 1 kolon hacminde [CV]) bulamaç dengelenmesi. Aşama 3,3 süpernatana dengelenmiş Ni boncuk ekleyin MBP-His-P alanı füzyon proteini olarak ifade ve yavaş dönme ile, 4 ° C&#39;de 30 dakika inkübe içeren. </li><li> İnkübasyondan sonra, bir kromatografi kolonuna, tüm Ni-Boncuk protein karışımı uygulanır. 10 mM, 20 mM, 10 mM, daha sonra 20 mM son 50 mM (Şekil 3A) ile başlanarak, 50 mM imidazol tampon her biri 5 CV ile yavaş yavaş sütundan yıkanır. </li><li> 250 mM imidazol tamponu (Şekil 3A) kullanılarak MBP-His-P alanı füzyon proteinini ayrıştırmak. Elüsyon süresince, füzyon proteininin elüsyon (OD 28 artış doğrulamak için OD 280nm kontrol0nm). OD 280nm ~ 0.1 düşene kadar elüsyon devam edin. 10 mM imidazol tamponu en az 10 CV ardından 250 mM imidazol tamponu (en az 10 CV) aşırı miktarda boncuk yıkayın. İkinci saflaştırma aşamasından (bölüm 4) için boncuk kaydedin. </li><li> % 12 SDS-poliakrilamit jeli (10 x 8 cm) 9 (Şekil 3A) kullanılarak SDS-PAGE ile MBP-His-P alanı füzyon proteininin varlığını kontrol edin. 45 A jel elektroforezi gerçekleştirmek ve 45 dakika için 200 V. </li><li> ~ 3 mg / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar (ticari konsantratör kullanılarak, örneğin) elüe MBP-His-P alanı füzyon proteinini konsantre edilir. (~ 1: 100), 10 mM 2 L karşı diyaliz sırasında imidazol tampon HRV-3C proteazı ile MBP-His-P alanı füzyon klivaj gece boyunca 4 ° C&#39;de (Şekil 3A). Konsantre edilen protein nihai hacmine bağlı olarak, bir diyaliz kaseti veya diyaliz tübüne diyaliz gerçekleştirin. Not: proteini için HRV-3C proteaz miktarınıbölünmesi belirli bir proteaz aktivitesi göre hesaplanır ve ifade düzeyinde değişiklik ve SDS-PAGE sonuç tahmin edilebilir temizlenen füzyon proteinin bir miktar (3,7 (2 U / ul, 1 U-100 protein ug parçalamak için yeterlidir) ). </li></ol> 4. 2. saflaştırma adımından <ol><li> 10 mM imidazol tamponu içinde adım 3.6 Ni-boncuk dengelenmesi. </li><li> Yavaş rotasyon ile 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca dengeye Ni-boncuk (4.1) ile (ayrıldı P alan MBP protein ve HRV-proteaz ihtiva eden) aşama 3,7 Diyaliz edilen protein inkübe edin. </li><li> Bir sütuna Ni-boncuk karışımı uygulayın ve flow-through (bölünmüş P etki) (Şekil 3B) toplamak. OD 280nm ~ 0.1 ulaşana kadar sütun kapalı geliyor gibi protein konsantrasyonu ölçün. Not: MBP-His Ni-boncuk (Şekil 3B) bağlı olarak kalır. </li><li> 1 ile SDS-PAGE kullanılarak bölünmüş P etki varlığını kontrol% 2 jeli (Şekil 3B), yukarıda tarif edilen. ~ 3 mg / ml ila elüt P alan konsantre edin ve daha sonra saflaştırma için SEC GFB karşı 4 ° C de bir gece boyunca diyaliz. </li></ol> 5. 3. saflaştırma adımından <ol><li> Yıkama pompaları ve HPLC arıtma sisteminin boruları ve ön denge SEC-sütunu GFB ile (Malzeme Listesine bakınız). </li><li> Konsantre edilmiş örneğin hacmine bağlı olarak, 1 ml (3 ml kadar) süper-(en fazla 12 mi) ya da öze kullanılarak / dakikalık bir akış hızında kolona P alan enjekte edilir. Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, / dakika 2.5 ml akış oranı. </li><li> OD artar ve p alan sütun dışan geldiğinde, 1.5 ml fraksiyonlar toplanır. % 12 jel ile SDS-PAGE kullanılarak fraksiyonların kontrol (Şekil 4A ve 4B). Havuz yalnızca en saf parçalar ve • 3 mg / ml ve • 8 mg / ml olacak şekilde konsantre edilir. Not: 110 ° sonra, ml (boşluk hacmi) en yabancı maddeler 320 ml yatak hacmi ile SEC kolonundan elüte edilir.P alanı genellikle bir dimer halinde elüt edilmiştir. P alanı dimerinin elüsyon zaman / hacim SEC kolonunun hazırlık derecesindeki (PG) bağlıdır. </li></ol> P Domain 6. Kristalleşme <ol><li> Başlangıç ​​taraması için kristalizasyon ~ 3 mg / ml ve 8 mg / ml&#39;de p alan kullanın. 384 piyasada mevcut tarama koşulları ile ilk ekranlar için konsantrasyon başına P etki en az 100 ul hazırlayın. Rezervuar ana çözelti 100 ul ihtiva eden bir 96-yuvalı plaka formatı, 18 ° C de bir tarama yapmak ve bir damla 0.2 ul ana çözelti ve 0.2 ul protein oluşmaktadır. </li><li> Tekrarlayın ve başarılı kristalleşme koşulları optimize. Bu nedenle, 3 satır içerecek 15-kuyu tabak kullanın. % 100 ana çözelti,% 90 anne solüsyonu ve% 10 su ve% 80 anne solüsyonu ve% 20 su ile üçüncü sırada ikinci satır ile ilk sırayı ayarlayın. 2 ul (1 ul protein + 1 ul anne çözelti) ve 500 bir damla boyutu kullanın81; bir hazne hacmi ana çözelti l. </li><li> ko-kristalize ligandlar P etki alanı için optimize kristal koşullarını kullanın. 6.2 de tarif edildiği gibi tabak hazırlayın. Bunun yerine 2 | il damla boyutu, 1 ul ana çözelti, 1 ul protein ve 1 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda ligandın 1 ul ihtiva eden damla ayarlayın. </li><li> sinkrotron radyasyon kullanarak tek kristallerin veri setleri toplayın. Ilk arama modeli 6,10-13 gibi yüksek sekans benzerliği ile yayınlanan P alan yapıları kullanılarak moleküler değiştirme gerçekleştirin. Not: Bir ligand varlığı elektron yoğunluğunun un modellenmiştir blob olarak gösterir. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li>
<li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li>
<li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li>
<li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li>
<li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li>
<li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+RNA+and+codon+optimization%3A+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li>
<li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li>
<li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+noroviruses%27+fondness+for+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li>
<li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada yüksek kalite ve miktar norovirus P etki ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol açıklar. Noroviruses iyi çalışılmış değildir ve yapısal verileri sürekli ihtiyaç vardır. Bildiğimiz kadarıyla, diğer protokolleri (örneğin, GST-etiketli P alanları) kullanarak P etki üretimi bugüne kadar, sorunlu olmuştur ve norovirus-konak etkileşimi yeterli yapısal verilerin eksik edilmiştir. yöntem burada açıklanan, biz son zamanlarda bağlayıcı karbohidrat norovirusa moleküler ayrıntıları anlaşılmasında önemli katkıl...

İnsan Noroviruses akut gastroenterit, dünya çapında 1 başlıca nedenidir. Bu virüsler Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus ve Nebovirus dahil olmak üzere en az beş cins, var olan Calıcıvırıdae ailesine aittir. sağlık sisteminin ve geniş dağılımı üzerindeki yüksek etkisine rağmen, insan Noroviruses çalışma sağlam bir hücre kültürü sisteminin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Bugüne kadar hiçbir onaylı aşılar veya antiviral stratejiler vardır. Norovirus majör kapsid proteini, VP1 olarak da adlandırılan bir tabaka (S) alan ve çıkıntı yapan bir (P) etki 2 ayrılabilir. P etki esnek menteşe (H) bölgeye göre S etki alanına bağlıdır. P etki viral kapsid dıştaki bölümünü oluşturur oysa S etki, viral RNA etrafında bir iskele oluşturur. bakterilerde ifade edildiğinde P etki biyolojik ilgili dimerleri içine toplanır. Öimer karbonhidrat yapıları ile etkileşim, tükürük çözünür antijenler olarak mevcut ve belirli konakçı hücreler 3 bulundu olan histo-kan grubu antijenleri (HBGAs) olarak adlandırılan. P etki alanı HBGA etkileşim enfeksiyonu 4 için önemli olduğu düşünülmektedir. Nitekim, son bir rapor sentetik HBGAs veya in vitro 5 insan norovirus enfeksiyonu için bakteri HBGA-ifade önemini ortaya koymuştur. Noroviruses konakçı hücre eki ile ilgili Güncel çalışmalar çoğunlukla böcek hücrelerinde veya Escherichia coli (E. Coli) &#39;de eksprese edilen rekombinant P alanları ile ifade edilebilir virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler) ile gerçekleştirilmiştir. atomik çözünürlükte P etki alanı HBGA etkileşimleri anlamak için, P etki-HBGA kompleks yapıların X-ışını kristalografisi kullanılarak çözülebilir. Burada, yüksek miktarda ve kalitede P alanının üretimi X-ışını da kristalin için kullanılmasına imkan verir P alan ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol açıklarcoğrafyayı. Dahası, bu yöntem, diğer calicivirüs P alanları ve yapısal olmayan proteinler için uygulanabilir. P etki E. için kodon optimizasyonu E. coli sentezleme ve standart bir aktarım vektörü içine klonlandı. P alanı daha sonra, bir polihistidin bölgesini (His) etiketi ve bir proteaz bölünme sitesi tarafından takip edilen mannoz bağlayıcı protein (MBP) kodlayan bir ekspresyon vektörü içine yeniden klonlanmıştır. MBP-His-P alanı füzyon proteini E. ifade edilir E. coli, üç saflaştırma kademesi takip. MBP-His-P alanı füzyon proteini hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi (IMAC) kullanılarak saflaştırılır. Daha sonra, füzyon proteini, insan rinovirüs (HRV) -3C proteaz ve P alanı ayrılır yarılır MBP-His ek IMAC saflaştırma aşaması. Son olarak, P alan boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırılır. saflaştınldı P alan X-ışını kristalografisi için kullanılabilir. Protein kristalizasyon koşullarına taranması perfo olanFarklı P domain proteini konsantrasyonları kullanılarak piyasada mevcut tarama kitleri ile rmed. Kristal büyüme gözlenir ve en umut verici koşullar optimize edilmiştir. yöntemleri burada tarif ile, en az dört hafta içinde yapısı proteine ​​gen gitmek mümkündür. Bu nedenle, P etki ifadesi, saflaştırma ve kristalizasyon bizim yöntem moleküler düzeyde norovirus-host etkileşimi incelemek ve up-to-date aşı tasarımı ve ilaç tarama yardımcı olmak için önemli veri sağlamak için uygundur.

<table><tbody><tr><td>P alanı DNA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>GeneArt Gen Sentezi</td></tr><tr><td>pMalc2x&nbsp; vektör</td><td>İstek</td><td></td><td></td>üzerine</tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Orta Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Ekono-Kolon Kromatografisi Kolon</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td>2,5 x 10 cm, diğer boyutlarda kullanılabilir</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20</td><td>GE Healthcare</td><td>çeşitli</td><td>10 kDa, 30 kDa ve 50 kDa'nın kesilmesi,</td></tr><tr><td>Alt Klonlama Verimliliği DH5 ve alfa kullanılır; Yetkili Hücreler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>Tek Atış BL21 (DE3) Kimyasal Olarak Yetkin E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>HRV 3C Proteaz</td><td>Merck Millipore</td><td>71493</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-34</td><td>SEC sütunu</td></tr><tr><td>JCSG Core süitleri</td><td>Qiagen</td><td>çeşitli</td><td>4 her 96 kuyulu ekranlar</td></tr><tr><td>Karbonhidratlar</td><td>Dextra Laboratuvarları, İngiltere</td><td>çeşitli</td><td>Kan grubu ürünleri</td></tr></tbody></table>

İnsan norovirüs çıkıntılı domains üretimi içinde<em&gt; e. e. coli</em&gt;, x ışını kristallografi için

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

norovirus kapsid tek büyük yapısal protein oluşur, VP1 olarak adlandırılır. VP1, bir tabaka (S) alan ve çıkıntı yapan bir (P) etki bölünür. S etki P etki formları S etki viral sivri ise, viral RNA etrafında bitişik iskele oluşturan ve antijenikliği ve konak hücre etkileşimleri belirleyicilerini içerir. P etki, yani., Düşünülen histo-kan grubu antijenleri, norovirus enfeksiyonları için önemli olduğu, karbonhidrat yapıları bağlar. Bu protokol, yüksek verimlerle kaliteli norovirus P etki üretmek için bir yöntem tarif eder. Bu proteinler daha sonra antijenikliği ve konak hücre etkileşimleri incelemek üzere X-ışını kristalografisi ve ELISA için kullanılabilir. P alan ilk bir ekspresyon vektörü içine klonlanabilir ve bakterilerde ifade edilmektedir. Protein, metal iyon afinite kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi immobilize barındırır üç adım kullanılarak saflaştırılır. İçindeilkesi, ekspres, klonlama arındırmak ve bu protokol yeni ortaya çıkan norovirus suşları analiz etmek için hızlı bir sistem yapar az dört hafta, proteinleri kristalize etmek mümkündür.

Tarif edilen protokol şematik Şekil 2. Protokol hedef genin klonlanması, ekspresyonu, üç aşamalı bir saflaştırma ve kristalizasyon, 6 ana parçaları kapsamaktadır., Şekil 1 &#39;de gösterilen sentezleme konstruktunun tasarımını görüntülemektedir (AT) ve pMalc2x ifade vektörünün özellikleri. PMalc2x vektörünün çoklu klonlama bölgesinin (MCS) dizisi sınırlama ve proteaz parçalama sitesi gösterir. Şekil 3, ilk iki karşılık gelen bir şema ile...

Burada, ifade ve E. (P) etki çıkıntılı yüksek kaliteli Norovirus arındırmak için bir yöntem tarif E. coli X-ışını kristalografisi çalışmalarında kullanılmak üzere. Bu yöntem, diğer calicivirüs P etki, hem de yapısal olmayan proteinleri de uygulanabilir, yani., Virüs protein genom bağlı (VPg), proteaz ve RNA bağımlı RNA polimeraz (RdRp).

İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde<em&gt; E. E. coli</em&gt;, X ışını Kristallografi için

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Bu protokolün genel amacı, X-ışını kristalografisi için son derece saf protein elde etmek amacıyla insan norovirüs çıkıntı bölgesinin E.coli'de üretilmesi ve saflaştırılmasıdır. Protein ekspresyonu, saflaştırma ve kristalleştirme protokolümüz hızlı, sağlamdır ve yapısal ile yapısal olmayan proteinler için kullanılabilir. Bu protokolün avantajı, proteinlerimizin çok saf olması ve yüksek çözünürlükte difraksiyon yapabilen kristaller oluşturabilmesidir.Deneyimlerimize göre, daha az çözünür proteinler için protokolde ayarlama yapılması gerekebilir. Örneğin, protein ekspresyonu sırasındaki büyüme ortamı veya büyüme sıcaklığı değiştirilebilir. Başlangıç olarak, standart bir transformasyon protokolü kullanarak, MBP-His-P domain füzyon proteinini kodlayan bir mikrolitre pMalc2x vektörünü 15 mikrolitre kompetan E.coli BL21 hücrelerine transforme edin.Hücrelere 600 µL SOC besiyeri ekleyin. Ardından 37 °C'de bir saat boyunca büyütülmeye bırakın. Transforme edilmiş hücreleri 120 mL LB-ampisilin içerisine alt kültüre aktararak 37 °C'de ve 160 rpm'de gece boyunca büyütün.Dokuz litre LB-ampisilin'i alt kültür ile inoküle edin. Hücreleri, 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,4 ile 0,6 değerine ulaşana kadar 37 °C'de, 160 rpm çalkalama hızıyla inkübatörde büyütün. Ardından, sıcaklığı yaklaşık bir saat boyunca 22 °C'ye düşürün.Suda çözünür protein ekspresyonuna izin vermek için, düşük miktarda IPTG ile indüksiyon yapmadan önce sıcaklığın 22 °C'ye ulaşmasını beklemek önemlidir. Protein ekspresyonunu 0,66 millimolar IPTG ile indükleyin. İndüksiyonun ardından, hücreleri 22 °C'de gece boyunca büyütün.Santrifüjasyon ile hücreleri hasat edin. Süpernatantı atın ve hücre peletini -20 °C'de dondurun. Protein saflaştırma basamaklarında kullanılacak tamponları, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere stok çözeltilerden hazırlayın.Dokuz litrelik kültürden elde edilen hücre peletini çözdürün ve dört °C'de 150 mililitre fosfat tamponlu salin içerisinde çözün. Hücreleri parçalamak için hücre süspansiyonuna ikişer dakikalık üç kez sonikasyon uygulayın. Eksprese edilen MBP-His-P domain füzyon proteinini içeren süpernatantı hücre kalıntılarından ayırmak için sonike edilmiş hücre süspansiyonunu santrifüjleyin.Süpernatantı toplayın ve pelletini atın. Bir kromatografi kolonunda, 10 mililitrelik nikel-NTA agaroz boncuk süspansiyonunu 10 milimolar imidazol tamponu ile yıkayın ve dengeleyin. Dengelenmiş nikel boncukları, eksprese edilmiş MBP-His-P domain füzyon proteinini içeren süpernatanta ekleyin ve dört derece Celsius'ta, yavaş rotasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonrası, nikel boncuk-protein karışımının tamamını bir kromatografi kolonuna uygulayın. Kolonu, dört santigrat derecede, her biri 10 milimolar, 20 milimolar ve 50 milimolar imidazol tamponu içeren beş CV ile yavaşça yıkayın. MBP-His-P domain füzyon proteinini, dört santigrat derecede 250 milimolar imidazol tamponu kullanarak elüe edin.Elüsyon sırasında, füzyon proteininin elüye edildiğini doğrulamak için 280 nanometredeki optik yoğunluğu kontrol edin. 280 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık 0,1'e düşene kadar elüsyona devam edin. Dört santigrat derecede çalışarak, boncukları önce aşırı miktarda 250 millimolar imidazol tamponu ile, ardından 10 millimolar imidazol tamponu ile yıkayın.Boncukları ikinci saflaştırma adımı için saklayın. MBP-His-P domain füzyon proteininin varlığını, %12'lik SDS poliakrilamid jel kullanarak sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile doğrulayın. Ardından, elüe edilen MBP-His-P domain füzyon proteinini yaklaşık üç miligram/mililitre son konsantrasyona ulaşana kadar konsantre edin.MBP-His-P alanını etkili bir şekilde kesmek için gereken proteaz miktarı dikkatle hesaplanmalıdır. Bu miktar, elüye edilen toplam füzyon proteini miktarına ve SDS-PAGE sonucuna bağlıdır. MBP-His-P alanı füzyonunu, iki litre 10 millimolar imidazol tamponu ile dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca gerçekleştirilen diyaliz sırasında HRV 3C proteaz ile kesin.Konsantre proteinin nihai hacmine bağlı olarak, diyalizi bir diyaliz kasedinde veya diyaliz tüplerinde gerçekleştirin. Kenara ayrılan nikel boncukları 10 millilmolar imidazol tamponu ile dengeleyin. P domaini ayrılmış protein, MBP proteini ve HRV proteaz içeren diyaliz edilmiş proteini, dengelenmiş nikel boncuklarla birlikte dört derece santigrat sıcaklıkta, yavaş rotasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin.Nikel boncuk karışımını bir kolona uygulayın ve akışta kalan kısmı dört santigrat derecede toplayın. Bu, ayrıştırılmış P domainidir. 280 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık 0,1'e ulaşana kadar kolondan çıkan protein konsantrasyonunu ölçün.MBP-His nikel boncuklara bağlı kalmalı ve ayrıştırılmış P domaini akış yoluyla elüe edilmelidir. Ayrıştırılmış P domaininin varlığını, daha önce olduğu gibi %12'lik bir jel ile SDS-PAGE kullanarak kontrol edin. Elüe edilen P domainini yaklaşık üç miligram/mililitre olacak şekilde konsantre ettikten sonra, sonraki boyut dışlama kromatografisi saflaştırması için jel filtrasyon tamponuna karşı dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca diyalize edin.Yüksek performanslı sıvı kromatografisi saflaştırma sisteminin pompalarını ve borularını yıkayın ve boyut dışlama kromatografisi kolonunu jel filtrasyon tamponu ile ön dengeye getirin. Konsantre örneğin hacmine bağlı olarak, bir superloop veya loop kullanarak P domainini dakikada 1 mL akış hızıyla kolona enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, akış hızını dakikada 2,5 mL'ye yükseltin.Optik yoğunluk arttıkça ve P alanı kolondan ayrıldıkça, 1,5 mililitrelik fraksiyonlar toplayın. P alanı genellikle bir dimer olarak elüe edilir. Fraksiyonları %12'lik bir jel ile SDS-PAGE kullanarak kontrol ettikten sonra, yalnızca en saf olanları birleştirin ve yaklaşık olarak mililitre başına üç miligram ile mililitre başına yaklaşık sekiz miligram olacak şekilde konsantre edin.İlk kristalizasyon taraması için P domainini yaklaşık olarak mililitre başına üç miligram ve mililitre başına sekiz miligram konsantrasyonlarda kullanın. 384 adet ticari olarak temin edilebilen tarama koşuluyla yapılacak ilk taramalar için, konsantrasyon başına en az 100 µL P domaini hazırlayın. Taramayı, rezervuarın 100 µL ana çözelti içerdiği ve bir damlanın 0,2 µL ana çözelti ile 0,2 µL proteinden oluştuğu 96 kuyucuklu plaka formatında, 18 °C'de gerçekleştirin.Üç satır içeren 15 kuyucuklu plakalar kullanarak başarılı kristalleşme koşullarını optimize edin. Rezervuar hacmi olarak 500 µL ana çözelti kullanın. İlk satırı %100 ana çözelti ile hazırlayın.İkinci sıra %90 stok çözelti ve %10 su ile; üçüncü sıra ise %80 stok çözelti ve %20 su ile hazırlanır. Eşit hacimlerde protein ve stok çözeltiyi karıştırarak, iki mikrolitrelik damla boyutuyla asılı damla düzeneğini kurun.P domaininin ligandlar ile birlikte ko-kristalizasyonu için optimize edilmiş kristal koşullarını kullanın. Plakaları daha önce olduğu gibi hazırlayın; ancak iki mikrolitrelik damla boyutu yerine, bir mikrolitre ana çözelti, bir mikrolitre protein ve bir miligram/mililitre konsantrasyonda bir mikrolitre ligand içeren damlalar hazırlayın. Burada, MBP-His-P domain füzyon proteininin nikel-NTA agaroz boncuklar kullanılarak saflaştırıldığı ilk saflaştırma basamağından sonra elüe edilen MBP-His-P domain füzyon proteini miktarını gösteren temsili bir SDS-PAGE sonucu gösterilmektedir.MBP-His'in ayrılmış P domeninden ayrılmasını takiben, elüye edilen ayrılmış P domeninin miktarı SDS-PAGE ile analiz edilir. Boyut dışlama kromatografisi ile yapılan son saflaştırma adımının ardından, kristal taraması optimize edilmiş kristal koşullarıyla sonuçlanmıştır. Burada, çıkıntılı bir domenin difraksiyon deseni gösterilmektedir.Prensip olarak, proteinleri dört haftadan kısa bir sürede klonlamak, eksprese etmek, saflaştırmak ve kristalize etmek mümkündür; bu da söz konusu protokolü, yeni ortaya çıkan norovirüs suşlarını analiz etmek için hızlı bir sistem haline getirir. Bu prosedür uygulanırken, kalitenin miktardan daha önemli olduğunu unutmamak gerekir. Saflaştırılmış P domainlerinin yüksek kalitesi sayesinde, antikor üretimi için immünizasyon, NMR deneyleri ve ELISA tabanlı çalışmalar dahil olmak üzere ek araştırmalar gerçekleştirilmeye uygundur.Ayrıca, saflaştırılmış P domaini, antikor fragmanları ve nanogövdelerle kompleks oluşumu için kullanılabilir. Bu protokolü izledikten sonra, yüksek kaliteli norovirüs P domainlerinin nasıl eksprese edileceği ve saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

production-human-norovirus-protruding-domains-e-coli-for-x-ray

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz elektron mikrograflarında fluoresan ışığı ile işaretlenmiş proteinler yerelleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Floresans ilk ince kesitler üzerinde fotoğraf ile aktive localisation mikroskopi kullanılarak yerelleştirilmiştir. Bu görüntüler daha sonra aynı bölümde elektron mikroskop ile hizalanır.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Kaynak: Leuthold, M.M., ve diğerleri. X-ışını Kristalografisi için E. coli'de İnsan Norovirüs Çıkıntılı Alanlarının Üretimi. J. Vis. Uzm. (2016).Bu video, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak rekombinant insan norovirüs P alanının saflaştırılmasını gösterir ve hedef proteinin diferansiyel gözenek erişilebilirliğine dayalı olarak daha yüksek ve daha düşük moleküler ağırlıklı safsızlıklardan ayrılmasını vurgular. Proses, UV absorbansı ile izlenir ve ayrıştırılan fraksiyonların SDS-PAGE...

İnsan Norovirüsünün Bakteri Kaynaklı Rekombinant P Alanı Proteinlerinin Saflaştırılması

Bu video, insan bağırsak bakterilerine bağlanan insan norovirüs virüsü benzeri parçacıkların (VLP'ler) miktarını belirlemek için bir testi göstermektedir. Bakteriyel süspansiyonlar VLP'lerle karıştırılır ve VLP-bakteri komplekslerinin oluşumuna izin vermek için inkübe edilir. Kompleksler daha sonra florofor etiketli VLP'ye özgü antikorlarla etiketlenir, ardından VLP'ye bağlı bakterilerin yüzdesini belirlemek için akış sitometrisi tabanlı görselleştirme ve miktar tayini yapılır.

İnsan Norovirüs VLP'lerinin Bağırsak Bakterilerine Bağlanmasını Ölçmek İçin Bir Test

Bu makale, makromoleküllerin doğala yakın durumlarında yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerini elde etmek için kullanılan kriyo-elektron mikroskobu metodolojisini açıklamaktadır. Yöntem, bir makromolekülün 3D rekonstrüksiyonunu oluşturmak için tasarlanan tek parçacık yaklaşımını kullanarak daha fazla bilgisayarlı işleme için uygun görüntüler verir.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Bu yöntem klonlama, ifade ve yapısal tayini için rekombinant Nsa1 arınma x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS) tarafından açıklar ve diğer proteinlerin hibrid yapısal analiz için geçerlidir her ikisi de içeren düzenli ve düzensiz etki alanları.

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

NEMO'nun IKK-bağlayıcı alanının x-ışını kristalografisi ile yapı tayinine ilişkin protokolleri açıklıyoruz. Bu yöntemler arasında protein ekspresyonu, saflaştırma ve karakterizasyonunun yanı sıra başarılı kristal optimizasyonu ve proteinin sınırsız formunda yapı tespiti stratejileri yer almaktadır.

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini

Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Öğrenin, insan norovirüsü çıkıntılı P domaininin E. coli'de hızlı üretimi, saflaştırılması ve kristalleştirilmesi için bu protokolü. Yüksek saflıkta protein, X-ışını kristalografisi ve yapısal analizler için uygundur.

İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde

Daha fazla video keşfet