Name: Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Öğrenin, yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile insan kanından nötrofil izolasyonunu ve lenfoma hücrelerinin kanser tedavisine duyarlılığı üzerindeki rollerini incelemeyi. Bu yöntem immün hücre popülasyonlarını hızla saflaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664) tarafından desteklenmiştir.

Primer lösemik hücreler ile 1. Nötrofil İzolasyon ve Co-kültür NOT: Prosedürler bilgilendirilmiş onam imzalanması tüm hastalarda Lyon Hastane Etik kurul onayı altında gerçekleştirilmiştir. <ol><li> Birincil lösemik hücreler ve nötrofillerin izolasyonu <ol><li> Kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı hastaların EDTA (kan mililitrede 1.8 mg EDTA) periferik kan tüpleri toplamak. </li><li> Bir steril 50 ml tüp kan her biri 15 ml ilave edilir ve 15 ml RPMI seyreltin (seyreltme 1: 1), daha sonra dikkatli bir şekilde yavaş yavaş fazlar karıştırılmadan tüpün dibine yoğunluk gradyan çözeltisi 15 ml ilave ediniz. yoğunluk gradyan çözeltisi hazırlanması için oda sıcaklığında olduğundan emin olun. </li><li> Oda sıcaklığında ve frensiz 35 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj. Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru gösterildiği gibi kan dört farklı aşamadan ayırmak gerekir: trombosit ve plazma, mononükleer hücreleri (white halkası), yoğunluk gradyan çözümü, granülositler ve eritrositler. </li><li> Yeni 50 ml tüp plastik Pasteur pipeti ve transferi ile birincil lösemik hücreleri temsil beyaz halka toplayın. <ol><li> PBS ile tüp içinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g toplam ve santrifüj 50 ml&#39;ye kadar (kalsiyum ve magnezyum içerir) doldurun. </li><li> 5 PBS daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g toplam ve santrifüj 50 ml&#39;ye kadar PBS ilave mL pelletini. </li><li> tam RPMI ortamı ile pelletini (RPMI 1640,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM glutamin, 100 U ile takviye / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin), hücre canlılığı sayacını kullanarak sayım için. </li></ol></li><li> Aspire Üst fazlar granülosit eritrosit faz ayrılıp 25 ml&#39;ye kadar PBS ekleyin toplam 50 ml% 0.9 NaClup içinde% 3 dekstran ekleyin. boruları 10 kez karıştırın ve karıştırma olmadan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca muhafaza edin. </li><li> Üst RBC-fakir nötrofil katman toplayıntemiz ve steril bir 50 ml tüp içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj tüpleri d. PBS sonra toplam 50 ml kadar kırmızı hücre parçalama tampon ekleyin ml 5 ile her pelletini. </li><li> RT daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g&#39;de santrifüj 15 dakika süreyle karanlıkta tüpler tutun. PBS ile pelet (toplam 50 ml&#39;ye kadar PBS ekleyin), daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g&#39;de santrifüj yıkayın. </li><li> hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile pelet yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi kullanılarak izolasyon saflığını belirlemek için 5 ml&#39;lik plastik tüplere 50 ul PBS-FBS (% 4), her hücre türü için 3 x 10 5 tutun. </li></ol></li><li> İzole hücre popülasyonlarının Morfolojik Görüntüle&#39;ye analiz <ol><li> Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 4 Nötrofiller ve 150 ul tam RPMI ortamında 3 x 10 4 mononükleer hücreleri yeniden süspanse edin. Bu t sağlanması, sitospin santrifüj cam slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları birleştirinO santrifüj iyi dengelenmiş. </li><li> santrifüj slaytlar, filtre kartları ve örnek odalarında çıkarın oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 750 x g&#39;de numune odasına ve hücre-santrifüje her bir hücre türü yer. slaytta hücrelere zarar vermemek için dikkatli sökün. Filtre kartları ve örnek odaları atın. </li><li> Giemsa boyama kiti kullanılarak hücreleri leke ve 1 saat kuruması için slaytlar tutun. 100X büyütme ile mikroskop hücreleri tarafından inceleyin. </li></ol></li><li> FACS İzole Hücrelerin Saflık test <ol><li> APC konjüge anti-insan CD19 antikoru (5 ul / 10 6 hücre) ile izole edilmiş, birincil lösemi hücreleri etiketlemek. Tablo 1 (5 ul / 10 6 hücre) listelenen anti-insan antikorlarının karışımı ile saflaştırılmış nötrofilleri etiketleyin. 4 O ° C&#39;de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri </li><li> 500 ul PBS-FBS (% 4), oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj tüpleri hücreleri yıkayın. </li><li>200 ul PBS-FBS (% 4), her pelletini. </li><li> , SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP FSC-A (488 nM): 488 nm lazer: Aşağıdaki optik yapılandırmayı kullanarak bir akış sitometresinde analiz ), PE (BP 575/26); 633 nm lazer: APC (BP 660/20), APC-Cy7 (BP 780/60). Renk karşılanmasını sağlamak. </li></ol></li><li> Otolog Nötrofiller ile İlköğretim lösemik hücrelerinin Coculture <ol><li> Tohum, birincil lösemi hücrelerinin tek başına ya da tam RPMI ortamı içinde oranı 1:10 otolog nötrofiller 2 x 10 5 hücre / ml olmuştur. Bunu yapmak için, seyreltilmesi hücre süspansiyonları, hücre sayıları ayarlayın ve 2 x 10 6 hücre / mL nötrofil birincil lösemi hücre 2 x 10 5 hücre / ml ekleyin. dikkatlice karıştırın. </li><li> hücrelere Bruton tirozin kinaz (Btk) inhibitörü (İbrutinib) 25 uM ekleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 24 saat süreyle inkübe edilir. </li></ol></li><li> Hücre Hasat ve FACS analizi <ol><li> collECT, FACS analizi ve santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;da tüpler 5 ml&#39;lik plastik tüplere hücreleri. daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj 1 ml PBS-FBS (% 4) ile granül yıkayın. </li><li> ticari kit kullanılarak ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe hücreleri süspanse Annexin V ve PI peletler. (FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PI 610: 488 nm lazer: Şekil 2A yolluk stratejisi kullanarak bir akış sitometresinde ve aşağıdaki optik yapılandırmasına analiz / 20 BP). Renk karşılanmasını sağlamak. </li></ol></li></ol> Granulositik Pathway ve 3D Model RL Lenfoma B Hücreleri ile Bunların kokültürü boyunca HL60 Hücre 2. Farklılaşma <ol><li> Nötrofil benzeri Hücreleri içine insan promiyelositik (HL60) Hücre Farklılaşma <ol><li> / Ml daha sonra değişimi etkilemek için 1 uM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ilave 3 x 10 5 hücre HL60 hücre sayısını ayarlar. Her 3 x 10 5 Tohum </skadar&gt; de 48 oyuklu plaka başına HL60 hücreleri daha sonra% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 48 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g hücreleri ve santrifüj toplar. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Sonra bu çözeltiye, 3 x 10 5 hücre / HL60 hücre sayısını ayarlamak ve 1 uM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ilave edilerek kendi değişimini etkileme tam RPMI ortamı içinde hücre süspansiyonu seyreltin. Oyuk başına 48 oyuklu plaka içerisinde her biri 3 x 10 5 HL60 hücreleri, tohum ve% 5 CO2 ile 37 ° C sıcaklıkta bir 48 saat daha inkübe edilir. </li></ol></li><li> HL60 farklılaşma Analizi (HL60 fark) <ol><li> hücreleri toplamak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj tüpleri. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile pelet yeniden süspanse edin. </li><li> flow sitometri ile hücre-yüzey belirteçleri ifade değişikliklerini analiz etmek. Her 3 x 10 5 koyun </sup&gt; ayrışmamış (hücre kültüründen) HL60 hücrelerinin ve FACS analizi ve santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;da tüpler 5 ml&#39;lik plastik tüplere, 3 x 10 5 HL60 fark hücreleri. </li><li> 50 ul PBS-FBS (% 4) pelet yeniden süspanse edin. AF700 veya APC konjüge anti-insan CD38 (5 ul / 10 6 hücre) konjüge edilmiş bir anti-insan CD11b hücreleri etiketleyin. 4 O ° C&#39;de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri </li><li> daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj 500 ul PBS-FBS (% 4) ile yıkayınız. 200 ul PBS-FBS (% 4) pelet yeniden süspanse edin. </li><li> 488 nm lazer: Şekil 3A yolluk stratejisi ve aşağıdaki optik yapılandırma kullanarak akış sitometresinde analiz FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm lazer: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (BP 730/45). </li><li> HL60 fark morfolojik değişiklikleri test etmek için, mikroskobik inceleme için cam slaytlar üzerine hücreleri hareketsiz. <ol><li> Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 tekrar süspansiyon <su(hücre kültüründen) p&gt; 4 farklılaşmamış HL60 hücrelerinin 150 ul komple RPMI ortamı içinde 3 x 10 4 HL60 fark. santrifüj dengeli olmasını sağlamak, sitospin santrifüj cam slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları birleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de numune odasına ve hücre-santrifüje her bir hücre türü yer. santrifüj slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları çıkarın. slaytta hücrelere zarar vermemek için dikkatli sökün. Filtre kartları ve örnek odaları atın. </li><li> Giemsa boyama kiti kullanılarak hücreleri leke ve 1 saat kuruması için slaytlar tutun. 100X büyütme ile mikroskop hücreleri tarafından inceleyin. </li></ol></li></ol></li><li> 3 boyutlu (3D) Kültür NOT: Bu deneyde kullanılan malzemeler soğuk ve deney buz üzerinde gerçekleşiyor emin olun. <ol><li> Tek başına veya HL60 fark ile karıştırılır ya her 5 x 10 4 RL hücreleri tekrar süspansiyon </em&gt; Oranı RL: HL60 fark 1:10 yaklaşık 2 ila 3 mm açıklığı genişletmek amacıyla steril makasla kesme, 1 ml bir pipet kullanarak 300 ul bazal membran matris ile karıştırılması. Bu adım sırasında kabarcıkları kaçının. </li><li> 24 oyuklu bir plaka içerisinde de / hücre süspansiyonu her biri 300 ul tohumu. Bu adım sırasında kabarcıkları kaçının. Daha sonra her bir RPMI ortamı doldurun ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 7 gün süre ile inkübe ml 1 ekleyin% 5 CO2 ile 37 ° C&#39; de 30 dakika boyunca inkübasyona bırakılır. iki günde orta değiştirin. günde 5 10 nM vinkristin ekleyin. </li></ol></li><li> FACS analizi <ol><li> 7 günlük bir kültürden sonra ortam aspire ve iki kez 1 ml buz gibi soğuk PBS ile her bir yıkama. 3 ml / buz gibi soğuk PBS-EDTA (5 mM) da ekleyin. 200 ul pipet ucu alt kullanılarak kazıyarak Kuyunun dibinden jel ayırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde hafifçe plakayı sallayın. </li><li> steril 15 ml tüp içine hücre süspansiyonu aktarın ve ic yavaşça tüpler sallayın30 dakika daha örn. homojen hücre süspansiyonu görünüm için kontrol edin. (Bu durumda değilse, o zaman daha uzun süre hücreleri sallamak ya da daha fazla PBS-EDTA ekleyin). </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin tüpler. PBS ile peletler daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj yıkayın. </li><li> PBS-FBS (% 4) ile yeniden süspanse edin ve PE-Cy7 ve APC konjüge anti-insan CD38 antikoru (5 ul / 10 6 hücre) bağlı anti-insan CD19 antikoru ile etiket. 4 O ° C&#39;de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g sonra 500 ul PBS-FBS (% 4) santrifüj tüplerine ile yıkayınız. ticari kit kullanılarak Annexin V ve PI ile hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Şekil 4A yolluk strateji kullanarak akış sitometresinde analiz ve aşağıdaki optik yapılandırma: 488 nm lazer: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm lazer: APC (BP 660/20). Renk karşılanmasını sağlamak. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol><li>Gocheva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+induces+cathepsin+protease+activity+in+tumor-associated+macrophages+to+promote+cancer+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion.</a> Genes Dev. 24, 241-255 (2010).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, Inflammation, and Cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells%2C+relieves+immunosuppression%2C+and+improves+chemotherapeutic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Complexity+Predicts+Breast+Cancer+Survival+and+Functionally+Regulates+Response+to+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Di Carlo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+role+of+polymorphonuclear+neutrophils+in+antitumor+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions.</a> Blood. 97, 339-345 (2001).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Cinderella+of+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).</li>
<li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).</li>
<li>Kelbaek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+isolation+of+polymorphonuclear+leukocytes+from+large+blood+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Chem.+Clin.+Biochem.+Z.+F%C3%BCrKlin.+Chem.+Klin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes.</a> J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).</li>
<li>Aynaud, M. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Tribbles+3+protects+nuclear+DNA+from+cytidine+deamination+by+APOBEC3A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A.</a> J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).</li>
<li>Ziòłkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+three-dimensional+cell+culture+and+anticancer+drug+activity+evaluation+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip.</a> Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).</li>
<li>Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+isolation+of+neutrophils+in+high+yield+without+the+use+of+dextran+or+density+gradient+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers.</a> J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).</li>
<li>Behnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+immune+complexes+induce+neutrophil+extracellular+trap+release+by+human+neutrophil+granulocytes+via+Fc%CE%B3RIIIB+and+Mac-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Baltim.Md+1950%22%5BJournal%5D)">Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1.</a> J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).</li>
<li>Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+not+less+sensitive+than+other+blood+leukocytes+to+the+genomic+effects+of+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids.</a> PloS One. 7, 44606(2012).</li>
<li>Dorward, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advance%3A+autofluorescence-based+sorting%3A+rapid+and+nonperturbing+isolation+of+ultrapure+neutrophils+to+determine+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production.</a> J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. , e50586(2013).</li>
<li>Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaplasmaphagocytophilum+reduces+neutrophil+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo.</a> Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).</li>
<li>Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22ActaHaematol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis of neutrophils.</a> ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).</li>
<li>Dalton, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-60+cell+line+was+derived+from+a+patient+with+FAB-M2+and+not+FAB-M3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3.</a> Blood. 71, 242-247 (1988).</li>
<li>Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+normal+and+transformed+epithelial+cells%3A+Their+contributions+to+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).</li>
<li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+cultures%3A+current+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).</li>
<li>Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+Neutrophils%2C+and+Cancer%3A+A+Double+Edged+Sword%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword.</a> New J. Sci. , 271940(2014).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).</li>
<li>Shojaei, F., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractoriness+to+antivascular+endothelial+growth+factor+treatment%3A+role+of+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells.</a> Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+the+malignant+glioma+phenotype+through+S100A4%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res+Off+J+Am+Assoc+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4.</a> Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).</li>
<li>Teramukai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+neutrophil+count+as+an+independent+prognostic+factor+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer%3A+an+analysis+of+Japan+Multinational+Trial+Organisation+LC00-03%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer+Oxf.Engl+1990%22%5BJournal%5D)">Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03.</a> Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-6-STAT3+axis+mediates+a+reciprocal+crosstalk+between+cancer-derived+mesenchymal+stem+cells+and+neutrophils+to+synergistically+prompt+gastric+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression.</a> Cell Death Dis. 5, 1295(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

yoğunluk gradyanlı santrifüj yaklaşımı kullanarak yüksek saflıkta insan kanından nötrofıller izolasyonu için ve aynı kademe tek çekirdekli hücreler içinde, burada etkili, basit, hızlı ve ucuz bir protokol açıklanan, aynı zamanda ayrılmakta ve geri kazanılmaktadır. izole edilmiş hücre popülasyonları ≥90% saftır. Çeşitli yöntemler insan kanından nötrofil izolasyonu için kullanılabilir. Bu süreksiz gradyanlar 11,12 kullanarak veya nötrofiller immüno-manyetik bu daha sonra CD16- bağla...

Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, tümör mikro içindeki hücrelerin önemli bir kısmını oluşturmaktadır ve hastalar ve kanser 1 hayvan modellerinde tümör kanser ile ilişkilidir. Son zamanlarda, daha yaygın kronik immün yanıtları kemoterapiler 2 tümör ilerlemesi, metastaz ve direnç teşvik kritik bir rol oynayan takdir haline gelmiştir. Makrofajlar ile doğrudan kemoterapi 3,4 tümör hücresi yanıtı düzenleyen gösterilmiştir önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, anti-kanser tedavisine, tümör yanıtı düzenleyen nötrofillerin, doğuştan gelen bağışıklık sisteminde anahtar oyuncular rolü bilinmemektedir. Bu protokollerin amacı KLL hastanın kan örneklerinden nötrofil ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem kullanmak ve anti-lenfoma ajanlara lenfoma hücrelerinin duyarlılığını düzenleyen rollerini araştırmak için granülositik yol boyunca HL60 hücreleri ayırt etmek vardır. 6 işgalci karşı ilk savunma hattı olarak kan 5 ve hareket doğuştan gelen bağışıklık sisteminin en bol hücresel bileşenidir. Nötrofiller, çeşitli patolojik şartlarda 7 değişken efektör fonksiyonlara ek olarak etkili bir doğuştan gelen bağışıklık yanıtları artan önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gibi diğer kan hücreleri, nötrofillerin izole etmek için, hızlı ve güvenilir bir yöntem olup, in vitro çalışmalar için gereklidir. Nötrofil izolasyonu için, bu yöntem kullanılarak, in vivo ve ex vivo nötrofil aracılığıyla oluşturulan imünolojik fonksiyonları üzerinde daha fazla araştırma kolaylaştıracaktır. Nötrofillerin saf popülasyonlarının elde etme yeteneği immünolojik hastalıkların 8 hastaların araştırılması için önemli bir ilk adımdır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi hücrelerin yüksek verim elde edildiği bir yere bir tekniktir. methoD ara vermeden 35 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüje edilerek ve ardından seyreltilmiş insan kanı ihtiva eden bir tüpün alt yoğunluk gradyan çözeltisi ilave edilmesini kapsar. mononükleer hücrelerin halka arayüzü görünür ve nötrofiller eski aşağıda bulunur. Bu yöntem, çok daha 9 pahalı nötrofil izolasyon kiti gibi diğer mevcut yöntemlere göre önemli avantajlara sahip. Buna ek olarak, insan nötrofillerinden için spesifik bir yüzey işaretleyici yönelik antikorlar kullanılarak ticari kitler insan kanından nötrofilleri izole hücre aktivasyonunun veya farklılaşmasının riskini arttırır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kısa bir süre içinde, nötrofillerin izolasyonu sağlar. Aynı aşamada içinde, tek çekirdekli hücreler, ayrılmış ve geri kazanılır. Saf hücrelerin yüksek verimi fonksiyonel bütünlüğü elde etmek için elde edildiği bir temel teknik. Tümör microenv taklit etmek içinironment 3D deneyler gerçekleştirilmiştir. In vitro nötrofil kısa yarı ömürlü göz önüne alındığında, yeni insan nötrofil 3D deneyler kesin değildir. Bu nedenle, promiyelositik (HL60) hücreleri farklılaşma uyarıcılar dimetil sülfoksit (DMSO) ve retinoik asit (RA) kullanılarak, nötrofil benzeri hücrelere farklılaşmaları için indüklenir. Farklılaşmış HL60 hücreleri (HL60 fark) kullanarak, farklı donörlerden izolasyon nötrofillerin farklı tepkiler sahip önleyecektir. In vitro 3D kültür modelleri, in vitro 2D modelleri arasında ve in vivo modellerde bir ara evresini temsil eder. 2B kültüründe hücreler bu sentetik yüzey üzerinde denatüre edilir biriken proteinlere doğal olmayan hücre ekleri oluşturan plastik yüzeye yayılır. Bunun aksine, hücre ve hücre dışı matrisin sentezlenmesi için 3D kültürü da doğal hücre-hücre ek hücreler, bağlı oldukları doğal malzeme vardır.Bu nedenle, özellikle de, kanser hücreleri ve diğer hücre tipleri arasında 3D ko-kültür modelleri, tümör büyümesi, anjiyogenez ve metastazın katkıları gösteren için yararlı olmuştur. Bunun bir sonucu olarak, 3D kültürleri, hücre kültürü, in vivo 10 mevcut fizyolojik koşulları taklit etmek.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS kalsiyum ve magnezyum içerir)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>N-asetil-L-alanil-L-glutamin (L-Glutamin)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin streptomisin (Pen Strep)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Bruton tirozin kinaz (Btk) inhibitörü (Ibrutinib)&nbsp;</td><td>CliniSciences</td><td>A3001</td><td></td></tr><tr><td>Vincristine&nbsp;</td><td>EG labo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel bazal membran matrisi &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Deney gününden önce gece boyunca (O>N) gece boyunca (<supoC'ye koyun</td></tr><tr><td>. Kırmızı hücre lizis tamponu&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll (Pancoll)</td> <td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td> <td>Euromedex</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Ek V-FLOUS boyama kiti ve nbsp;</td><td>Roche</td><td>11&nbsp; 988&nbsp; 549&nbsp; 001</td><td></td></tr><tr><td>Kiti RAL 555 Modifiye Giemsa boyama kiti</td><td>Cosmos Biyomedikal</td><td>CB361550-0000</td><td></td></tr><tr><td>LSRII akış sitometrisi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitosantrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR-XA mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Otomatik T4 Hücre Canlılık Sayacı</td><td>Nexcelom&nbsp; Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nötrofil İzolasyon ve analiz terapötik ajanların için lenfoma hücre duyarlılık kendi rolü belirleme

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofiller, en bol bulunan (%40 ila %75) beyaz kan hücresi türüdür ve iltihap bölgesine doğru göç eden ilk enflamatuar hücreler arasındadır. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminde kilit oyunculardır ve kanser biyolojisinde önemli roller oynarlar. Nötrofiller, malign transformasyon, tümör progresyonu, anjiyogenez ve antitümör bağışıklığının modülasyonunda anahtar mediatörler olarak önerilmiştir; çözünür faktörlerin salınması veya tümör hücreleri ile etkileşimleri yoluyla. Nötrofillerin spesifik fonksiyonlarını karakterize etmek için, nötrofillerin insan kanından in vitro izolasyonu için hızlı ve güvenilir bir yöntem rağbet görmektedir. Burada, nötrofillerin yanı sıra mononükleer hücreleri kandan izole etmek için bir yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gösterilmiştir. Prosedür, kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı konan hastalardan elde edilen seyreltilmiş kanın üzerine Ficoll gibi yoğunluk gradyan solüsyonunun dikkatlice katmanlanması, ardından santrifüjleme, mononükleer tabakanın izolasyonu, nötrofillerin eritrositlerden dekstran ile ayrılması ve ardından rezidüel eritrositlerin parçalanmasından oluşur. Bu yöntemin nötrofilleri %90 saflıkta izole ≥ gösterilmiştir. Tümör mikroçevresini taklit etmek için, Matrigel gibi bazal membran matrisi kullanılarak 3 boyutlu (3D) deneyler yapıldı. Nötrofillerin in vitro kısa yarı ömrü göz önüne alındığında, taze insan nötrofilleri ile 3D deneyler yapılamaz. Bu nedenle promiyelositik HL60 hücreleri, dimetil sülfoksit (DMSO) ve retinoik asit (RA) farklılaşma indükleyicileri kullanılarak granülositik yol boyunca farklılaşır. Deneylerimizin amacı, nötrofillerin lenfoma hücrelerinin anti-lenfoma ajanlarına duyarlılığı üzerindeki rolünü incelemektir. Bununla birlikte, bu yöntemler, nötrofillerin veya nötrofil benzeri hücrelerin farklı durumlarda çok çeşitli hücre tipleri ile etkileşimlerini incelemek için genelleştirilebilir.

, Beyaz bir halka tek-çekirdekli hücreleri temsil eder, trombositler ve plazma. Burada tarif edilen yoğunluk gradyan ayırma yöntemi CLL hasta kanından izole primer lösemik hücreler ve uyarılmamış nötrofiller Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru (yoğunluk gradyanlı santrifüj işlemi sonrasında elde edilen farklı kan katmanları temsil içerir yoğunluk gradyan çözeltisi, granülositler ve eritrositler). Şekil 1B ve 1C, sırasıyla nötrofil (çok loblu çekirdek hücre...

Nötrofiller en bol bulunan beyaz kan hücresi türüdür. Nötrofillerin insan kanından yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile izolasyonu ve insan promiyelositik (HL60) hücrelerinin granülositik yol boyunca farklılaşması burada açıklanmaktadır; lenfoma hücrelerinin anti-lenfoma ajanlarına duyarlılığı üzerindeki rolünü test etmek.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Bu prosedürlerin genel amacı, iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) hücre kültürü modellerini kullanarak lenfoma hücrelerinin kanser tedavisine duyarlılığındaki rollerini araştırmak amacıyla, yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile insan kan örneklerinden yüksek saflıkta nötrofilleri hızlı bir şekilde izole etmektir. Bu yöntemler, nötrofil aracılı tümör hücresi yanıtlarının kanser tedavisinde nasıl bir rol oynadığı gibi, doğuştan gelen bağışıklık sistemi ile kanser arasındaki etkileşimlere dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yoğunluk gradyanı ayırmasının temel avantajı, hücreleri fonksiyonlarını değiştirebilecek uyarılara maruz bırakmadan, kısa bir süre içinde saf bağışıklık hücresi popülasyonlarını izole edebilme yeteneğidir.Primer lösemik hücreleri ve nötrofilleri izole etmek için, kronik lenfositik lösemi hastası örneklerinden alınan 15 mililitre EDTA'lı kanı, ayrı steril 50 mililitrelik tüplere ekleyerek başlayın. Kanı 15 mililitre RPMI ile seyreltin. Ardından, katmanların karışmamasına dikkat ederek, kanın altına oda sıcaklığında 15 mililitre yoğunluk gradiyenti çözeltisini dikkatlice ve yavaşça ekleyin.Santrifüj ile hücreler ayrıştırıldıktan sonra, dört farklı faz görülecektir. Üstte trombositler ve plazma, mononükleer hücrelerden oluşan beyaz bir halka, yoğunluk gradyan çözeltisi ve altta granülositler ile eritrositler. Plastik bir pastör pipeti kullanarak, öncelikle primer lökemik hücrelerin bulunduğu beyaz halkayı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın.Hücreleri, kalsiyum ve magnezyum içeren 50 mililitreye kadar PBS ile yıkayın. Ardından pellet'i beş mililitre taze PBS içerisinde yeniden süspanse edin. Daha sonra hücrelere 45 mililitre daha PBS ekleyin ve hücreleri tekrar santrifüjleyin.İkinci yıkamadan sonra, damak dokusunu tam RPMI besiyerinde yeniden süspande edin. Ve canlı primer lösemik hücrelerin sayısını belirleyin. Ardından, trombosit plazma ve yoğunluk gradyan katmanlarını uzaklaştırın ve granülosit eritrosit fazına 25 mililitre PBS ve 25 mililitre sodyum klorür içeren Dekstrin ekleyin.Tüpleri ters çevirerek on kez karıştırın. Ardından, hücrelerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çökelmesini bekleyin. Dengeleme işleminin sonunda, üstteki kırmızı kan hücresi yönünden fakir nötrofil tabakasını steril, 50 millilitre'lik bir tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleyin.Pelleti beş mililitre PBS içinde yeniden süspande edin ve eritrositleri 45 mililitre eritrosit liz süspansiyonu ile lize edin. Oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dakika bekledikten sonra hücreleri tekrar santrifüjleyin ve pelleti 50 mililitre PBS ile yıkayın. Yıkama işleminin sonunda, hücreleri tam RPMI besiyerinde yeniden süspande edin ve canlı nötrofil sayısını belirleyin.Her iki hücre grubunu, 50 µL RPMI başına 300.000 hücre olacak şekilde seyreltin ve örnekleri uygun sayıdaki beş mL'lik faks tüplerine paylaştırın. Santrifüjden sonra, peletleri FBS ile tamamlanmış 50 µL PBS içinde yeniden süspande edin. İzole edilen hücre alt kümelerinin saflığını belirlemek için, primer lökemik hücrelerden alınan alikotu APC ile konjuge edilmiş anti humanCD19 antikoruyla, saflaştırılmış nötrofillerin alikotunu ise tabloda listelenen anti human antikor karışımıyla, 4 °C'de karanlıkta 30 dakika boyunca işaretleyin.İnkübasyon sonunda, hücreleri 500 µL FBS destekli PBS ile yıkayın ve pelletleri 200 µL taze FBS PBS içinde yeniden süspande edin. Ardından, numunelerin renk kompanzasyonunu yapmaya dikkat ederek, hücre popülasyonlarının saflığını akış sitometrisi ile analiz edin. Primer lökemik hücreleri otolog nötrofillerlele birlikte kültürlemek için, 24 kuyucuklu plakadaki tam RPMI besiyerinde, sadece lökemik hücreleri veya lökemik hücreleri otolog nötrofillerle birlikte mililitre başına 200.000 hücre olacak şekilde ekleyin.Hücreleri dikkatlice karıştırın. Ardından hücreleri, 37 °C ve %5 CO2 ortamında 24 saat boyunca Brutton's Tyrosine Kinase İnhibitörü ile tedavi edin. Ertesi gün, hücrelerden bir alikotu beş mililitrelik plastik bir faks tüpüne toplayın.Ardından, hücreleri santrifüjle çöktürün ve pelletleri bir mililitre FBS PBS ile yıkayın. İkinci santrifüjden sonra, üretici talimatlarına göre hücreleri anineksin beş ve propidyum iyodür ile oda sıcaklığında, karanlıkta on dakika boyunca işaretleyin. Daha sonra, nötrofilleri ve primer lösemik hücreleri, gösterilen kapılama stratejisini kullanarak akış sitometrisi ile analiz edin.Üç boyutlu bir ko-kültür kurulumu için, steril 15 mililitrelik tüplere tek başına 50.000 RL lenfoma b-hücresi ekleyin veya bunları HL60 diferansiye hücreleri ile karıştırın. Örnekleri santrifüjleyin ve peletleri, ucu 2 ila 3 milimetreye kadar kesilmiş bir milimetrelik pipet ucu kullanarak 300 mikrolitre bazal membran matriksi içinde yeniden süspanse edin. Ardından, 24 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 300 mikrolitre hücre ekleyerek 37 derece Celsius ve yüzde beş CO2 ortamında 30 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonunda, her kuyucuğa bir mililitre tamamlanmış RPMI besiyeri ekleyin ve üç boyutlu kültürleri, her iki günde bir besiyeri değişimleri yaparak yedi gün daha inkübatöre yerleştirin. Beşinci günde, kültürlere on nanomolar incristine ekleyin. Bir haftalık kültür süresinin ardından, besiyerini aspire edin ve her kuyucuğu bir mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, her bir kuyucuğa üç mililitre buz gibi soğuk EDTA'lı PBS ekleyin ve jelleri ayırmak için kuyucukların tabanını 200 mikrolitrelik bir pipet ucuyla kazıyın. Plakayı buz üzerinde 30 dakika boyunca hafifçe sallayın. Sonra, hücre süspansiyonlarını buz üzerinde 30 dakika daha hafifçe sallamak üzere ayrı steril 15 mililitrelik tüplere aktarın.Homojen bir hücre süspansiyonunun oluştuğunu doğrulayın. Ardından, hücreleri santrifüjle çöktürün, PBS ile yıkayın ve pelletleri FBS içeren taze PBS içinde yeniden süspande edin. Son olarak, hücreleri az önce gösterildiği gibi uygun antikorlar ve canlılık boyalarıyla işaretleyin ve RL ile HL60 farklılaşmış hücrelerini, gösterilen gating stratejisini kullanarak akış sitometrisi ile analiz edin.İzole edilen hücre popülasyonlarındaki tüm olayların akış sitometrisi ile analiz edilmesi, bu ayırma yönteminin yüksek saflıkta, tek piki olan ve CD19 eksprese eden primer lösemi hücresi popülasyonu ile sonuçlandığını göstermektedir. Ayrıca, lökosit ortak antijeni CD45'e ve olgun nötrofiller tarafından eksprese edilen CD15 ve CD16 antijenlerine pozitif, yüzde 90'tan daha yüksek saflıkta bir nötrofil popülasyonu elde edilmiştir. Nötrofil ko-kültürlerinden primer lösemi hücrelerinin kapılanması (gating), nötrofillerin tirozin inhibitörü ibrutinib'e karşı hücre sağkalımı üzerinde koruyucu bir etki gösterdiğini ve tek başına primer lösemi hücresi kültürüne kıyasla anlamlı derecede daha yüksek sayıda canlı primer lösemi hücresi bulunduğunu kanıtlamaktadır.Farklılaşmış HL60 hücreleri, üç boyutlu kültürlerde nötrofillere göre daha stabildir. Granülositik gelişimleri indükledikten sonra, bu hücreler farklılaşmamış HL60 hücrelerinden daha küçüktür ve daha yüksek seviyelerde CD11B ve CD38 ekspres ederler. Farklılaşmış HL60 hücreleri ayrıca çok loblu çekirdekler sergiler.Bu hücreler, vincristin tedavisi sonrası üç boyutlu ko-kültürlerde, tek başına kültüre edilen ve vincristin tedavisi gören lenfoma hücrelerine kıyasla anlamlı derecede daha yüksek sayıda canlı RL hücresi ile RL hücreleri üzerinde koruyucu bir etki göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, yoğunluk gradyanı santrifüj yöntemi 90 dakika içinde tamamlanabilir. Bu teknikler geliştirildikten sonra, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların, preklinik modellerde ve hasta örneklerinde çeşitli beyaz kan hücrelerinin tümör malignitesi üzerindeki etkisini keşfetmelerine olanak sağlamıştır.Bu videoyu izledikten sonra, mononükleer hücrelerin ve nötrofillerin nasıl hızlı ve güvenilir bir şekilde izole edileceği, nötrofillerin tümör hücrelerinin antikanser ajanlara verdiği yanıtları yönetmedeki etkisinin nasıl analiz edileceği ve üç boyutlu bir ko-kültür sisteminin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, süreksiz sükroz gradyan santrifüjleme ile tümör taşıyan bir farenin kanından sitotoksik yüksek yoğunluklu nötrofillerin ve düşük yoğunluklu nötrofillerin izolasyonunu gösteriyoruz.

Tümörlü Fare Kanından Sitotoksik Nötrofillerin İzolasyonu

Bu video, lenfoma hücrelerini kemoterapötik ajanların sitotoksisitesine karşı korumada nötrofil benzeri hücrelerin rolünü araştıran bir testi göstermektedir. Lenfoma ve nötrofil benzeri hücrelerden oluşan bir 3D ko-kültür kurulur ve bir kemoterapi ilacı olan vinkristin'e maruz bırakılır. Nötrofil benzeri hücrelerle doğrudan temas, lenfoma hücrelerinde anti-apoptotik proteinlerin yukarı regülasyonuna neden olur, böylece vinkristin varlığında hayatta kalmalarını teşvik eder.

Lenfoma hücresinin bir test ilacına duyarlılığında nötrofil benzeri hücrelerin rolünün belirlenmesi

Burada, iki çift proteomik teknikleri, yani Elektroforez (2DE) ve kütle spektrometrisi (MS) 2 boyutlu, diferansiyel primer örnekleri, iki veya daha fazla grup arasından / translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinler olarak ifade teşhis edilmesi için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım, birbirine işlevsel deneyler ile, prognostik parametreler / terapötik hedeflerin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlar.

Protein fonksiyonu için bir 2DE-Jel Spot: Kronik Lenfositik Lösemide HS1 öğrendim Ders

Nötrofiller sadece istilacı mikroorganizmalara karşı konak savunmasında değil, aynı zamanda tümör hücrelerinin immün sürveyansında da önemli bir rol oynarlar. Burada, anti-tümör özelliklere sahip nötrofillerin izolasyonu ile ilgili teknikleri ve in vitro ve in vivo olarak anti-tümör nötrofil fonksiyonunu izleme yöntemlerini açıklıyoruz.

Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu

Burada açıklanan protokol, farklı koşullar altında kültürlenen kronik lenfositik lösemi (KLL) hücrelerinde pürin metabolizmasını ölçmek için ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) kullanan kolay ve tekrarlanabilir bir yöntemi temsil eder.

HPLC tabanlı Testi İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Ekstraselüler Nükleotid / Nükleozid Metabolizması Monitör

Burada, postoperatif peritoneal lavaj sıvı, kurtarılan insan düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), büyük nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) üretmek ve verimli bir şekilde daha sonra grow ücretsiz tümör hücreleri tuzak bir yöntem mevcut.

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Batı dünyasında en sık görülen lösemi var. NFAT transkripsiyon faktörleri önemli düzenleyiciler geliştirme ve harekete geçirmek içinde çok sayıda hücre tipleri vardır. Burada, NFAT2, roman hedef genlerin tanımlamak için insan CLL hücrelerinde kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanımı için bir iletişim kuralı mevcut.

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Bu protokol, nötrofillerin tam kan, buffy coats veya lökferez zarlarından izole edilmesinin, iyi verim, yüksek saflık ve minimum hücre aktivasyonu elde edilmesinin bir yöntemini detaylandırmaz. Yüksek kaliteli/saflıkta nötrofil preparatı elde etmek için gradyan saflaştırma, kırmızı kan hücresi (RBC) sedimilasyonu ve RBC lizizini kullanıyoruz.

İnsan Nötrofillerinin Tam Kan ve Buffy Coats'tan İzolasyonu

Bu protokol, farklı sinyal yollarından gelen fonksiyonları kapsamak için bir tarama yöntemi olarak kullanılacak bir dizi nötrofil fonksiyonel tahlil içerir. Protokol, hücre canlılığının, saflığının, reaktif oksijen türlerinin üretiminin, gerçek zamanlı göçün, fagositozun ve nötrofil hücre dışı tuzakların bir ön önerisinin ilk ve basit bir değerlendirmesini içerir.

Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği

Burada, manyetik izolasyon (negatif seçim) ve süreksiz yoğunluk gradyan ortamı kullanarak düşük ve normal yoğunluklu nötrofillerin tam kandan izole edilmesi için güvenilir bir yaklaşım sunuyoruz. Yüksek saflıkta hücrelerin (%≥93) el değmeden izolasyonunu sağlayarak, sağlık ve hastalıktaki rollerini anlamak için çok önemli olan nötrofil alt popülasyonlarının doğru aşağı akış analizini kolaylaştırır.

Tam Kandan Düşük ve Normal Yoğunluklu Nötrofillerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN) birçok hastalıkta önemli ölçüde artar. LDN genellikle hücre sıralaması yoluyla izole edilir. Saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem sunuyoruz. Periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra, hücreler manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, manyetik kolonlar aracılığıyla ayrılır.

Düşük Yoğunluklu Nötrofillerin Verimli Saflaştırılması için Hızlı Manyetik-mikro Boncuk Yöntemi

Öğrenin, yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile insan kanından nötrofil izolasyonunu ve lenfoma hücrelerinin kanser tedavisine duyarlılığı üzerindeki rollerini incelemeyi. Bu yöntem immün hücre popülasyonlarını hızla saflaştırır.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Daha fazla video keşfet