Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Bu prosedürlerin genel amacı, iki D ve üç D hücre kültürü modeli kullanarak lenfoma hücresinin kanser tedavisine duyarlılığındaki rollerini araştırmak için yoğunluk gradyan santrifüjleme ile insan kan örneklerinden yüksek oranda saflaştırılmış nötrofilleri hızlı bir şekilde izole etmektir. Bu yöntemler, nötrofil aracılı tümör hücresi yanıtlarının kanser tedavisinde nasıl bir rol oynadığı gibi, doğuştan gelen bağışıklık sistemi ile kanser arasındaki etkileşimler hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Yoğunluk gradyanı ayrımının ana avantajı, hücreleri işlev değiştiren uyaranlara maruz bırakmadan saf bağışıklık hücresi popülasyonlarını kısa bir süre içinde izole etme yeteneğidir.

Primer lösemik hücreleri ve nötrofilleri izole etmek için, kronik lenfositik lösemi hasta örneklerinden 15 mililitre EDTA ile muamele edilmiş kanı bireysel, steril 50 mililitrelik tüplere ekleyerek başlayın. Kanı 15 mililitre RPMI ile seyreltin. Daha sonra dikkatlice ve yavaşça 15 mililitre oda sıcaklığında yoğunluk gradyan solüsyonunu kanın altına ekleyin, katmanları karıştırmamaya dikkat edin.

Hücreleri santrifüjleme ile ayırdıktan sonra, dört farklı faz görünür olacaktır. Üstte trombositler ve plazma, beyaz bir mononükleer hücre halkası, yoğunluk gradyan çözeltisi ve altta granülositler ve eritrositler. Plastik bir mera pipeti kullanarak, önce birincil lösemik hücrelerin beyaz halkasını 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Hücreleri kalsiyum ve magnezyum ile 50 mililitreye kadar PBS ile yıkayın. Ve damağı beş mililitre taze PBS'de tekrar askıya alın. Ardından, hücrelere 45 mililitre daha PBS ekleyin ve hücreleri tekrar döndürün.

İkinci yıkamadan sonra, damağı tam RPMI ortamında tekrar askıya alın. Ve canlı birincil lösemik hücrelerin sayısını sayın. Daha sonra, trombosit plazma ve yoğunluk gradyan katmanlarını çıkarın ve granülosit eritrosit fazına sodyum klorür içinde 25 mililitre PBS ve 25 mililitre Dekstrin ekleyin.

Tüpleri ters çevirerek on kez karıştırın. Ardından, hücrelerin oda sıcaklığında 30 dakika oturmasına izin verin. Dengelemenin sonunda, üst kırmızı kan hücresinden fakir nötrofil tabakasını steril, 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri aşağı doğru döndürün.

Damağı beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve kırmızı kan hücrelerini 45 mililitre kırmızı hücre lizis tamponu ile parçalayın. Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika bekledikten sonra, hücreleri tekrar döndürün ve damağı 50 mililitre PBS'de yıkayın. Yıkamanın sonunda, hücreleri tam RPMI ortamında yeniden askıya alın ve canlı nötrofillerin sayısını sayın.

Her iki hücre grubunu da 50 mikrolitre RPMI konsantrasyonu başına 300.000 hücreye seyreltin ve örnekleri uygun sayıda beş mililitre faks tüpü arasında bölün. Santrifüjlemeden sonra, peletleri FBS ile takviye edilmiş 50 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. İzole edilmiş hücre alt kümelerinin saflığını belirlemek için, primer lösemik hücrelerin aliquant'ını APC'ye konjuge edilmiş anti humanCD19 antikoru ile ve saflaştırılmış nötrofillerin aliquant'ını, karanlıkta 30 dakika boyunca karanlıkta dört santigrat derecede tabloda listelendiği gibi bir anti insan antikorları karışımı ile etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri 500 mikrolitre FBS takviyeli PBS içinde yıkayın ve damakları 200 mikrolitre taze FBS PBS'de yeniden süspanse edin. Ardından, hücre popülasyonlarının saflığını akış sitometrisi ile analiz edin ve numunelerin rengini telafi etmeye özen gösterin. Birincil lösemik hücreleri otolog nötrofillerle birlikte kültürlemek için, tek başına mililitre lösemik hücre başına 200.000 hücreye veya tam RPMI ortamında 24 oyuklu bir plakada otolog nötrofillere bakın.

Hücreleri dikkatlice karıştırın. Daha sonra hücreleri Brutton'un Tirozin Kinaz İnhibitörü ile 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de tedavi edin. Ertesi gün, beş mililitrelik plastik bir faks tüpünde hücrelerin bir kısmını toplayın.

Ardından, hücreleri döndürün ve peletleri bir mililitre FBS PBS'de yıkayın. İkinci santrifüjlemeden sonra, hücreleri anineksin beş ve propidyum iyodürü üreticinin talimatlarına göre karanlıkta oda sıcaklığında on dakika boyunca etiketleyin. Ardından, gösterilen geçit stratejisini kullanarak nötrofiller ve birincil lösemik hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin.

Üç boyutlu bir ko-kültür oluşturmak için, tek başına 50.000 RL lenfoma b hücresi ekleyin veya steril 15 mililitrelik tüplerde HL60 farklılaşmış hücrelerle karıştırın. Numuneleri döndürün ve peletleri 300 mikrolitre bazal membran matrisi içinde, açıklığı iki ila üç milimetreye kesilmiş bir milimetre pipet ucu kullanarak yeniden süspanse edin. Daha sonra, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 300 mikrolitre hücreyi 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa bir mililitre tam RPMI ortamı ekleyin ve üç D kültürleri, her iki günde bir orta değişikliklerle yedi gün daha inkübatöre geri koyun. Beşinci günde, kültürlere on nanomolar incristine ekleyin. Bir haftalık kültürden sonra, ortamı aspire edin ve her birini bir mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.

Daha sonra, her bir oyuğa üç mililitre EDTA'lı buz gibi PBS ekleyin ve jelleri ayırmak için kuyuların dibini 200 mikrolitrelik bir pipet ucu ile kazıyın. Plakayı 30 dakika boyunca buz üzerinde hafifçe çalkalayın. Ardından, buz üzerinde 30 dakika daha hafifçe çalkalamak için hücre süspansiyonlarını ayrı ayrı steril 15 mililitrelik tüplere aktarın.

Homojen bir hücre süspansiyonunun görünümünü onaylayın. Ardından, hücreleri döndürün, ardından bir PBS yıkaması yapın ve peletleri FBS ile taze PBS'de yeniden süspanse edin. Son olarak, hücreleri az önce gösterildiği gibi uygun antikorlar ve canlılık boyaları ile etiketleyin ve gösterilen geçit stratejisini kullanarak RL ve HL60 farklılaşmış hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin.

İzole edilmiş hücre popülasyonlarının tüm olaylarının akış sitometrisi ile analiz edilmesi, bu ayırma yönteminin primer lösemik hücre popülasyonunu eksprese eden oldukça saf tek bir tepe CD19 ile sonuçlandığını göstermektedir. Ve lökosit ortak antijenleri CD45 ve olgun nötrofiller tarafından eksprese edilen CD15 ve CD16 antijenleri için pozitif olan yüzde 90'dan fazla saf nötrofil popülasyonu. Nötrofil kokültürlerinden elde edilen primer lösemik hücreler üzerinde yürüme, nötrofillerin, tek başına primer lösemik hücrelerin kültürüne kıyasla önemli ölçüde daha fazla sayıda canlı primer lösemik hücre ile tirozin inhibitörü ibrutinib'e karşı hücre sağkalımı üzerinde koruyucu bir etki gösterdiğini göstermektedir.

Diferansiye HL60 hücreleri, üç D kültürlerde nötrofillerden daha kararlıdır. Granülositik gelişimlerinin indüksiyonundan sonra, bu hücreler farklılaşmamış HL60 hücrelerinden daha küçüktür ve daha yüksek CD11B ve CD38 seviyelerini eksprese eder. Farklılaşmış HL60 hücreleri ayrıca çok loblu çekirdekler sergiler.

Bu hücreler, tek başına kültürlenen vinkrostin ile tedavi edilen lenfoma hücrelerine kıyasla, vinkrostin tedavisinden sonra üç D kokültür içinde önemli ölçüde daha fazla sayıda canlı RL hücresi ile RL hücreleri üzerinde koruyucu bir etki gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, yoğunluk gradyan santrifüjleme yöntemi 90 dakika içinde tamamlanabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknikler kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların, çeşitli beyaz kan hücrelerinin klinik öncesi modellerde ve hasta örneklerinde tümör malignitesi üzerindeki etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, mononükleer hücrelerin ve nötrofillerin nasıl hızlı ve güvenilir bir şekilde izole edileceğini, nötrofillerin anti kanser ajanlarına tümör hücresi yanıtlarına aracılık etme üzerindeki etkisini analiz etmeyi ve üç boyutlu bir kokültür oluşturmayı iyi anlamalısınız.