Name: Marginating pulmoner lökosit seçici Hasat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Öğrenin, sıçan ve fare akciğerlerinden marjinal pulmoner lökositleri seçici olarak izole etme yöntemini. Bu teknik, akciğer kapillerlerine yapışan bu hücrelerin benzersiz immünolojik fonksiyonlarını incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ve bu çalışma NIH / NCI hibe # (SBE kadar) R01CA172138 tarafından desteklendi.

Hayvan denekleri Prosedürleri Tel-Aviv Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Sıçan Protokolü <ol><li> hazırlıklar <ol><li> 2 kelebek 21 G iğne düzenleyin. İsteğe bağlı olarak, iğnenin keskin kenar dosyalama 2 künt kenarlı kelebek 21 G iğne hazırlamak. </li><li> yerçekimi (kuru) ayarında en az 30 dakika süreyle 121 ° C&#39;de otoklav ile sterilize makas 2 çift, körelmiş kenarlı forseps, hemostat, diş doku forseps: cerrahi aletler sterilize edin. </li><li> fosfat tamponlu tuzlu su (1 x PBS), çözeltinin ml&#39;si başına heparin 30 adet ekleyerek heparinize PBS (30 birim / ml) hazırlayın. Oda sıcaklığında kullanın. 35 ml hayvan başına ihtiyaç duyulan minimum hacimdir. </li><li> Hava kabarcıklarını önlemek için peristaltik pompa hatları ve kelebek iğne içine heparinize PBS akışı. </li></ol></li><li> MP-lökosit Akciğerler ve Toplama perfüzyon <ol><li> % 8 izofluran aşırı dozda ile hayvan Euthanize. izleme solunum durması ile ötenazi onaylayın. </li><li> Solunumun durması üzerine, derhal steril makas ve diş doku forseps kullanılarak periton ve göğüs boşlukları açın. kılıç şeklinde sürecine karın kadar birlikte orta hat karın kesisi gerçekleştirin. </li><li> herhangi bir iç organ ya da büyük kan damarları delmeden, dikkatli her iki tarafta göğüs kafesini kesme, forseps kullanarak sternum kaldırın. sternum üzerinde bir hemostat kelepçe ve rostrally kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için göğüs kafesi katlayın. </li><li> kalbin sağ ventrikül içine, bir kelebek iğne yerleştirin ve yaklaşık bir dakika içinde (~ 250 g hayvan 6 ml) bir şırınga içine kan maksimal hacim toplar. </li><li> Karaciğer (Tartışma) geriye doğru perfüzyon önlemek için hemostatla vena kava Kelepçe. </li><li> p çıkış borusu ile kan içeren şırınga değiştirirken sağ ventrikül içinde kelebek iğne tutuneristaltic pompa. </li><li> interventriküler septum nüfuz kaçınarak sol ventrikül içine, bir 5 mi hasat şırıngaya bağlanan ikinci bir kelebek iğne yerleştirin. </li><li> yaklaşık olarak 5 mL / dakikalık bir hızda bir peristaltik pompa açın ve yavaşça şırıngaya kan ile kirlenmiş olan perfüzat ilk mililitre toplar. perfüzat kırmızı renk soluk karanlıktan açılana kadar devam edin. (Kan bulaşmış perfuste atın). </li><li> peristaltik pompa kesilmesi olmadan, hızlı bir şekilde 20 mi hasat şırınga ile 5 mi hasat şırınga yerine ve perfüzyon daha yüksek bir hızda (kadar 7 ml / dakika) kullanılarak, akciğer perfüzat 20 ml toplar. Vakum oluşumunu kaçınarak sürekli toplama enjektöre perfüzyon akışını izlemek. </li><li> peristaltik pompa akışını kesmeye. </li></ol></li><li> lökositler Ekstraksiyon <ol><li> 400 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj perfüzat. </li><li> sıvıyı aspire. </li><li>10 dakika boyunca 400 x g&#39;de 10 ml PBS veya orta, santrifüj ekleyin ve sıvıyı aspire. İki kez bu adımı yineleyin. PBS veya ortam kullanılması numunesinin sonucu kullanımına bağlıdır. </li><li> 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de 20 ml PBS veya orta, santrifüj ekleyin ve sıvıyı aspire. </li><li> Örnek kullanım (FACS PCR, vb) göre istenen konsantrasyona hücreleri sulandırın. </li></ol></li></ol> 2. Fare Protokolü <ol><li> hazırlıklar <ol><li> 2 kelebek 25 G iğne düzenleyin. İsteğe bağlı olarak, iğnenin keskin kenar dosyalama 2 künt kenarlı kelebek 25 G iğne hazırlamak. </li><li> yerçekimi (kuru) ayarında en az 30 dakika süreyle 121 ° C&#39;de otoklav ile sterilize makas 2 çift, körelmiş kenarlı forseps, hemostat, diş doku forseps: cerrahi aletler sterilize edin. </li><li> 1x PBS çözeltisi ml&#39;si başına heparin 30 adet ekleyerek heparinize PBS (30 birim / ml) hazırlayın. Oda sıcaklığında kullanın. 25 ml hayvan başına ihtiyaç duyulan minimum hacimdir. </li><li> streHava kabarcıklarını önlemek için peristaltik pompa hatları ve kelebek iğne içine PBS heparinize ediyorum. </li></ol></li><li> MP-lökosit Akciğerler ve Toplama perfüzyon <ol><li> % 8 izofluran aşırı dozda ile hayvan Euthanize. izleme solunum durması ile ötenazi onaylayın. </li><li> Solunumun durması üzerine, derhal steril makas ve diş doku forseps kullanılarak periton ve göğüs boşlukları açın. kılıç şeklinde sürecine karın kadar birlikte orta hat karın kesisi gerçekleştirin. </li><li> herhangi bir iç organ ya da büyük kan damarları delmeden, dikkatli her iki tarafta göğüs kafesini kesme, forseps kullanarak sternum kaldırın. sternum üzerinde bir hemostat kelepçe ve rostrally kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için göğüs kafesi katlayın. </li><li> Karaciğer (Tartışma) geriye doğru perfüzyon önlemek için hemostatla vena kava Kelepçe. </li><li> Sağ ven içine peristaltik pompa çıkış borusuna bağlı bir kelebek iğne yerleştirinKalbin tricle ve kalp, septum ve avoidingpenetration sol ventrikül içine, bir 2 mi hasat şırıngaya bağlanan ikinci bir kelebek iğne. </li><li> yaklaşık 2 ml / dk hızına pompa açın ve perfüzyon (kan bulaşmış perfuste atın) kırmızı soluk karanlıktan dönene kadar hasat şırıngaya kan kirlenmiş perfüzat ilk mililitre toplamak. </li><li> peristaltik pompa kesilmesi olmadan, hızlı bir şekilde 10 mi hasat şırınga ile 2 mi hasat şırınga yerine ve perfüzyon daha yüksek bir hızda (en fazla 4 ml / dakika) kullanılarak, akciğer perfüzat 10 ml toplar. Vakum oluşumunu kaçınarak sürekli toplama enjektöre perfüzyon akışını izlemek. </li><li> peristaltik pompa akışını kesmeye. </li></ol></li><li> lökositler Ekstraksiyon <ol><li> 400 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj perfüzat. </li><li> sıvıyı aspire. </li><li> 400 10 ml PBS veya orta, santrifüj ekle10 dakika xg ve sıvıyı aspire. Bu adımı üç kez tekrarlayın. PBS veya ortam kullanılması numunesinin sonucu kullanımına bağlıdır. </li><li> 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de 10 ml PBS veya orta, santrifüj ekleyin ve sıvıyı aspire. </li><li> Örnek kullanım (FACS PCR, vb) göre istenen konsantrasyona hücreleri sulandırın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginated+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li>
<li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC%3A+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li>
<li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li>
<li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li>
<li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis%3A+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li>
<li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada sunulan yöntem seçici hasat sağlayan ve MP-lökositlerin eşsiz nüfusun eğitim. Döner ya da dalak lökositleri karşılaştırıldığında, MP popülasyonu bir lökosit alt gruplarının farklı bileşim, yüksek aktivasyon düzeyleri, muhtelif sitokinlerin yüksek bırakma ve yanlısı ve anti-enflamatuar sitokinlerin 2,3 daha yüksek mRNA seviyeleri ile karakterize edilir. Özellikle, MP-NK hücreleri, çeşitli hedef hücrelere 3,4 karşı dolaşım NK hücreleri daha sitotoksiktir ve interferon-y yüksek seviyelerde eksp...

Akciğer kılcal (örneğin, marginating pulmoner (MP) lökositler) 1 diğer bağışıklık bölümlerinde (örneğin, kan dolaşımı, karaciğer, dalak, kemik iliği) gelen lökositlere kıyasla belirgin lökosit bileşim ve özel aktivitesi sergiledikleri gösterilmiştir ve 2- yapışan lökositlerin 4. Örneğin, dolaşım ve dalak NK hücreleri, hem de ayırt mesajcı RNA (mRNA) seviyeleri ve pro- ve anti-enflamatuar sitokinlerin artan salgılanmasında karşılaştırıldığında çeşitli tümör hücrelerine karşı MP-lökosit sergi yüksek doğal katil (NK) hücreler sitotoksisite. MP-lökosit dolaşan lökositlerin (% 50 vs sırasıyla% 30,) ile karşılaştırıldığında doğal / adaptif bağışıklığın daha yüksek bir oranına sahip olarak hücrelerin kompozisyonu da dolaşan lökositlerin ayırt edilir. Burada sunulan yöntemin amacı, MP-lökositlerin selektif hasat sağlamak, bu önemli ve eşsiz bağışıklık bölmesi (hücre popülasyonu) incelemek için, ve eluc için iseBu özel hücreler üzerinde çeşitli manipülasyonlar (örneğin, bağışıklık aktivasyon) etkisini idate. Bu eşsiz nüfusun önemini anlamak için, bağışıklık sisteminin hücre-aracılı bağışıklık (CMI) in vivo fonksiyonları ile tümör hücrelerini, mikrometastazlar ve rezidüel hastalığın dolaşan kontrol edebilirsiniz dikkat etmek önemlidir. Bu yetenek primer tümörü kontrol etmek için bağışıklık sisteminin emsal etmemesine rağmen belirgindir ve kanser hastaları ve hayvan modellerinde 5 in vivo kanıt yeterli destekleniyor. Önemli bir şekilde, bu bulgular, 6,7 (sitotoksisite deneyleri ile ölçülen) çoğu zaman, in vitro ve en otolog tümör hücreleri, insan ve hayvanların kan örneklerinde lökosit dolaşımı sitotoksisite dirençli olduğunu rapor ex vivo çalışmalar, tutarsız. Bu çelişki gibi afore gibi farklı lökosit popülasyonlarının, in vivo varlığı bağlanabilirbahsedilen MP lökosit popülasyonu ve aktive NK hücreleri 3 özel olarak alt popülasyonu. Gerçekten de, dolaşımdaki lökositlerin ve dalak dirençli olduğu bulunmuştur sinjenik tümör hücreleri (MADB106), MP-NK hücrelerinin 3,8 ile lize edilmesi gösterilmiştir. Bu nedenle, fischer344 (F344) farelerin akciğerlerinde metastaz sözde &quot;NK dayanıklı &#39;MADB106 hücreler değil, döner ya da genel olarak erişim kolaylığı verilen incelenen olan dalak NK hücreleri, MP-NK hücreleri tarafından kontrol edilir. Saflaştırılmış ve aktif MP-lökosit akciğer doku taşlama veya biyolojik bozulma 9 dayalı akciğerler, lökositlerin standart hasat yöntemleri ile erişilemez. Bizim yaklaşımımız doku işleme yaklaşımları ile karşılaştırıldığında iki önemli avantaja sahiptir. İlk olarak, perfüzyon yaklaşımı seçici diğer akciğer parankim, geçiş reklamı kaynaklanan hücreler ve bronş-alveol karş onları ayıran, MP-lökositleri hasadındepartmanlarında. İkincisi, daha iyi perfüzyon tekniği öğütme ve biyolojik işleme aksine bütünlük ve MP-lökositlerin fizyolojik ortam, korur hasar hücreleri, kendi morfolojisi değiştirebilir ve üretim ve bağışıklık aktivitesini modüle ve özellikle NK bastıran çeşitli faktörlerin salınımını neden olduğunu yaklaşımlar sitotoksisite 10. Akciğerler kanser metastazı ve çeşitli bulaşıcı hastalıklar için önemli bir hedef organ vardır. Tüm dolaşan habis hücreleri ve enfekte olmuş hücrelerin deforme ve kapiller endotel hücreleri ve ikamet lökositlerin ile etkileşim için gereken akciğer kılcal damarlar yoluyla geçer. Bu koşullar altında, dolaşımdaki hücreleri kolayca yerleşik MP-lökositler tarafından hedeflenebilir. Bu nedenle bu bağışıklık bölmeye aktive lökositler var biyolojik avantajlı görünüyor ve farklı biyolojik, deneysel ve klinik ortamlarda bu eşsiz MP-nüfus incelemek için önemlidir. O sy dikkat layıkÇeşitli biyolojik cevap-değiştiricilerle stemic immün aktivasyonu (örneğin, poli-inozinik-polisitidilik asit (poli I: C) ya da tip-Cı CpG oligodeoksinükleotitler (CpG-Cı ODN)), dolaşımdaki lökositlerin 3 den MP-lökositler fazla aktif olduğu gösterilmiştir 8,11.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Peristaltik pompa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kelebek iğne</td><td>OMG</td><td></td><td>26G</td></tr><tr><td>Kelebek iğne</td><td>OMG</td><td></td><td>21G*3/4 "</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Pic çözeltisi</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Pic çözeltisi</td><td></td><td>2.5 ml</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Pic çözeltisi</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Pic solüsyonu</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Pic solüsyonu</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Künt kenarlı forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kanama durdurucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodyum domuz mukozası (koruyucu içermez)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

marginating pulmoner lökosit seçici hasat

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marjinal-pulmoner (MP) lökositler, akciğer kılcal damarlarının iç endoteline yapışan lökositlerdir. MP-lökositlerin, diğer bağışıklık bölmelerinin lökositlerine kıyasla benzersiz bileşim ve özellikler sergilediği gösterilmiştir. Kanıtlar, doğal öldürücü hücrelerin daha yüksek sitotoksisitesini ve dolaşımdaki veya splenik immünositlere kıyasla MP-lökosit popülasyonunun belirgin bir pro- ve anti-inflamatuar profilini göstermektedir. Burada sunulan yöntem, farelerde veya sıçanlarda akciğerlerin zorla perfüzyonu ile MP-lökositlerin seçici olarak toplanmasını sağlar. Doku öğütme ve biyolojik bozunma gibi akciğer-lökositleri çıkarmak için kullanılan diğer yöntemlerin aksine, bu yöntem yalnızca parankimal, interstisyel ve bronko-alveolar hücrelerle kontamine olmamış akciğer kılcal damarlarından lökositler verir. Ek olarak, perfüzyon tekniği, doku işlemeye bağlı fizyolojik tepkilere neden olmadan MP-lökositlerin bütünlüğünü ve fizyolojik ortamını daha iyi korur. Bu benzersiz MP lökosit popülasyonu, dolaşımdaki tüm kötü huylu hücreler ve enfekte olmuş hücreler akciğer kılcal damarlarından geçerken, endotel hücreleri ve yerleşik lökositlerle fiziksel olarak etkileşime girerken alıkonulduğundan, anormal dolaşımdaki hücreleri tanımlamak ve bunlara tepki vermek için stratejik olarak konumlandırılmıştır. Bu nedenle, MP-lökositlerin seçici olarak toplanması ve çeşitli koşullar altında incelenmesi, özellikle dolaşımdaki anormal hücrelerin ve akciğerle ilgili hastalıkların kontrol edilmesi ile ilgili olarak biyolojik ve klinik önemlerini anlamamızı ilerletebilir.

MP-bölmesi sergi, farklı bir lökosit alt kümesi kompozisyon lökosit dolaşan karşılaştırıldı. flow sitometri analizi kullanarak, lökosit subpopülasyonunun tespit ve hem dolaşan ve MP lökositlerin kompozisyonu karakterize etmek için ölçüldü. Granülosit ve lenfositler ileri ve yan scatter göre tespit edilmiştir. Lenfositler içinde NKRP-1 parlak hücrelerin NK hücreleri, monositler gibi T hücreleri gibi, CD3 +, H1 + ve CD4 + / CD8 +<...

Marjinal-pulmoner lökositler, diğer lökosit popülasyonlarına kıyasla benzersiz özellikler ve farklı immünolojik fonksiyonlar sergiler. Burada, sıçanlarda ve farelerde akciğerlerin zorla perfüzyonu ile bu pulmoner lökosit alt popülasyonunun seçici olarak toplanmasını tarif ediyoruz. Marjinizan pulmoner lökositler, kan yoluyla bulaşan ve akciğerle ilgili hastalıklara duyarlılığın belirlenmesinde kritik görünmektedir.

Marginating pulmoner lökosit seçici Hasat

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Bu prosedürün genel amacı, akciğer kılcal damarlarının iç endotelyumuna tutunan marjinal pulmoner lökositlerin seçici olarak toplanması için fare veya sıçan akciğerlerine zorunlu perfüzyon uygulamaktır. Bu yöntem, kendine özgü özellikler ve farklı hematolojik fonksiyonlar sergileyen bu spesifik lökosit popülasyonunun incelenmesine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, parenkimal, interstisyel ve bronkoalveoler kompartmanlardaki hücreleri hariç tutarak, yalnızca akciğer kılcal damarlarından lökosit elde edilmesini sağlamasıdır.Bu prosedürü, laboratuvarımdan iki lisansüstü öğrencisi olan Liat Sorski ve Lee Shaashua gerçekleştirecektir. Prosedüre başlamadan önce, hava kabarcıklarını gidermek için peristaltik pompa hatlarından ve kelebek iğnelerden heparinli PBS akıtın. Ardından, solunumun durmasının hemen ardından, steril makas ve diş doku pensi kullanarak, ksifoid çıkıntıya kadar orta hat abdominal insizyon yaparak ötanazi uygulanmış sıçanın periton ve göğüs boşluklarını açın.Ardından, sternumu kaldırmak için pens kullanın ve göğüs kafesini her iki yandan dikkatlice kesin. Sternuma bir hemostatik klempleme yapın ve kardiyopulmoner kompleksi açığa çıkarmak için göğüs kafesini rostral yönde katlayın. Daha sonra, kalbin sağ ventrikülüne bir kelebek iğne yerleştirin ve maksimum miktarda kan toplayın.Tüm kan toplandığında, karaciğerin geri perfüzyonunu önlemek için vena cava bir hemostata ile klempleyin. Ardından, kelebek iğneyi sağ ventrikül içinde tutarak, kan dolu şırıngayı peristaltik pompanın çıkış borusuyla değiştirin ve beş mililitrelik bir toplama şırıngasına bağlı ikinci bir kelebek iğneyi sol ventriküle yerleştirin. Şimdi peristaltik pompayı yaklaşık beş mililitre/dakika hıza ayarlayarak çalıştırın ve perfüzat koyu kırmızıdan açık kırmızıya dönene kadar, perfüzat ile kontamine olmuş ilk mililitre kanı nazikçe toplama şırıngasına toplayın.Ardından, pompayı durdurmadan beş mililitrelik toplama şırıngasını hızla 20 mililitrelik bir toplama şırıngasıyla değiştirin ve sırtan marjinasyon gösteren pulmoner lökositleri toplamak için dakikada yedi mililitre hızla 20 mililitre akciğer perfüzatı toplayın. Başarılı bir perfüzyona işaret eden, akciğerlerin soluk kırmızıdan net bir beyaza doğru kademeli olarak renk değiştirdiğini gözlemleyin. Perfüzatın tüm hacmi toplandığında, peristaltik pompanın akışını durdurun ve toplanan perfüzatı bir tüpe aktarın.Ardından perfüzatı santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin. Hava kabarcıklarını gidermek için peristaltik pompa hatlarından ve kelebek iğnelerden heparinli PBS akıtın. Fare kenara yerleşen akciğer lökositlerini toplamak için, solunum durur durmaz steril makas ve dişli doku pensi kullanarak ksifoid çıkıntıya kadar orta hat abdominal insizyon yapıp periton ve göğüs boşluklarını açın.Ardından, sternumu kaldırmak için pens kullanın ve göğüs kafesini her iki taraftan kesin. Kardiyopulmoner kompleksi açığa çıkarmak için sternuma bir hemostatik klemple sabitleme yapın ve göğüs kafesini rostral yöne doğru katlayın. Karaciğerin geriye doğru perfüzyonunu önlemek için vena cava'yı bir hemostatla klempleyiniz ve kelebek iğneyi kalbin sağ ventrikülüne yerleştirin.Ardından, kelebek iğneyi sağ ventrikül içerisinde tutarak, kelebek iğneyi peristaltik pompanın çıkış borusuna bağlayın ve iki mililitrelik bir toplama şırıngasına bağlı ikinci bir kelebek iğneyi sol ventriküle yerleştirin. Pompayı yaklaşık iki mililitre/dakika hıza ayarlayarak çalıştırın. Perfüzat koyu kırmızıdan açık kırmızıya dönene kadar, kontamine olmuş ilk bir mililitre kanı toplama şırıngasına nazikçe toplayın.Ardından, peristaltik pompayı durdurmadan, iki mililitrelik toplama şırıngasını hızlıca 10 mililitrelik bir toplama şırıngasıyla değiştirin ve dakika başına dört mililitre perfüzyon hızında 10 mililitre akciğer perfüzatı toplayın. Başarılı bir perfüzyonu gösteren, akciğerlerin soluk kırmızıdan net bir beyaza doğru kademeli renk değişimini gözlemleyin. Tüm akciğer perfüzatı toplandığında, peristaltik pompanın akışını durdurun ve toplanan perfüzatı bir tüpe aktarın.Ardından perfüzatı santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Marjinalize pulmoner kompartman, dolaşımdaki lökositler için gözlemlenenden farklı bir lökosit alt küme kompozisyonu sergiler. Nitekim granülositler, monositler ve doğal öldürücü hücreler dahil olmak üzere doğal immünositler, marjinalize pulmoner lökosit popülasyonunun %50'den fazlasını oluşturur.Dolaşımdaki hücre kompartmanının %30'undan daha azına kıyasla. Buna karşın, T hücresi ve dendritik hücre popülasyonları, dolaşımdaki hücrelere göre marjinal-pulmoner kompartmanda daha düşük yüzdelerde bulunur. Genel olarak doğal öldürücü hücrelerin toplam sayısı benzer olsa da, büyük doğal öldürücü hücrelerin yüzdesi marjinal-pulmoner kompartmanda, dolaşımdaki hücre kompartmanına göre üç kat daha yüksektir.Ayrıca, en az iki farklı tümör hücre hattına karşı standart bir kromyum salınım testi ile ölçüldüğünde, marjinal-pulmoner bölgedeki doğal katil hücrelerin tümör hücrelerini lizleme yeteneği, dolaşımdaki doğal katil hücrelerinkinden daha fazladır. Ek olarak, in vivo Poly I:C uygulaması yoluyla yapılan immün stimülasyon, MADB106 hedefleri kullanıldığında, marjinal-pulmoner doğal katil hücrelerin sitotoksisitesi üzerinde, dolaşımdaki doğal katil hücrelere kıyasla daha derin bir etki yaratır. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, doğru şekilde uygulandığı takdirde birkaç dakika içinde gerçekleştirilebilir.Bu teknikler, MP lökositlerinin seçici olarak toplanmasını sağlar. Bu lökositlerin incelenmesi, özellikle dolaşımdaki aberan hücrelerin kontrolü ve akciğerle ilgili hastalıklar açısından biyolojik ve klinik önemin anlaşılmasını geliştirecektir. Bu prosedürün ardından hücreler; akış sitometrisi, PCR veya ilgi duyulan herhangi bir başka analiz yöntemi ile karakterize edilebilir ve analiz edilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, marjinasyon yapan pulmoner lökositlerin nasıl toplanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

selective-harvesting-of-marginating-pulmonary-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fare akciğer dendritik hücreler yüksek oranda saflaştırılmış açıklanmıştır. Özgül ağırlık, geleneksel dendritik hücre alt izolasyon verilir.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Bu videoda, marjinal hepatik lökositlerin fare karaciğerinden zorla perfüzyon ile izolasyonunu gösteriyoruz.

Bir Fare Karaciğerinden Marjinal Hepatik Lökositlerin İzolasyonu

Bu protokol, enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma plastik uyumu ve CD146 + manyetik boncuk seçimi aracılığıyla, sıçanlardan primer akciğer yerleşik mezenkimal stromal hücreler elde etmek için bir izolasyon tekniği tarif etmektedir.

CD146 İzolasyonu<sup&gt; +</supSıçan Akcigerlerinden&gt; Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler

Marjinal-hepatik lökositler, diğer lökosit popülasyonlarına kıyasla benzersiz özellikler ve farklı immünolojik işlevler sergiler. Burada, sıçanların veya farelerin karaciğerinin zorla perfüzyonu yoluyla bu spesifik hepatik hücre popülasyonunun seçici olarak toplanması için bir yöntem tarif ediyoruz. Marjinanjik hepatik lökositler, hepatik ilişkili hastalıklara ve metastazlara duyarlılığı belirlemede kritik görünmektedir.

Marginating-hepatik lökosit seçici Hasat

Bu iletişim kuralı kaldırma ve süre onlar pulmoner arter sağ kalp kateterizasyonu sırasında sıkışmış kalır Swan-Ganz kateter balon ipuçlarını bağlı pulmoner arter endotel hücreleri (PAECs) arıtma açıklar için yapışık sönük balon kaldırma hastanın vücut takip.

Swan-Ganz kateter sağ kalp kateterizasyonu sonra balon ipuçlarını endotel hücre hasat

Biz Bronkoalveoler Lavaj sıvısı işleme için bir yöntem tarif ve pulmoner HıV rezervuarları değerlendirmek için antiretroviral tedavi kronik HıV enfekte bireylerin periferik kan eşleşen. Bu yöntemler, son derece saf CD4 T hücrelerinin satın alınması ve daha sonra ultrason polimeraz zincir reaksiyonu ile immünofenotipleme ve HIV DNA/RNA ölçülerinde kullanılabilir alveoler makrofajlar sonuçlanır.

Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

Yakın zamanda tanımlanmış bir intrakraniyal hücre tipi olan leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), işlevleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma, farelerden LLEC'lerin toplanması ve in vitro birincil kültürlerin oluşturulması için tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, araştırmacıların LLEC'lerin hücresel fonksiyonlarını ve potansiyel klinik etkilerini araştırmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.

Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hasadı ve Primer Kültürü

Bu protokol, canlı bağışıklık ve bağışıklık dışı popülasyonların fare akciğerinden kararlı bir durumda ve grip enfeksiyonunu takiben izolasyonunu detaylandırır. Ayrıca epitelyal ve miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejileri sağlar.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Fare beyni infiltre lökositler elde etmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, sürekli Percoll degrade ve süreksiz Ficoll degrade lökosit zenginleştirilmiş katmanı seçin ve arındırmak için kullanır. İzole lökositler akım sitometrik ölçümleri ile karakterize olabilir.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Öğrenin, sıçan ve fare akciğerlerinden marjinal pulmoner lökositleri seçici olarak izole etme yöntemini. Bu teknik, akciğer kapillerlerine yapışan bu hücrelerin benzersiz immünolojik fonksiyonlarını incelemeyi sağlar.

Marginating pulmoner lökosit seçici Hasat

Daha fazla video keşfet