Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

Fare kulağı derisi kıl foliküllerini innerve eden palisade uçlarının mızrak şeklinde terminallerinin mekanik stimülasyonuna bağlı afferent deşarjı kaydetmek için basit ve yeni bir teknik sunulmuştur.

Bu prosedürün genel amacı, erişilmesi zor, mekanik olarak hassas, nöron terminallerinde canlı hücre görüntüleme ve elektrofizyolojik kaydı birleştirmek için hızlı ve basit bir yöntem göstermektir. Bu yöntem, mekanosasyondaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Örneğin, sinaptik benzeri veziküllerin rolü veya tam olarak farklılaşmış terminallerde aday mekanotransdüser kanallarının farmakolojisi gibi, yerinde.

Bu tekniğin ana avantajı, çok basit olması, ancak fizyolojik inceleme için tamamen farklılaşmış terminallere görsel erişim sağlamasıdır. Bu yöntem saç folikülü afferansına odaklanmış olsa da, kas iğcikleri, merkel duyusal terminalleri ve baroreseptörler gibi diğer düşük eşikli mekanosensoriyel sistemler hakkında da fikir verebilir. Bu tekniğin etkileri, anormal kan basıncı regülasyonunun tedavisi de dahil olmak üzere mekanik sensörleri düzenlemek için yeni ilaç hedeflerinin geliştirilmesine kadar uzanır.

Genç yetişkin bir farenin kafasını kestikten sonra, baş sırt tarafı yukarı, gazlanmış Liley'nin solüsyonuna, 50 santimetre genişliğinde bir alt tabağa, bir stereo diseksiyon mirkoskopu altına yerleştirin. Yaklaşık her 10 dakikada bir, diseksiyon alanını gaz silan ile iyice durulayın. Şimdi, bir yaylı yay makası ve üç numaralı forseps kullanarak kulak kepçesinin tabanındaki deriyi dikkatlice kesin ve ayırın.

Dış işitsel meatusun innervasyonunu ve kıkırdağını ortaya çıkarın. Trigeminal ve büyük kulak sinirlerinin mandibular bölümünün dallarını, mandibular eklemin yarığındaki kafatasından çıkarken tanımlayın. Bu iki sinir dalı, kulak kepçesi derisinin içbükey ve dışbükey yönlerini innerve etmek için kıkırdak boyunca uzanır.

Daha sonra, çene ve mastoid süreç arasındaki olukta, trigeminal sinir dallarının nereden çıktığını belirleyin. Kulak kepçesini kafatasından nazikçe çekerek uzunluklarını ortaya çıkarın. Bu şekilde açığa çıktıktan sonra, sinirleri kafatasına mümkün olduğunca yakın kesin.

Ardından, kulak kepçesini kafadan çıkarmak için yaylı yay makası kullanın. Bölünmüş sinirlerin distal kütüklerini kesmekten kaçının ve yoğun saç miktarını en aza indirin. Kulak kepçesini, gazlı Liley'nin solüsyonu ile doldurulmuş silikon kauçuk kaplı bir kaba aktarın.

Şimdi, dış kulak etini en dar noktasından bölerek açın. Ardından, kulak kepçesini içbükey tarafı aşağı bakacak şekilde düzleştirin ve bu tarafı düzenli aralıklı, çok ince böcek pimleriyle kenar boşlukları boyunca aşağı doğru sabitleyin. Daha sonra, makas kullanarak künt diseksiyon ile açıkta kalan sırt derisini kulak kepçesinden ve alt çizgi kıkırdağından tamamen çıkarın.

Bu adım sırasında ön cilde zarar vermeyin. Daha sonra, forseps kullanarak, ince bir böcek pimini tutun ve cilt ile dış işitsel meatus kıkırdağı arasında posterior olarak ortaya çıkan mandibular bölümün kesilen dallarını nazikçe uzatın. Bu sinir dallarını mümkün olan en ince pimlerle plakaya sabitleyin.

Bağ dokusunu saplamak, kesik uçlarına bitişik ve sinir parçalarını kendileri değil. Sinir dallarının etrafından çevredeki bağ dokusunun büyük bir kısmını çıkararak doku hazırlığını tamamlayın ancak aşırı çekme ya da kesme ile sinirlere zarar vermeyin. Saç folikülü mekanosensoriyel uçlarını hayati boyalar veya ilaçlarla tedavi etmek için, subdermal yağ tabakasının köpüklü fibroelastik kıkırdağını kulak kepçesi kenarının beş milimetresi boyunca dikkatlice soyun.

Böylece, saç köklerinin dermisini ve tabanını açığa çıkaran kare bir pencere açın. Genç bir fare kullanmak, ön ve arka cilt katmanları arasındaki yapışmayı ve alttaki kıkırdağın çıkarılmasının zorluğunu en aza indirir. Bunların her ikisi de başarılı lekelenme görme olasılığını artırır.

Preparatın bir kayıt odasının silikon kaplı tabanına aktarılmasıyla olmak. İnce böcek pimleri kullanarak, kulağın tabanının temiz sinirlerini iki emme elektrodunun yanına yerleştirerek kulağı kenarlardan sabitleyin. Biri kayıt için, diğeri ise nötr sinyali bir diferansiyel amplifikatöre sağlamak için kayıtsız bir elektrot.

Kayıt elektrodu için, açıklığın açıklığını ve iç çapını kayıt için seçilen sinirin kalınlığıyla dikkatlice eşleştirin. Bir kez yapıldıktan sonra, bu genellikle herhangi bir deney dizisi için sabit olacaktır. İyi bir sinir uzunluğunun içine sıkıca sığması gerekir.

Siniri elektrotun içine çekmek için, silikon boru ile tutturulmuş iki mililitrelik bir şırıngadan hafifçe emme kullanın. Kayıt elektrodunda, emme sırasında siniri ince bir böcek iğnesi ile nazikçe geri çekip yeniden yerleştirerek sinirlerin düz olduğundan ve katlanmadığından veya ikiye katlanmadığından emin olun. Şimdi, elektrot ağzında su geçirmez bir sızdırmazlık oluşturmak için çevredeki bazı bağ dokusunu veya yumuşak, esnek bir yağ dokusunu emdirin.

Elektrotlar arasında dengeli bir empedans geliştirmek, yüksek kaliteli, saygılı kayıt için çok önemlidir. Bunun için kritik olan, sinirin etrafında yüksek dirençli, su geçirmez bir sızdırmazlık geliştirmektir. Daha sonra, kayıtsız elektrodu, spontan kılcal hareket ile doldurulmamışsa, emme yoluyla salin ile doldurun.

Ardından, aynı gümüş kayıt tellerini kaydın ve kayıtsız elektrotların iç deliğine yerleştirin. Diğer uçta, teller iki damarlı bir ekran kablosunun farklı damarlarına bağlanmalıdır. Kayıt elektrodundaki telin tuzlu suya temas ettiğinden ve sinire yakın olduğundan, ancak sızdırmazlığı bozmadığından emin olun.

Teli kayıtsız elektrotun ucuna yerleştirin. Ardından, bir gümüş-gümüş klorür peleti olan toprak elektrodunu banyoya yerleştirin. Bu elektrodu, kayıt elektroduna bağlı iki damarlı kablonun ekranına takın.

İki kanalın elektriksel gürültü seviyelerinin benzer olup olmadığını kontrol etmek için tek tek sinyallerini bir osiloskopta görüntüleyin. Kayıt elektrodundaki spontan aksiyon potansiyelleri, iki elektrot dengelenene kadar görünmeyebilir. Arka plan gürültüsü farklılıklarını düzeltmek için, yağ bağ dokusunu elektrotun içine daha fazla emerek bir kanalın empedansını artırın.

Elektrotlar dengeli arka planlara sahip olduğunda, diferansiyel kayda geçin ve spontan aksiyon potansiyellerini arayın veya kulak kepçesinin kenarındaki tüyleri ateşle parlatılmış bir cam çubukla okşayarak aksiyon potansiyellerini çağırın. Ardından, bilgisayar arayüzü üzerinden bir elektronörogram kaydedin. Ve sivri uçluluğu temel gürültünün hemen üzerinde duyulabilir hale getirmek için nörogramı bir ses sistemi aracılığıyla besleyin.

Bu işitsel geri bildirim rölesi, deneyler yaparken çok kullanışlıdır. Daha sonra, kılları manuel olarak uyararak, temizlenen alanın yakınındaki foliküllerin innervasyonunun sağlam olduğunu onaylayın. Şimdi, alttaki tüyleri ortaya çıkarmak için kulak derisinin kenarının bir ila iki milimetresini yağ temizlenmiş pencere seviyesinde katlayın.

Karşı cilt katmanları arasında tuzlu su dolu bir boşluk bırakın. Dikkatlice dinlerken, katlanmış kenar boyunca çıkıntı yapan tüyleri bir cam çubukla hafifçe okşayın. Cilde dokunmayın.

Gerekirse, çıktıyı değerlendirmek için osiloskopu kontrol edin. Uyaranla uyarılmış aksiyon potansiyellerinin kontrollü kayıtlarını yapmak için, seramik bir piezo-elektrik aktüatöre bağlı, ateşle parlatılmış, on santimetre borosilikat mikroelektrot camından mekanik bir prob kullanın. Probu, cilt kıvrımına paralel hareket edecek ve cilde değil tüylere dokunacak şekilde konumlandırın.

Cilt yüzeyinin yaklaşık bir buçuk ila bir milimetre üzerine koyun. Ardından, prob hareket ettiğinde ses çıkışını dinleyerek stimülasyonu manuel olarak doğrulayın. Şimdi, yazılımı küçük bir saç alanının mekanik stimülasyonunu sağlayacak şekilde ayarlayın.

Örneğin, her on saniyede bir beş hertz sinüzoidde üç saniyelik simülasyonlar programlayın. Bu, 200 ila 2.000 mikron arasında bir prob yer değiştirmesi gerektirir. Ardından, sinirlerde kaydedilen yanıtların tutarlılığını kontrol etmek için tekrarlanan otomatik stimülasyon kullanarak devam edin.

Tekrarlanabilir sonuçlar elde edilebilir olmalıdır. Sonuçlar tutarlı olduğunda, tekrarlama hızını her 30 saniyede bir düşürün. Metin protokolünde daha fazla talimat verilmiştir.

Mekanosensoriyel kanalların özelliklerini araştırmak ve saç foliküllerinin etrafındaki mekanosensoriyel terminalleri etiketlemek için solüsyona on mikromolar FM1-43 ekleyin ve 60 dakika bekletin. Salınımlı prob ile kılları uyarmaya devam ederken. Bu boya, kültürdeki ve koklea kıl hücrelerindeki aday dönüştürücü kanallarını ve duyusal nöronları bloke eder.

Bununla birlikte, matür saç folikülü afferansında yerinde ateşlemeyi engellemez. Uçların etiketlenmesi, boyanın, boya maruziyeti boyunca mekanik stimülasyona yanıt vermeye devam eden terminallere erişimini gösterir. Tarif edilen protokol kullanılarak yapılan elektronörogramlar tipik olarak, en büyük boyuttaki aksiyon potansiyelleri de dahil olmak üzere manuel stimülasyonun yokluğunda bile devam eden aksiyon potansiyeli aktivitesi gösterdi.

Spontan aktivite, saniyede yaklaşık 10-20 ani artışta meydana geldi ve hiçbir yapı veya tonisite belirtisi göstermedi. Stimülasyon dönemleri arasındaki aralıklar için oto-korelasyon her zaman oldukça. Saç tellerinin beş hertz, 500 mikronluk mekanik stimülasyonu sırasında, genel çıktı tipik olarak saniyede yaklaşık 50 sivri uça yükseldi.

Döngü histogramlarının oluşturulması, sinüzoidal döngü başına dört ila on sivri uç ile yanıtların güçlü bir şekilde sürüklendiğini ortaya çıkardı. Bu oldukça tekrarlanabilirdi, elbette, yanıtların kilitlendiği dalga formunun fazı, titreşimli probun saçla nerede temas ettiğine ve o noktadaki hareket yönüne bağlıydı. Daha sonra saç folikülü mızrak şeklinde sinir ucu kanal farmakolojisi araştırıldı.

Kanallar, FM1-43'e maruz kaldıklarında bile yanıt vermeye devam etti, bu da kültürdeki duyusal nöronlar veya koklea kıl hücreleri gibi bazı mekanosensoriyel kanalları ex vivo olarak bloke edebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra bu teknik, elektronörogram kaydının başlangıcına kadar, 60 ila 90 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, elektrotlarda yüksek dirençli elektrik sözleşmesi geliştirmek ve boya penetrasyonunu ve optik berraklığı iyileştirmek için küçük fareler kullanmak için görselleştirme folikülleri ile birleştirmek önemlidir.

Bu yöntem fikrini, aslen yakın bir meslektaşımız ve şimdi emekli profesör olan Clarke Slater ve yüksek lisans öğrencisi Nakul Kain tarafından geliştirilen bir yöntemden uyarladık, onlara kas iğindeki mekanosensasyonda sinaptik benzeri veziküllerin olası rolünü ve bunları FM1-43 ile görselleştirmek için daha iyi bir yönteme duyulan ihtiyacı anlattığımızda. Bu prosedürü takiben, farmakoloji ve vital boya etiketlemesi gibi yöntemlerle, mekanotransdüser kanallarının ve farklılaşmış terminallerin hangileri olduğu ve mekanik stimülasyonun sinaptik benzeri vezikül geri dönüşümünü düzenleyerek boya alımını ve salınımını modüle edip edemeyeceği gibi soruları yanıtlamak için yapılabilir. FM1-43'ün toksisitesi açısından değerlendirilmediğini ve tehlikeliymiş gibi ele alınması gerektiğini unutmayın.