Name: Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Keşfedin fare kulak derisindeki saç folikülü mekanoreseptörlerinden afferent kayıt yöntemini. Canlı hücre görüntüleme ve elektrofizyolojik kaydı birleştirerek sinir terminali etiketleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışma kısmen Birleşik Krallık Tıbbi Araştırma Konseyi proje hibesi tarafından G0601253 G.S.B. ve R.W.B. tarafından finanse edilmiştir.

Fare Otopsi doku hasat etik yöntemler onaylanmış kullanmanız gerekir. İngiltere&#39;de, servikal dislokasyon yetişkin farelerin (UK Hayvanlarda bir listede Çizelge 1 yönteme (Bilimsel Prosedürler) Yasası, 1986 ve Avrupa Direktifi 2010/63 / EU) için bir devlet onaylı bir yöntemdir. Bu mevzuat gözden geçirilmiş ve aşağıdaki protokole kullanılan tüm prosedürleri onaylı Hayvan Refahı ve Etik Değerlendirme Kurulu tarafından Aberdeen Üniversitesi&#39;nde yerel uygulanır. Not: Bu yöntemler Bankalar ve ark bildirilen araştırma kullanılmıştır 7. Elektrofizyoloji 1. hazırlanması Kulaklar <ol><li> Diseksiyon önce, bu tür Liley (1956) gibi standart bir serum fizyolojik, hazırlamak ve% 90 O 2 /% 5 CO 2 ile doyurabilecek. NaHCOs 3 (12), KCI (4), KH 2 PO 4 (1), NaCI (138.8), MgCI2 (1), CaCl2 (2) ve glükoz: Liley en tuz (mM) oluşur(11). </li><li> Insanca kulaklara yakın kafatası zarar vermeden bir yetişkin fare euthanize. Burada C57 / Bl6J ve MF1 fareleri kullanabilir ancak herhangi bir standart laboratuvar fare suşu kullanılabilir. İdeal olarak, elektriksel kayıt büyük farelerde markalama daha az güvenilir olarak, stiril boya etiketi ile kombine edilecek ise, &lt;25 g olan fareler kullanmak genellikle sadece sınırlı sınırlı alanlarda bulunan edilir. </li><li> büyük makas veya kemik makası ile baş kaldırmak. </li><li> Stereo diseksiyon mikroskobu aşamasında (50 cm genellikle uygun) geniş tabanlı diseksiyon çanak gaz verilerek Liley en baş dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Düzenli (~ 10 dk) savak veya gazlı tuz ile baş daldırın. </li><li> Dikkatle kesilirken ve dış kulak yolu (EAM) ve kıkırdak açığa springbow makas ve 3. forseps ile dış kulak (kulak kepçesi) tabanındaki cilt ayırmak. onlar f ortaya çıktıkça trigeminal dalları (mandibuler bölünme, MDV) ve büyük auricular sinirleri tespitrom kıkırdak tabanı üzerinden mandibular eklem ve projenin aralıktaki kafatası sırasıyla içbükey (ön) ve dışbükey (posterior) kulak kepçesi cilt yönlerini innerve. </li><li> Kafatası civarında tespit nerede çene ve mastoid arasındaki oluk iki sinir dalları çıkın. yavaşça kafatası telek çekerek onların uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak ve mümkün olduğunca kafatası kadar yakın sinirler kesilir. </li><li> bölünmüş sinirlerin distal kütükleri önlemek için özen ve kaldırılır kulağın dibinde yoğun pelage miktarını en aza indirerek, springbow makas ile baş telek çıkarın. </li><li> esnek bir silikon kauçuk (PDMS) Gassed Liley en sıvıyla doldurulmuş -lined çanak için telek aktarın. en dar (ön-çoğu) noktasında bölünerek ADM&#39;yi açın. dikkatle ~ 6-8 düzenli aralıklı çok ince (~ 0.2 mm çap) böcek iğneli kenarlarında telek, ön deri (içbükey) PDMS aşağı tarafı ve pin dümdüz. </li><li> remTamamen kepçesi arka yönü derisini ove ve kısmen ön cilt değişmeden kalır sağlanması, 3. forseps ile künt diseksiyon ile pinna kıkırdak kaldırın. </li><li> ince böcek pin noktası ile nazikçe cilt ve EAM kıkırdaklar arasında posterior ortaya MDV dallarını (genellikle 2) uzatmak, 3. forseps ile kavradı. onların kesilmiş uçlara değil sinir gövdeleri kendilerini bitişik bağ dokusu impaling, en iyi olası böcek iğneli PDMS bu pin. </li><li> dikkatlice çekerek aşırı veya kesme zarar kaçınarak, çevrelerindeki çevreleyen bağ dokusu en kaldırın. </li></ol> 2. Elektrofizyolojik Kayıt Kurma <ol><li> için (kayıt için tek - iki emme elektrotların yakın kulağın dibinde temizlenmiş sinirleri yerleştirerek, (~ kulağa başına 6-8) kenarlarda ince böcek iğneli bir kayıt odasının PDMS kaplı tabanına kulak kepçesi cildi pin sinir) ve ot almakOnun etkisiz bir elektrot (bir diferansiyel yükseltecin nötr bir sinyal sağlamak için, 7). </li><li> kayıt elektrot için, dikkatli bir şekilde açıklık ve iki sinir kombine kalınlığının açılma iç çapına uygun, yani mümkün olduğu ve mümkün olduğu kadar büyük bir uzunluğu olduğu gibi bir şekilde oturması. </li><li> silikon kauçuk borudan diğer ucuna bağlı bir 2 ml şırınga yumuşak emilerek elektrot içine sinirler çizin. sinirler, düz değil katlanmış veya iki katına olduğundan emin olun. </li><li> sıkıca sinir etrafındaki diyafram kapatan bir fiş oluşturmak için bağ dokusu veya yağ dokusu çizmek için güçlü emme kullanarak yüksek elektrik direnci / empedans uyum geliştirin. </li><li> (Bu kılcal hareket ile dolabilir) gerekirse emme ile tuzlu su ile diğer (kayıtsız) elektrodu doldurun. </li><li> tuzlu ve sinir irtibata kayıt elektrotları iç delik içine özdeş kayıt teller (gümüş veya platin) yerleştirin(Kayıt) ya da elektrot daralmış, yangın cilalı ucu (kayıtsız). Her elektrot iki çekirdekli ekranlı kablo farklı çekirdeklere ayrı lehimlenmiştir. banyoya banyo (toprak) elektrodu (Ag / AgCl topak) yerleştirin ve kayıt elektrotları bağlanmış iki çekirdek kablo ekrana topraklayın. </li><li> Bir osiloskop ekranında bir diferansiyel amplifikatör, filtre (bant-geçti 0,2-2 kHz), ve bakış ayrı kanallar içine iki elektrot elektrik aktiviteyi besleyin. Bu kanal A (kayıt) kontrol edin ve kanal B (kayıtsız) Elektrik gürültü seviyeleri benzer. aşamada iki elektrot dengeli önce kanal A normal spontan aksiyon potansiyelleri görmek mümkün olmayabilir. </li><li> kayıt (kanal A) veya kayıtsız (kanal B) elektrotların empedansını artırarak elektrotlar arasında arka plan gürültüsü herhangi bir farklılık giderilecek. Her iki elektrodun içine daha fazla areolar (adipoz) bağ dokusu emerek bunu yapın, ve /ya da 50 ml şırınga ile ilgili daha fazla emme kuvveti uygular. <ol><li> Bu şekilde &#39;dengeli&#39; bir kez (AB) kayıt diferansiyel ve kulak kepçesi kenarda tüyleri okşayarak spontan eylem izleme potansiyelleri (AP) veya aramak için geri dönün. genellikle sıkı (yüksek direnç) mühür ve iki daha eşit empedans - herhangi bir aktivite (spiking) görülürse, kayıt elektrot sinirin sıkı bir uyum ve kayıtsız elektrot areolar bağ dokusu yeniden kontrol elektrotlar, o kadar iyi. Sinyal: gürültü oranı: Uygulama ile, bu iyi bir kalite (1&gt; 2) başaracaktır. </li></ol></li><li> Bir bilgisayar üzerinde çalışan bir laboratuar arayüzü ve elektrofizyoloji yazılımı ile elektronörogram kaydedin. çivilenmesi bir ses çıkışı çok yararlıdır ve bir ses amplifikatörü ve ilişkili ses hoparlörden neurogram beslenmesiyle elde edilebilir. Sadece beyaz n yokluğu ile belirlenen başlangıç ​​gürültüsü (yukarıda olduğu eşik ayarlamaoise) &#39;tıs&#39;. </li><li> Dermis ve folikül tabanını açığa ~ 5 mm x 5 mm bir pencere açarak, dikkatli, ilaç veya mızrak şeklinde sonları floresan stiril boya erişimi artırmak pinna marjı yakın alt dermal yağ tabakasını soymaya için (Şekil 1A, B ). </li><li> (Varsa, sadece üretilen pencere düzeyinde) apposed cilt katmanları arasında net bir tuzlu dolu boşluk bırakarak, lider marjı adipoz-temizlenmiş kulak cilt ~ 1 mm kat geri pin. Yavaşça inme cilt dokunmadan, bir pim ya da topraklı ince forseps ile katlanmış kenarı boyunca çıkıntılı kıllar, ses çıkışı osiloskop ve ayırt edici maksimal AP çıktı alanı &#39;tıklama&#39; ve &#39;pops&#39; bulmak için. </li></ol> 3. Kayıt Stimulus uyarılmış Eylem Potansiyelleri <ol><li> mekanik uyarım probu yerleştirin - Bir Cerami bağlı bir yangın cilalı 10 cm borosilikat cam mikroelektrotc piezo-elektrik aktüatör - yani hareket cilt kat ile paraleldir. bu tüyler değil cilt dokunur, böylece kat bir uca deriden yaklaşık 0.5-1 mm yerleştirin. yavaş yavaş tüyleri saptırmak ve gözlemlemek / spiking dinlemek için el prob ucunu hareket ettirerek etkili stimülasyon doğrulayın. </li><li> (Deplasman 200-500 mikron kontrol edin., 5 Hz sinüzoidlerde her 10 saniye gibi 3 sn) 1-3 kılların mekanik uyarılması sürücü yazılımı kullanın ve sinirlerdeki stimülasyon uyarılmış yanıtları kaydedin. </li><li> 10 sn aralıklarla birkaç özdeş mekanik uyarım trenler verin. Daha sonra deney protokolü (10 sn 30 sn örn damla tekrar oranı) göre uyarım sıklığını azaltmak, tekrarlanabilirlik için prob pozisyonu optimize edin. </li><li> Yüksek frekanslı gürültü genlik ve en büyük AP ~% 25 2x ~ ayarlanmış basit bir eşik kullanarak AP-benzeri aktivite örneğin ayırımcılık yazılımı kullanın. </li><li> eşik olarak geçiş AP sayınüretilen AP sıklığını ve özelliklerini miktarının &#39;olayları&#39;,. </li></ol> N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) piridinyum dibromür Etiketleme ile birlikte 4. Kayıt Stimulus uyarılmış Ateşleme <ol><li> uyaran-uyarılmış afferent ateş ve terminal etiketleme üzerinde stiril boyaların etkisini incelemek için, deniz çözeltisine, seçtiğiniz bir stiril boya uygun konsantrasyonunu ekleyebilir ve elektrik kayıt ile devam ediyor. </li><li> Gerekli maruz kalma süresi (genellikle en az 30 dakika) sonra, folikülleri görüntülemek için hazırlık hazırlar. Tespit işaretçilerine kaldırarak cilt kapağını açın ve terminal etiketleme ortaya çıkarmak için temizlenmiş dermal alanını maruz kalmaktadır. </li><li> salin 3 tam değişiklik yapma, boya içermeyen tuzlu su ile dış boya silsin. </li><li> En kalıcı boya kontaminasyon maruz / dış membranlar süzülmeye imkan vermek üzere 10-15 dakika süreyle gaz verilerek boya içermeyen tuzlu son değişiklik kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Bir kenetleme maddesi (sulfobutylated beta-siklodekstrin, 1 mM, 5 dakika) tuzlu su içinde olan membranlar üzerinde kalan olmayan içsel boya çıkarın. </li><li> dik bir Epifloresans mikroskop aşamasında kayıt odasına transfer ve sahne / slayt hareket mekanizması ile odasına girerler. </li><li> stiril boya için uyarma ışık uygun olan hazırlık aydınlatır. Folikül etiketleme (Şekil 1) gözlemlemek için bir 10X veya 25X floresan mikroskop objektif kullanın. </li></ol>

<ol><li>Cahusac, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transient+receptor+potential+%28TRP%29+channel+agonists+and+antagonists+on+slowly+adapting+type+II+mechanoreceptors+in+the+rat+sinus+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Peripher.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).</li>
<li>Fagan, B. M., Cahusac, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+glutamate+receptor+mediated+transmission+at+mechanoreceptors+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin.</a> Neuroreport. 12, 341-347 (2001).</li>
<li>Price, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+sodium+channel+BNC1+is+required+for+normal+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation.</a> Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).</li>
<li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo2+is+the+major+transducer+of+mechanical+forces+for+touch+sensation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice.</a> Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).</li>
<li>Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+in+the+innervation+of+mystacial+vibrissal+follicle-sinus+complexes+in+the+rat+and+cat%3A+a+confocal+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study.</a> J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).</li>
<li>Li, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+organization+of+lanceolate+mechanosensory+complexes+at+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles.</a> eLife. 3, 01901(2014).</li>
<li>Banks, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+modulation+of+synaptic-like+vesicle+recycling+in+mechanosensory+lanceolate+nerve+terminals+of+mammalian+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles.</a> J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li>
<li>Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+dynamics+in+rat+fast+and+slow+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).</li>
<li>Meyers, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+the+senses%3A+FM1-43+loading+of+sensory+cells+through+nonselective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels.</a> J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li>
<li>Drew, L. J., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+is+a+permeant+blocker+of+mechanosensitive+ion+channels+in+sensory+neurons+and+inhibits+behavioural+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli.</a> Molecular Pain. 3 (1), 1(2007).</li>
<li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+reveals+membrane+recycling+in+adult+inner+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).</li>
<li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+endocytosis+in+outer+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea.</a> Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).</li>
<li>Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autogenic+modulation+of+mechanoreceptor+excitability+by+glutamate+release+from+synaptic-like+vesicles%3A+evidence+from+the+rat+muscle+spindle+primary+sensory+ending%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending.</a> J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).</li>
<li>Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gadolinium+and+FM1-43+as+blockers+of+stretch-evoked+firing+of+rat+muscle+spindle+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Phys.+Soc%22%5BJournal%5D)">Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents.</a> Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, hızlı bir şekilde çıkarılmasına olanak nispeten basit bir hazırlama geliştirdik düşük saç folikülü bir yoğunluğa sahiptir ve saç köklerinin az sayıda görece seçici bir mekanik uyarıya sağlar. Bu mekanik olarak uyarıldığında saç folikülleri, tanımlanmış elektrofizyolojik yanıtları yani görüntüleme folikülleri görselleştirmek için uygulamayı boya verilen yanıtlar da dahil elektrofizyolojik kayıt ve canlı hücre floresan görüntüleme için kolayca erişilebilir. Biz yapmadıysanız olsa da, bu sistem aynı zamanda tek bir birim (tek duyusal akson) kayıt için duyusal sinir alt-bölünmesi ve duyusal terminali biten morfoloji görselleştirmek için hedeflenen GFP-ifadesini kullanarak kolayca müsait görünüyor. Biz içselleştirme ve floresan membran stiril Pridinyum boyaların 7 sürümü özelliklerini araştırmak için kulak cilt hazırlığı kullanmış, bir teknik aslında lokalize Vesic incelemek için geliştirilensinaptik terminallerde 8 le membran geri dönüşüm. Sinapslarda, görüntüleme da kolaylıkla tespit terminali 8,9 yanıtların aynı anda elektrofizyolojik kayıt ile birleştirilir. Biz ilk boyalar da mechanosensory sonlar 10 tarafından içselleştirilmiş edildi kaydetti bu ilk çalışmalarda oldu. Kültürde ve koklea saç hücreleri duyusal nöronlar için, stiril piridinyum boyalarla etiketleme çok onlar sonra 11,12 blok mechanosensory kanalları, geçen boyalar dahil görünüyor. boyalar daha sonra hücre içi membranlar etiket ve bu etiketleme geri döndürülemez. Ancak saç hücreleri mekanik 13,14 uyarılmış olmadığını ve tamamen farklılaşmış birincil duyu siniri kas iğ 15 la sonlara olarak yerinde terminalleri, ve burada 7 hançer sonlara içinde stiril boya etiketleme membran endositoz yansıtacak gibi görünüyor etiketleme geri dönüşümlüdür ve mechanosensory res bloke olmadığından7,15,16 ponses. Bu sonlar kanal nüfuz bazı boya içselleştirilmesi tamamen göz ardı edilemez iken, in situ farklılaşmış terminallerde etiketleme büyük çoğunluğu geri dönüşüm vezikül ile içselleştirme tarafından olduğu boya inkübasyon sırasında devam eden ateş ve etiketleme tersine çevrilme açıktır zar. Bu nedenle, bu basit bir teknik hali hazırda ex vivo doku mechanosensory terminal fonksiyonları bir dizi kombine elektrikli ve optik izleme için kullanılır. En pratik tekniklerle olduğu gibi, tekrarlanabilirlik tekrarı ve pratik gerektirir. Bazı önemli noktalar değer özellikle dikkat tarif edilecektir. Diseksiyon ve kayıt oturum boyunca, hazırlık sürekli tam% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile doymuş tuz ile perfüze sağlayarak doku canlılığını ve hayatta kalma en üst düzeye çıkarmak. WH folikülleri Bu işlem sırasında yerinden değil saç sağlamakich duyusal bitiş ateş teşvik edecektir. Her iki preparasyon bir mesafede ince boru organ banyosu boyunca bir sürekli, laminer akış perfüzyon sistemine veya dikkatli bir balon gaz kullanmak ya da dikkatli bir şekilde her zaman tuzlu su yüzeyinin altında hazırlanması tutulması, çözelti 20-30 dk yenileyin. Emme kayıt elektrotları normal hücre içi kayıt için kullanılan keskin elektrot borosilikat pipetler değiştirerek yapılır. İlk olarak, dikkatli bir Bunsen beki alev çok kısa (&lt;1 sn) maruz kalma sinirler ve yangın lehçe sığdırmak için uygun iç çapını vermek için # 3 forseps keskin ipuçları kesiyorum (2.4 ve 2.5 bakınız). kayıt iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, bu iki elektrot elektrik empedansı (direnç) maksimum ve eşit her iki esastır. iki elektrot aşağıdaki dikkat ederek bunu yapın. kayıt elektrot için, iç çapı sinirde rahat bir uyum ve KD maksimum uzunluğu sağlamakrve kayıt elektrotu içine çekilir. etkin bir elektrot ucu mühür sinir çevreleyen bağ dokusu kullanmayı deneyin. Alternatif olarak veya ek olarak, sinir birlikte adipoz doku uygun boyutlu bir konik parçanın dar ucuna çeker. Daha sonra, boru bağlanmış bir 50 ml şırınga ile yaklaşık 1 dakika boyunca güçlü bir emme uygulanarak elektrot ucunu takın. iyi mühürlü ucu, güçlü emme uygulayarak basitçe fiş etkinliğini güçlendirecek ve daha sıvı veya sinir çekmek olmaz. sinir hasarı önlemek için, ancak, bağ dokusu çevreleyen malzeme ve EAM kıkırdak üzerinde sıkıştırma sinir yastıklama emin olun. kayıtsız elektrot mümkün olduğunca yakın kayıt elektrot direnci / empedansı taklit etmelidir. Bu dikkatle yangın parlatma aslında sızdırmazlık olmadan mümkün olduğunca küçük bir diyafram ucu ile katkıda bulunuyor. Daha fazla direnç gerekiyorsa, o zaman adipo ile kayıtsız elektrot ucunuSE bağ dokusu, kayıt elektrot için yukarıda anlatıldığı gibi. elektroseramik hem mekansal ve zamansal olarak, mekanik deplasman üzerinde nefis kontrol sağlar. yüksek sıcaklık onları yok, çok sıcak lehim kullanmayın - Bununla birlikte, elektrik bağlantı yapmadan özen gösterin. metal yüklü epoksi yapıştırıcı kullanın veya tedarikçi tarafından tavsiye edilen bir uzman itme-fit soketi kullanın. Bu ikisi de sıkıca tutun ve elektrik bağlantı kuracak. Standart epoksi reçine ile elektroseramik cam uyarıcı prob takın. Yangın lehçe standart 10 cm uç doku hasarı riskini en aza indirmek için elektrofizyolojik kayıt için yama veya keskin elektrotları yapımında kullanılan 1,5 mm çaplı borosilikat cam kılcal boru x. tek saç folikülünün uyarılması gerekiyorsa, yangın lehçe ucu tek bir saç sığacak ve açık diyafram içinde tek saçlı prob konumuna getirin. Bu, tek bir saç üzerinde nefis kontrol sağlar. stiril dy İçine etiketleme, bu daha küçük olan hayvanlardan elde edilen dokularda genellikle daha düzgündür. Bu neden tam olarak belli değil, ama bu büyük olasılıkla genç dokulardan daha az mekanik travma ve daha etkin derin doku çıkarılmasını yansıtır. saç folikülü üsleri örten köpüklü tabaka benzeyen genişletilmiş polistiren giderilmesinde eksiksiz olması. Bu sinir pleksus tabakası ve ilgili hançer terminalleri çıkarmadan riskleri Ancak, çok dinç önlemek. az veya hiç elektrik saç folikülü hareketi tepki ve stiril boya uygulaması varsa, (turuncu / sarı) yerine hançer sonlar daha kıl şaftının tabanının farklı otofloresans ile (sarı / beyaz) yağ bezlerinin baskın etiketleme yol açar aşırı hevesli boşluk altındaki dokuları zarar verdi. Son olarak, görüntüleme önce bir boya kenetleme ajanı kullanılarak büyük ölçüde nihai görüntü görüntü kontrastım ve kalitesini arttırır. Bu teknik bundan başka çalışmalarda, bir dizi yararlı olabilir. Bu koULD aday kanalları için seçici farmakolojik ligandlarla preparatını inkübe ya da genetik olarak silinmiş bu tür kanallar fare hatları tarama ile, germe uyarılmış tepkilerden sorumludur mechanosensory kanal (lar) için tarama, örneğin, yer alır. Ikincisi, Npy2r bağlı GFP 17, örneğin fare hatları, genetik manipülasyon terminal morfolojisinde herhangi bir değişiklik floresan değerlendirilmesi ile birleştirilebilir. Son bir örnek, SLV ciro modülatörlerinin etkisi incelenerek bu mızrak şeklinde terminallere sinaptik benzer kesecikler rolü (SLV) 7 araştıran olabilir (Ca, Mg, latrotoxin, glutamat reseptör ligandlar) esnetilebilir-uyarılmış tepkiler ve stiril boya alımı üzerindeki / release. Böylece, bu yeni tekniğin mechansensory nörobilim araştırma potansiyel olarak ilginç caddeleri bir dizi açılır.

duyusal akson hançer terminalleri memelilerde saç köklerinin saç şaft epiteli etrafında palisades oluştururlar innerve. Onların amacı, çevreleyen kılların mekanik deplasman tespit etmektir. Onlar hızlı ve yavaş ağırlıklı saç hareketine karşılık olarak faaliyet öbekler üreten sonlar adapte bir karışımdır. hareket bile devam deplasman varlığında, durduğunda Etkinlik çok hızlı bir şekilde sona erer. Burada yapının karşılıklı çalışmalar için bu fare kulak kepçesi modelinin geliştirilmesi tarif ve mızrak terminallerinde işlev görür. kepçesi, bu uçlarının çalışmak için birçok avantajlı özelliğe sahiptir. Birincisi, kulak kepçesi folikülleri ve terminaller erişime engel arasındaki derinin esasen iki kat az diğer doku ile, back-to-back apposed olduğunu. Cilt nedeniyle sert bağ dokusu minimal miktarda çok ince ve kolay disseke. innervasyon kolayca erişilebilir ve tanımlanabilir. saç follicl ikenes nispeten seyrek mekanik köklerinin tek tek veya küçük gruplar uyarılmasını kolaylaştırmak, dağıtılır, mevcuttur. İnce yatan dermal tabaka farmakolojik ilaçlar ve boyalar ile sinir terminallerine iyi erişilebilirlik verir. Bu floresan mikroskobu kullanarak görüntüleme çalışmaları için onları özellikle idealdir. görüntüleme ya yaşayan terminallerde veya sabitleme ve ileri histolojik işlenmesinden sonra olabilir. Mechanosensory nöronların yanıtları saç köklerinin geleneksel izole cilt hazırlıkları 3,4, bir dereceye kadar, 1,2 burun kılı kemirgen çalışılmıştır edilmiş ve innerve. Bu saç şaft çevreleyen sinir uçlarında mechanosensory fizyolojisinin genel prensipleri hakkında bize çok öğretti. vibrissal hazırlık Tek bir saç folikülünün hareketi üzerinde nefis kontrol sağlar. Ancak, vibrissal olarak, onun karmaşıklığı nedeniyle çıkış deşifre etmek zor olabilirfolikülleri anatomik farklı mechanosensory biten 5 en az 8 farklı türlerini içeren ve belirli elektrofizyolojik yanıtları bu morfolojik tip eşleştirme hala anlaşmazlık konusudur. Fare deri / safen sinir hazırlığı en sık ağrı ve dokunma yanıtları araştırmak için kendi depilated halde kullanılır. Böyle bir hazırlık saç köklerinin innervasyon daha az karmaşık ama saç köklerinin yoğunluğu, artı yakın 6 üç farklı folikül türleri (bekçi, Awl / auchene ve zikzak kıllar) varlığı, belirli yanıtları okuyan demektir tek bir folikül veya biten tek tip tekrar meydan okuyor. Ayrıca, bu hazırlık kompleks diseksiyon içerir. Son olarak, vibrissal ve diğer cilt preparatlar hem de, preparasyonlar hayatta ex vivo da dahil uçlarının zaman güç olmaktadır. Bu durumda, dokunun kesit GFP-ifade fare hatları da gereklidir. Alternatif, böyle Immünofloresan için fiksasyon ve / veya antikor inkübasyon gibi diğer immünolojik / histolojik işlem gerektirir. Bu nedenle kulak kepçesi hazırlık geliştirdi ve saç folikülü afferentleri sınırlı bir nüfus elektrik kayıtları yapmak için kullanılan ve membran bisiklet stiril piridinyum boyaların alımını kanıtladığı bu hançer sonlar, meydana göstermektedir var. Son olarak, boya bu mechanotransduction kanallarını bloke etmediğini gösterir mekanik duyarlılık ile birlikte etki etmediğini göstermektedir. Basit uyarıcı ve analiz protokollerinin sonuçları gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Esnek, inert, yarı saydam katı silikon polimer.</td></tr><tr><td>3 Dumont forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Austerlitz Böcek pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-10</td><td>Kulak kepçesi preparatını minimum hasarla PDMS'ye güvenli bir şekilde bağlamak için çok ince pimler.</td></tr><tr><td>AC Diferansiyel Önamplifier</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL104A</td><td>Gelen afferent elektronörogramın boyutunun yükseltilmesi. Diferansiyel kayıt, yabancı elektriksel gürültüyü ve taban çizgisi kaymasını en aza indirir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Yüksek/Düşük Geçişli Filtre</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL125</td><td>En iyi sinyal-gürültü oranını sağlamak için yabancı elektriksel gürültüyü azaltarak sinyal koşullandırma.</td></tr><tr><td>Spike Trigger</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL201</td><td>Olay dedektörü eşiğini ayarlar ve osiloskopta görüntüler. Bu, aksiyon potansiyeli tespit etkinliğini gösterir.</td></tr><tr><td>Ses Amplifikatörü ve hoparlörler</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL120S</td><td>Mikroskopta mekanik stimülasyon preparatını ayarlarken duyusal uçların elektriksel ateşlemesinin varlığı için faydalı ses izleme&nbsp;</td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>Digitimer</td><td>PM3380A</td><td>Bu eski modeli kullanıyoruz ancak herhangi bir standart osiloskop yeterli olacaktır.</td></tr><tr><td>Piezo elektroseramik ve gofret</td><td>Morgan Electroceramics, Southampton UK</td><td>PZT507</td><td>Elektrofizyoloji / bilgisayar arayüzü</td></tr><tr><td>Piezo elektroseramik ve güç kaynağı</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>0-200 V DC çıkış, seramik gofret yer değiştirmesini sürmek için, kayıt / stimülasyon yazılımı ve bilgisayar arayüzü aracılığıyla çıkışın değişken elektronik kontrolü ile. Spike2 yazılımını ve 1401micro bilgisayar arayüzünü kullanıyoruz.</td></tr><tr><td>Elektrofizyoloji Yazılımı</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>Spike2 v7</td><td>Elektrofizyoloji kayıt, stimülasyon ve veri analizi yazılımı</td></tr><tr><td>Laboratuvar arayüzü</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>1401 mikro</td><td>Elektrofizyoloji arayüzü, amplifikatör/filtreler ve bilgisayar arasında. Elektronörogramı girer ve aynı zamanda elektroseramik hareketi çalıştırır.</td></tr><tr><td>FM1-43/Synaptogreen C4</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>Hücre zarlarının dış broşürüne geri dönüşümlü olarak ayrılan floresan membran probu. Ağırlıklı olarak vezikül membranı endo- / ekzositozu izlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>FM1-43'ü (ve diğer stiril piridinyum boyalarını) açıkta kalan zarlardan şelatlayan ve arka plan etiketlemesini/floresansını düşürerek içselleştirilmiş boyanın daha net görülmesini sağlayan sülfonatlı bir b-siklodekstrin türevi.</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Monokrom, soğutmalı CCD kamera - temel model</td></tr><tr><td>Volocity 3D Görüntü Analiz Yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Görüntü yakalama ve analiz yazılımı.</td></tr></tbody></table>

fare saç folikül hançer endings de mekanik uyarılmış afferent Çıkışı ve sinir terminali etiketleme kombine kaydı

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

Bir roman diseksiyon ve kayıt tekniği fare kulak kepçesi kılların mekanik değiştirmesi ile uyarılmış izleme afferent ateş tarif edilmiştir. teknik çok maliyetli ve kolay yaygın çoğu elektrofizyoloji laboratuvarlarında bulunan, ya da kolayca satın alınan malzemeler ile üstlenilen olduğunu. Diseksiyon tescilli yazılım tarafından kontrol edilen bir jenerik elektroseramik gofret tarafından sağlanan mekanik deplasman, kolay ve hızlı. Aynı yazılım aynı zamanda kayıt ve elektronörogram çıkışını analiz eder. uyarılmış sinir aktivitesinin kayıt yangın cilalı standart cam Mikroelektronlar bağlı ticari bir diferansiyel amplifikatör geçer. Yararlı ipuçları hazırlanması, stimülasyon ve kayıt kalitesini optimize etmek için kayıt koşullarına kalitesini artırmak için verilmiştir. Sistem yanı sıra, saç foliküllerinin çit sonlar hançer terminallerinin elektrofizyolojik ve optik özelliklerini tahlil için uygundurfarmakolojik ve / veya genetik manipülasyon gelen sonuçları. bir stiril piridinyum hayati boya ile mekanik stimülasyonu ve etiketleme ile elektrik kayıt birleştirerek bir örneği verilir.

Subküten adipoz doku saç köklerinin açığa çıkarılmış elektrofizyolojik kayıt düzeneği, Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir. Bu açıklık, bir kısmı Şekil 1B aydınlık aydınlatma daha yüksek bir büyütmede gösterilmiştir. Bu alanda yukarı ve kendi üzerinde geri pinna marjı Katlanır epidermal yüzeyini ortaya çıkarır. Bu Şekil 1C boya maruz kalma ve yeniden açılmış pozisyona marjı döndükten sonra, folikülleri harekete gösteren bir künt prob (gösterilmemiştir). Mekanik stimülasyonu için ideal bir durum, yatay çıkıntı kat kenarında tüyleri konumlandırır Bu pozisyonda bir stiril piridinyum boya ile etiketlenmiştir. Müstahzarlarından Electroneurograms tipik haliyle daha büyük boyutta AP içeren cam elyaf prob uygulanan hareketin, yokluğunda (Şekil 2A&#39;da eden AP aktivitesi gösteren <strong&gt; i-iii). Etkinlik oldukça düz stimülasyon dönemleri arasında aralıklarla otomatik korelasyon gibi, hiçbir yapı veya tonisite belirtileri gösteren, yaklaşık 10-20 dürtülerini / sn ( &#39;sivri&#39; iz) bir hızda gerçekleşir. 5 Hz sırasında kıl gövdesinin 100 um, mekanik uyarma genel çıkış tipik haliyle 20-50 darbeleri / san veya sinüzoidal döngü başına 4-10 yükselir. Döngüsü histogramlar inşaatı daha sonra tepkiler ( &#39;faz-kilitleme sözde) güçlü sürüklenmesini ortaya koymaktadır (Şekil 2BI-iii)). Yanıtlar kilitli hangi dalga faz hareketinde hangi noktada, yani kendi konumu üzerine titreşimli prob kişileri saç bağlı olmasına rağmen, oldukça tekrarlanabilir. Basit bir eşik saptama (A neurogram izleri geçen yatay çizgi (I-III)) bu analiz için kullanılmıştır. Bununla birlikte, kayıt yazılımı işlevleri çoğunlukla daha gelişmiş bir şekilde kullanılabilirçivi boyutu ve şekli özellikleri ayırt edebilir. Bu daha sonra sözde tek ünite kayıt analizi yapılmalıdır izin vermek için bu özelliklere göre belirli Afferent liflerin yanıtları izole edebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig1.jpg" /> Şekil 1:. Elektrofizyolojik Kayıt Düzenleme ve N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) Saç Folikül Afferent hançer uçlarının Piridinyum dibromür Etiketleme (A) A kulak kepçesi hazırlık telek gösteren bir elektrofizyolojik deney için kurulmuş oryantasyon, sinirlerin yeri, kayıt elektrotları ve adipoz doku çıkarıldıktan sonra folikül innervasyon maruz alanı. (B) Çeşitli saç köklerinin dermis aşağı örten yağ dokularının temizlenmiş alanda parlak bir alan aydınlatma görebilir. Karanlık, genellikle bilobe, şekiller yağ bezleri vardır. ( <stRong&gt; C), stiril boya N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) piridinyum dibromür ve epifloresans mikroskobu ile mekanik uyarma işleminden sonra görüntülü ile etiketlenmiş iki mızrak şeklinde uçları gösteren B kutulu alan) büyük görüntüsü . 7&#39;den, izni ile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig2.jpg" /> Şekil 2: Fare Pinna dan Kaydedilen (A) Uyarıcı-uyarılmış Etkinlik. Standart Liley en tuzlu su çözeltisi içinde memelerine harici olarak sürekli neurograms gelen aktivite, 3 ayrı deneyden alınmıştır (AI-III) örnekleri arasında. Her kayıt bir 5 saniye bölüm olarak sinüzoidal yerinden bir 3 saniye süresi dahil kayıt başladıktan sonra yaklaşık 5 dakika, gösterirsaç milleri alışveriş merkezi sayısı. mekanik stimülasyonu genellikle 1-2 saat süren kesintisiz kayıt boyunca her 30 sn tekrarlandı. Özel komut dosyaları yatay imleç (sivri) tarafından belirlenen bir eşik yanı sıra her sinüzoidal döngüsü (dönem) başlangıcını geçti bireysel olayları işaretlenmiş. (AIV) sinüzoidal deplasman için komut sinyali. (B) Analiz spike aktivitesini Stimulus uyarılmış. 3 ° kutularına (Bi-iii) Çevrim histogramlar cam prob ile saç milleri 5 Hz sinüzoidal deplasman mekanik uyarım tahmin hançer sonları tepkilerini gösteren, (Ai-iii) sırasıyla neurogram örneklerinden inşa edilmiştir. Mekanik sonda başlangıç ​​pozisyonuna kendi konumunda bağlı olarak döngüsünün farklı aşamalarında, işaretlenmiş faz kilitleme edin. (BIV) Normalize sonda yer değiştirme sinusoid; gerçek genlik yaklaşık 100 idi1;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Fare kulağı derisi kıl foliküllerini innerve eden palisade uçlarının mızrak şeklinde terminallerinin mekanik stimülasyonuna bağlı afferent deşarjı kaydetmek için basit ve yeni bir teknik sunulmuştur.

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Bu prosedürün genel amacı, erişimi zor ve mekanik olarak hassas olan nöron terminallerinde, canlı hücre görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt yöntemlerini birleştiren hızlı ve basit bir yöntemi göstermektir. Bu yöntem, mekanosensasyonla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, tam farklılaşmış terminallerde in situ olarak sinaptik benzeri veziküllerin rolü veya aday mekanotransdüser kanalların farmakolojisi gibi konular ele alınabilir.Bu tekniğin temel avantajı, oldukça basit olması ve buna rağmen fizyolojik incelemeler için tam olarak farklılaşmış terminallere görsel erişim sağlamasıdır. Bu yöntem kıl folikülü afferensine odaklanmış olsa da, kas iğleri, Merkel duyusal terminalleri ve baroreseptörler gibi diğer düşük eşikli mekanosensör sistemler hakkında da bilgi verebilir. Bu tekniğin etkileri, anormal kan basıncı regülasyonu tedavisi dahil olmak üzere, mekanik sensörleri düzenlemek için yeni ilaç hedefleri geliştirilmesine kadar uzanmaktadır.Genç yetişkin bir fareyi dekapiyte ettikten sonra, başı sırt kısmı yukarı gelecek şekilde, gazlı Liley solüsyonu içeren 50 santimetre genişliğinde bir tabanlı kaba, stereo diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Yaklaşık her 10 dakikada bir, diseksiyon alanını gaz silan ile iyice durulayın. Şimdi, yaylı kavisli makas ve 3 numara pens kullanarak kulak kepçesinin tabanındaki deriyi dikkatlice kesin ve ayırın.Dış kulak yolunun innervasyonunu ve kıkırdağını açığa çıkarın. Mandibular eklem yarığında kafatasından çıkan trigeminal sinirin mandibular dalının dallarını ve büyük auriküler sinirleri tanımlayın. Bu iki sinir dalı, pinna derisinin konkav ve konveks kısımlarını innerve etmek için kıkırdak boyunca uzanır.Ardından, çene ve mastoid çıkıntı arasındaki olukta, trigeminal sinir dallarının çıktığı yeri belirleyin. Kulak kepçesini nazikçe kafatasından uzaklaştırarak sinirlerin uzunluklarını açığa çıkarın. Bu şekilde açığa çıkarıldıktan sonra, sinirleri kafatasına mümkün olduğunca yakın yerden kesin.Ardından, kulak kepçesini kafadan ayırmak için yaylı kavisli makas kullanın. Ayrılan sinirlerin distal uçlarını kesmekten kaçının ve yoğun kılların miktarını minimize edin. Kulak kepçesini, gazlanmış Liley çözeltisi ile doldurulmuş silikon kauçuk astarlı bir kaba aktarın.Şimdi, dış kulak yolunu en dar noktasından bölerek açın. Ardından, kulak kepçesini konkav tarafı aşağı gelecek şekilde düzleştirin ve bu tarafı kenarlar boyunca düzenli aralıklarla yerleştirilmiş çok ince böcek iğneleriyle sabitleyin. Sonrasında, açığa çıkan sırt derisini, makas kullanarak küt diseksiyonla kulak kepçesinden ve altındaki kıkırdaktan tamamen ayırın.Bu adım sırasında ön taraftaki deriye zarar vermeyin. Ardından, bir penset kullanarak ince bir entomoloji iğnesini tutun ve mandibüler dalın deri ile dış kulak yolu kıkırdağı arasında posterior olarak çıkan kesilmiş dallarını nazikçe genişletin. Bu sinir dallarını mümkün olan en ince iğnelerle plakaya sabitleyin.Sinir parçalarının kendilerini değil, bağ dokusunu saplayarak kesik uçlarını birbirine yaklaştırın. Sinir dallarının etrafındaki çevre bağ dokusunun çoğunu temizleyerek doku hazırlığını tamamlayın ancak aşırı çekme veya kesme işlemiyle sinirlere zarar vermeyin. Kıl folikülü mekanosensör uçlarını canlı boyalar veya ilaçlarla işlemek için, pinna kenarı boyunca beş milimetrelik bir alanda subdermal adipoz tabakanın köpüklü fibroelastik kıkırdağını dikkatlice soyun.Böylece, dermisi ve kıl foliküllerinin tabanını açığa çıkaracak şekilde kare bir pencere açın. Genç bir fare kullanmak, ön ve arka deri tabakaları arasındaki yapışmayı ve alttaki kıkırdağı çıkarmanın zorluğunu en aza indirir. Bunların her ikisi de başarılı boyama görme olasılığını artıracaktır.Hazırlığı bir kayıt odasının silikon kaplı tabanına aktararak başlayın. İnce böcek iğneleri kullanarak kulağı kenarlarından sabitleyin ve kulağın tabanındaki temiz sinirleri iki vakumlu elektrodun yakınına yerleştirin. Bunlardan biri kayıt için, diğeri ise diferansiyel bir amplifikatöre nötr sinyal sağlamak amacıyla kayıtsız elektrot olarak kullanılır.Kayıt elektrodu için, açıklığın ağzını ve iç çapını kayıt için seçilen sinirin kalınlığıyla dikkatlice eşleştirin. Bu işlem tamamlandıktan sonra, değerler genellikle herhangi bir deney serisi boyunca sabit kalacaktır. Uygun uzunluktaki bir sinir parçasının içeriye sıkıca oturması gerekir.Siniri elektrodun içine çekmek için, silikon tüp aracılığıyla bağlanan iki mililitrelik bir şırıngadan hafif vakum uygulayın. Kayıt elektrodunda, vakum sırasında ince bir böcek iğnesi ile siniri nazikçe geri çekip tekrar yerleştirerek sinirlerin düz olduğundan, katlanmadığından veya üst üste binmediğinden emin olun. Şimdi, elektrot deliğinde su sızdırmaz bir sızdırmazlık sağlamak için çevreleyen bazı bağ dokusunu veya yumuşak, esnek bir adipoz dokuyu içeri çekin.Yüksek kaliteli ve diferansiyel kayıt için elektrotlar arasında dengeli bir empedans geliştirmek esastır. Bunun için sinirin etrafında yüksek dirençli, su sızdırmaz bir sızdırmazlık alanı oluşturulması kritik öneme sahiptir. Ardından, eğer kendiliğinden kılcal hareketle dolmamışsa, indifferent elektrodu vakumla salin ile doldurun.Ardından, kayıt ve indiferan elektrotların iç boşluğuna özdeş gümüş kayıt telleri yerleştirin. Tellerin diğer uçları, iki damarlı bir ekranlı kablonun farklı damarlarına bağlanmalıdır. Kayıt elektrodundaki telin saline çözeltisiyle temas ettiğinden ve sızdırmazlığı bozmadan sinire yakın olduğundan emin olun.Teli kayıtsız elektrodun ucuna yerleştirin. Ardından, gümüş-gümüş klorür pelletten oluşan toprak elektrodu banyoya yerleştirin. Bu elektrodu, kayıt elektroduna bağlı olan iki damarlı kablonun ekranına bağlayın.İki kanalın elektriksel gürültü seviyelerinin benzer olduğunu kontrol etmek için sinyallerini bir osiloskop üzerinden ayrı ayrı görüntüleyin. İki elektrot dengelenene kadar kayıt elektrodundaki spontan aksiyon potansiyelleri görünür olmayabilir. Arka plan gürültüsü farklılıklarını düzeltmek için, adipoz bağ dokusunu elektrodun daha derinlerine çekerek bir kanalın empedansını artırın.Elektrotların arka planları dengelendiğinde, diferansiyel kayda geçin ve spontan aksiyon potansiyellerini arayın veya ateşle cilalanmış bir cam çubukla pinna kenarındaki kılları okşayarak aksiyon potansiyellerini tetikleyin. Ardından, bilgisayar arayüzü aracılığıyla bir elektroneurogram kaydedin. Spike'ların bazal gürültünün hemen üzerinde duyulabilir olması için nörogramı bir ses sistemine aktarın.Bu işitsel geri bildirim iletisi, deneyler yürütülürken oldukça yararlıdır. Ardından, kılları manuel olarak uyararak, temizlenen alanın yakınındaki foliküllerin innervasyonunun sağlam olduğunu doğrulayın. Şimdi, alttaki kılları açığa çıkarmak için, adipoz temizleme penceresi seviyesinde kulak derisi kenarının bir ila iki milimetresini katlayın.Karşıt deri tabakaları arasında serum fizyolojik dolu bir boşluk bırakın. Dikkatle dinlerken, katlanmış kenar boyunca dışarı çıkan kılları bir cam çubukla nazikçe okşayın. Deriye dokunmayın.Gerektiğinde, çıktıyı değerlendirmek için osiloskobu kontrol edin. Stimulasyonla tetiklenen aksiyon potansiyellerinin kontrollü kayıtlarını yapmak için, seramik piezo-elektrik bir aktüatöre bağlı, ateşle pürüzsüzleştirilmiş on santimetrelik borosilikat mikroelektrot camından yapılmış mekanik bir prob kullanın. Probu, deri katlanmasına paralel hareket edecek ve deriye değil, kıllara temas edecek şekilde konumlandırın.Cilt yüzeyinin yaklaşık yarım ila bir milimetre üzerinde tutun. Ardından, prob hareket ettiğinde ses çıkışını dinleyerek stimülasyonu manuel olarak doğrulayın. Şimdi, küçük bir kıl alanının mekanik stimülasyonunu gerçekleştirmek için yazılımı ayarlayın.Örneğin, her on saniyede bir beş hertz sinüzoidlerle üç saniyelik simülasyonlar programlayın. Bu işlem, 200 ile 2.000 mikron arasında bir prob yer değiştirmesi gerektirir. Ardından, sinirlerde kaydedilen yanıtların tutarlılığını kontrol etmek için tekrarlanan otomatik stimülasyonu kullanarak devam edin.Tekrarlanabilir sonuçlar elde edilebilmelidir. Sonuçlar tutarlı olduğunda, tekrarlama hızını her 30 saniyeye düşürün. Daha fazla talimat metin protokolünde verilmiştir.Mekanosensör kanalların özelliklerini araştırmak ve kıl folikülleri çevresindeki mekanosensör terminalleri işaretlemek için çözeltiye on mikromolar FM1-43 ekleyin ve 60 dakika bekletin. Bu sırada kılları osilasyonlu prob ile uyarmaya devam edin. Bu boya, kültürdeki aday transduser kanallarını ve duyusal nöronlar ile koklea tüy hücrelerini bloke eder.Bununla birlikte, in situ mature kıl folikülü afferanslarının ateşlenmesini engellemez. Sonlanmaların etiketlenmesi, boyanın terminallere ulaştığını ve boya maruziyeti boyunca mekanik stimülasyona yanıt vermeye devam ettiğini göstermektedir. Tanımlanan protokol kullanılarak elde edilen elektroneurogramlar, manuel stimülasyon olmasa bile, en büyük boyutlu aksiyon potansiyelleri dahil olmak üzere devam eden aksiyon potansiyeli aktivitesini tipik olarak göstermiştir.Spontan aktivite, herhangi bir yapı veya tonisite belirtisi göstermeksizin saniyede yaklaşık 10-20 spike şeklinde gerçekleşti. Stimülasyon dönemleri arasındaki aralıkların oto-korelasyonu her zaman oldukça düz seyretti. Kıl şaftlarının saniyede beş hertz, 500 micron mekanik stimülasyonu sırasında genel çıktı tipik olarak saniyede yaklaşık 50 spike'a yükseldi.Çevrim histogramlarının oluşturulması, sinüzoidal çevrim başına dört ila on spike ile yanıtların güçlü bir sürüklenmesini ortaya çıkardı. Bu durum oldukça tekrarlanabilirdi; elbette yanıtların kilitlendiği dalga formu fazı, titreşen probun kıla temas ettiği noktaya ve o noktadaki hareket yönüne bağlıydı. Ardından, kıl folikülü mızrak uçlu sinir ucu kanal farmakolojisi araştırıldı.Kanallar, kültürdeki duyusal nöronlarda veya ex vivo kokleal tüy hücrelerinde bulunanlar gibi bazı mekanosensör kanalları bloke edebilen FM1-43'e maruz kaldıklarında bile yanıt vermeye devam etti. Bu teknik uzmanlaşıldığında, elektroneurogram kayıtlarının başlangıcına kadar olan süreç 60 ila 90 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, elektrotlarda yüksek dirençli elektriksel temas sağlamak ve foliküllerin görüntülenmesi ile birleştirilecekse, boya penetrasyonunu ve optik netliği artırmak için küçük fareler kullanmak önemlidir.Bu yöntem için fikri, kas iğindeki mekanosensasyonda sinaptik benzeri veziküllerin olası rolünden ve bunları FM1-43 ile görselleştirmek için daha iyi bir yönteme duyulan ihtiyaçtan bahsettiğimizde, yakın bir meslektaşımız ve şu an emekli olan profesör Clarke Slater ile yüksek lisans öğrencisi Nakul Kain tarafından başlangıçta geliştirilen bir yöntemden uyarladık. Bu prosedürün farmakoloji ve canlı boya etiketlemesi gibi yöntemlerle takip edilmesi; hangi kanalların mekanotransduser olduğu, in situ farklılaşmış terminallerin hangileri olduğu ve mekanik stimülasyonun, sinaptik benzeri vezikül geri dönüşümünü düzenleyerek boya alımı ve salınımını modüle edip etmediği gibi sorularye cevap vermek için gerçekleştirilebilir. FM1-43'ün toksisitesinin değerlendirilmediğini ve tehlikeliymiş gibi ele alınması gerektiğini unutmayın.

combined-recording-mechanically-stimulated-afferent-output-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Memeli koklea iç saç hücresi şerit sinaps işitsel sinir lifi dendritler Tüm hücre yama klemp kayıtları.

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

Bu video, bir fare kulak kepçesinin kıl foliküllerinde mekanik olarak uyarılmış afferent çıktı ve sinir terminali etiketlemesinin birleşik kaydını göstermektedir. Bir floresan membran boyasına maruz kalmadan önce ve sonra saç folikülü sinir terminallerinin mekanik stimülasyonu, üretilen aksiyon potansiyellerinin elektrofizyoloji kaydı ve saç foliküllerindeki sinir terminali etiketlemesinin görselleştirilmesi ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Fare kılı foliküllerinde mekanik olarak uyarılmış afferent çıktının ve sinir terminali etiketlemesinin birleşik kaydı

Bu video, fare beyni kama dilimlerinde medial olivokoklear nöronlarda işitme sinir kökünü uyarmak ve postsinaptik akımları kaydetmek için bir protokolü göstermektedir.

Bir Fare Beyin Kaması Diliminde İşitsel Sinir Kökü Stimülasyonu ve postsinaptik akım kayıtları

Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi - - mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Kas duyusal nöronlar propriyoseptör sinyalizasyon dahil ve aynı zamanda metabolik devlet ve yaralanma ile ilgili olaylar üzerine rapor edilmektedir. Biz streç aktive kas afferentlerde çalışmaları için in vitro kas-sinir hazırlanmasında bir yetişkin fare açıklar.

Bir İn Vitro Yetişkin Fare kas-sinir Hazırlık

Bu video, bir in vitro fare kolorektum sinir preparatı üzerinde tek lifli elektrofizyolojik kayıtların yürütülmesi için bir protokolü göstermektedir.

Fare Kolorektal Afferent Endings in vitro Fonksiyonel Karakterizasyonu içinde

Burada, stiril piridinyum boyalarla boyama ve lekelenme sırasında fare kulağı derisi kıl foliküllerini innerve eden palisade uçlarının canlı mızrak şeklinde duyusal terminallerini görüntülemek için yeni bir hazırlığı açıklıyoruz.

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fare Kulak Cilt

Mezenterik afferent sinirler, normal homeostaz ve patofizyoloji ile ilgili bilgileri gastrointestinal sistemden beyne doğru iletir. Gastrointestinal afferent sinir aktivitesi, bağlı afferent sinirlere sahip izole bağırsak segmentlerinin bir organ banyosuna monte edilmesi, sinirin izole edilmesi ve bazal ve uyarılmış aktivitenin değerlendirilmesi ile değerlendirilebilir.

Fare jejunal ve Kolon Segmentlerde Mezenterik Afferent Sinir Faaliyet Vitro kaydedilmesi

Bu iletişim kuralı İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi postnatal fare pups üzerinden kaydetmek için yöntemler açıklanır. Dış saç hücreleri fonksiyonel gelişimi incelemek için tüm hücreli yama kelepçe dış saç hücreleri izole kayıt deneysel işlemin adım adım açıklanmıştır.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

Biz aynı anda hem electrocorticography hem de yerel alan potansiyelleri fareler serbestçe hareket nosiseptif lazer uyaranlara yanıt kaydeder bir teknik geliştirmiştir. Bu teknik araştırma nosiseptif bilgi beyinde işleme kolaylaştırır electrocortical sinyalleri mezoskopik ve makroskopik düzeyde, doğrudan bir ilişki kurmak yardımcı olur.

Kortikal yerel alan potansiyelleri ve Electrocorticograms fareler serbestçe hareket nosiseptif lazer uyaranlara yanıt olarak eşzamanlı kayıt

Bu çalışma, farelerin ön pençe derisindeki düşük eşikli mekanoreseptör (LTMR) akson terminallerinin görselleştirilmesi için in vivo iki fotonlu görüntüleme yaklaşımını sunmaktadır. Bireysel aksonların tekrarlanan, yüksek çözünürlüklü görüntülemesi kullanılarak, bu yöntem gelişim sırasında ve yetişkinlerde deri duyusal devresinin yapısı ve işlevini incelemek için yeni bir platform sağlar.

Fare Derisindeki Dokunma Duyusal Akson Morfolojisinin İntravital İki Fotonlu Görüntülemesi

Keşfedin fare kulak derisindeki saç folikülü mekanoreseptörlerinden afferent kayıt yöntemini. Canlı hücre görüntüleme ve elektrofizyolojik kaydı birleştirerek sinir terminali etiketleme sağlar.

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

Daha fazla video keşfet