Name: Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme S. venezuelae Yaşam Döngüsü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Öğrenin, Streptomyces venezuelae'nin yaşam döngüsünü mikroakışkan cihazlar ve floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanarak canlı hücre görüntüleme ile incelemeyi. Bu yöntem sporlanma ve protein lokalizasyonunu gerçek zamanlı gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, mikroskopla ilgili teknik yardım için Grant Calder'a, protokol hakkındaki yorumları için Matt Bush'a ve Zeiss geniş alan mikroskobunu satın aldığı için John Innes Merkezi'ne teşekkür eder. Bu çalışma, BBSRC hibesi BB / I002197 / 1 (MJB'ye), BBSRC Enstitüsü Stratejik Program Hibesi BB / J004561/1 tarafından John Innes Merkezi'ne, İsveç Araştırma Konseyi hibesi 621-2010-4463 (KF'ye) ve Leopoldina Doktora Sonrası Bursu (SS'ye) tarafından finanse edilmiştir.

Taze S. 1. İzolasyonu venezuelae Sporlar ve kültür aracı maddesinin hazırlanması <ol><li> DivIVA mCherry P ftsZ - gerilme SV60 yanda sayılan [attB φ BT1 :: pSS209 (P divIVA 10 ul sporlarla, 60 ul R2 eser element solüsyonu (TE) ile desteklenmiş 30 ml maltoz-Maya Özü-Malt Extract aşılamak (MYM) orta, -ftsZ-ypet)]. istikrarlı büyüme ve hücre sporülasyonun için bir şaşkın şişeyi ya da yeterli havalandırma sağlamak için bir bahar içeren bir şişesi kullanın. </li><li> 30 ° C&#39;de 35-40 saat ve 250 rpm&#39;de Kültür hücreleri. </li><li> Sıvı monte faz-kontrast mikroskobu ile hücrelerin inceleyin. Bu noktada misel parçaları ve sporlar görünür olacaktır. </li><li> Santrifüj 1 dakika boyunca 400 x g&#39;de bir masa üstü santrifüjü içinde 1 ml hücre misel ve büyük hücre fragmanları pelet. </li><li> Yaklaşık 300 ul süpernatant co aktarınyeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe bir spor süspansiyonunun ntaining ve buz üzerinde tutun. Aşama 1.7 kalan kültür ortamı tutun. </li><li> Sporlar MYM-TE içinde 1:20 seyreltilir (nihai konsantrasyon: 0.5-5 x 10 7 spor / ml) ve gerektiği kadar buz üzerinde tutulur (adım 2.3). Not: Streptomyces içinde sporlanmasını tetikleyen tam koşullar, bir sporlanan kültürden herhangi bir bilinmeyen hücre dışı sinyaller dahil olmak üzere, harcanan MYM-TE ortamı kullanılarak, anlaşılmamış olmakla birlikte, sporulasyonunu uyarır. </li><li> sporlar ve miselial parçalar içermez MYM-TE harcanan olarak ulaşmak için kalan kültür ortamında 10 ml filtre sterilize. steril 0.22 mikron şırınga filtresi kullanın ve transfer steril 15 ml tüp MYM-TE geçirdi. </li><li> Benzer büyüme koşulları kullanılarak ek deneyler yapılacak ise 4 ° C&#39;de birkaç gün için hazırlanan harcanan MYM-TE tutun. </li></ol> Mikroakışkan Aygıt 2. Hazırlık Not: Her mikroakışkan plaTe gerçekleştirilebilir dört bağımsız deneyde kadar sağlar. bir deney kurarken kullanılmayan akış odaları kirlenmesini önlemek için, steril çözümler ve çalışma koşullarını kullanın. <ol><li> mikroakışkan plakadan nakliye çözüm çıkarın ve steril MYM-TE ile kuyu durulayın. </li><li> 300 ul MYM-TE 6 kuyular 2 iyi 1 ve 300 ul geçirdi MYM-TE girişine ekle. </li><li> Yük 40 ul şerit &quot;A&quot; hücre yükleme oyuk 8 adım 1.6 sporların seyreltildi ve uygun plaka manifold üretici talimatlarına mühür. </li><li> , Mikroakiskan kontrol yazılımı başlatmak uygun plaka türünü seçin ve oyuk başına 2 dakika süreyle 6 psi 5&#39;e giriş kuyulardan akan ortamı tarafından 1 asal akış kanalı ve kültür odasına bir akış programı kurmak. </li><li> Çimlenme ve hücrelerin vejetatif büyüme sağlamak için 6 saat süreyle giriş kuyusundan 1 MYM-TE akan: Mikroakiskan kontrol yazılımı olarak, deney için bir akış protokolü oluşturmak. anahtarDaha sonra deney kalan süre için de 2 ila 5 harcanan MYM-TE perfüzyon için. Deney sırasında (yaklaşık 9 ul ortam / saat karşılık gelir) 6 psi akış basıncı sabit tutmak. Adım 3.5 sonra akış programını başlatın. </li></ol> Mikroskop ve Time-lapse Protokolün 3. Kurma Not: Bu yöntem, bir sCMOS kamera, bir metal-halojen lamba, bir donanım otofokus, 96 oyuklu plakalar için bir sahne tutucu ve bir çevre bölmesi ile donatılmış bir tam motorlu ve otomatik ters Geniş açılı, mikroskop uygulanmıştır. <ol><li> deney başladıktan sonra otofokus sorunları önlemek amacıyla önceden 30 ° C çevre odasının ön ısıtmak. gerekli süre kullanılan çevre odasında, mikroskop ve ısıtma sistemine bağlıdır. deneyden önce sistem gece ısınmaya başlar. </li><li> mikroskop ve mikroskop otomasyon ve kontrol softwa açınyeniden. Böyle bir 100X, 1.46 NA yağı DIC hedef olarak optimal sinyal toplama ve uzaysal çözünürlüğü, yüksek bir sayısal açıklık (NA) immersiyon yağı hedefi kullanın. Sarı-floresan ve kırmızı floresan proteini füzyonlarının diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri ve görüntüleri elde etmek için uygun filtre ve iki renkli aynalar seçin. </li><li> amaç üzerine daldırma petrol bir damla koyun ve görüntü alımı sırasında hücre odağı artırmak için mikroakışkan plaka üzerinde görüntüleme penceresinin altına daldırma sıvısı ekleyin. Dikkatle ters mikroskop sahneye mühürlü mikroakışkan cihaz (adım 2.5) monte edin. plaka güvenli sahne tutucu yerleştirilir ve deney boyunca kayma olmadığından emin olun. </li><li> yönlendirme için gömülü pozisyon işaretlerini kullanarak odak haline mikroakışkan kültür odasının görüntüleme penceresini getirin. ilk akış odasının soldaki kısmına odaklanın karşılık, tuzak büyüklüğü 5 ile ( &quot;A&quot; etiketli)0.7 mikron bir tuzak yüksekliği. </li><li> Mikroakiskan yazılımında, giriş kuyudan 8 den yük hücreleri 15 saniye boyunca 4 psi. görüntüleme penceresi boyunca sahne hareket ettirerek kültür odasında hücre yoğunluğu kontrol edin. Hiçbir sporların sıkışıp olsaydı, hücre yükleme adımı tekrarlayın veya alternatif istenilen hücre yoğunluğu (2.048 x 2.048 piksel görüntüleme penceresi başına 1-10 sporları) elde edilene kadar yükleme basıncı ve / veya süresini artırın. kültür odasını aşırı yüklemekten kaçının. Biz normalde Streptomyces görüntüleme için tuzak boyutu 5 kullanın, ama biz de 4 ve 3 hücreli yükleme işlemini optimize etmek konusunda ek öneriler için tedarikçinin kılavuzuna başvurun boyutları tuzağı ile iyi sonuçlar elde edilmiştir: Not. </li><li> Adım 2.5 kontrol yazılımı akış programını başlatın ve mikroakışkan plaka görüntü toplama başlamadan önce mikroskop aşamasında 1 saat ısı-gelmesini sağlayınız. </li><li> mikroskop kontrol yazılımı, mu almak için çok boyutlu bir satın kurmakzamanla çok kademeli pozisyonlarda ltiple görüntüleri: <ol><li> Autosave için: resim dosyalarının otomatik tasarrufu için dizini belirtin. </li><li> Aydınlatma ayarları için, önceden her özel yapı için en uygun aydınlatma ayarlarını belirlemek. DIC 150 msn, YFP 250 msn, RFP 100 msn: özetlenen deney için aşağıdaki pozlama süreleri kullanın. </li><li> Zaman serisi için: sırayla istenilen zaman noktalarında görüntüler elde etmek için bir zaman serisi kurdu. S. yaşam döngüsünü görüntülenmesi için venezuelae, 24 saatlik bir süre boyunca 40 dakikalık bir zaman aralığını seçin. </li><li> Sahne pozisyonları ve otomatik odaklama için: ilgi her görüntüleme konumu için sahne ve mağaza sahne pozisyonları hareket ettirerek kültür odasına tarayın. tek kademeli pozisyonları yeterince ayrı photobleaching ve phototoxicity.Typically 12 pozisyonları kadar kullanabilirsiniz aza indirmek için yer olduğundan emin olun. Her zaman noktası için çalıştırın otomatik odaklama rutin yavaş odak kayması düzeltmek için. Eğer mikroskop kontrol yazılımı mevcut&quot;Donanım otofokus yerel yüzey güncelleme&quot; olarak ayarlayın otofokus stratejisi. Seçilen sahne pozisyonların Z koordinatları doğrulandıktan sonra, donanım otofokus etkinleştirin. </li></ol></li><li> mikroskop kontrol yazılımı time-lapse deney başlatın. </li><li> Tüm sahne pozisyonları daha sonraki noktalarda odak hala olup olmadığını kontrol edin. otofokus kullanırken birkaç saat içinde çalışan time-lapse deneyler için, zaman zaman hatta bir sahne sürüklenme gözlemlemek. sahne pozisyonları odakladı gerekiyorsa, uygun bir zaman noktasında denemeyi durdurmak Odağı ayarlamak ve tanımlı görüntüleme zaman aralığının (adım 3.7.3) içinde denemeyi yeniden başlatın. Zaman serisi bağlamak için nasıl adım 4.3&#39;e bakın. </li><li> 24-30 saat sonra görüntü elde etme durdurmak veya ilgi bölgedeki hif sporları içine farklılaşmış zaman (DIC görüntü serisi bakınız). Yazılımın akış programı durdurmak ve mikroakışkan cihaz demonte. </li><li> Kısa vadeli sto için kullanılan mikroakışkan tabak hazırlayınöfke. MYM-TE kalan çıkarın ve 6 kuyusundan 1 MYM-TE geçirdi boş atık kuyu 7 ve steril koşullar altında hücre yükleme kuyu 8. yeniden dolum için şeritli &quot;A&quot; kuyu ve kullanılmayan hatlarının kuyular ( &quot;B&quot; kullanılmıştır steril fosfat tamponlu salin ile plaka üzerinde, &quot;D&quot;), (PBS). 4 ° C&#39;de ve mağaza kurumasını önlemek için parafilm plaka mühür. </li></ol> Fiji Yazılım Kullanma Time-lapse Filmler 4. Nesil Not: farklı ticari ve özgür yazılım paketleri ZenBlue, Metamorph, Icy, ImagePro veya ImageJ dahil time-lapse mikroskopi görüntüleri işlemek için kullanılabilir olduğunu unutmayın. Burada bir açık kaynak görüntü işleme ImageJ dayalı bir program ve hangi zaten yararlı önceden yüklenmiş eklentileri bir dizi sağlar olan Fiji, odaklanmak. <ol><li> Fiji yüklü olduğu bir bilgisayara time-lapse deney transfer görüntüleme verileri. </li><li> programı başlatın ve &amp; kullanarak görüntüleme dosyasını içe# 34; Dosya&gt; İçe Aktar&gt; Biyo-Biçimleri &quot;. Ya da basitçe Fiji içine görüntüleme dosyasını sürükleyerek&quot; Biyo-Biçimleri İthalat Seçenekleri her aydınlatma kanalı için ayrı bir görüntü yığını elde etmek için bölünmüş kanallar &quot;&quot;, kutuyu işaretleyin &quot;(DIC , RFP, YFP). </li><li> İsteğe bağlı: (DIC, RFP, YFP her kanal için, bağlı refocusing (adım 3.9) görüntü edinimi bir mola kaynaklanan ayrı zaman serisi birleştirme ilgili görüntü yığınlarını açmak ve çalıştırmak &quot;Image&gt; Yığınlar&gt; Araçlar&gt; Concatenate&quot; için ). </li><li> görüntü yığınlarından gezinerek zaman atlamalı veri kalitesini değerlendirmek. zamanla odak kaldı hifler, gösteri misel büyüme için bakmak ve sonunda sporlar (DIC yığını) oluştururlar. sırasıyla, bitkisel ya da sporogenic hifler (YFP yığınında) tek halkaları veya birden fazla, merdiven benzeri yapılar oluşturan hifal ucunda DivIVA-mCherry (RFP yığını) ve FtsZ-YPet için beklenen hücre içi lokalizasyonu inceleyin. </li><li> aşağı işlenme için ilgi bir bölge yalıtmakgörüntülerin ng. Time-lapse mikroskopi genellikle Fiji tarafından işlenmesini yavaşlatabilir büyük dosyaları üretir. Nedenle tespit ve faiz (ROI) bir bölge izole etmek ve görüntü yığınının bu küçük bir versiyonu hakkında daha fazla görüntü işleme adımları gerçekleştirmek için tavsiye edilir. <ol><li> Menüde &quot;Dikdörtgen Seçim&quot; aracını seçin ve gelişmekte olan hif görüntü dizi boyunca ROI çevrili olduğu şekilde DIC görüntü yığınında bir dikdörtgen ROI çizin. </li><li> &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot; ile YG-yığını çoğaltın. </li><li> YFP görüntü yığını adı çubuğuna tıklayın ve &quot;Düzenle&gt; Seçim&gt; Seçimi Restore&quot; YFP yığınında aynı borudaki konumuna yığını özgün DIC önceki dikdörtgen seçim geri ve &quot;Ctrl&quot; ile ROI çoğaltmak için menüde + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li> RFP yığını için bu işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> üç resim t yığınlarının görüntüleri hizalayıno zamanla xy düzleminde sahne sürüklenir kaldırın. DIC yığınında son kareye gidin ve menüden &quot;Eklenti&gt; Kayıt&gt; StackReg&gt; RigedBody&quot; seçeneğini seçin. RFP ve YFP görüntü yığını için bu adımı yineleyin. Gerekirse, adım 4.5.1-4.5.3 yineleyerek ROI kırpın. </li><li> İsteğe bağlı: &quot;&gt; Süreç Kontrast geliştirin&quot; &quot;Parlaklık ve Kontrast Aracı ayarlama&quot; ( &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;C&quot;) ya da seçmek her görüntü yığını için elle parlaklık ve kontrast ayarlama menüden ve &quot;Normale&quot; uygulamak yığının tüm görüntüleri komut. Ikinci komut aşağı görüntü analizi etkileyebilir, bu nedenle piksel değerlerini değiştirebilir ve olacağı unutulmamalıdır. </li><li> İsteğe bağlı: yatay veya dikey &quot;Image&gt; Yığınlar&gt; Araçlar&gt; birleştirin&quot; eklentisi kullanarak (RGB dosya formatına dönüştürülmüş 4.11 bakınız) bireysel yığınları birleştirin. </li><li> (&amp; Ve bir süre Stamper ( &quot;&gt;&gt; Ölçek Bar Araçlar Analiz&quot;) bir ölçek çubuğu ekleyin# 34; Image&gt; Yığınları&gt; Saat Stamper &quot;). </li><li> &quot;.tiff&quot; Formatında bir görüntü dizisi olarak değiştirilmiş görüntü yığınlarını kaydedin. Bir film üretmek için, &quot;.avi&quot; olarak kaydedin. Alternatif olarak, &quot;Biyo-Biçimleri&gt; Biyo-Biçimleri İhracatçı&quot; eklentisi ve &quot;.mov&quot; dosya türünü seçin kullanarak QuickTime formatında ihracat görüntü serisi. </li><li> tek kare resim elde etmek için, + &quot;D&quot; ilgi çerçeve seçin ve görüntü &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; yinelenen. &quot;Görüntü&gt; Type&gt; RGB renk veya 8-bit&quot; adı altında ortaya çıkan görüntü &quot;RGB&quot; veya &quot;8-bit&quot; türünü değiştirmek ve &quot;tiff&quot; olarak görüntüyü kaydetmek. Not: Fiji ek daha açıklamak işlevleri veya işlem time-lapse serisi bir dizi sunuyor. Ayrıntılı bilgi (http://fiji.sc/Fiji) Fiji çevrimiçi destek gidin. </li></ol>

<ol><li>Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-di-GMP+signalling+and+the+regulation+of+developmental+transitions+in+streptomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes.</a> Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).</li>
<li>Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+division+and+DNA+segregation+in+Streptomyces.%3A+how+to+build+a+septum+in+the+middle+of+nowhere%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere?</a> Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).</li>
<li>McCormick, J. R., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+regulators+that+govern+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Signals and regulators that govern Streptomyces development.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).</li>
<li>Flärdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+apical+growth+and+hyphal+branching+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).</li>
<li>Hempel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ser%2FThr+protein+kinase+AfsK+regulates+polar+growth+and+hyphal+branching+in+the+filamentous+bacteria+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).</li>
<li>Fuchino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gradients+of+an+intermediate+filament-like+cytoskeleton+are+recruited+by+a+polarity+landmark+during+apical+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).</li>
<li>Holmes, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coil+protein+Scy+is+a+key+component+of+a+multiprotein+assembly+controlling+polarized+growth+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).</li>
<li>McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+viability+of+Streptomyces+coelicolor.+mutant+for+the+cell+division+gene+ftsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ.</a> Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).</li>
<li>Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+and+the+division+of+prokaryotic+cells+and+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).</li>
<li>Grantcharova, N., Lustig, U., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+FtsZ+assembly+during+sporulation+in+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).</li>
<li>Richards, D. M., Hempel, A. M., Flärdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+basis+of+branch-site+selection+in+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002423(2012).</li>
<li>Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblies+of+DivIVA+mark+sites+for+hyphal+branching+and+can+establish+new+zones+of+cell+wall+growth+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor.</a> J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).</li>
<li>Wolanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+trafficking+in+growing+vegetative+hyphae+of+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+Streptomyces+coelicolor.growth+and+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).</li>
<li>Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+control+of+cell+division%3A+FtsZ+is+recruited+by+SsgB+during+sporulation+of+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces.</a> Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).</li>
<li>Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+of+Streptomyces+venezuelae.+in+submerged+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures.</a> J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).</li>
<li>Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+chaplin+and+rodlin+hydrophobic+sheath+proteins+in+Streptomyces+venezuelae.is+controlled+by+sigma%28BldN%29+and+a+cognate+anti-sigma+factor%2C+RsbN%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN.</a> Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).</li>
<li>Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+regulator+heterodimer+formation+controls+a+key+stage+in+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development.</a> PLoS Genet. 10, e1004554(2014).</li>
<li>Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+aerial+growth%2C+cell+division%2C+and+chromosome+segregation+are+targets+of+WhiA+before+sporulation+in+Streptomyces+venezuelae%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae.</a> MBio. 4, e00684-e00613 (2013).</li>
<li>Tschowri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrameric+c-di-GMP+mediates+effective+transcription+factor+dimerization+to+control+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development.</a> Cell. 158, 1136-1147 (2014).</li>
<li>Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-Lòpez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MreB-Dependent+Inhibition+of+Cell+Elongation+during+the+Escape+from+Competence+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 11, e1005299(2015).</li>
<li>Zopf, C. J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquiring+fluorescence+time-lapse+movies+of+budding+yeast+and+analyzing+single-cell+dynamics+using+GRAFTS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS.</a> J. Vis. Exp. (e50456), (2013).</li>
<li>Meniche, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpolar+addition+of+new+cell+wall+is+directed+by+DivIVA+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).</li>
<li>Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+impacts+on+cell+growth+and+division+site+selection+in+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum.</a> PLoS One. 8, e55078(2013).</li>
<li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Escherichia+coli.+growth+rate+to+osmotic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).</li>
<li>Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+DivIVA+in+polar+growth+and+morphogenesis+in+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).</li>
<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
<li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).</li>
<li>Szafran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+%28TopA%29+is+recruited+to+ParB+complexes+and+is+required+for+proper+chromosome+organization+during+Streptomyces+coelicolor.+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation.</a> J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Streptomyces yaşam döngüsü time-lapse mikroskopi geçmişte teknik açıdan zorlayıcı olmuştur. Burada (Şekil 2) görselleştirmek ve gelişim programı aracılığıyla ilerlemesini iz yardımcı olmak için hücre polarite işaretleyici DivIVA ve hücre bölünmesi proteini FtsZ için floresan protein füzyonları kullanarak tüm yaşam döngüsünün canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek için sağlam bir protokol mevcut. Bu yöntem Orta S. yetiştirme (MYM-TE harcanan) harcanan orta ile sürekli orta perfüzyon ve normal büyüme ortamı (MYM&#39;nin-TE) alışverişini sağlayan bir mikroakışkan cihaz venezuelae. Kültür durumun değişim besin açısından zengin bir ortamda sürekli bir tedarik bitkisel growt uyarır, oysa sporulasyonunu teşvik nedeniyle harcanan kültür ortamında herhangi henüz tanımlanmamış hücre dışı sinyalleri olarak kuyu (örn nisap algılama sinyalleri) olarak beslenme vites açıklanan protokole önemlidirneredeyse hiç spor oluşumu H (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, bu mikro-akışkan sistemi içinde kültürlenmesi daha deney esneklik sağlar ve kültür koşullarının değiştirilmesi yanıt olarak bakteri büyümesinin değişikliklerin uzun süreli izlenmesine olanak sağlar, çünkü agaroz üzerinde hücrelerin kültürlenmesi daha üstündür. mikroakışkan plakaları tek bir kullanım için tasarlanmıştır, ancak sadece sonraki deneylerde kullanılabilen hücre ile inoküle edilmemiş kanalları akar. Biz uzun zaman açılmıştır plakalara manifoldu sızdırmazlık problemleri yaşamış gibi, bir hafta içinde bir mikroakışkan plaka tüm kanallarını kullanmanızı öneririz. Bir deney kurarken, biz mikrop tüpleri (veriler gösterilmemiştir) ortaya önce donmuş bir gliserol stoku türetilen sporlar en az 6 saat gerekli ise taze hazırlanmış sporlar, akış odasına yüklenen iki saat içinde çimlenmiş bulundu. çimlenme bu gecikme deney uzunluğunu uzatır ve engelleyebilirekipman kullanılabilirliği ve deneysel koşullar. Mikrop tüplerinin geliştirilmesi ve akıbet için yeterli besin sağlamak için en az 3 saat MYM-TE perfüzyon ile denemeyi başlatmak için de önemlidir. Deney vejetatif büyümeyi incelemek için tasarlanmış ise MYM-TE ile Perfüzyon ilk 3 saat ötesine uzatılabilir. sporların başlangıç ​​malzemesinin tercih seçeneği sağlarken, kısa hifal parçaları da mikroakışkan plakaya yüklenebilir. Ancak, makaslanmış misel kullanarak yükleme verimi düşüktür önemli ve genellikle sigara sporlanan mutantlar incelerken bir sınırlama mevcut olabilecek çeşitli yükleme çalışır gerektirir. Ne olursa olsun kullanılan inokulum Çeşidi, medya difüzyon müdahale ve görüntü analizi komplike edebilir hızlı kalabalık yol açacaktır bu kadar sporların veya hifal fragmanları ile kültür odasını aşırı önemlidir. Muhabir proteinlerin yapımını planlamak önemlidir dikkatli bir şekildLly Streptomyces floresan time-lapse görüntüleme kullanım için. Hedef protein ve flüoresan raportör ve N- veya C-terminali füzyonları seçimi arasındaki ekleyicinin boyu kritik öneme sahip olabilir. Ayrıca, görüntüleme frekansı ve maruz kalma süresi de dahil olmak üzere uygun deney koşulları, her bir floresan etiketli proteini için önceden tespit edilmesi gerekmektedir. S. düşük seviyelerde ifade edilen bir floresan etiketli protein görüntüleme sorunlu olabilir sarı / yeşil kanaldaki venezuelae hifler sergi otomatik floresans. Buna ek olarak, bu çimlenme ve ilk vejetatif büyüme fazı, S. sırasında dikkat edilmelidir venezuelae kısa dalga boylu ışığa (örneğin CFP protein füzyonları kullanırken) için özellikle duyarlıdır. Bakterilerin canlı hücre görüntüleme için görüntüleme yöntemleri ve floresan muhabiri sistemlerinde sürekli ilerlemelere rağmen, yazılım paketleri çoğu (örneğin MicrobeTracker, Schnitzelcveri setleri bu tür sonraki otomatik işleme arşın, CellProfiler) bir çok hücreli yaşam tarzı 27-29 ile ipliksi bakteriler elde edilen görüntülerin analizini desteklemez. Bu nedenle, Streptomyces ve diğer lifli bakteri görüntüleme de niceliksel veri yüksek verimli bir analizi için uygun bir algoritma geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır. Özetle, burada açıklanan çalışma S. muazzam potansiyelini göstermektedir Çünkü sıvı içinde sporlanmalanna kabiliyetini cinsi için yeni bir model gelişim sistem olarak venezuelae. Mikroakışkan kültür cihazı deneyimsiz kullanıcılar için bile kullanımı basittir. Bu dinamik protein lokalizasyonu, polarize büyüme ve unigenomic sporların zincirleri içine çok hücreli misel morfolojik farklılaşma dahil Streptomyces yaşam döngüsü, merkezi hücre biyolojik süreçleri incelemek için mükemmel bir platform sağlar. Buna ek olarak, bu deney u ayarlamakp ayrıca peptidoglikan sentezini veya propidium iyodür ve 4 izlemek için floresan D-amino asitler &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol olarak kültür koşulları alternatif gerektiren gelişme olayları, ya da floresan boyaların kullanımını araştırmak için cezbedici bir başlangıç ​​noktası sağlar (DAPI) kromozom organizasyonu 30,31 görselleştirmek için.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The author&#39;s name was updated from:
Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycet&#39;ler uykuda, unigenomic sporlar 1-3 bir çok hücreli, besin süpürücü misel gelen morfolojik farklılaşma içeren karmaşık bir gelişimsel döngüsünde ile karakterize edilir toprakta yaşayan bakteriler vardır. Uygun büyüme koşulları altında, tipik bir Streptomyces spor bir ya da iki tohum tüpü (Şekil 1) haddelenmesiyle çimlenme başlar. Bu tüpler ucu uzantısı uzamış ve vejetatif misel olarak bilinen dallı hifal ağına büyür. Polar büyüme ve hifal dallanma temel protein DivIVA tarafından yönetilmektedir. Bu halkalı-halka proteini büyük sitoplazmik kompleks bir parçası olarak uzanan uç 4-7 yeni hücre kılıfı malzemesinin sokulması için çok önemlidir polarisome olarak adlandırılır. Vejetatif büyüme sırasında, hifal filamentler sözde çapraz duvarların 8 seyrek oluşumu ile bölümlere olur. yeniden bu çapraz duvarların oluşumu<html> quires FtsZ, çoğu bakteri 9 hücre bölünmesi için gerekli olan tübülin gibi iskelet proteindir. Streptomyces, ancak, bu vejetatif çapraz duvarlar daralma ve hücre-hücre ayrımına neden olmayan ve bu nedenle de misel kütle birbiriyle bağlantılı sinsityal bölmelerin ağı olarak kalır. Iyi anlaşılmış değildir besin sınırlaması ve diğer sinyallere yanıt olarak, uzman bir anten hif vejetatif misel uzakta kırmaya ve havaya 3 dönüşebilir. Bu yapıların montajı haline uzun multi-genomik hava hifler eşit büyüklükte unigenomic Prospore bölmeleri onlarca bölünmüş sırasında gelişme üreme fazını başlatır. Bu büyük hücre bölünmesi olayı tek sporogenic hifler 2,10 içinde birden fazla FtsZ yüzük senkron daralma tarafından tahrik edilir. Morfolojik ayrım uykuda, kalın duvarlı, pigmentli sporların salınımı ile tamamlanır. t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> Şekil 1:. Katı ortam üzerinde Streptomyces yaşam döngüsü Bu S. klasik çalışmalara dayalı yaşam döngüsünün bir modeldir agar plakaları üzerinde büyüyen coelicolor. Bir sporun hücresel gelişim hif dallanma bir ağ oluşturmak üzere uç uzantısı büyür bir ya da iki germ tüpleri, oluşumu ile başlar. Polar büyüme ve bitkisel hiflerin dallanma DivIVA (kırmızı) tarafından yönetilmektedir. vejetatif çapraz duvarların oluşumu FtsZ (yeşil) gerektirir. besin sınırlamalar ve diğer sinyallere yanıt olarak, hava hif inşa edilmiştir. hava büyüme tutuklanması sıkıca kutu benzeri Prospore bölmeye sporogenic hif bölümlendirirse sporülasyon septa doğuran FtsZ-ringler, bir merdiven montaj ile koordine edilir. Bu bölmeler kalın spor Duvara montaj ve sonunda Relea vardırolgun pigmentli sporlar sed. Streptomyces yaşam döngüsünün kilit gelişim olayları iyi 1,3 karakterize edilir. Ancak, yine de ne kıt, protein yerelleştirme dinamikleri, kromozom hareketi ve gelişimsel kontrollü hücre bölünmesi olarak farklılaşmasını destekleyen hücre içi süreçlere, içgörü sağlamak için floresan time-lapse mikroskobu kullanan hücre biyolojik çalışmalar vardır. Streptomyces gelişme Canlı hücre görüntüleme nedeniyle yaşam döngüsünün karmaşıklığı ve organizmanın fizyolojik özelliklerinin zorlu olmuştur. Bitkisel büyüme önceki çalışmaları ve sporlaşma septasyon başlangıç ​​aşamaları oksijen geçirgen görüntüleme odaları veya mikroskop sahnede 11-15 Streptomyces coelicolor agaroz destekli büyüme istihdam var. Ancak bu yöntemler, bir dizi faktöre ile sınırlıdır. Bazı sistemler sadece hücresel büyümenin kısa vadeli görüntüleme izinhücreler önce d floresan proteinleri yetersiz oksijen kaynağı muzdarip veya bağlı hifal geliştirme üç boyutlu desen odak düzleminden dışarı büyür. Uzun vadeli görüntüleme hücreleri alternatif büyüme ya da stres koşullarına maruz ve agaroz pedleri ortamdan eşiğe ciddi zayıf floresan izlemek için yeteneği sınırlar olamaz çünkü agaroz pedleri sınırları deneysel esneklik üzerinde hücrelerin yetiştirilmesi mümkün olduğu durumlarda sinyaller. Burada mükemmel hassasiyet ve duyarlılığı ile tam Streptomyces yaşam döngüsünün canlı hücre görüntüleme için bir protokol açıklar. Bir floresan geniş açılı mikroskobu (Şekil 2) bağlı olan bir mikro sıvısal tertibat Streptomyces büyüyerek, şimdi en fazla 30 saatlik bir süre boyunca çimlenme, vejetatif büyüme ve sporulizasyon septumu oluşumunu izlemek mümkündür. Bu büyük ölçüde, yeni bir model organizma Streptomyces kullanılmasıyla kolaylaştırılır </em&gt; venezuelae o batık kültürde yakın tamamlanması için sporulates ve böylece klasik bir model türlerinin S. sınırlama üstesinden gelir, çünkü Katı ortam 16-20 sadece sporulates coelicolor. vejetatif gelişmesi ve spor görselleştirmek yardımcı olmak için, birlikte express floresan hücre polarite işaretleyici DivIVA ve anahtar hücre bölünmesi proteini FtsZ sürümlerini etiketledi. Başarıyla mikobakteriler, Escherichia coli Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis ve maya 21-25 için kullanılan olan bir ticari olarak temin edilebilir mikroakışkan cihaz kullanmaktadır. Sistem tek bir odak düzlemi hücreleri yakalar ve farklı haznelerden kültür ortamının sürekli perfüzyon kontrol edilmesini sağlar. Ayrıntılı protokolde S. ortaya çıkarmak için bu özellikten yararlanmak sporulasyonunu tanıtmak için bir beslenme downshift için bitkisel misel venezuelae. protokol deScribed tüm Streptomyces yaşam döngüsünün canlı hücre görüntüleme için, ancak belirli gelişim evreleri özel ilgi ise alternatif medya koşulları veya mikroskop ayarları seçilebilir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> Şekil 2: Şematik deneysel iş akışı betimleyen. protokol açıklanan üç temel adım gösterilmiştir. İlk olarak, sporlar ve harcanan ortam sabit faz kültüründen hazırlanmıştır. İkincisi, taze sporlar mikroakışkan sistemi ve S. yüklenir venezuelae gelişimsel ömrü optimal büyüme sıcaklığı korumak için bir kuluçka hücresine sahip, tam otomatik bir ters mikroskop kullanılarak boyunca görüntüsü alınır. Üçüncü olarak, elde edilen time-lapse serisi analiz ve açık kaynak yazılımı Fiji kullanılarak işlenir.

<table><tbody><tr><td>Bakteri hücreleri için B04A CellAsic ONIX plakası</td><td>Merck-Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>Mikroakışkan kültür plakaları</td></tr><tr><td>CellAsic ONIX Mikroakışkan Perfüzyon Sistemi ve ONIX FG (sürüm 5.0.2)</td><td>Merck-Millipore</td><td>EV-262</td><td>En son ONIX sürümü (Temmuz 2015) ve programın nasıl kullanılacağına ilişkin talimatlar burada bulunabilir: http://www.merckmillipore.com</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Tam otomatik ve motorlu ters çevrilmiş geniş alan mikroskobu</td></tr><tr><td>İnkübatör XL multi S1, Sıcaklık Modülü S1 ve Isıtma ünitesi XL S2</td><td>Zeiss</td><td>411857-9061-000</td><td>Mikroskobu çevreleyen çevre odası</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Yağ DIC objektifi</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Ocra FLASH 4 V2</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Aydınlatıcı HXP 120V</td><td>Zeiss</td><td>423013-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>FL Filtre Seti 46 HE YFP vites serbest</td><td>Zeiss</td><td>489046-9901-000</td><td>Floresan filtre seti, uyarma 500/25 nm, emisyon 535/30 nm</td></tr><tr><td>FL Filtre Seti 63 HE RFP vites serbest</td><td>Zeiss</td><td>489063-0000-000</td><td>Floresan filtre seti, uyarma 572/25 nm, emisyon 629/30 nm</td></tr><tr><td>Multiwell için montaj çerçevesi K-M plakalar</td><td>Zeiss</td><td>000000-1272-644</td><td>Mikroakışkan plaka için sahne tutucu</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>Zeiss</td><td>410135-1002-120</td><td>Mikroskop kontrol yazılımı</td></tr><tr><td>ZEN Modülü Zaman Atlamalı</td><td>Zeiss</td><td>410136-1031-110</td><td>Hızlandırılmış mikroskopi deneylerini ayarlamak için yazılım modülü</td></tr><tr><td>ZEN Modülü Döşemeler/Konumlar</td><td>Zeiss</td><td>410136-1025-110</td><td>Belirli sahne konumlarını kaydetmek için yazılım modülü (xzy)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>açık kaynaklı yazılım paketi</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td> <td>Hızlandırılmış film üretimi</td></tr><tr><td><güçlü>Maltoz-Maya Dışarcık-Malt Özü (MYM)</güçlü> 4 g Maltoz 4 g Maya özütü 10 g Malt özütü %50 musluk suyu ve %50 ters ozmoz suyu kullanarak 1 L H2O ekleyin ve 100 başına 200 ml R2 eser element çözeltisi ile takviye edin otoklavlamadan</td><td></td><td></td> sonra ml <td>S. venezuelae SV60</td></tr><tr><td><güçlü >R2 Eser element çözeltisi (TE) < / güçlü > 8 mg ZnCl < alt > 2 < / alt > 40 mg FeCl < alt > 3 < / alt > < alt >2 < / alt > O 2 mg CuCl < alt > 2 < / alt>-2H < altı > 2 < / alt > O 2 mg MnCl < alt > 2 < / alt >-4H < alt > 2 < / alt > O 2 mg Na < alt > 2 < / alt > B < alt > 4< / alt > < alt >7< / alt >-10H<alt >2< / alt >O 2 mg ( NH<alt>4</alt>)<alt>6</alt>Ay<>7<>altO<alt>24</alt>-4H<alt>2</alt>O 200 ml H2O ekleyin Otoklav ve 4 oC'de</td><td></td><td></td> saklayın <td>0.002 birim ekleyin MYM</td></tr><tr><td>PBS (fosfat tamponlu tuzlu su)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>Plakayı kısa süreli depolamaya hazırlamak için B04A plakalarında kullanılmayan şeritlerin giriş kuyularını yeniden doldurmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>0.22 ve mikro; m şırınga filtreleri</td><td>Satorius stedim</td><td>16532-K</td><td>Kullanılmış MYM-TE</td></tr><tr><td>SV60</td><td>John Innes Center suş toplama</td><td></td><td>S. venezuelae suş eksprese eden divIVA-mcherry ve ftsZ-ypet</td></tr></tbody></table>

tam floresans zaman atlamalı görüntüleme<em&gt; s. venezuelae</embir mikroakışkan cihaz kullanımı&gt; yaşam döngüsü

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Tek hücre düzeyinde biyolojik süreçlerin canlı hücre görüntülemesi, bakteri hücrelerinin hücre altı organizasyonuna ilişkin mevcut anlayışımızda etkili olmuştur. Bununla birlikte, sporlanan filamentli bakteri Streptomyces'te gelişmeyi destekleyen hücre biyolojik süreçlerini incelemek için hızlandırılmış mikroskopi uygulaması, teknik zorluklar nedeniyle engellenmiştir. 
Burada, yeni model türü Streptomyces venezuelae'yi, ters çevrilmiş bir floresan geniş alan mikroskobuna bağlı, ticari olarak temin edilebilen bir mikroakışkan cihazda büyüterek bu sınırlamaların üstesinden gelmek için bir protokol sunuyoruz. Klasik model türlerin aksine, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sıvı içinde sporlanır ve S. venezuelae'nin uzun zaman dilimleri boyunca hücresel gelişimini ve farklılaşmasını yetiştirmek ve mikroskobik olarak izlemek için mikroakışkan büyüme odalarının uygulanmasına izin verir. Morfolojik değişikliklerin izlenmesine ek olarak, floresan olarak işaretlenmiş hedef proteinlerin uzaysal-zamansal dağılımı da hızlandırılmış mikroskopi ile görselleştirilebilir. Ayrıca, mikroakışkan platform, mikroakışkan odada S. venezuelae'nin sporülasyonunu uyarmak için ayrıntılı protokolde kullanılan kültür ortamını değiştirmek için deneysel esneklik sunar. Tüm S. venezuelae yaşam döngüsünün görüntüleri belirli aralıklarla elde edilir ve kaydedilen zaman serilerinin filmlerini üretmek için açık kaynaklı yazılım Fiji'de işlenir.

Tüm S. başarılı canlı hücre görüntüleme venezuelae yaşam döngüsü çimlenme, vejetatif büyüme ve sporlanma (Şekil 3, Film 1) en önemli gelişim aşamaları dahil olmak üzere, sürekli bir zaman serisi elde edilir. yaşam döngüsü boyunca ilerlemenin Görselleştirme daha DivIVA mCherry ve FtsZ-YPet ayrı hücre içi lokalizasyonu ile geliştirilmiştir. Çimlenme ve vejetatif büyüme sırasında, DivIVA mCherry sadece büyüyen hifal ipuçları ya da yeni şube noktaları (Şekil 4A) oluşturan işaretleri birikir. Bu sonuçlar DivIVA 12,26 önceden bildirilen hücre içi konumlandırma ile uyumludur. Bunun aksine, FtsZ-YPet artan misel (Şekil 4B) düzensiz aralıklarla tek halka-benzeri yapılar oluşturmaktadır. Bu yapılar İnterconn oluşumuna neden olmayan konstriktif bitkisel çapraz duvarlar sentezi için iskele temintutarları hifal bölmeleri 8. Sporogenic hif içine hif büyüyen hücre farklılaşması polar DivIVA mCherry odaklarının kaybolması ile görünür hale gelir, polar büyüme yakalanması ve FtsZ-YPet floresans birlikte artış (Şekil 4C). hif sporlanan olarak FtsZ-YPet lokalizasyonu deseni dramatik değişiklikler; İlk sarmal FtsZ-YPet filamentler hypha boyunca takla ve sonra aniden neredeyse eşzamanlı olay, bu helezonlar düzenli aralıklı FtsZ-YPet halkaların bir merdiven içine birleşmek. Burada tarif edilen deney koşulları altında, bu eşit olarak dağıtılmış FtsZ-YPet merdivenler yaklaşık 2 saat süre ile devam etmektedir. Son olarak, sporulasyon septa diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri (Şekil 4D) ve en sonunda yeni sporlar yayımlanan içinde fark edilebilir hale gelir. olarak sağlayan Fiji yazılımını kullanarak görüntü işleme açıklayan sonraki protokol<html> TEP-adım edinilen time-lapse serisi (Film 1) den yayınlanması için bir film üretmek için nasıl bir açıklama. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> Şekil 3: S. temsili time-lapse floresan mikroskopi serisinden Anlık görüntüler venezuelae üreten floresan etiketli FtsZ (yeşil) ve DivIVA (Kırmızı) birleştirilmiş görüntülerin seçilen kareleri vardır Gösterildi (üst panel: RFP-YFP DIC, alt panel: DIC). çimlenme, vejetatif büyüme ve sporülasyonun dahil Streptomyces yaşam döngüsü görselleştirerek. Görüntüler Film 1. Zaman alınmıştır saat şöyledir: dk. Ölçek çubukları = 5 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> d / 53863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4: Streptomyces yaşam döngüsünün başarılı zaman atlamalı serisi için Örnek sonuçlar DivIVA mCherry (A) lokalizasyonu.. RFP ve DIC kanallarının birleştirilmiş görüntüleri ile Movie 1 iki sonraki zaman noktalarında anlık gösterilmiştir. DivIVA mCherry yeni hifal şube siteleri (dolu ok başı) işaretler ve polar büyüme (açık ok başı) doğrudan hifal ucunda lokalize. Ölçek çubuğu = 10 vejetatif büyüme (ok başı) sırasında um (B) FtsZ-YPet yerelleştirme. FtsZ-YPet (DIC, alt panel) sıkmak yok tek halka benzeri yapılar (üst panel) oluşturur. Sporlanma septasyon sırasında (C) FtsZ-YPet (yeşil) yerelleştirme. (Sa: dk) DivIVA mCherry odakları aşağıda gösterildiği geçen süre, kırmızı renkle gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 5 mikron. (C) den sporlanan hif DIC görüntüleri İlgili (D) şeklini gösterensonunda sporların bir zincir (sağ resim) içine olgun görünür sporlanma septa (sol resim) ile Prospore bölmeleri, bir tirme. Zaman saat şöyledir: dk. Ölçek çubuğu = 5 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 1 Çerçeve" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> Film 1: yaşam döngüsünün venezuelae Streptomyces Time-lapse floresan mikroskopi dizileri film birleştirilmiş RFP-YFP görüntüleri (solda) ve karşılık gelen diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri (sağda) oluşur.. DivIVA mCherry yeşil, kırmızı ve FtsZ-YPet gösterilmiştir. tek kare arasındaki zaman aralığı 40 dk. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">Thi görmek için buraya tıklayınız</a>s film.

Streptomyces, hücre biyolojik yollarla incelenmesi deneysel olarak zor olan karmaşık bir yaşam döngüsü ile karakterize edilir. Burada, Streptomyces venezuelae'yi mikroakışkan bir cihazda büyüterek tüm yaşam döngüsünün floresan hızlandırılmış mikroskobunu gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme<em&gt; S. venezuelae</emBir mikroakışkan Cihaz Kullanımı&gt; Yaşam Döngüsü

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Bu floresan zamanraflatımlı mikroskopi protokolünün genel amacı, sporulasyon yapan ipliksi bakteri Streptomyces venezuelae'de gelişimi ve hücresel farklılaşmayı destekleyen biyolojik hücre süreçlerini incelemek için bir yöntem sunmaktır. Tanımlanan yöntem; dinamik protein lokalizasyonu, polarize büyüme ve sporulasyon septasyonu dahil olmak üzere Streptomyces yaşam döngüsünün merkezinde yer alan hücre biyolojik süreçlerini çalışmak için mükemmel bir platform sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, Streptomyces venezuelae'nin sıvı ortamda sporulasyon yapmasıdır; bu durum hücreleri bir mikroakışkan cihazda büyütmemize ve tüm yaşam döngüsünü mikroskobik olarak izlememize olanak tanır.Bu yöntem, çok merkezli bir miselyumun spor zincirlerine farklılaşmasının canlı hücre görüntülemesine olanak tanıdığı için, Streptomyces venezuelae'nin cins için yeni bir gelişim sistemi olarak sahip olduğu muazzam potansiyeli göstermektedir. Başlangıç için, 30 mililitre desteklenmiş büyüme ortamını, görüntülemesi yapılacak S.venezuela suşundan 10 mikrolitre spor ile ekleyn. Hücrelerin tutarlı büyümesi ve sporülasyonu için, yeterli havalandırmayı sağlamak amacıyla bölmeli (baffled) bir erlen veya içinde yay bulunan bir erlen kullanın.Hücreleri 30 °C'de ve 250 RPM'de 35 ila 40 saat boyunca kültürleyin. Hazır olduğunda, sıvı monte faz kontrast mikroskobisi aracılığıyla miselyum fragmanlarını ve sporları görebiliyor olmanız gerekir. Miselyumu ve daha büyük hücre fragmanlarını çöktürmek için, kültürden bir mililitreyi masaüstü santrifüjle 400 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, spor süspansiyonunu içeren süpernatantın yaklaşık 300 µL'sini yeni bir 1,5 mm tüpe aktarın ve tüpü buz üzerinde bekletin. Kalan kültür ortamını daha sonraki bir adımda kullanmak üzere saklayın. Daha sonra, sporları desteklenmiş büyüme ortamında 1/20 oranında dilüe edin ve dilüe edilen sporları ihtiyaç duyana kadar buz üzerinde tutun.Kalan kültür ortamını 50 mililitrelik bir behere boşaltın, ardından bir şırınga ile 10 mililitre çekin ve kalan kültür ortamını sterilize etmek için steril 22 µm şırınga filtresi kullanın. Bu işlem, sporlardan ve miselyum fragmanlarından arındırılmış harcanmış takviyeli büyüme ortamı elde etmek içindir. Benzer büyüme koşullarının kullanılacağı ek deneyler yapılacaksa, filtrelenmiş harcanmış takviyeli büyüme ortamını birkaç gün boyunca 4 °C'de saklayın.Her bir mikroakışkan plaka dört bağımsız deneye kadar kullanılabilir. Kullanılmayan akış odalarının kontamine olmasını önlemek için, deneyi kurarken steril çözeltiler ve çalışma koşulları kullandığınızdan emin olun. İşleme, mikroakışkan plaktaki sevkiyat çözeltisini uzaklaştırarak başlayın.Ardından kuyucukları steril takviyeli büyüme medyumu ile durulayın. Durulama işlemi tamamlandığında, birinci kuyucuğun girişine 300 µL takviyeli büyüme medyumu ve iki ile altı arasındaki kuyucuklara 300 µL kullanılmış takviyeli büyüme medyumu ekleyin. Daha sonra, A şeridinin sekizinci kuyucuğuna 40 µL seyreltilmiş spor yükleyin ve manifoldu üretici talimatlarına uygun olarak plakaya sabitleyin.Mikroakışkan kontrol yazılımını başlatın ve uygun plaka türünü seçin. Akış kanalını ve kültür odasını hazırlamak için, birinci ile beşinci giriş kuyucuklarından ortamı, kuyucuk başına iki dakika boyunca altı psi basınçta akıtacak bir akış programı kurun. Ardından, birinci giriş kuyucuğuna altı psi basınçta takviye edilmiş büyüme ortamını altı saat boyunca akıtın.Bu durum, çimlenmenin ve vejetatif büyümenin gerçekleşmesini sağlayacaktır. Programın altı saat sonra tüketilmiş takviyeli büyüme ortamına geçmesini ve deneyin geri kalanında bunu altı psi basınçla iki ile beş arasındaki kuyucuklara akıtmasını sağlayın. Çevresel hazneyi önceden 30 °C'ye ısıtın.Ardından mikroskobu ve mikroskop kontrol yazılımını açın. Yüksek sayısal açıklıklı bir yağ daldırma objektifini yerleştirin ve diferansiyel girişim kontrast görüntülerini ve sarı floresan ile kırmızı floresan protein füzyon görüntülerinin alınması için uygun filtrelerin ve diyagramatik aynaların ayarlandığını onaylayın. Objektife ve mikroakışkan plakanın görüntüleme penceresinin altına bir damla daldırma yağı damlatın.Sızdırmaz hale getirilmiş mikroakışkan cihazı, evirtilmiş mikroskobun tablasına dikkatlice yerleştirin ve sabitleyin. Görüntüleme penceresini mikroakışkan kültür odasına odaklamak için gömülü konum işaretçilerini kullanın. A olarak etiketlenen birinci akış odasının en sol kısmına odaklanın ve ardından tabloyu, 7 mikrometre tuzak yüksekliğine karşılık gelen beşinci tuzak boyutuna getirin.Mikroakışkan yazılımında, sistemi 4 psi basınçta 15 saniye boyunca sekiz numaralı giriş kuyucuğundan hücreleri yükleyecek şekilde ayarlayın. İşlem tamamlandıktan sonra, sahneyi görüntüleme penceresi boyunca hareket ettirerek kültür odasındaki hücre yoğunluğunu kontrol edin. Eğer sporlar tutulmamışsa, hücre yükleme adımını tekrarlayın veya alternatif olarak, görüntüleme penceresi başına 1 ila 10 spor şeklindeki istenen hücre yoğunluğu elde edilene kadar yükleme basıncını ve/veya süresini artırın.Kültür odasının aşırı doldurulmamasına dikkat edin. Daha sonra, kontrol yazılımındaki önceden hazırlanmış akış programını başlatın ve görüntüleme işlemine başlamadan önce mikroakışkan plakanın mikroskop tablasında bir saat boyunca ısı dengesine ulaşmasını sağlayın. Mikroskop kontrol yazılımında, görüntü dosyalarının otomatik olarak kaydedileceği bir dizin belirleyerek, zaman içinde birden fazla tabla konumunda çok sayıda görüntü almak için çok boyutlu bir görüntüleme işlemi ayarlayın.Ardından, aydınlatma ayarlarına gidin ve her bir spesifik konstrükt için önceden belirlenmiş optimal aydınlatma ayarlarını girin. Daha sonra, 24 saat boyunca her 40 dakikada bir görüntü toplamak üzere bir zaman serisi oluşturun. Sahne konumlarını belirlemek ve otofokus ayarını yapmak için kültür odasını tarayın ve ilgilenilen her bir görüntüleme konumu için sahne konumlarını kaydedin.Fotobeyazlamayı ve fototoksisiteyi minimize etmek için tek aşamalı konumların yeterince uzak olduğundan emin olun. Seçilen sahne konumlarının Z koordinatları doğrulandıktan sonra, donanım odaklamasını (autofocus) etkinleştirin. Ardından, mikroskop kontrol yazılımında zaman atlamalı (time-lapse) deneyi başlatın.Görüntüleme işlemini 24 ila 30 saat sonra veya ilgi bölgesindeki hifler sporlara farklılaştığında durdurun. Ardından, yazılımdaki akış programını durdurun ve mikroakışkan düzeneği sökün. Giriş kuyucuklarında, atık kuyucuğunda ve hücre yükleme kuyucuğunda kalan tüm medyumu uzaklaştırarak kullanılmış mikroakışkan plakayı kısa süreli saklama için hazırlayın.Ardından, A şeridinin kullanılan kuyucuklarını ve kullanılmayan şeritlerin kuyucuklarını steril PBS ile doldurun. Son olarak, kurumasını önlemek için plakayı parafilm ile mühürleyin. Ve plakayı dört santigrat derecede saklayın.S.venezuela yaşam döngüsünün tamamının başarılı canlı hücre görüntülemesi; çimlenme, vejetatif büyüme ve sporülasyonun temel gelişim aşamalarını içeren sürekli bir zaman serisi sağlar. Çimlenme veya vejetatif büyüme sırasında, DivIVA-mCherry yalnızca büyüyen hipnal uçlarda birikir veya yeni oluşan hif branching noktalarını işaretler. Buna karşın, FtsZ-YPet büyüyen miselyumda düzensiz aralıklarla tekil halka benzeri yapılar oluşturur.Bu yapılar, birbirine bağlı hifal kompartmanların oluşumuna yol açan nonkonstruktif vejetatif çapraz duvarların sentezi için iskelet sağlar. Sporülasyon yapan hiflerde, FtsZ-YPet'in lokalizasyon paterni belirgin şekilde değişir. İlk olarak, helikal FtsZ-YPet filamentleri hifa boyunca yuvarlanır ve ardından ani, neredeyse senkronize bir olayla, bu helisler düzenli aralıklı FtsZ-YPet halkalarından oluşan bir merdivene dönüşür.Son olarak, diferansiyel girişim kontrast görüntülerinde sporülasyon septaları belirginleşir ve nihayetinde yeni sporlar salınır. Bu teknik, Streptomyces yaşam döngüsünün tamamının canlı hücre görüntülemesini gerçekleştirmek için sağlam bir protokol sunar. Mikroakışkan sistemin kullanımı kolaydır.Deneysel esneklik sunar ve uzun süreli izlemeye olanak tanır. Bu deneysel düzenek ayrıca, değişen kültürel koşullara yanıt olarak gelişime özgü olayları araştırmak veya peptidoglikan sentezini izlemek ya da kromozom organizasyonunu görselleştirmek için floresan boyalar kullanmak adına mükemmel bir başlangıç noktası sağlar.

fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için...

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Kaynak: Schlimpert, S. ve ark. Mikroakışkan Bir Cihaz Kullanılarak Tüm S. venezuelae Yaşam Döngüsünün Floresan Hızlandırılmış Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, çimlenmeyi, hif büyümesini ve sporlanmayı gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için mikroakışkan bir cihaz kullanarak Streptomyces venezuelae bakterisinin tüm yaşam döngüsünün floresan hızlandırılmış görüntülemesini göstermektedir.

Streptomyces venezuelae Yaşam Döngüsünün Floresan Hızlandırılmış Görüntülemesi

Kaynak: Winkle, C. C., et al. Akson dallanması ve nöronal morfogenez sırasında plazma zarı iletiminin rolünü tanımlamak için birleşik metodolojilerin kullanılması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, kortikal nöronlardaki ekzositik olayları görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunu göstermektedir. pH'a duyarlı bir yeşil floresan protein (GFP) markörü, vezikül füzyonu üzerine floresan yapar ve zaman atlamalı görüntülemede membran-proksimal ekzositozu yakalayan seçici TIRF...

Ekzositik olayların görselleştirilmesi için toplam iç yansıma floresan mikroskobu 

Bu protokolün amacı stoma kompleksinin hücre korteks içinde, GFP etiketli PATROL1, bir membran kaçakçılığı protein noktalar yanıp sönen gösteren değişken açılı Epifloresans mikroskobu ile bitki hücre yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamikleri izlemek için nasıl göstermek için Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Burada sunulan bir agarose ped ve hücre görüntüleme yemekleri ile birlikte zaman atlamalı floresan mikroskobu kullanarak yırtıcı bakteri Bdellovibrio bakteriovorus tam yaşam döngüsünün izlenmesi açıklayan bir protokoldür.

Zaman Atlamalı Floresan Mikroskopi kullanarak Bakteriyel Predator Bdellovibrio bakteriovorus Yaşam Döngüsünün Canlı Hücre Görüntüleme

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, Streptomyces venezuelae'nin yaşam döngüsünü mikroakışkan cihazlar ve floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanarak canlı hücre görüntüleme ile incelemeyi. Bu yöntem sporlanma ve protein lokalizasyonunu gerçek zamanlı gözlemlemeyi sağlar.

Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet