Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme S. venezuelae Yaşam Döngüsü

Bu floresan hızlandırılmış mikroskopi protokolünün genel amacı, sporlanan filamentli bakteri Streptomyces venezuelae'de gelişimi ve hücresel farklılaşmayı destekleyen biyolojik hücre süreçlerini incelemek için bir yöntem sağlamaktır. Tanımlama yöntemi, dinamik protein lokalizasyonu, polarize büyüme ve sporülasyon septasyonu dahil olmak üzere Streptomyces yaşam döngüsünün merkezinde yer alan hücre biyolojik süreçlerini incelemek için mükemmel bir platform sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, Streptomyces venezuelae'nin sıvı içinde sporlanmasıdır, bu da hücreleri mikroakışkan bir cihazda büyütmemize ve tüm yaşam döngüsünü mikroskobik olarak izlememize olanak tanır.

Bu yöntem, Streptomyces venezuelae'nin cins için yeni bir gelişim sistemi olarak muazzam potansiyelini göstermektedir, çünkü çok merkezli bir miselyumun spor zincirlerine farklılaşmasının canlı hücre görüntülemesine izin verir. Başlamak için, 30 mililitre takviye edilmiş büyüme ortamını, görüntülenecek olan S.venezuela suşundan 10 mikrolitre spor ile aşılayın. Hücrelerin tutarlı bir şekilde büyümesi ve sporlanması için, yeterli havalandırmaya izin vermek için şaşkın bir şişe veya bir yay içeren bir şişe kullanın.

Hücreleri 30 santigrat derece ve 250 RPM'de 35 ila 40 saat kültürleyin. Hazır olduğunuzda, sıvıya monte faz kontrast mikroskobu ile misel parçalarını ve sporlarını görebilmelisiniz. Miselyum ve daha büyük hücre parçalarını peletlemek için kültürün bir mililitresini bir masa üstü santrifüjde 400 kez G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Daha sonra, bir spor süspansiyonu içeren süpernatanın yaklaşık 300 mikrolitresini yeni bir 1.5 milimetrelik tüpe aktarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Kalan kültür ortamını daha sonraki bir adımda kullanmak üzere saklayın. Daha sonra, sporları takviye edilmiş büyüme ortamında bir ila 20 oranında seyreltin ve seyreltilmiş sporları ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutun.

Kalan kültür ortamını 50 mililitrelik bir behere dökün ve daha sonra bir şırınga ile 10 mililitre çekin ve kalan kültür ortamını sterilize etmek için steril bir 22 mikrometre şırınga filtresi kullanın. Sporlardan ve misel parçalarından arınmış, harcanmış takviye edilmiş büyüme ortamı elde etmek için. Benzer büyüme koşullarını kullanan ek deneyler yapılacaksa, filtrelenmiş harcanan takviye edilmiş büyüme ortamını birkaç gün boyunca dört santigrat derecede tutun.

Her mikroakışkan plaka, dört adede kadar bağımsız deney için kullanılabilir. Kullanılmayan akış odalarının kirlenmesini önlemek için, deneyi kurarken steril solüsyonlar ve çalışma koşulları kullandığınızdan emin olun. Nakliye solüsyonunu mikroakışkan plakadan çıkararak başlayın.

Daha sonra kuyuları steril takviyeli büyüme ortamı ile durulayın. Durulandıktan sonra, 300 mikrolitre takviye edilmiş büyüme ortamını birinci kuyunun girişine ve 300 mikrolitre harcanan takviye edilmiş büyüme ortamını iki ila altı kuyucuğa ekleyin. Daha sonra, seyreltilmiş sporların 40 mikrolitresini A şeridinin sekizinci kuyusuna yükleyin ve manifoldu üreticinin talimatlarına uygun olarak plakaya kapatın.

Mikroakışkanın kontrol yazılımını başlatın ve uygun plaka tipini seçin. Akış kanalını ve kültür odasını doldurmak için kuyu başına iki dakika boyunca altı psi'de bir ila beş giriş kuyularından ortamı akıtmak için bir akış programı ayarlayın. Daha sonra, altı psi'de takviye edilmiş büyüme ortamını, altı saat boyunca bir giriş kuyusuna akıtın.

Bu, çimlenme ve vejetatif büyümenin gerçekleşmesine izin verecektir. Programın altı saat sonra harcanan takviye edilmiş büyüme ortamına geçmesini sağlayın ve deneyin geri kalanı için altı psi'de iki ila beş arasındaki kuyulara akıtın. Çevre odasını önceden 30 santigrat dereceye ısıtın.

Ardından mikroskobu ve mikroskop kontrol yazılımını açın. Yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip bir yağa daldırma objektifi yerleştirin ve sarı floresan ve kırmızı floresan protein füzyonlarının görüntüleriyle birlikte diferansiyel girişim kontrast görüntüleri elde etmek için uygun filtrelerin ve diyagramatik aynaların ayarlandığını onaylayın. Objektife ve mikroakışkan plaka üzerindeki görüntüleme penceresinin altına da bir damla daldırma yağı yerleştirin.

Sızdırmaz mikroakışkan cihazı dikkatlice monte edintage ters çevrilmiş mikroskobun tablası ve yerine sabitleyin. Mikroakışkan kültür odasının görüntüleme penceresini odağa getirmek için gömülü konum işaretleyicilerini kullanın. A etiketli ilk akış odasının en sol kısmına odaklanın ve ardından sahneyi, 7 mikrometrelik tuzak yüksekliğine karşılık gelen beş bindirme boyutuna getirin.

Mikroakışkan yazılımda, sistemi 15 saniye boyunca dört psi'de sekiz giriş kuyusundan hücreleri yükleyecek şekilde ayarlayın. İşlem çalıştırıldıktan sonra, sahneyi görüntüleme penceresi boyunca hareket ettirerek kültür odasındaki hücre yoğunluğunu kontrol edin. Hiçbir spor yakalanmadıysa, hücre yükleme adımını tekrarlayın veya alternatif olarak, görüntüleme penceresi başına bir ila 10 spor arasında istenen hücre yoğunluğu elde edilene kadar yükleme basıncını ve / veya süresini artırın.

Kültür odasının aşırı yüklenmesini önlemek için dikkatli olun. Ardından, kontrol yazılımında önceden hazırlanmış akış programını başlatın ve görüntü almaya başlamadan önce mikroakışkan plakanın mikroskop aşamasında bir saat boyunca ısı dengesine sahip olmasına izin verin. Mikroskop kontrol yazılımında, önce görüntü dosyalarının otomatik olarak kaydedilmesi için bir dizin belirterek, zaman içinde birden çok aşama konumunda birden fazla görüntü almak için çok boyutlu bir alım ayarlayın.

Ardından, aydınlatma ayarlarına gidin ve her bir yapı için önceden belirlenmiş optimum aydınlatma ayarlarını girin. Ardından, 24 saat boyunca her 40 dakikada bir görüntü almak için bir zaman serisi ayarlayın. Sahne alanı konumlarını belirlemek ve otomatik odaklamayı ayarlamak için, kültür odasını tarayın ve ilgilenilen her görüntüleme konumu için sahne konumlarını saklayın.

Fotoğraf ağartmayı ve fotoğraf toksisitesini en aza indirmek için tek aşamalı konumların birbirinden yeterince uzağa yerleştirildiğinden emin olun. Seçilen sahne konumlarının Z koordinatları doğrulandıktan sonra, donanım otomatik odaklamasını etkinleştirin. Ardından mikroskop kontrol yazılımında hızlandırılmış deneyi başlatın.

24 ila 30 saat sonra veya ilgilenilen bölgedeki hifler sporlara farklılaştığında görüntü alımını durdurun. Ardından yazılımdaki akış programını durdurun ve mikroakışkan cihazı sökün. Kullanılmış mikroakışkan plakayı, giriş kuyularından, atık kuyusundan ve hücre yükleme kuyusundan kalan herhangi bir ortamı çıkararak kısa süreli depolama için hazırlayın.

Daha sonra A şeridinin kullanılmış kuyularını ve kullanılmayan şeritlerin kuyularını steril PBS ile doldurun. Son olarak, kurumasını önlemek için plakayı armut filmle kapatın. Ve plakayı dört santigrat derecede saklayın.

Tüm S.venezuela yaşam döngüsünün başarılı canlı hücre görüntülemesi, çimlenme, vejetatif büyüme ve sporülasyonun temel gelişim aşamaları da dahil olmak üzere sürekli bir zaman serisi sağlar. Çimlenme veya vejetatif büyüme sırasında, DivIVA-mCherry yalnızca büyüyen hipnal uçlarda birikir veya yeni oluşan hifal dallanma noktalarını işaretler. Buna karşılık, FtsZ-YPet, büyüyen miselyumda düzensiz aralıklarla tek halka benzeri yapılar oluşturur.

Bu yapılar, birbirine bağlı hiphal bölmelerin oluşumuna yol açan yapıcı olmayan vejetatif çapraz duvarların sentezi için iskele sağlar. Sporlu hiflerde, FtsZ-YPet'in lokalizasyon paterni önemli ölçüde değişir. İlk olarak, sarmal FtsZ-YPet filamentleri hif boyunca yuvarlanır ve daha sonra ani, neredeyse eşzamanlı bir olayda, bu sarmallar düzenli aralıklarla yerleştirilmiş FtsZ-YPet halkalarından oluşan bir merdivende birleşir.

Son olarak, sporülasyon septa, diferansiyel girişim kontrast görüntülerinde fark edilebilir hale gelir ve sonunda yeni sporlar salınır. Bu teknik, tüm Streptomyces yaşam döngüsünün canlı hücre görüntülemesini gerçekleştirmek için sağlam bir protokol sağlar. Mikroakışkan sistemin kullanımı kolaydır.

Deneysel esneklik sunar ve cihazın uzun süreli izlenmesine olanak tanır. Bu deney düzeneği aynı zamanda, değişen kültürel koşullara veya peptidoglikan sentezini izlemek veya kromozom organizasyonunu görselleştirmek için floresan boyaların kullanımına yanıt olarak belirli gelişimsel olayları araştırmak için harika bir başlangıç noktası sunar.