Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme

Bu floresan zamanraflatımlı mikroskopi protokolünün genel amacı, sporulasyon yapan ipliksi bakteri Streptomyces venezuelae'de gelişimi ve hücresel farklılaşmayı destekleyen biyolojik hücre süreçlerini incelemek için bir yöntem sunmaktır. Tanımlanan yöntem; dinamik protein lokalizasyonu, polarize büyüme ve sporulasyon septasyonu dahil olmak üzere Streptomyces yaşam döngüsünün merkezinde yer alan hücre biyolojik süreçlerini çalışmak için mükemmel bir platform sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, Streptomyces venezuelae'nin sıvı ortamda sporulasyon yapmasıdır; bu durum hücreleri bir mikroakışkan cihazda büyütmemize ve tüm yaşam döngüsünü mikroskobik olarak izlememize olanak tanır.

Bu yöntem, çok merkezli bir miselyumun spor zincirlerine farklılaşmasının canlı hücre görüntülemesine olanak tanıdığı için, Streptomyces venezuelae'nin cins için yeni bir gelişim sistemi olarak sahip olduğu muazzam potansiyeli göstermektedir. Başlangıç için, 30 mililitre desteklenmiş büyüme ortamını, görüntülemesi yapılacak S.venezuela suşundan 10 mikrolitre spor ile ekleyn. Hücrelerin tutarlı büyümesi ve sporülasyonu için, yeterli havalandırmayı sağlamak amacıyla bölmeli (baffled) bir erlen veya içinde yay bulunan bir erlen kullanın.

Hücreleri 30 °C'de ve 250 RPM'de 35 ila 40 saat boyunca kültürleyin. Hazır olduğunda, sıvı monte faz kontrast mikroskobisi aracılığıyla miselyum fragmanlarını ve sporları görebiliyor olmanız gerekir. Miselyumu ve daha büyük hücre fragmanlarını çöktürmek için, kültürden bir mililitreyi masaüstü santrifüjle 400 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, spor süspansiyonunu içeren süpernatantın yaklaşık 300 µL'sini yeni bir 1,5 mm tüpe aktarın ve tüpü buz üzerinde bekletin. Kalan kültür ortamını daha sonraki bir adımda kullanmak üzere saklayın. Daha sonra, sporları desteklenmiş büyüme ortamında 1/20 oranında dilüe edin ve dilüe edilen sporları ihtiyaç duyana kadar buz üzerinde tutun.

Kalan kültür ortamını 50 mililitrelik bir behere boşaltın, ardından bir şırınga ile 10 mililitre çekin ve kalan kültür ortamını sterilize etmek için steril 22 µm şırınga filtresi kullanın. Bu işlem, sporlardan ve miselyum fragmanlarından arındırılmış harcanmış takviyeli büyüme ortamı elde etmek içindir. Benzer büyüme koşullarının kullanılacağı ek deneyler yapılacaksa, filtrelenmiş harcanmış takviyeli büyüme ortamını birkaç gün boyunca 4 °C'de saklayın.

Her bir mikroakışkan plaka dört bağımsız deneye kadar kullanılabilir. Kullanılmayan akış odalarının kontamine olmasını önlemek için, deneyi kurarken steril çözeltiler ve çalışma koşulları kullandığınızdan emin olun. İşleme, mikroakışkan plaktaki sevkiyat çözeltisini uzaklaştırarak başlayın.

Ardından kuyucukları steril takviyeli büyüme medyumu ile durulayın. Durulama işlemi tamamlandığında, birinci kuyucuğun girişine 300 µL takviyeli büyüme medyumu ve iki ile altı arasındaki kuyucuklara 300 µL kullanılmış takviyeli büyüme medyumu ekleyin. Daha sonra, A şeridinin sekizinci kuyucuğuna 40 µL seyreltilmiş spor yükleyin ve manifoldu üretici talimatlarına uygun olarak plakaya sabitleyin.

Mikroakışkan kontrol yazılımını başlatın ve uygun plaka türünü seçin. Akış kanalını ve kültür odasını hazırlamak için, birinci ile beşinci giriş kuyucuklarından ortamı, kuyucuk başına iki dakika boyunca altı psi basınçta akıtacak bir akış programı kurun. Ardından, birinci giriş kuyucuğuna altı psi basınçta takviye edilmiş büyüme ortamını altı saat boyunca akıtın.

Bu durum, çimlenmenin ve vejetatif büyümenin gerçekleşmesini sağlayacaktır. Programın altı saat sonra tüketilmiş takviyeli büyüme ortamına geçmesini ve deneyin geri kalanında bunu altı psi basınçla iki ile beş arasındaki kuyucuklara akıtmasını sağlayın. Çevresel hazneyi önceden 30 °C'ye ısıtın.

Ardından mikroskobu ve mikroskop kontrol yazılımını açın. Yüksek sayısal açıklıklı bir yağ daldırma objektifini yerleştirin ve diferansiyel girişim kontrast görüntülerini ve sarı floresan ile kırmızı floresan protein füzyon görüntülerinin alınması için uygun filtrelerin ve diyagramatik aynaların ayarlandığını onaylayın. Objektife ve mikroakışkan plakanın görüntüleme penceresinin altına bir damla daldırma yağı damlatın.

Sızdırmaz hale getirilmiş mikroakışkan cihazı, evirtilmiş mikroskobun tablasına dikkatlice yerleştirin ve sabitleyin. Görüntüleme penceresini mikroakışkan kültür odasına odaklamak için gömülü konum işaretçilerini kullanın. A olarak etiketlenen birinci akış odasının en sol kısmına odaklanın ve ardından tabloyu, 7 mikrometre tuzak yüksekliğine karşılık gelen beşinci tuzak boyutuna getirin.

Mikroakışkan yazılımında, sistemi 4 psi basınçta 15 saniye boyunca sekiz numaralı giriş kuyucuğundan hücreleri yükleyecek şekilde ayarlayın. İşlem tamamlandıktan sonra, sahneyi görüntüleme penceresi boyunca hareket ettirerek kültür odasındaki hücre yoğunluğunu kontrol edin. Eğer sporlar tutulmamışsa, hücre yükleme adımını tekrarlayın veya alternatif olarak, görüntüleme penceresi başına 1 ila 10 spor şeklindeki istenen hücre yoğunluğu elde edilene kadar yükleme basıncını ve/veya süresini artırın.

Kültür odasının aşırı doldurulmamasına dikkat edin. Daha sonra, kontrol yazılımındaki önceden hazırlanmış akış programını başlatın ve görüntüleme işlemine başlamadan önce mikroakışkan plakanın mikroskop tablasında bir saat boyunca ısı dengesine ulaşmasını sağlayın. Mikroskop kontrol yazılımında, görüntü dosyalarının otomatik olarak kaydedileceği bir dizin belirleyerek, zaman içinde birden fazla tabla konumunda çok sayıda görüntü almak için çok boyutlu bir görüntüleme işlemi ayarlayın.

Ardından, aydınlatma ayarlarına gidin ve her bir spesifik konstrükt için önceden belirlenmiş optimal aydınlatma ayarlarını girin. Daha sonra, 24 saat boyunca her 40 dakikada bir görüntü toplamak üzere bir zaman serisi oluşturun. Sahne konumlarını belirlemek ve otofokus ayarını yapmak için kültür odasını tarayın ve ilgilenilen her bir görüntüleme konumu için sahne konumlarını kaydedin.

Fotobeyazlamayı ve fototoksisiteyi minimize etmek için tek aşamalı konumların yeterince uzak olduğundan emin olun. Seçilen sahne konumlarının Z koordinatları doğrulandıktan sonra, donanım odaklamasını (autofocus) etkinleştirin. Ardından, mikroskop kontrol yazılımında zaman atlamalı (time-lapse) deneyi başlatın.

Görüntüleme işlemini 24 ila 30 saat sonra veya ilgi bölgesindeki hifler sporlara farklılaştığında durdurun. Ardından, yazılımdaki akış programını durdurun ve mikroakışkan düzeneği sökün. Giriş kuyucuklarında, atık kuyucuğunda ve hücre yükleme kuyucuğunda kalan tüm medyumu uzaklaştırarak kullanılmış mikroakışkan plakayı kısa süreli saklama için hazırlayın.

Ardından, A şeridinin kullanılan kuyucuklarını ve kullanılmayan şeritlerin kuyucuklarını steril PBS ile doldurun. Son olarak, kurumasını önlemek için plakayı parafilm ile mühürleyin. Ve plakayı dört santigrat derecede saklayın.

S.venezuela yaşam döngüsünün tamamının başarılı canlı hücre görüntülemesi; çimlenme, vejetatif büyüme ve sporülasyonun temel gelişim aşamalarını içeren sürekli bir zaman serisi sağlar. Çimlenme veya vejetatif büyüme sırasında, DivIVA-mCherry yalnızca büyüyen hipnal uçlarda birikir veya yeni oluşan hif branching noktalarını işaretler. Buna karşın, FtsZ-YPet büyüyen miselyumda düzensiz aralıklarla tekil halka benzeri yapılar oluşturur.

Bu yapılar, birbirine bağlı hifal kompartmanların oluşumuna yol açan nonkonstruktif vejetatif çapraz duvarların sentezi için iskelet sağlar. Sporülasyon yapan hiflerde, FtsZ-YPet'in lokalizasyon paterni belirgin şekilde değişir. İlk olarak, helikal FtsZ-YPet filamentleri hifa boyunca yuvarlanır ve ardından ani, neredeyse senkronize bir olayla, bu helisler düzenli aralıklı FtsZ-YPet halkalarından oluşan bir merdivene dönüşür.

Son olarak, diferansiyel girişim kontrast görüntülerinde sporülasyon septaları belirginleşir ve nihayetinde yeni sporlar salınır. Bu teknik, Streptomyces yaşam döngüsünün tamamının canlı hücre görüntülemesini gerçekleştirmek için sağlam bir protokol sunar. Mikroakışkan sistemin kullanımı kolaydır.

Deneysel esneklik sunar ve uzun süreli izlemeye olanak tanır. Bu deneysel düzenek ayrıca, değişen kültürel koşullara yanıt olarak gelişime özgü olayları araştırmak veya peptidoglikan sentezini izlemek ya da kromozom organizasyonunu görselleştirmek için floresan boyalar kullanmak adına mükemmel bir başlangıç noktası sağlar.