Name: Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından Ovo olarak Mikro-elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Öğrenin, gelişen tavuk işitsel organında genetik manipülasyon için modifiye edilmiş in ovo mikro-elektroporasyon tekniğini. Bu yöntem, embriyonik dördüncü günden itibaren işitsel progenitör hücrelerinin proliferasyonunu ve farklılaşmasını incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz ifade plazmaları ve in situ sondaları Dr. Doris K. Wu teşekkür Duyu Biyoloji görüntüleme tesisi için Johns Hopkins Üniversitesi Merkezi ve İşitme ve Denge Merkezi. Bu çalışma LE NIDCD Grant T32 DC000023 tarafından desteklenen

yumurta ve çıkmamış embriyolar için bakım ve etik ve insanca muamele edilir. çıkmamış embriyo kullanımı için tüm protokoller Tıp Baltimore, Maryland Johns Hopkins School Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Yumurta ve ekspresyon yapıları hazırlanması <ol><li> Yumurtalar: <ol><li> 3 inkübe - 4 düzine döllenmiş tavuk yumurtası (Gallus gallus) 37 ° C&#39;de onların yüzüne düz yalan. <ol><li> inkübasyon 24 saat sonra yumurtanın yuvarlak arka ucundan bir şırınga ile albümin 3 cc çekin ve şeffaf bir bantla delik mühür. Bu yumurta 19 üstünde erişim için pencere keserken kabuk yapışmasını embriyo olmadan embriyo erişim kolaylığı sağlayan, embriyo ve yumurta kabuğu arasında bir hava boşluğu oluşturur. </li><li> İnkübasyon süresi 117 saatte, Hamburger ve Hamilton 20 gelişim aşamalarına göre embriyolar sahneE4 (HH24-25) de (Şekil 1D bakınız). </li></ol></li></ol></li><li> İfade oluşturur: <ol><li> reaktifler kullanılarak plazmid DNA ve bir ticari olarak temin edilebilir preparat kitinin üretici tarafından yapılan protokoller hazırlayın. hazırlama son aşamasında, 500 ul TE (Tris-EDTA), 1.5 ml tüp içine kitte sağlanan tampon içine DNA elüte. </li><li> Etanol 3 M sodyum asetat ve 50 ul ve boru 100,% 1 mL etanol ekleyerek konsantre DNA hızlandırabilir. -20 ° CO / N tüp yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 14,000 rpm&#39;de 30 dakika boyunca tüp santrifüjleyin. Süpernatantı ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca pelet hava-kurutun. ~ 4 ug / ul konsantrasyon elde edilmelidir, 15 ul TE tampon maddesi içinde pelet, eritin. Not: Burada kullanılan kontrol tanım yapılan bir tavuk β-aktin promotör tarafından yönlendirilen PMES IRES-GFP 10, ya da pCI-H2B-IRES-RFP vardır <sCMV promoteri tarafından tahrik edilir&gt; 10 kadar. </li></ol></li></ol> Ovo Mikro elektroporasyon ve Ovo Hücre Proliferasyon Tahlili 2 tavuk <ol><li> İfade Construct ve Mikro-elektroporasyon Ovo Mikro enjeksiyon: <ol><li> 2.5 x 2.5 mm Kutu Platin Isıtma Filament için aşağıdaki optimize parametreler ile bir mikro-pipet çektirmenin kullanarak ince iğneler içine cam kılcal tüpler çekin: Basınç = 500, Isı = 600 ° C, Velocity = 105 ve Zaman = 64 çekin = 150 milisaniye (bakınız Tablo 1). </li><li> Sol- ve mikroskop yan Sağ el mikro-manipülatör aşamalarında kurmak (Şekil 1A bakınız). Sağ el mikro-manipülatör cam kılcal iğne ve Solaklar mikro-manipülatör elektrotlar (Şekil 1A) tutar tutar. </li><li> keserek mikro-enjeksiyon için ince çekti cam kapiller iğne hazırlayınBir forseps ile iğne ucu mikroskop altında çalışırken. </li><li> Mikroskop altında çalışırken% 0.1 Hızlı Yeşil ile renklendirilmiş plazmid DNA 2.5 ul mikro-manipülatör kullanarak elle manuel olarak iğne doldurun. </li><li> (Şekil 1A bakınız) bir kalıp / yumurta tutma cihaz içinde yan yatan yumurta yerleştirin. Makas 19 (Şekil 1A) kullanarak yumurtanın üstünde bir yuvarlak pencere kesti. </li><li> Mikroskop altında çalışırken, dikkatle forseps kullanarak embriyo kaplayan iki membranlar açın. </li><li> Mikroskop altında çalışırken, elle mikro-manipülatör kullanarak ve mikro-elektro-sağ elinizi kullanarak mikro-enjeksiyon sağ kulak vezikül lümene plazmid DNA yaklaşık ~ 0.5 ul teslim. <ol><li> Aynı anda sol ışığımdır kullanırken bu yüzden, Sağ mikro-manipülatör (Şekil 1B-D) DNA ile sağ kulak vezikül lümen mikro-enjekte yapmakEmbriyonun baş aşaması E4 dips çünkü ga forcep, embriyonun baş sakinleştirmeye. Bu otik vezikül zarar verecektir çünkü, otik vezikül lümeni geçmiş mikro-enjekte etmeyin. </li><li> Hemen mikro-enjeksiyon sonrasında, mikroskop altında çalışırken, pozitif (anot) platin elektrot ön-ventral sağ kulak vezikül ve paralel olarak negatif 2 mm elektrot (katot) ile 2 mm yerleştirmek için Sol mikro-manipülatör kullanın 1 mm aralıklı (Şekil 1 C). 100 milisaniye süre ve 200 msn aralıkla 12 V 4 darbeleri sunun. sol kulak vezikül bir iç işlenmemiş kontrol olarak hizmet vermektedir. NOT: 1x PBS batırılmış bir pamuk uçlu çubukla electroporations arasında elektrotlar temizleyin. </li></ol></li></ol></li><li> Ovo Hücre Proliferasyon Tahlili: <ol><li> Hemen elektroporasyon sonra el bütün üzerine 50 ul Edu çözüm bırakarak 0.25 mg 50 ul ekleyin / ml edu 1x PBS içindeBir pipet kullanarak ovo embriyo. bant ile yumurta Seal ve 18 için inkübatör dönmek - 96 saat. </li><li> ( &#39;Şekil 1 EE bakınız) standart floresan mikroskop kullanılarak 24 saat - dikkatle bandı çıkarın ve 18 sonrası otik vezikül içinde floresan GFP veya RFP sinyali embriyolar kontrol edin. Floresan sinyal varsa, ( &#39;&#39; Şekil 1 FP bakınız) bu noktada analizler için embriyolar hasat veya bant ile yeniden mühürlemek ve hasat için inkübatör iade ve sonraki aşamalarda analiz eder. NOT: - 7 saat elektroporasyon 10 sonra PMES IRES-GFP yapı ile GFP sinyali Anlatım 6 açıktır. </li></ol></li></ol> Yerinde hibridizasyon ve immünohistokimya RNA 3. Embriyo Hasat ve Doku İşleme <ol><li> forseps kullanarak embriyolar hasat. Soğuk 1x PBS embriyo durulayın. onun boynundan başını keserek, embriyoların başkanları kaldır4 ° C &#39;de% 4 paraformaldehid O / N olarak kafaları forseps kullanılarak ve yerleştirin. kafasının içinde% 4 paraformaldehit girmesine izin vermek üzere, bir forsepsle kullanarak beyin delikler. </li><li> 4 ° C&#39;de O / N (1X PBS)% 30 sukroz içinde kafaları kurutmak. </li><li> kuru buz ve metilbütan (2-metilbütan) içindeki bir bulamacı içinde hızlı dondurulması ile kriyokoruyucu ortam içinde kafa monte edin. Alternatif olarak, hızlı sıvı azot ile kriyokoruyucu ortamda başlarını dondurma. -80 ° C de monte kafaları saklayın. </li><li> 12 mikron kalınlığında doku bölüme başlarını cryosection ve superfrosted mikroskop cam slaytlar üzerine tüm iç kulak içeren doku bölümleri toplamak. </li><li> Daha önce 4,21 açıklandığı gibi in situ hibridizasyon ve immünohistokimya standart RNA gerçekleştirin ve kit üreticisi tarafından sağlanan protokol izlenerek edu hücre çoğalması için analiz edin. NOT: Saç hücreleri tavşan poliklonal kullanılarak tespit edilebilir a-MyosinVIIa (Myo7a) birtibody (1: 1,000, Proteus Biosciences) ile ve floresan etiketli ikincil antikor (1: 250, keçi anti-tavşan AlexaFluor 488; Invitrogen). </li></ol> 4. Görüntü Yakalama ve İşleme <ol><li> dijital görüntüleme ekipmanları ile görüntü alabilir. Standart bir floresan mikroskop ve (5x gelen büyütme 40x arasında değişen) standart geniş alan mikroskobu kullanarak in situ sonuçları ile görüntü immünhistokimya sonuçları. </li><li> Görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri işlemek. </li></ol>

<ol><li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Patterning of the mammalian cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).</li>
<li>Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Development of the inner ear.</a> Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).</li>
<li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134, 4405-4415 (2007).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132, 1687-1697 (2005).</li>
<li>Katayama, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+production+in+the+chicken+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Cell production in the chicken cochlea.</a> The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).</li>
<li>Cotanche, D. A., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+stereociliary+bundles+in+the+cochlear+duct+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos.</a> Brain Res. 318, 181-193 (1984).</li>
<li>Alsina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+is+required+for+determination+of+otic+neuroblasts+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo.</a> Developmental biology. 267, 119-134 (2004).</li>
<li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> PLoS genetics. 4, e1000050(2008).</li>
<li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).</li>
<li>Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+gene+transfer+and+in+ovo+electroporation+of+the+otic+placode%3A+a+powerful+and+versatile+approach+for+investigating+embryonic+development+and+regeneration+of+the+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear.</a> Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).</li>
<li>Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id+gene+regulation+and+function+in+the+prosensory+domains+of+the+chicken+inner+ear%3A+a+link+between+Bmp+signaling+and+Atoh1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).</li>
<li>Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+Sox2+and+Sox3+in+neuronal+and+sensory+progenitors+of+the+developing+inner+ear+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick.</a> The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).</li>
<li>Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prosensory+function+of+Sox2+in+the+chicken+inner+ear+relies+on+the+direct+regulation+of+Atoh1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1.</a> PLoS One. 7, 30871(2012).</li>
<li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+neural+crest+cell+alphaN-catenin+impacts+chick+trigeminal+ganglia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation.</a> Developmental biology. 392, 295-307 (2014).</li>
<li>Kumar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-small+cell+lung+tumor+development+by+the+let-7+microRNA+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).</li>
<li>Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+regulates+development+and+transdifferentiation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+basilar+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla.</a> Hearing research. 289, 27-39 (2012).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e306(2007).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+in+the+developing+vestibular+and+auditory+sensory+organs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).</li>
<li>Bell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+segregation+of+auditory+and+vestibular+neurons+in+the+otic+placode%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode.</a> Developmental biology. 322, 109-120 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Ovo mikro-elektroporasyon burada anlatılan yöntem geliştirilmesi işitsel organ haline gen transferi için optimize edilmiştir. Tipik olarak, gen fonksiyonu / ifade işlemek için kullanılan plazmid DNA bazlı ekspresyon vektörleri ile uyumludur. E4 elektroporasyon zamanlaması işitsel organında HC geliştirme odaklanmak araştırmalar için en uygunudur. En kritik adımlar iğne ile çok derin gidiyor ve otik vezikül zarar vermeden otik vezikül lümenine DNA mikro-enjekte otik vezikül ön-ventral alanı tarafından içine DNA h...

Memeli ve kuş işitsel duyu organı arasındaki morfoloji farklılıkları ve hücresel desenlendirme rağmen, moleküler faktörler ve duyusal HC geliştirmeden sorumlu yollar evrimsel 1-3 korunmuş olduğu düşünülmektedir. işitsel HCS ve çevrelerindeki SC&#39;ler evler baziler papilla, iç kulak otocyst outpocketing olarak gelişir. Erken HC ve SC atalarıdır bir havuz otik plakod / otik fincan sinir-duyu yetkili etki alanı (NSDAP) içinde belirtilir. Kader-haritalama verileri nöronal ve duyusal soylar bağlantılı ve otik fincan antero-ventral bölgesinde bulunan ya da fareler ve tavuk 4,5 yılında otocyst NSDAP kaynaklanan olduğunu kanıtlar sunmaktadır. İlk olarak, Nöroblastlar sonunda işitsel ve vestibüler ganglionlar bölünmüş işitsel-vestibüler ganglion, nöronlar yol vermek için NSDAP dan tabakalara. Bu nöronlar beyin sapı iç kulak ve çekirdeklerin duyusal HCS innerve. th hücreleriNSDAP kalır at mekano nakleden duyusal HCS ve bunların ilişkili AVM oluşan işitsel duyu organı dahil olmak üzere çeşitli duyusal yamalar, yol düşünülmektedir. civciv ve sıçangil hem de, işitme organı duyusal progenitör hücre döngüsü çıkış ve HC farklılaşma degradeler karşı meydana gelir. Civciv, işitsel progenitör hücre döngüsü çıkış ~ E5 etrafında başlar ve tabandan tepeye doğru ilerler ve merkezden çevreye 6. Bir gün sonra, HC farklılaşma apeks başlar ve tabanına 7 ilerler. Fonksiyonel mekanizmalar karmaşık ameliyatları gerektirir diğer model sistemler uterus, embriyolar manipüle aksine ovo göreli kolaylıkla araştırılabilir olarak tavuk iç kulak gelişiminin incelenmesi birçok teknik avantajlar sağlamaktadır. Burada tarif edilen yöntem, olası Basila ilgi genleri hedef ovo mikro elektroporasyon kullananÖzellikle E4 otik vezikül r papilla alanı ön-ventral. Ovo Elektroporasyon iyi kurulmuş ve genel olarak 8-14 kullanılan bir tekniktir. Elektroporasyon tekniği ilkesi nükleotidleri (örneğin, plazmid DNA, sentetik DNA ya da RNA oligonükleotidleri) negatif yüklü gerçeğine dayanır. DNA, ilgi konusu doku içine enjekte edilir. bir elektrik akımı doku boyunca yerleştirildiğinde, mevcut hücre duvarlarının geçici gözenekleri açılır ve negatif yüklü DNA, pozitif elektrot (anot) doğru akarken, DNA alımı için izin verir. kazanç fonksiyon-deneyleri için, ilgi konusu gen genellikle yeşil flüoresan protein (GFP) veya kırmızı flöresanlı proteindir (RFP) için uygun ekspresyon kasetleri içeren ifade plazmidleri alt klonlanır. kayıp-fonksiyon deneyleri plazmid tabanlı dominant negatif represör yapıları veya RNAi veya morfolino yapıları için c vardırommonly 15,16 kullanılır. Bazlı plazmid tipik mikroRNA (MiRNA) işlevi miRNA&#39;lar sünger yapıları, inhibe etmek için, 17 kullanılabilir. Ovo mikro elektroporasyon yöntemi kolayca tüm embriyo edu ekleyerek ovo hücre çoğalma tahlilinde birleştirilebilir burada tarif edilen yöntem olup, işitme organı proliferasyonu ve farklılaşmasını kontrol eden molekül mekanizmalarının incelenmesi için izin verir. elektroporasyon ve Edu eklenmesi bir gün işitsel organında hücre döngüsü çıkış başlangıcından önce olduğu otik vezikül içinde E4 gerçekleştirilir. tipik olarak 18 gerçekleştirilen bir işitsel organ Analizi - (HC farklılaşma sırasında) E5 (duyusal progenitör hücre döngüsü çıkış başlangıcı), E6 (HC farklılaşma başlangıcı) ve E7 elektroporasyon sonra 96 ​​saat; ve daha sonra ~ E9 (HC farklılaşma sonuna) kadar. Gen transferi bu elektroporasyon yöntemi olup, ~ 4 gün yaklaşık süren geçicidir becauSE ilgili genler, genomu içine entegre değildir, ancak yöntem, Tol2-aracılı gen transferi 11 gibi genomuna entegre yeteneğine sahip yapmak için, uygun plazmid DNA bazlı ekspresyon vektörleri ile kullanılmak için uygundur. Bu yöntemle sağlam GFP veya RFP ifade sürer ~ ile sinyalleri işaret solmaya, ancak işitsel organ karmaşık gelişimini incelemek için geniş bir zaman pencere sağlamak sonra kokleadaki 4 gün. Ovo gen aktarım yöntemi Bu roman ve özellikle işitme organı HC geliştirme odaklanmak araştırmalar için en uygun olan E4 olası işitsel organı, hedef sağlar. Bu çok daha genç gelişim aşamalarında 11,12 ya da in vitro baziler papilla eksplant kültürleri 18 kullanımı ile karşılaştırıldığında en elektroporasyona alternatif yöntemler, iyi bir yer.

<table><tbody><tr><td>Steril 1x PBS pH 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil FCF Tozu</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU Toz</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Görüntüleme Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plazmid Midi Kiti (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&nbsp;</td><td>BTX Harvard Aparatı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muz - Micrograbber Kablo Kiti</td><td>BTX Harvard Aparatı</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Sağ El ve Solak Mikromanipülatörler</td><td>Dünya Hassas Aletler A.Ş.</td><td>M3301R ve M3301L</td><td></td></tr><tr><td>İki adet 12 mm Manyetik Tutma Cihazı Aşamaları, 7 inç dikey direklerle</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Metal Çelik Taban Plakası 12x24 inç</td><td>Dünya Hassas Aletler A.Ş.</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Yumurta Makasları 12 cm uzunluğunda kavisli, 12 mm ekstra ince bıçaklar; Bahar Makas</td><td>Dünyası Hassas Aletler A.Ş. &nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>İğneleri çekmek için Micropippette Çektirme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2.5x2.5 mm Kutu Platin Isıtma Filamenti</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam Kılcal Tüpler / İğneler / Elyaf Yok / Borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Cam Şırınga 100 & mu; l</td><td>Hamilton</td><td>80601 Model 710LT</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Cam Şırınga için Mineral Yağ (Ağır)</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>Cam Şırınga ve Cam Kapiler İğneleri bağlamak için Polietilen Boru / Toksik Olmayan</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td> <td>427420 Intramedic Clay Adams Marka</td><td></td></tr><tr><td>3 cc Tek Kullanımlık Şırıngalar</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık 21 Gauge İğneler</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Bir çift 2 mm Platin</td><td>Elektrot Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>Elektrot Tutucu</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>Bir çift Dumont ince forseps numara 5</td><td>Güzel Bilim Araçları (FST)Yumurtaları</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>kapatmak için mat kaplama görünmez bantOfis Deposu</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk Uçlu Çubuklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Steril filtre uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tavuk İşitsel organ gen transferi tarafından<em&gt; ovo olarak</em&gt; mikro-elektroporasyon

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Tavuk embriyo gen fonksiyonunun manipülasyonlar ovo göreli kolaylıkla yapılabilir embriyonik gelişme çalışmak için ideal bir model sistemleridir. iç kulak işitme duyu organı duymak yeteneğimizi için kritik öneme sahiptir. Bu destek hücreleri (SC&#39;ler) glial gibi son derece uzmanlaşmış duyusal (HCS) mekano nakleden saç hücrelerden oluşur epiteli ve çevresindeki evler. Işitsel organlarda yapısal farklılıklara rağmen, işitsel organ gelişimini düzenleyen moleküler mekanizmalar evrimsel memeliler ve kuşların arasında muhafaza edilir ovo elektroporasyon E1 erken aşamalarında büyük ölçüde sınırlıdır -. E3. Nedeniyle E5 işitsel organ göreli geç gelişmesine, E3 geçmiş ovo elektroporasyon ile işitsel organın manipülasyonlar nedeniyle daha sonraki aşamalarda tavuk embriyo ileri gelişimine zordur. Burada sunulan yöntem de ilgi genleri hedef için geçici bir gen transferi yöntemisahne E4 - ovo mikro-elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan tavuk işitsel duyu organ E4.5. Bu yöntem, gain- ve-kaybı fonksiyonları bilinen plazmid DNA bazlı ekspresyon vektörleri ile uygulanabilir ve en bütün embriyoya edu (5-etinil-2&#39;-deoksiuridin) eklenerek ovo hücre çoğalma tahlilinde birleştirilebilir elektroporasyon süresi. yeşil ya da kırmızı floresan proteininin (GFP veya RFP) ifade plazmaları kullanımı deneyci hızla elektroporasyon başarıyla gelişen iç kulağın işitme bölümünü hedef belirlemek için izin verir. Bu yöntem yazıda, GFP Electroporated örneklerin temsili örnekleri gösterilmiştir; elektroporasyon sonra 96 saat ve işitsel organ yanlısı duyusal alana GFP hedefleyen in situ hibridizasyon RNA tarafından doğrulandı - embriyolar 18 toplandı. yöntemi kağıt da CellProlif analiz etmek edu analog timidin kullanımı için optimize edilmiş bir protokol sağlardurmasýna; immüno-etiketlenmesi birleştiren edu Click kimyası eğitsel göre hücre çoğalma tahlilinin bir örneği temin edilmiştir.

yeşil floresan protein içeren bu yöntem, kağıt plazmid DNA içinde (GFP) ifade kasetleri ~ bir sonuçta 12 V ve 4 100 milisaniye darbe süresi ile bakliyat ve 200 milisaniye aralıklarla optimize parametreleri ile gelişmekte olan tavuk baziler papilla (BP) içine hedef aldı % 50 embriyo sağkalım oranı ve BP içine hedefleme plazmid-DNA etkinliği. (Beyaz ok Şekil 1, EE &#39;) ve GFP tanımı bir süre boyunca takip edilebilir embriyoların geliştirilmesinde ana GFP tanımının Flores...

İşitme organı işitmeye aracılık eder. Burada, gelişmekte olan tavuk işitme organında işitsel progenitör hücre proliferasyonu ve farklılaşmasını incelemek için optimize edilmiş modifiye edilmiş bir in ovo mikro-elektroporasyon yöntemi sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Bu yöntemin genel amacı, dördüncü embriyonik günden itibaren gelişmekte olan tavuk işitme organında genetik manipülasyonlar gerçekleştirmektir. Tavuk embriyosunun ileri gelişim aşamalarıyla çalışmanın zorluğu nedeniyle bu yöntem büyük önem taşımaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık in utero cerrahiler gerektiren diğer tekniklere kıyasla, gelişmekte olan işitme organını in ovo olarak nispeten kolay bir şekilde hedeflemesidir.Bu yöntem, işitsel duyusal gelişime dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Buna, duyusal progenitör hücre proliferasyonunun ve herediter farklılaşmanın uzamsal ve zamansal örüntülerinin nasıl koordine edildiği dahildir. Bu prosedüre başlamak için, sağ el mikromanipülatörüne yerleştirilen cam şırıngaya bağlı tüpü kullanarak cam kapiler iğneyi takın ve elektrotları sol el mikromanipülatörüne yerleştirin.Mikroskop altında, bir pens yardımıyla iğne ucunu kesin. Ardından, %0,1 fast green ile renklendirilmiş 2,5 µL plazma DNA'sını bir kaba yerleştirin. Sağ el mikro manipülatörüne bağlı şırınganın pistonunu kullanarak iğneyi plazma DNA'sı ile doldurun.Bir yumurtayı yan tarafı üzerine gelecek şekilde bir tutucuya yerleştirin. Ardından, makas kullanarak yumurtanın üst kısmında yuvarlak bir pencere açın. Bundan sonra, yumurtayı mikroskobun altındaki tutucuya yerleştirin.Sağ otik vezikülü açığa çıkarmak için embriyonun üzerini örten iki membranı bir penset yardımıyla dikkatlice açın. Sol el ile penset kullanarak embriyonun baş kısmını stabilize ederken, sağ el mikromanipülatörü ile yaklaşık 0,5 µL plazma DNA'sı iletin. Otik vezikül lümeninin ötesine enjeksiyon yapmamaya dikkat edin çünkü bu durum otik veziküle zarar verecektir.Otik veziküle zarar vermeden lümene DNA mikroenjeksiyonu yapmak kritiktir ve her iki elin kullanımını gerektirir. Mikroenjeksiyondan hemen sonra, sol el mikromanipülatörünü kullanarak iki milimetrelik platin pozitif ve negatif elektrot setini sağ otik vezikülün ön ventral kısmına yerleştirin ve elektroporatörü çalıştırarak 12 volt değerinde dört darbe uygulayın. Elektrotların, varsayılan işitme organının ön ventral bölgesine hassas bir şekilde yerleştirilmesi önemlidir ve gelişmekte olan işitme organının hedeflenmesini sağlar.Elektroporasyondan hemen sonra, 50 µL EdU'yu ovo ortamındaki embriyonun tamamına ekleyin. Ardından, yumurtayı bantla mühürleyin. Manipüle edilmiş ve mühürlenmiş tüm yumurtaları 18 ila 96 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.18 ila 24 saat sonra bandı dikkatlice çıkarın. Standart bir floresan mikroskobu kullanarak, otik vezikül içindeki floresan GFP veya RFP sinyallerini kontrol edin. Floresan sinyal mevcutsa, embriyoları analizler için toplayın veya bandla tekrar mühürleyip sonraki aşamalarda toplama ve analizler yapmak üzere inkübatöre geri yerleştirin.Elektroporasyonun, gelişmekte olan iç kulağın işitsel kısmını başarıyla hedefleyip hedeflemediğini belirlemek için RNA in situ hibridizasyonu kullanılmıştır. Gelişmekte olan BP içinde, duyusal öncül hücreler Sox2 ve Lunatic Fringe ekspresyonları ile tanımlanmıştır. Bu görüntüler, gelişmekte olan BP'nin taban ve apeksindeki tüm duyusal öncül hücrelerin başarıyla hedeflendiğini ve elektroporasyondan 68 saat sonra GFP eksprese ettiğini göstermektedir.Ayrıca, GFP, duyusal olmayan epitel hücrelerinde ve Neurod1 ekspresyonu ile işaretlenen işitsel ganglionda, duyusal alanın dışında eksprese edildi. Duyusal progenitörlerin proliferatif davranışını belirlemek için, bir timidin analoğu olan EdU, E4 aşamasındaki elektroporasyon sırasında eklendi ve dört gün sonra, gelişmekte olan BP'deki EdU inklüzyonu doku kesitlerinde analiz edildi. Gelişmekte olan BP'deki farklılaşan tüy hücrelerini tanımlamak için tüy hücresine özgü protein Myosin7a'ya yönelik immünboyama kullanıldı. BP'nin apikal kısmında, Myo7a pozitif tüy hücrelerinin sıklıkla EdU pozitif olduğu görüldü.Bazda ise sadece birkaç Myo7a pozitif tüy hücresi EdU ile işaretlenmişti; bu durum, E dört aşamasındaki EdU ilavesi sırasında bazdaki duyusal progenitörlerin büyük ölçüde postmitotik olduğunu göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik yumurta başına beş ila sekiz dakikada tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, embriyoların sağkalımını sağlamak için taze hazırlanmış ve steril reaktiflerin kullanılması önemlidir.Bu prosedürün ardından, yöntem parametreleri; vestibüler organların gelişimi ve iç kulak nörojenezi gibi gelişmekte olan iç kulaktaki diğer fenomenleri incelemek için değiştirilebilir. Bu teknik, iç kulak alanındaki araştırmacıların, nispeten geç gelişen tavuk işitme organını embriyonik dördüncü günden itibaren spesifik olarak incelemelerinin önünü açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, tavuk embriyosunun nasıl uygun şekilde yönetileceği, mikroenjeksiyon ve elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceği ve in ovo hücre proliferasyon analizinin nasıl yürütüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Ovo elektroporasyon Civciv kuş embriyonun genetik manipülasyon sağlayan bir tekniktir. Bu tekniğin yaygın uygulamalar genlerin fonksiyonel analiz ve olası artırıcı unsurları içerir. Bu video HH 10 civciv embriyosunda nöral tüp elektroporasyon göstermektedir. Enjeksiyon tekniği ve uygun yumurta taşıma tartışılmıştır.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir...

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için...

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem...

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Daha sonra kuluçka dönemlerinde (Hamburger ve Hamilton evresi (SS) 22 yaşından büyük) az tavuk embriyosu gen transferi yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, dezavantajların...

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporasyon

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

İn ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikro-RNA dizilerinin civciv embriyolarına sokulmasını ve genomik entegrasyonunu içeren yeni bir fonksiyon kaybı yaklaşımı geliştirdik. Bu teknik, geliştirme sırasında gen fonksiyonu çalışmaları için sağlam ve kararlı bir gen yıkım metodolojisi sağlar.

Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Ovo elektroporasyonunu kullanarak, devre montajının ayrı dönemlerinde kırılgan X mental retardasyon proteininin hücre grubuna özgü bir nakavtını sağlamak için tavuk embriyolarındaki işitsel iç kulağı ve koklear çekirdeği seçici olarak transfekte etmek için bir yöntem geliştirdik.

In Ovo Electroporation tarafından İşitsel Bir Devrede Kırılgan X Mental Retardasyon Proteininin Hücre Otonom Fonksiyonunun Diseksiyonu

Öğrenin, gelişen tavuk işitsel organında genetik manipülasyon için modifiye edilmiş in ovo mikro-elektroporasyon tekniğini. Bu yöntem, embriyonik dördüncü günden itibaren işitsel progenitör hücrelerinin proliferasyonunu ve farklılaşmasını incelemeyi kolaylaştırır.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından

Daha fazla video keşfet