Name: Anjiyotensin II Reseptör lokalize Görselleştirme için Reseptör Otoradyografi Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Öğrenin, reseptör otoradyografi yöntemiyle sıçan beyninde Anjiyotensin II reseptörlerinin lokalizasyonunu ve niceliksel analizini nasıl yapılır. Bu teknik, davranış ve kardiyovasküler fonksiyon üzerindeki etkileri anlamak için fonksiyonel reseptörleri yüksek özgüllükle tanımlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH Grant HL-113905 tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma için yapılan tüm hayvan prosedürleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyum içinde Nova Southeastern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi, 8 inci Edition (Ulusal Akademiler Press, Washington, DC 2011 ). Reseptör Otoradyografi 1. hazırlanması Doku Bölümler <ol><li> kurban üzerine, hasat taze beyin dokuları ve alüminyum folyo ve yerinde sarın -20 ° C derin dondurucuda en kısa sürede. 20 ° C derin dondurucu - Doğru şekli korumak kafatası içini taklit eden bir beyin kalıp içinde beyinleri yerleştirmek için, alüminyum folyo ve yerde sarın. 30 dakika sonra, bir yerde yapışmalı dondurucu saklama torbasında doku ve uzun süreli depolama için -80 ° C derin dondurucuda taşıyın. <ol><li> -80 -10 ° C ve -18 ° C maksimum minimum ayarlanmış bir kriostada C derin dondurucuda ve transferi ° önlemek için çözülme ilgi taze dondurulmuş doku örneği elde edin. </li&gt; <li> doku üzerine numune, sadece ortam içine numunenin çok küçük bir kısmını gömme bir glikol ve reçine-tabanlı gömme ortamı ile monte yerleştirin. beyin için, beyin koronal planda kesit etkinleştirmek için dikey olarak monte edilir. </li></ol></li><li> Doku cryostat içinde mikrotom üzerine monte ve sıkıca yerinde sıkın yerleştirin. dorso-ventral eksen dik yaygın olarak kullanılan beyin atlasları olduğunu aynı antero-Postero koordinatlarda olan beynin sol ve sağ tarafını sağlamak ve. </li><li> İstenen kalınlıkta kesme başlar (20 um tavsiye edilir) ve slayt alanı daha büyük bir yüzey alanına sahip bir dikey yönde mikroskop lamı üzerine bölümleri monte eritin. Slaytlar ilk seti (Şekil 3) 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 ve 1-5 etiketli, yani beş sıralı setleri Slaytlarınıza bölümleri toplayın. </li><li> bölümleri ile slaytlar bir dizi doldurduktan sonra, en fazla 1 saat boyunca kuru hava slaytlar, sonra sli yer izin-20 ° C&#39;de bir plastik slayt kendi kendine kapanan dondurucu saklama torbasında kutu ve mağaza des. </li></ol> 2. Alıcı Otoradyografi UYARI: Radyoaktivite. radyoaktivite işlemek için koruyucu kıyafetleri kullanın. Bertaraf kurulması bağımlı olduğunu, ve düzgün (yarım-life 60 gün) çürümeye ya da sertifikalı firma tarafından alınmayı kurallara uymak zorundadır. <ol><li> (Şekil 5) -20 ° C dondurucu ilgi &quot;-2&quot; &quot;-1&quot; ve slaytlar çıkarın ve slayt kulpları içine monte edin. Birlikte &#39;non-spesifik&#39; tedavisi için &quot;-1&quot; slaytlar ve toplam &#39;tedavi için &quot;-2&quot; slaytlar monte edin. Bağlama kavanoz yalnızca 10 içerir, bakiyeleri (Tablo 1) &#39;Spesifik olmayan &quot;kavanoz 2R antagonisti, PD123319, bir 10 uM nihai konsantrasyonlar içerir ve deney ortamı tamponunda, 1R antagonisti, (AM5) bir losartan AM5 mikron PD123319. </li><li> slayt tersçeneler, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca AM5 35-40 ml dolu ön inkübasyon Coplin kavanoz içine slaytlar ve ilgili inhibitörleri yer. 4 dakika aralıklarla öncesi inkübasyon banyosu içerisinde müteakip setleri başlatın. </li><li> Hemen oda 60-90 dakika boyunca 10 AM5 ml artı ilgili inhibitörleri ile (Şekil 4&#39;te hesaplanan) 125I-sı-Ang II önceden tespit edilmiş bir konsantrasyonunu ihtiva eden inkübasyon kayıcı postaları ön inkübasyon çözeltisinden slaytlar aktarmak sıcaklık. Yeterli radyoligand varsa, 10 slaytlar modifiye slayt kulpları (arka arkaya) yerleştirilir ve Coplin kavanozlarda 125 I-SI-Ang II ile inkübe edilebilir. </li><li> Talep (gerekirse), benek, yavaşça, iki ayrı kaplar içinde damıtılmış su, 400 ml 1-2 saniye boyunca döndürülerek yıkayın kayıcı kılıf içine geri çekilir. </li><li> Tam 1 dakika her (Şekil 4 &lt;gösterildiği gibi için AM5 35-40 ml içeren dört Coplin kavanoz içine sırayla slaytlar aktarın/ Strong&gt; &#39;). </li><li> Son 1 dakika durulama sonra, yavaşça buzla soğutulmuş damıtılmış su dört değişiklikler 1-2 saniye için bölümler girdap. </li><li> -Darbe kurumaya soğuk hava ile slaytlar (Dikkat: sıcak hava radyoaktif bileşik uçucu hale) 4 dakika (Şekil 5) için farklı açılardan kurmak dört saç kurutma makinesi kullanarak, tüm bölümleri kuruyana kadar, daha sonra bir kağıt havlu üzerine koyun. </li><li> Dağı dokular çift taraflı bant kullanarak X-ışını filmine apozisyon bir karton üzerine yukarı bakacak şekilde kayar. </li><li> En az bir Dağı, her karton üzerine 125 İyot kalibrasyon standart slayt (Şekil 6). Not: Kalibrasyon standartları iyice beyin kesitleri ile aynı kalınlıkta kesildi ve mikroskop üzerine çözülme monte kriyostat olan 1 mL&#39;lik bir tüberkülin şırınga içinde santrifüjleme ile sıkıştırılmış bir fenol halkası ihtiva eden bir bileşik, bağlanmış 125 iyot ile karıştırılmış, beyin macun oluşur slaytlar. Alternatif olarak, 125I kalibrasyon standartları20 um kalınlığında kesitler plastik reçine ticari olarak elde edilebilir. Bu standartlarda plastik reçine kısmen böyle% 40 ~ bir doku denklik kalibrasyon hesaba gerektiğini radyasyondan filmi korur. </li></ol> 3. Film Pozlama ve Kalkınma <ol><li> bir kayış-arka X-ışını kaset ve otoradyografi film ile bir karanlık oda geçin. Kaseti açın ve içindeki slaytlar (Şekil 6) ile karton yerleştirin. <ol><li> Işıkları kapatın ve Karanlıkodanızda açın. Dikkatle, X-Ray film kutusunu açmak bir filmi çıkarın ve kaset slaytlar üstünde (sağ alt köşede tırtıklı kenar) filmi parlak tarafı yukarı yerleştirin. Dikkatle kaseti kapatın ve hafif (Şekil 6) dışarı mühürlemek için kilit çubuklarını bükün. -20 ° C&#39;de birkaç gün ila birkaç hafta için slaytlar Açığa. </li></ol></li><li> karanlık odada, kaseti açın ve filmin gelişen proc devamess. <ol><li> ardışık tepsilerine slaytlar yerleştirin; 2 dakika için geliştirici, 5 dakika için% 5 buzlu asetik 30 saniye için asit ve fixer içeren su. filmler 20 dakika akan su ile bir tepsiye yerleştirilir, daha sonra en fazla 10 saniye boyunca Photoflo yerleştirilir ve kapattı. Düşük bağlama ile alanlardan ölçülebilir sinyalleri elde etmek için yeterince uzun, ama çok uzun zaman yüksek bağlayıcı olduğu bölgelerde filmini doyurmak için: maruziyet süresi ampirik olarak belirlenir ve farklı pozlama süreleri ile birden filmleri içerebilir: Not. kabul edilebilir riskler elde edildikten sonra, bir sonraki adıma geçin. </li></ol></li></ol> 4. Histoloji <ol><li> Tionin leke ve boyama reaktifleri (Tablo 2, Şekil 7) hazırlayın. <ol><li> Slayt rafa &quot;-3&quot; slaytlar yerleştirin ve 1 dakika boyunca iyonu giderilmiş su ile başlayarak sıralı transferi, daha sonra 10 dakika boyunca tionin leke çözeltisi Deion halinde üç dip ardındanözelleşmiş suları ve deiyonize su içinde bir 30 saniye yıkama. </li><li> aşağıdaki gibi su takiben, etanol yıkar içine slayt raf yerleştirin; 1 dakika her biri için,% 100 iki etanol yıkaması, ardından% 50,% 70, ve 30 saniye süreyle% 90. Son olarak, 3 dakika boyunca iksilen içine kayar ızgarayı daha sonra 5 dakika için bir ikinci ksilen çözeltisine aktarılmaz. </li></ol></li><li> Son iksilen banyosundan her seferinde bir slayt çıkarın ve organik çözücü montaj orta bir reçine ile sürgünün üst kenarını kapsayan ve slayt üzerine 24 mm x 60 mm&#39;lik bir örtücü cam yerleştirin. ~ 48 saat slaytlar için yeterince kurumasını bekleyin ve sonra 2.400 dpi gri bilgisayara tarayın. </li></ol> 5. Densitometrik Görüntü Analizi <ol><li> sol alt köşesinde tırtıklı kenarı aşağı filmin parlak tarafı yerleştirin ve görüntüleme sistemi bilgisayarda herhangi bir bozulma olmadan film yoğunluğu bilgisini iletebilen özel bir tarayıcı kullanarak tarayın. </li><li> özel görüntüleme sys açtem ve kullanmak kalibrasyon çubukları filmin görüntüleri (- 12 Şekil 9) gelecekteki dansitometrik analizi için kalibrasyon standartları oluşturmak. </li><li> Bir şablon kurulması veya ampirik ilgi alanları özetleyen biri tarafından ilgi ölçüsü alanları. Veriler, kontrol ya da vahşi tip (bölümü) ve bölge ya da toplandı ve film göre ayrılır. (Şekil 9) ölçümlerde yoğunluğu (fmol / g), tarama alanı ve toplam hedef alanı da kapsayacak şekilde emin olun. <ol><li> Ilgi bölgesi vurgulayarak parametreleri (Şekil 10) arasında düştüğü temin ederek tarama alanı çubukları ayarlayın. </li><li> Bir e-tabloya İhracat verileri (Tablo 4). , Yoğunluk çarpı toplam hedef alan çarpın o belirli bir alanın bağlama değerini elde etmek için tarama alanının bölün. Bu ölçülen tüm değerlere tamamlandıktan sonra, seçici bağlantı p vermek üzere toplam oluşturulan spesifik olmayan substratkızıyorum. Ortalamalar, aynı zamanda bu değerleri için gerçekleştirilebilir. </li></ol></li></ol>

Robert Speth, anjiyotensin II reseptörlerine karşı antikorları ticari bir satıcıya lisansladı ve söz konusu antikorların satışından telif ücreti alıyor. Diğer yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Açıklanan protokol, bir kemirgen beyin önce hasat edilmiş ve -80 ° C&#39;de saklandı koronal bölümlerin bitişik bölümlerinde Radyoligandın bağlanması, toplam &quot;ve&quot; non-spesifik &quot;görselleştirme tanımlar ve hemen hemen her dokuya kolayca uygulanabilir olabilir anatomik reseptörlere veya radyoligand bağlanma sitelerinin diferansiyel miktarları görüntülemek altyapılarını çözmüştür. protokolü kapsamında açıklanan prosedürler basit ve analiz sonuçlarını doğru yorumlamak için kritik öneme sahiptir. 20 um kalınlığ...

Kardiyovasküler hastalık 2011&#39;de 1 ABD&#39;de ölümlerin% 30&#39;undan fazlasını neden ABD&#39;de ölüm ve sakatlık, önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Amerikan Kalp Derneği en son istatistikler üç birden fazla kişi birine sahip olduğunu göstermektedir kardiyovasküler hastalık ya da daha fazla türü. Kardiyovasküler araştırmalar bu hastalığı anlamak karşı adımlar atmaya devam ediyor, ancak kuşaklar yaşlanıyor başlarken çabalarına devam etmesi zorunludur. Renin-anjiyotensin sistemi (RAS), esas (Şekil 1), 2-8, sempatik sinir sisteminin ateroskleroz, enflamasyon, sistemik vazokonstriksiyon ve aktivasyonunu teşvik ederek kalp-damar sistemi regülasyonunda önemli bir rol oynamaktadır. RAS tansiyon azalan böbrek jukstaglomerüler hücreleri yanıt olarak kan dolaşımına renin salgılayan aktive bir hormonal sistem, sympat arttıinfographie stimülasyon veya makula densa sodyum akışını azalmıştır. Renin anjiyotensin I (Ang I) &#39;in (karaciğerde sentezlenir) anjiyotensinojen metabolizması için önemlidir. Ang sonra anjiyotensin II (AngII), RAS ana efektör peptit oluşturmak için, birincil akciğer ve böbrekte, vasküler endotel hücrelerinin luminal tarafta, anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) tarafından ectoenzyme metabolize edilir. Ang II İki reseptör alt tipi aktive edebilen olduğu; (1 AT R) tip 1 reseptör ve (2 R AT) tip 2 reseptör, kardiyovasküler sistem düzenleyen hem de sıvı ve elektrolit homeostazisini korumak ve şimdi bilişsel işlev ve nörodejeneratif hastalığı etkilediği düşünülmektedir 8,9 işler. Yerel, beyin özel RAS bağımsız Ang II sentezlenmesi için bildirilmektedir. Beyinde, ön-madde proteini anjiyotensinojen bir renin-benzeri enzim 3 Ang I dönüştürülür astroglial 10 sentezlenir, muhtemelen prorenin prorenin reseptörüne bağlanan11, ve daha sonra, bol beyindeki 12 nöronların hücre dışı yüzeyi üzerinde eksprese edilir anjiyotensin dönüştürücü enzim ile Ang II ile dönüştürüldü. Ang II oluşturulan bu intrabrain 1 beyin ve kan yoluyla bulaşan Ang II izole edilmiştir 2 reseptörlerinde agonistidir. AT 1 R, önemli bir fizyolojik rol oynarken, daha iyi öncelikle kalp-damar sistemi ve böbrekler (Şekil 2) etkileyen, vücutta, patofizyoloji etkileri bilinmektedir. Ang II AT 1 R bağlandığında, bu vazokonstriksiyona neden olur; kan akışına direnci arttırarak ve kan basıncını yükselterek. Ayrıca, artan sodyum ve su retansiyonu giden, aldosteron ve vazopresinin sentez ve salgılanmasını teşvik eder. Bu etkiler, iskemik beyin tahribatı ve bilişsel bozuklukları uyarabilir ve Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ile bağlantılı olduğu ve diabetes, son zamanlarda tespit ediliyor yanı sıra, öğrenme ve hafıza 13-15 etkileyecek. Böbrekte jukstaglomerüler hücreler üzerinde 1 R AT ki RAS bir geribesleme döngüsü renin salgısı yoktur inhibe olduğunu. İlginçtir, AT 2 R genellikle 1 R AT, diğerleri 16-20 arasında vazodilatasyon, nörit büyümesini, aksonal rejenerasyon, anti-çoğalmasını ve cerebroprotection neden eylemi karşı düzenler. AT 2R, aynı zamanda, anti-hipertansiyon ve en son, anti-kanser ilaçları 21 için bir hedef olarak tanımlanmıştır. çeşitli dokularda içinde Ang II reseptörlerinin lokalizasyonu ve yoğunluğunu belirleme ve nasıl RAS belirli hastalıklarda oynadığı rolü ortaya çıkarmak yarayacak nicel dansitometrik reseptör otoradyografisim kullanarak çeşitli tedaviler ve hastalık durumlarında tarafından etkilenmektedir. Reseptör otoradyografi anjiyotensin I varlığını göstermek için etkili bir yöntem olarak 30 yıldan uzun bir süredir kullanılmaktadırI reseptörleri beyinde RAS diğer bileşenleri ve deneysel koşullara 22-34 çeşitli altında sıçan, fare, kobay, köpek ve insan ve diğer dokular. Beyin içinde Ang II reseptörlerini bulma önemi bir beyinde Ang II eylemleri fonksiyonel nöroanatomisini uygulayabilirsiniz olduğunu, örneğin, hipotalamus (PVN) paraventriküler çekirdeğinde AT 1 R varlığı Ang bir fonksiyonu göstermektedir beyindeki II vasopresin, oksitosin veya kortikotropin salan hormon (CRH) serbest ya da sempatik sinir sisteminin aktivasyonu uyarmak için. Bu nedenle, en 1 R bloke eden ilaçlar, beyin RAS aktivitesi ile ilişkili bu PVN aracılı bazı etkileri azaltabilir. Work in progress 1 R antagonistleri AT kullanımı CRH Travma Sonrası Stres Bozukluğu (TSSB) bağlı salınımını azaltmak ve TSSB belirtileri iyileştirmek düşündürmektedir (Hurt ve ark., Yayımlanmak üzere gönderilen). PVn, subfornicalOrgan (SFO), ve amigdala homeostasis, iştah / susuzluk, uyku, hafıza, duygusal tepki düzenleyen bilinir ve bu gösteri çalışmanın hedef alanlardır. Bu bölgeler, mikroskop lamları üzerinde beyin koronal kesitler toplanması ve Ang II reseptörleri için spesifik radyo-ligand ile birlikte spesifik inhibitörleri olan bölümleri muamele edilmesiyle incelendi. Bu çalışmada, önerilen satıcılar ile birlikte tüm maddeleri ve reaktif maddeler listelenmiş iyot-125 daha sonra mono- 125 I olarak saflaştırılan bir Ang II reseptör antagonisti, sarkosin 1, izolösin 8 Ang II (SI Ang II), radyolabel kullanılmıştır edilir Daha önce tarif edildiği gibi 35, HPLC yöntemleri kullanılarak -Si Ang II. Bu yüksek bir spesifik aktivitesi radyo-ligand kullanımı X-ışını filmine radyo-etiketli bölümleri maruz kaldıktan sonra, düşük, orta ve yüksek reseptör yoğunluğu alanlarının görülmesine olanak verir. İyot-125, belirli bir miktarda bilinen miktarlarda içeren beyin macun standartlarına filmi kalibre tarafındanBir alanda bağlanmış Ang II reseptörünün belirlenebilir. Deneysel çalışmalarda, deneysel konularda beyinlerinde bağlanması Ang II reseptör kontrol grubunun beyinlerinde olduğu mukayese edilebilir. Bu Ang II eylemleri genetik durum, fenotipik anormallik, hastalık durumunun veya ilaç tedavisine yanıt değişmiş olup olmadığını gösterebilir. Bu bilgi daha sonra RAS düzensizliklerine bağlı hastalıkların tedavisi için terapiler geliştirilmesi için uygulanabilir. Düşük anatomik çözünürlükte ancak siteler reseptör bağlanma tespit Alternatif teknikler, ayrışma sabiti olarak radyoligand bağlanma afinitesini belirlemek için bir konsantrasyon aralığı üzerinde radyo-ligand ile kuluçkalanır doku homojenatlarında türetilen doku zar müstahzarları kullanan analizler (KD bağlayıcı Çevrede doku) ve maksimum bağlanma kapasitesi (B Max). Burada açıklanan protokol 5 büyük işbirliği içine bölünebilirmponents: Reseptör Otoradyografi için Doku Bölümler hazırlanması; Reseptör Otoradyografi; Film Pozlama ve Gelişimi; Histoloji; VE DENSİTOMETRİK Görüntü Analizi.

<table><tbody><tr><td>500 ml Plastik Beher</td><td>Fisher</td><td>02-591-30</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm Lamel</td><td>Fisher</td><td>22-050-25</td><td></td></tr><tr><td>Otoradyografi Görüntüleme Filmi 24 mm x 30 cm</td><td>Carestream-Biomax MR Filmi</td><td>891-2560</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracin (Bacillus licheniformis'ten)</td><td>Sigma</td><td>B-0125</td><td></td></tr><tr><td>Karton Levha 8 x 11</td><td>Hilal İllüstrasyon Panosu #201</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Kavanozları</td><td>Fisher Scientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>Ticari saç kurutma makineleri</td><td>Conair</td><td>Model SD6X</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Kültür Tüpleri</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Disodyum tuzu, Dihidrat)</td><td>USB Corporation</td><td>15-699</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>16-100-210&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-19 Developer</td><td>Photographers Formulary, Inc. için Formüler Yedeği &nbsp;</td><td>01-0036</td><td></td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>Fisher</td><td>A38 SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Histoprep / OCT</td><td>Fisher</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>Film Sabitleyici</td><td>Kodak</td><td>5160320</td><td></td></tr><tr><td>Photo flo</td><td>Kodak</td><td>1464502</td><td></td></tr><tr><td>Losartan</td><td>Fisher / Tocris</td><td>37-985-0</td><td></td></tr><tr><td>MCID ve ticaret; Çekirdek 7.0</td><td>MCID</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Soyulabilir kayar saplar</td><td>VWR</td><td>48440-003</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PD123319</td><td>Fisher</td><td>13-615-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Şarjlı Slaytlar, İnce Zemin Kenarı</td><td>Premiere Mikroskop Slaytları</td><td>9308W</td><td></td></tr><tr><td> 125I Ligandlar</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX- 248</td><td></td></tr><tr><td>125SI-Ang II&nbsp;</td><td>George Washington Üniversitesi</td><td>Dr. Speth</td><td></td>Slide Mailers tarafından radyoiyodilatılmış</tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dibazik Fosfat Susuz (Na2PO4)</td> <td>Fisher</td><td>RDCS0750500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat (Susuz)</td> <td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Tiyonin&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>T409-25</td><td></td></tr><tr><td>X-Işını Kasası (10 x 12)</td><td>Spectronics Corporation</td><td>Dört Kare</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

anjiyotensin ii reseptör lokalize görselleştirme için reseptör otoradyografi protokolü

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Bu protokol Ang II reseptörleri reseptör otoradyografik haritlama özgü bir radyo-kullanarak sıçan beyninde Anjiotensin II (Ang II) için reseptör bağlanma şekilleri ile ilgili bilgiler. Doku numuneleri hasat edilmiş ve -80 ° C&#39;de saklanır. Bir kriyostat koronal bölümüne doku (beyin) kullanılır ve yüklü slaytlar üzerine bölümleri monte çözdürmeyiniz. Slayt monte doku bölümleri Ang II reseptörlerinin radyolabel 125I-sı-Ang II içerisinde inkübe edilir. Komşu slaytlar iki kümeye ayrılır: bir alıcı doyurarak radyo-etiketlenmemiş Ang II konsantrasyonu ya da varlığında (MGP) &#39;spesifik olmayan bağlanmayı&#39; 1, Ang II reseptörü alttipinin (1 r) seçici Ang II reseptör antagonisti ve 1 R antagonisti AT hiçbir ile &#39;bağlayıcı toplamı&#39;. 2, Ang II reseptörü alttipinin (2&#39;de R) doyurucu konsantrasyonu antagonisti (PD123319, 10 uM), aynı zamanda kuluçkalamadan mevcutturtampon üzerinde AT 1 R alt tipine bağlama 125l-SI-Ang II sınırlamak için. 22 ° C, MGP slaytlar 10 uM PD123319 ve losartan maruz ° &#39;de 30 dakikalık bir ön inkübasyon sırasında, slaytlar 10 uM PD123319 maruz&#39; bağları, toplam &#39;ise. Slaytlar, sonra &#39;toplam bağlanma için&#39; PD123319 mevcudiyetinde 125l-sı-Ang II ile inkübe edildi ve analiz tamponu içinde MGP için PD123319 ve losartan, birkaç &#39;yıkama &quot;, ardından tampon maddesi içinde ve su tuzunu ve non-kaldırmak edilir spesifik olarak bağlanmış radyoligandı. slaytlar uzmanlaşmış bir film ve kaset kullanarak ardından otoradyografi filmine maruz darbe kurutucular kullanılarak kurutulur. Film geliştirilen ve görüntüler, özel bir görüntüleme sistemi ve elektronik tablo kullanarak görsel ve kantitatif dansitometri için bir bilgisayara taranır. slaytlar ek olarak bir dizi histolojik karşılaştırmalar için tionin-boyanır. reseptör otoradyografi kullanmanın avantajı görselleştirmek yeteneğiAng II, bir doku numunesinin bir bölümü içinde yerinde reseptörler, anatomik bir bitişik histolojik bir referans bölümüne karşılaştırarak doku bölgesini tanımlamak.

Renin-anjiyotensin sisteminin bir metabolik yolun genel görünüşü Şekil 2&#39;de tarif edilen Şekil 1 ve (R1 Ar ve 2) anjiyotensin II reseptör alt-tipleri üzerindeki doğrudan odak gösterilmektedir. Şekil 3&#39;te bir koronal beyin transferi Şekil Şekil 4&#39;te görüldüğü gibi, daha sonra, önceden belirlenmiş bir 125I-siang II konsantrasyonu kullanılarak bir alıcı otoradyog...

Burada, anjiyotensin II'nin iyot-125 etiketli bir analogu kullanılarak sıçan beynindeki anjiyotensin II Tip 1 reseptörlerinin lokalizasyonunu kantitatif, dansitometrik, in vitro reseptör otoradyografisi ile tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Anjiyotensin II Reseptör lokalize Görselleştirme için Reseptör Otoradyografi Protokolü

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

Bu prosedürün genel amacı, Reseptör Autoradyografisi ve beyin yapılarının histolojik tanımlamasını kullanarak beyin kesitlerindeki Anjiyotensin II Reseptörü ekspresyonunu anatomik olarak lokalize etmek ve miktarını belirlemektir. Bu yöntem, Anjiyotensin II'nin davranışı, bilişsel fonksiyonları ve kardiyovasküler sistemi etkilediği beyin bölgelerini tanımlayarak, nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisine yönelik yeni terapilerin geliştirilmesi için öngörüler sağlar. Bu tekniğin temel avantajları; kantitatif ve kalitatif olması ve Anjiyotensin II için fonksiyonel reseptörlerin diğer yöntemlere göre daha yüksek spesifite ile tanımlanmasına olanak tanımasıdır.Bu yöntem, vücut genelindeki madde bağımlılığı ile ilgili reseptörler gibi diğer hormon reseptör sistemlerinin işlevselliğini karakterize etmek için de kullanılabilir. Hasattan hemen sonra, beyin dokularını kafatasının içini simüle eden beyin kalıplarına yerleştirin ve kalıpları -20 °C'de saklamak üzere alüminyum folyo ile sarın. 30 dakika sonra, dokuları sızdırmaz bir dondurucu saklama torbasına aktarın ve torbayı -80 °C'de saklayın.Kesme işleminden önce, beyni beyin kalıbından nazikçe çıkarın. Beyin dokusunu kesmek için, ilgili örneği -10 ile -18 santigrat derece arasında ayarlanmış bir kriyostatın içine aktarın. Doku yeni sıcaklığa alıştığında, koronal planın kesilebilmesini sağlamak için glikol ve reçine bazlı bir medium kullanarak örneğin küçük bir kısmını bir doku montaj aparatına dikey olarak gömün.Dokuyu mikrotoma yerleştirin ve sabitleyiciyi sıkıca sıkın, ardından beyni istenen kalınlıkta kesmeye başlayın ve dokunun lam üzerindeki yüzey alanını artırmak için kesitleri dikey yönde mikroskop lamlarına yerleştirin. Kesitleri beşli ardışık setler halinde toplayın. Tüm kesitler toplandığında, lamların bir saate kadar havada kurumasına izin verin.Ardından numuneleri, -20 °C'de saklamak üzere kilitli bir dondurucu poşeti içindeki plastik bir lam kutusuna yerleştirin. Örnekleri radyoyla işaretlemek için, her beşli setten birinci ve ikinci lamları çıkarın ve ticari olarak mevcut olan veya 3D yazıcıyla basılmış lam tutuculara monte edin. Bir numaralı lamlar spesifik olmayan işlem grubuna, iki numaralı lamlar ise toplam işlem grubuna aittir.Lamları, uygun ön inkübasyon Coplin kavanozları içindeki oda sıcaklığındaki 35 ila 40 mL AM5 ve ilgili inhibitörlerine ters çevirerek yerleştirin. Birden fazla lam seti ile çalışmak karmaşık olabilir. Bu nedenle, kurutma aşamasında herhangi bir çakışma yaşanmadığından emin olmak için lamların ön inkübasyon kavanozlarına dört dakikalık aralıklarla yerleştirilmesi son derece kritiktir.30 dakika sonra lamları, uygun konsantrasyondaki I125 SI Angiotensin II ve ilgili tedavi grubu inhibitörleri ile takviye edilmiş 10 mililitre AM5 içeren inkübasyon lam taşıyıcılarına aktarıp oda sıcaklığında 60 ila 90 dakika bekletin. 125I SI Ang II konsantrasyonunun kesin olarak belirlenmesi, Angiotensin II reseptörlerinin bir günden diğerine karşılaştırılabilmesi açısından kritik öneme sahiptir. İnkübasyonun sonunda lamları lam tutuculara geri yerleştirin, lamları bloke edin ve 400 mililitrelik iki ayrı distile su kabında bir ila iki saniye boyunca nazikçe çalkalayın.İkinci su yıkamasından sonra, lamları 30 ila 40 mililitre AM5 ile ardışık dört kez birer dakikalık yıkamalarla durulayın. Dördüncü yıkamanın ardından, kesitleri buz gibi soğuk distile su ile dört kez değiştirerek bir ila iki saniye boyunca nazikçe çalkalayın. Ardından, lamları soğuk hava ile dört dakika boyunca kurutmak için farklı açılara ayarlanmış dört adet hava kurutucu kullanın.Tüm kesitler kuruduğunda, lamları bir kağıt havluya aktarın. Ardından, doku yüzeyi yukarı gelecek şekilde lamlarıle çift taraflı bant kullanarak, her grup için en az bir iyot 125 kalibrasyon standart lamı da dahil olacak şekilde, röntgen filmi için bir karton parçasına sabitleyin. Kesitleri filme maruz bırakmak için, karanlık bir odada kartonlamları bir strap back röntgen kasetinin içine yerleştirin ve ışıkları kapatın.Güvenli ışığı açın ve bir kutu X-ray filmi dikkatlice açın. Bir filmi, parlak yüzü yukarıya gelecek ve tırtıklı kenarı sağ alt köşeye gelecek şekilde kasedeki lamların üzerine yerleştirin. Ardından, ışık sızmasını önlemek için kilitleme barları çevrilerek kasedi dikkatlice kapatın ve kasedi -20 °C'de saklayın.Uygun pozlama süresinden sonra, filmi iki dakika boyunca geliştirici çözeltiye, ardından 30 saniye boyunca asetik asit içeren çift distile suyla hazırlanmış durdurma banyosuna ve son olarak beş dakika boyunca sabitleyici çözeltiye aktarın. Filmi akan su bulunan bir tepside 20 dakika boyunca yıkayın. Filmi yaklaşık 10 saniye boyunca bir sürfaktana aktarın ve kuruması için asın.Beyin dokusu kesitlerinin histolojik analizi için, üç kesiti bir lam rafında çözündürün. Ardından, kesitleri bir dakika boyunca deiyonize su ile yıkayın; bunu takiben tionin boya solüsyonunda 10 dakikalık bir inkübasyon ve bir deiyonize su kabında üç kez daldırma işlemi uygulayın. Lamları 30 saniyelik ek bir deiyonize su yıkaması için suya daldırın.Ardından lamları belirtilen sırayla etanol yıkama işlemlerine tabi tutun. Son %100 etanol yıkamasından sonra, lamları iki ayrı ksilen kabında sırasıyla üç ve beş dakika boyunca yıkayın. İkinci ksilen yıkamasının sonunda, her bir lamın üst kenarını bir reçine bazlı, inorganik çözücü içeren montaj ortamı ile kapatın.24 by 60 milimetre boyutundaki lamelleri lamların üzerine yerleştirin ve lamların 48 saat boyunca kurumasını bekleyin. Ardından, lamları ve filmi 2400 DPI gri tonlamalı olarak bilgisayara taratın. Filmi densitometri ile analiz etmek için, tarama işleminden sonra her film üzerindeki ilgi alanlarını ampirik olarak belirleyerek çevreleyin.Bu, taranmış filmin görüntü analiz programında açılmasının ardından oluşturulan yalancı renkli görüntüdür. Ölçümlere yoğunluğu, tarama alanını ve toplam hedef alanını dahil edin. Her bir ilgi bölgesinin vurgulama parametreleri arasında kaldığından emin olmak için tarama alanı çubuklarını ayarlayın.Ardından, her örnek için mevcut olan spesifik bağlanmayı belirlemek amacıyla verileri bir hesap tablosuna aktarın. Kantifikasyon için kullanılan kalibrasyon standart birimleri, deneyin gerçekleştirildiği tarihe göre belirlenir. Filmler tarandıktan sonra, kalibrasyon değerleri, söz konusu film için farklı iyot 125 standart konsantrasyonlarına dayalı bir eğri oluşturmak için kullanılır.Doğruluk için kalibrasyon ve standart değerler üç tekrarlı olarak kaydedilir. Spesifik olmayan bağlanma ile toplam gruplar arasındaki ayrımların yanı sıra doku etiketleri, her bir veri setinin uygun alt gruplara atanmasıyla belirlenir. İlgi duyulan taranmış alanın tamamının daha doğru bir şekilde ölçülmesine olanak tanımak için, üst eşik değeri parametreler kırmızıdan siyaha ayarlanarak belirlenmeli, alt eşik değeri ise sıfıra yakın ayarlanmalıdır.Örneğin, burada hipotalamusun paraventriküler çekirdeğinin toplam bağlama ile spesifik olmayan bağlama gruplarındaki nihai ölçülen alanları, anatomik onay için tiyonin boyalı bir kesit ile karşılaştırılmıştır. Spesifik olmayan bağlama, doyurucu konsantrasyondaki radyoaktif olmayan Anjiyotensin I Reseptör ligandı varlığında, Anjiyotensin Reseptörleri dışındaki bölgelere bağlanan radyoligand miktarıdır; toplam bağlama ise radyoaktif olmayan Anjiyotensin I Reseptör ligandı yokluğunda bağlanan radyoligand miktarıdır. Anjiyotensin I Reseptörleri için spesifik bağlama değerlerini elde etmek için, spesifik olmayan bağlama değerleri toplam bağlama değerlerinden çıkarılabilir.Uzmanlaşıldığında, reseptör otoraidiyografi adımı yaklaşık dört saatte tamamlanabilirken, film geliştirme adımı film başına yaklaşık 30 dakika sürer. Bu prosedür uygulanırken, tüm slaytların tam olarak aynı süre boyunca inkübe edildiğinden, durulandığından ve kurutulduğundan emin olmak için zaman takibinin yapılması önemlidir. Bu prosedürün ardından, Angiotensin II Reseptörü ekspresyonu gösteren bölgelerin boyutundaki değişiklikleri değerlendirmek için beyin morfolojisine yönelik ek çalışmalar yürütülebilir.Bu teknik, reseptör farmakolojisi çalışan araştırmacıların farklı beyin bölgelerinin çeşitli nörohormonlar, nörotransmitterler ve ilaçlar tarafından nasıl etkilendiğini belirlemesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bir reseptör otoraidiyografi analizini başarıyla nasıl gerçekleştireceğiniz, histolojik olarak boyanmış lamlar ve reseptörleri belirli beyin bölgelerine yerleştirmek için otoraidiyogramların nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktivite ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve radyoaktif kontaminasyonu önlemek için uygun zırhlama, muhafaza, maruziyet izleme ve bertaraf gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makalenin amacı, dijital bir immunofluorescent mikroskop kullanılarak sıçan pial arteriyel dilim östrojen reseptör-α immunofluorescent algılama (ERα) optimize etmek için bir yöntem göstermektir.

Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Biyoortogonal ters elektron talebi Diels-Alder sikloilavesi, kanser için etkili ve modüler önceden hedeflenmiş bir PET görüntüleme stratejisi oluşturmak için kullanılmıştır. Bu protokolde, bu metodolojinin adımları, kolorektal kanser hedefli antikor huA33 ve 64Cu etiketli bir radyoligand kullanan bir model sistem bağlamında açıklanmaktadır.

Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing

Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Bu el yazması transgenik muhabir fare kullanımı ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu değerlendirmek için kan damarlarının intravital video mikroskobu kullanılarak Anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonda floresan boyalar farklı yönetim yollarını açıklar ve onların yetenek rulo ve endotel için uygun.

Lökosit haddeleme ve yapışma Anjiyotensin II-infüzyon farelerde görselleştirme: teknikleri ve Püf noktalar

αvβ3 integrin angiogenez geçiren aktive endotel hücreleri son derece ifade yapışma protein türüdür. Böylece, integrin bütünlüğünü değerlendirmek Onkoloji büyük ilgi olmuştur. Burada, 68Ga etiketli radiopeptides hazırlamak için bir yöntem ve biyolojik etkinliğini değerlendirmek için bir yöntem sunar.

68Ga etiketli arginin glisin aspartat (RGD) hazırlama-peptid angiogenez için

Autoradiography yöntemi radioligands doku bölümlerine bağlama nitel veya nicel Farmakoloji belirlenmesi için incelemek için düzenli olarak kullanılır.

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

Tirozin-nitrated proteinlerin proteomik profilleme 3-nitrotirozin modifikasyonunda düşük bolluk nedeniyle zorlu bir teknik olmuştur. Burada, nitropeptid zenginleştirme ve model olarak angiotensin II kullanarak profil oluşturma için yeni bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer in vitro veya in vivo sistemlerde uzatılabilir.

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Bu makalede, alkalen fosfataz konjuge ScFv D11 antikoru kullanılarak immünofloresan yoluyla dokulardaki izolevuglandinlerin ölçümü için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Hem farelerde hem de insanlarda hipertansiyon modelleri, doku örneklerinde izolevuglandin ölçümü ile ilişkili adım adım prosedürleri ve temel ilkeleri açıklamak için kullanılır.

D11 scFv-alkalen fosfataz füzyon proteini ve immünofloresan kullanılarak dokulardaki izolevuglandinlerin doğrudan tespiti

Bu makalede, biz Neuronetics NeuroStar TMS cihaz kullanarak FDA onaylı depresyon tedavi protokolü ile ilgili metodoloji ve düşünceler inceleyin.

NeuroStar TMS Aygıt: FDA yürütülmesi Depresyon Tedavisinde Protokolü Onaylandı

Video oynatma hayvan davranışları yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Biz oluşturulan ve 3-D bilgisayar animasyonları kurallara dayalı, interaktif çalma tabi davranışı üzerinde gerçek zamanlı, otomatik veri yanıt geçerli bir program değerlendirilir.

Hayvan İletişim Araştırmaları Otomatik Etkileşimli Video Oynatma

Öğrenin, reseptör otoradyografi yöntemiyle sıçan beyninde Anjiyotensin II reseptörlerinin lokalizasyonunu ve niceliksel analizini nasıl yapılır. Bu teknik, davranış ve kardiyovasküler fonksiyon üzerindeki etkileri anlamak için fonksiyonel reseptörleri yüksek özgüllükle tanımlar.

Anjiyotensin II Reseptör lokalize Görselleştirme için Reseptör Otoradyografi Protokolü

Daha fazla video keşfet