Anjiyotensin II Reseptör lokalize Görselleştirme için Reseptör Otoradyografi Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, Reseptör Otoradyografisi ve beyin yapılarının histolojik olarak tanımlanması kullanılarak beyin bölümlerinde Anjiyotensin II Reseptör ekspresyonunu anatomik olarak lokalize etmek ve ölçmektir. Bu yöntem, Anjiyotensin II'nin davranışı, bilişsel işlevi ve kardiyovasküler sistemi etkilediği beyin bölgelerini tanımlar ve nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisi için yeni tedavilerin geliştirilmesi için içgörüler sağlar. Bu tekniğin temel avantajları, kantitatif, kalitatif olması ve Anjiyotensin II için fonksiyonel reseptörlerin diğer yöntemlere göre daha fazla özgüllükle tanımlanmasına izin vermesidir.

Bu yöntem aynı zamanda, kötüye kullanılan ilaçlarla ilgili reseptörler gibi vücuttaki diğer hormon reseptör sistemlerinin işlevselliğini de karakterize edebilir. Hasattan hemen sonra, beyin dokularını kafatasının içini simüle eden beyin kalıplarına yerleştirin ve kalıpları eksi 20 santigrat derece saklama için alüminyum folyoya sarın. 30 dakika sonra, dokuları sızdırmaz bir dondurucu saklama torbasına aktarın ve torbayı eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Bölümlere ayırmadan önce beyni nazikçe beyin kalıbından çıkarın. Beyin dokusunu bölümlere ayırmak için, ilgilenilen örneği eksi 10 ila eksi 18 santigrat derece arasında ayarlanmış bir kriyostata aktarın. Doku yeni sıcaklığa dengelendiğinde, koronal düzlemin kesitlenmesini sağlamak için numunenin küçük bir bölümünü bir doku yuvasına dikey olarak gömmek için glikol ve reçine bazlı bir ortam kullanın.

Dokuyu mikrotomun üzerine yükleyin ve montajı yerine sıkıca sıkın, ardından beyni istenen kalınlıkta kesmeye başlayın, ardından dokunun daha büyük bir yüzey alanını slayta uygulamak için bölümleri dikey yönde mikroskop slaytlarına monte edin. Bölümleri beşli sıralı kümeler halinde toplayın. Tüm bölümler toplandığında, slaytların bir saate kadar kurumasına izin verin.

Ardından numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklamak için kendinden sızdırmaz bir dondurucu poşetine plastik bir sürgülü kutuya koyun. Numuneleri telsizle etiketlemek için, birinci ve ikinci slaytları beşli setin her birinden çıkarın ve piyasada bulunan veya 3D baskılı slayt tutamaklarına monte edin. Bir çizgi slaytlar spesifik olmayan tedavi grubu içindir ve iki çizgi iki slaytlar toplam tedavi grubu içindir.

Slaytları 35 ila 40 mililitre oda sıcaklığında AM5 ve ilgili inhibitörlerini uygun ön inkübasyon Coplin kavanozlarında ters çevirin. Birden fazla slayt seti çalıştırmak bunaltıcı olabilir. Bu nedenle, kurutma aşaması sırasında üst üste binme olmadığından emin olmak için slaytları dört dakikalık aralıklarla ön inkübasyon kavanozlarına yerleştirmek son derece önemlidir.

30 dakika sonra, slaytları, oda sıcaklığında 60 ila 90 dakika boyunca uygun konsantrasyonda I125 SI Anjiyotensin II ve ilgili tedavi grubu inhibitörleri ile desteklenmiş 10 mililitre AM5 içeren inkübasyon slayt postalarına aktarın. 125I SI Ang II'nin tam konsantrasyonunun belirlenmesi, Anjiyotensin II Reseptörlerinin bir günden diğerine karşılaştırılmasına izin vermek için kritik öneme sahiptir. Kuluçka işleminin sonunda, slaytları slayt tutamaklarına geri koyun, slaytları bloke edin ve 400 mililitre damıtılmış su içeren iki ayrı kapta bir ila iki saniye hafifçe döndürün.

İkinci suyla yıkamadan sonra, slaytları 30 ila 40 mililitre AM5'te dört ardışık bir dakikalık yıkama ile durulayın. Dördüncü yıkamadan sonra, dört kez buz gibi soğuk damıtılmış suda bölümleri bir ila iki saniye hafifçe döndürün. Ardından, slaytları dört dakika boyunca soğuk hava ile kurutmak için farklı açılarda ayarlanmış dört fön makinesi kullanın.

Tüm bölümler kuruduğunda, slaytları bir kağıt havluya aktarın. Ardından, slaytları, doku tarafı yukarı bakacak şekilde, X-ışını filmi için bir karton parçasına ve grup başına en az bir iyot 125 kalibrasyon standart slaytı içerecek şekilde monte etmek için çift taraflı bant kullanın. Bölümleri filme almak için, karanlık bir odada, karton slaytları bir kayışlı arka X-ray kasetinin içine yerleştirin ve ışıkları kapatın.

Güvenli ışığı açın ve bir kutu X-ışını filmini dikkatlice açın. Kasetteki slaytların üzerine, parlak tarafı yukarı bakacak şekilde bir filmi sağ alt köşede pürüzlü kenarı olacak şekilde yerleştirin. Ardından, ışığı kapatmak için kilitleme çubukları bükülmüş olarak kaseti dikkatlice kapatın ve kaseti eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Uygun maruz kalma süresinden sonra, filmi iki dakika boyunca geliştirici çözeltisine aktarın, ardından 30 saniye durdurma banyosunda, asetik asit ile çift damıtılmış su ve ardından sabitleyici çözeltide beş dakika boyunca aktarın. Filmi 20 dakika boyunca akan su dolu bir tepside yıkayın. Yaklaşık 10 saniye boyunca bir yüzeyciye aktarın ve filmi kuruması için asın.

Beyin dokusu bölümlerinin histolojik analizi için, kısa çizgiyi üç bölümü bir kayar rafta çözün. Daha sonra, bölümleri bir dakika deiyonize suda yıkayın, ardından tionin leke solüsyonunda 10 dakikalık bir inkübasyon ve bir deiyonize su kabına üç daldırma yapın. 30 saniyelik ek bir deiyonize su ile yıkama için slaytları daldırın.

Daha sonra slaytları belirtildiği gibi sıralı etanol yıkamalarında yıkayın. Son %100 etanol yıkamasından sonra, slaytları iki kap ksilen içinde art arda üç ve beş dakika yıkayın. İkinci ksilen yıkamanın sonunda, her seferinde bir sürgünün üst kenarını bir reçine bazlı, inorganik çözücü montaj ortamı ile kaplayın.

Slaytların üzerine 24 x 60 milimetrelik kapak kızakları monte edin ve slaytların 48 saat kurumasını bekleyin. Ardından slaytları ve filmi 2400 DPI gri tonlamalı olarak bilgisayara tarayın. Filmi dansitometri ile analiz etmek için, taramadan sonra, her filmdeki ilgi alanlarını ampirik olarak ana hatlarıyla belirtin.

Bu, taranan filmi görüntü analiz programında açtıktan sonra oluşturulan sözde renkli görüntüdür. Ölçümlere yoğunluğu, tarama alanını ve toplam hedef alanı dahil edin. İlgilenilen her bölgenin vurgulama parametreleri arasında kaldığından emin olmak için tarama alanı çubuklarını ayarlayın.

Ardından, her örnek için mevcut olan belirli bağlamayı belirlemek için verileri bir elektronik tabloya aktarın. Miktar tayini için kalibrasyon standart birimleri, testin yapıldığı tarihe göre belirlenir. Filmler tarandıktan sonra, kalibrasyon değerleri, söz konusu film için değişen iyot 125 standart konsantrasyonlarına dayalı bir eğri oluşturmak için kullanılır.

Kalibrasyon ve standart değerler, doğruluk için üç nüsha halinde kaydedilir. Spesifik olmayan bağlanma ile toplam gruplar ve doku etiketleri arasındaki farklar, her bir veri setinin uygun alt gruplara atanmasıyla belirlenir. Parametreler kırmızıdan siyaha ayarlanarak daha yüksek bir eşik değeri ayarlanmalı, taranan tüm ilgi alanının daha doğru bir ölçümünü sağlamak için daha düşük eşik değeri sıfıra yakın ayarlanmalıdır.

Örneğin, burada hipotalamusun paraventriküler çekirdeğinin toplamdaki ve spesifik olmayan bağlanma gruplarındaki son ölçülen alanları, anatomik doğrulama için tionin lekeli bir bölümle karşılaştırılır. Spesifik olmayan bağlanma, radyoaktif olmayan Anjiyotensin I Reseptör ligandının doymuş bir konsantrasyonunun varlığında Anjiyotensin olmayan Reseptörlere bağlanan radyoligand miktarıdır, oysa toplam bağlanma, radyoaktif olmayan Anjiyotensin I Reseptör ligandının yokluğunda bağlanan radyoligand miktarıdır. Spesifik olmayan bağlanma değerleri daha sonra Anjiyotensin I Reseptörleri için spesifik bağlanma değerlerini elde etmek için toplam bağlanma değerlerinden çıkarılabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, reseptör otoradyografi adımı yaklaşık dört saat içinde tamamlanabilirken, film geliştirme adımı film başına yaklaşık 30 dakika sürer. Bu prosedürü gerçekleştirirken, tüm slaytların tam olarak aynı süre boyunca inkübe edildiğinden, durulandığından ve kurutulduğundan emin olmak için zamanı takip etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, Anjiyotensin II Reseptör ekspresyonu gösteren bölgelerin boyutundaki değişiklikleri değerlendirmek için ek beyin morfolojisi çalışmaları yapılabilir.

Bu teknik, reseptör farmakolojisi üzerine çalışan araştırmacıların, farklı beyin bölgelerinin çeşitli nörohormonlar, nörotransmiterler ve ilaçlardan nasıl etkilendiğini belirlemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bir reseptör otoradyografi testinin, histolojik olarak boyanmış slaytların nasıl başarılı bir şekilde gerçekleştirileceğini ve reseptörleri belirli beyin bölgelerine lokalize etmek için otoradyogramların nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Radyoaktivite ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve radyoaktif kirlenmeyi önlemek için her zaman uygun koruma, muhafaza, maruz kalma izleme ve bertaraf gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.