Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

Bu basit, hücre bazlı biyo-tahlilin genel amacı, liginlerin vasküler endotelyal büyüme faktörü ailesinin üyelerinin aktivitesini tespit etmek, ölçmek ve izlemektir. Bu yöntem, VEG-FR ailesi liginlerinin bu hastalıklarda anahtar süreçleri yaydığı vasküler biyoloji, viroloji, kanser ve oftamolojideki temel soruları yanıtlayabilir. Bu testin ana avantajı, VEG-FM ailesi liginlerinin, özel epitel hücreleri gerektirmeden farklı reseptörlerini bağlama ve çapraz bağlama kapasiteleri açısından değerlendirilmesine izin vermesidir.

IL3 salgılayan hücre hattı WEHI-3D'yi, büyümenin kütük yüzündeki on ila altıncı hücreyi, 50 milimetre taze kültür ortamı içeren dört ila on T175 şişesine pipetleyerek kültürleyin. Yedi gün boyunca veya hücreler günlük büyüme aşamalarını yaklaşık 24 ila 48 saat geçene kadar kuluçkaya yatırın. Sıvıyı ve hücreleri şişelerden boşaltın.

Hücreleri ve hücresel kalıntıları temizlemek için 15 dakika boyunca 1.000 Gs'de döndürün. Ardından süpernaytentin üst %90'ını çıkarın ve 0,22 mikronluk bir filtre ünitesinden süzün. Tahlil hazırlığı için şartlandırılmış ortamı bir mililitrelik alikotlara ayırın.

Faktöre bağlı hücre hatlarını geçmek için kültür ortamı yapmak için 50 mililitrelik alikotlar ve 20 santigrat derecede uzun süreli depolama için 200 mililitrelik hacimler. Daha küçük hacimleri 20 santigrat derecede saklayın. % 10 WEHI-3D şartlandırılmış ortam içeren kültür ortamında kültür kontrolü BAF3 hücreleri.

ve aynı ortamdaki VegFR2-EPoR-BAF3 hücreleri artı mililitre G418'de bir miligram. Log fazında büyüyen hücrelerden bir ila 15 seyreltmede geçiş hücreleri. Orta log faz kültürleri için hasat kontrolü BAF3 veya VegFR2VPoR-BAF3 hücreleri.

Hücreleri şişenin altından çıkarmak için hafifçe pipetleyerek, hücre peletini geri kazanmak için beş dakika boyunca 750 Gs'de santrifüjleyin. Peleti 10 mililitre fare tonisite fosfat tamponlu salin içinde yeniden süspanse edin ve beş dakika boyunca 750 Gs'de tekrar santrifüjleyin. IL3 içeren ortamı çıkarmak için yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

DEHI-3D şartlandırılmış ortam içermeyen ortam kullanarak hücreleri bir kez yıkayın. Yanlış pozitif sonuç veya yüksek arka plan aktivitesi oluşturabilecek ek büyüme faktörlerinin kalmadığından emin olmak için IL3 içeren kültür ortamını yıkamak önemlidir. Santrifüjleme ve atma işleminden sonra, süpernayten hücreleri aynı IL3 serbest ortamda, mililitre başına 10 ila dördüncü hücre 7.4 kez konsantrasyonda yeniden askıya alın.

Son olarak, PBS'de eşit hacimde tripan mavisini bir hücre popülasyonu ile karıştırın ve bir hemasitometreye yükleyin. En az 100 hücre sayın. Boyayı alan hücreler ölü veya ölmekte olarak kabul edilir.

Test için kullanılan hücrelerin, tahlil koşullarına yanıt verebilmelerini sağlamak için yüksek canlılığa sahip olması çok önemlidir. 72 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 13,5 mikrolitre IL eksik ortamda 1.000 hücre eklemek için iyi kalibre edilmiş bir P20 otomatik pipet ve otoklavlanmış uçlar kullanın. Yerçekimi ile hücre çökelmesinin hücre konsantrasyonunu bozmamasını sağlamak için alikotasyon sırasında hücre süspansiyonunu karıştırmaya dikkat edin.

Kontrol kuyularına üç nüsha halinde 1,5 mikrolitre IL3 içermeyen ortam eklemek için iyi kalibre edilmiş bir P2 pipeti kullanın. Karıştırmak için karmaşık. Aynı şekilde, istenen kuyucuklara %10 WEHI-3D şartlandırılmış ortamı ve mililitre başına 100 nanogram VegFA no IL3 kontrolünü ekleyin.

Son olarak, test numunelerinden 1.5 mikrolitre üç kopya halinde ekleyin. Mikrokuyu plakasının kullanılmayan kuyularını steril su, PBS veya ortam ile doldurun. Gaz değişimine izin veren nemlendirilmiş bir oda oluşturmak için suya batırılmış kağıt mendili gaz geçirgen bir kaba koyun.

Tahlil plakalarını odalarda% 10 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 16 saat boyunca inkübe edin. 16 saatlik inkübasyondan sonra, 40 ila 100x büyütmede standart bir ters faz mikroskobu kullanarak plakaları analiz edin. Şu anda, pozitif ve negatif numuneler arasında ayrım yapmak mümkündür.

Büyüme faktörlerinin desteği olmayan veya tek başına besiyeri olan kuyular, daha az sayıda yuvarlak hücrenin yanı sıra ölü veya ölmekte olan hücrelere ve hücresel kalıntılara sahip olacaktır. VegFR2 için IL3 veya ligin içeren ortamla inkübe edilen hücreler büyük ve yarı saydamdır ve hücre sitoplazmasında granülerlik veya kültürde hücre kalıntısı olduğuna dair hiçbir kanıt yoktur veya çok az kanıt vardır. Standart 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 135 mikrolitre IL3 eksik ortamda 10.000 yıkanmış hücre ekleyin.

Kuyucuklara 20 mikrolitre test numunesi ve kontrol eklemek için kalibre edilmiş bir P15 pipeti kullanın. Hücre büyüme faktörleri ve / veya inhibitör ajanların karışımını daha önce olduğu gibi 48 saat boyunca inkübe edin. Kuluçka süresinin tamamlanmasında, protokolün yazılı bölümünde belirtilen yöntemleri kullanarak kuyucuklardaki canlı hücrelerin sayısını değerlendirin.

Burada, VEGF-R2 EPoR BAF3 biyo-tahlilinin, VEGF-R2 için özgüllük ile üç yaslanmış insan ligininin aktivitesini ölçmek için kullanıldığı bir testin sonuçları temsil edilmektedir. VEGF-A165, VEGF-C ve VEGF-D. Aktivite, VEGF-A165'e karşı inhibitör bir monoklonal antikor olan bevacizumab varlığında veya nötralize edici olmayan bir antikor olan trastuzumab varlığında ölçüldü.

Veriler, yalnızca VEGF-A165'e verilen yanıta karşı normalleştirilmiştir. Beklendiği gibi, bevacizumab testte VEGF-A165'in etkisini bloke etti, ancak VEGF-C ve VEGF-D'nin aktivitesi üzerinde hiçbir etkisi olmadı. IL3'e maruz kalan hücreler oldukça canlıydı.

Oysa ek bir büyüme faktörüne maruz kalmayanlar zayıf canlılık gösterir. Bu prosedürü denerken, bunların testten önce üretilmesi gereken şartlandırılmış ortamlarda bir dizi kontrol ajanı olduğunu akılda tutmak önemlidir. Bu teknik, VEG-FM'in liginlerdeki rolünü keşfetmek için vasküler biyoloji, viroloji, kanser ve optomolojide yeniden canlanmanın yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, biyotahlil hücrelerinin nasıl hazırlanacağını, biyotahlili nasıl çalıştıracağınızı ve VEG-FM ligin aktivitesinin kantitatif veya yarı kantitatif analizlerini nasıl yapacağınızı iyi anlamış olmalısınız.