Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

Bu basit, hücre tabanlı biyolojik analiz yönteminin genel amacı, vasküler endotelyal büyüme faktörü ligand ailesi üyelerinin aktivitesini tespit etmek, nicelleştirmek ve izlemektir. Bu yöntem, VEGF ailesi ligandlarının bu hastalıklardaki temel süreçleri yönettiği vasküler biyoloji, viroloji, kanser ve oftalmoloji alanlarındaki kritik sorulara yanıt verebilir. Bu analizin temel avantajı, özel epitel hücrelere ihtiyaç duymadan VEGF ailesi ligandlarının farklı reseptörlerine bağlanma ve çapraz bağ kurma kapasitelerinin değerlendirilmesine olanak tanımasıdır.

Logaritmik büyüme evresindeki beş çarpı 10⁶ IL3 salgılayan WEHI-3D hücre hattı hücresini, 50 ml taze kültür ortamı içeren dört ila on adet T175 flaskına pipetleyerek kültüre edin. Hücreler logaritmik büyüme evrelerini yaklaşık 24 ila 48 saat geçene kadar veya yedi gün boyunca inkübe edin. Flasklardaki sıvıyı ve hücreleri boşaltın.

Hücreleri ve hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için 1,000 Gs'de 15 dakika santrifüjleyin. Ardından süpernatantın üstteki %90'lık kısmını alın ve 0.22 mikronluk bir filtre ünitesinden süzün. Analiz hazırlığı için kondisyonlu medyumu birer mililitrelik alikotlara ayırın.

Faktör bağımlı hücre hatlarını pasajlamak için kültür ortamı hazırlamak amacıyla 50 milliliter'lik alikotlar ve 20 degree Celsius'ta uzun süreli saklama için 200 milliliter'lik hacimler hazırlayın. Daha küçük hacimleri 20 Celsius'ta saklayın. Kontrol BAF3 hücrelerini %10 WEHI-3D kondisyonlu ortam içeren kültür ortamında kültüre edin.

ve aynı ortam ile mililitre başına bir miligram G418 içeren VegFR2-EPoR-BAF3 hücrelerini ekleyin. Log fazda büyüyen hücrelerden 1 ila 15 dilüsyonlarda pasajlama yapın. Orta log fazdaki kültürler için kontrol BAF3 veya VegFR2VPoR-BAF3 hücrelerini hasat edin.

Hücreleri flask tabanından uzaklaştırmak için nazikçe pipetleyerek, hücre peletini elde etmek amacıyla 750 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti 10 mililitre fare tonisitesinde fosfat tamponlu salin içerisinde yeniden süspanse edin ve 750 Gs'de beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. IL3 içeren medyumu uzaklaştırmak için yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın.

Hücreleri, DEHI-3D kondisyonlu ortam içermeyen medya kullanarak bir kez yıkayın. Yanlış pozitif sonuç veya yüksek arka plan aktivitesi oluşturabilecek ek büyüme faktörlerinin kalmadığından emin olmak için IL3 içeren kültür ortamının yıkanıp uzaklaştırılması önemlidir. Santrifüjleme ve süpernatantın atılmasının ardından, hücreleri aynı IL3 içermeyen medyada 7,4 × 10⁴ hücre/mL konsantrasyonda yeniden süspande edin.

Son olarak, PBS içindeki trypan blue ile hücre popülasyonunun eşit hacimlerini karıştırın ve bir hemositometreye yükleyin. En az 100 hücreyi sayın. Boyayı alan hücreler ölü veya ölmekte olan hücreler olarak kabul edilir.

Hücrelerin analiz koşullarına yanıt verebildiklerinden emin olmak için, analizde kullanılan hücrelerin yüksek canlılığa sahip olması kritik öneme sahiptir. 72 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına, IL eksikliği olan 13,5 microliters besiyeri içerisinde 1.000 hücre eklemek için iyi kalibre edilmiş bir P20 otomatik pipet ve otoklavlanmış uçlar kullanın. Hücrelerin yerçekimi nedeniyle çökmesinin hücre konsantrasyonunda sapmaya yol açmaması için, alikotlama sırasında hücre süspansiyonunu karıştırmaya özen gösterin.

Kontrol kuyucuklarına üç tekrarlı olarak 1.5 µL IL3 içermeyen besiyeri eklemek için iyi kalibre edilmiş bir P2 pipeti kullanın. Karıştırmak için hafifçe viritin. Aynı yöntemle, %10 WEHI-3D kondisyonlu besiyerini ve 100 ng/mL VegFA (IL3 içermeyen) kontrolünü ilgili kuyucuklara ekleyin.

Son olarak, test örneklerinden her birini üç tekrar halinde 1.5 µL ekleyin. Mikroplaka üzerindeki kullanılmayan tüm kuyucukları steril su, PBS veya besiyeri ile doldurun. Gaz değişimine izin veren nemlendirilmiş bir bölme oluşturmak için gaz geçirgen bir kabın içine suyla doyurulmuş doku kağıdı yerleştirin.

Deney plakalarını, %10 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, bölmeler içerisinde 16 saat boyunca inkübe edin. 16 saatlik inkübasyonun ardından plakaları, 40 ila 100x büyütmede standart bir evrilmiş faz kontrast mikroskobu kullanarak analiz edin. Bu aşamada pozitif ve negatif örnekler arasında ayrım yapmak mümkündür.

Büyüme faktörü desteği olmayan veya yalnızca besiyeri içeren kuyucuklarda, yuvarlak hücre sayısında azalmanın yanı sıra ölü veya ölmekte olan hücreler ve hücresel debris görülecektir. Buna karşın, IL3 veya VegFR2 için ligin içeren besiyeri ile inkübe edilen hücreler iri ve şeffaftır; hücre sitoplazmasında granülarite veya kültürde hücre debrisine dair kanıt yok denecek kadar azdır. Standart bir 96 kuyucuklu plakadaki kuyucuklara, 135 microliters IL3 eksik besiyeri içindeki 10,000 yıkanmış hücre ekleyin.

Test örneklerinden ve kontrollerden 15 µL eklemek için kalibre edilmiş bir P20 pipet kullanın. Hücrelerin, büyüme faktörlerinin ve/veya inhibitör ajanların karışımını daha önce olduğu gibi 48 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi tamamlandığında, kuyucuklardaki canlı hücre sayısını protokolün yazılı kısmında belirtilen yöntemleri kullanarak değerlendirin.

Burada, VEGF-R2 özgüllüğüne sahip üç rekombinant insan liginin (VEGF-A165, VEGF-C ve VEGF-D) aktivitesini nicelleştirmek için VEGF-R2 EPoR BAF3 biyolojik deneyi kullanılarak elde edilen sonuçlar sunulmuştur. Aktivite, VEGF-A165'e karşı inhibitör bir monoklonal antikor olan bevacizumab varlığında veya nötralize edici olmayan bir antikor olan trastuzumab varlığında nicelleştirilmiştir.

Veriler, tek başına VEGF-A165'e verilen yanıta göre normalize edilmiştir. Beklendiği üzere bevacizumab, analizdeki VEGF-A165 etkisini bloke etmiş ancak VEGF-C ve VEGF-D aktivitesi üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir. IL3'e maruz bırakılan hücreler yüksek canlılık göstermiştir.

Ek bir büyüme faktörüne maruz kalmayanlar ise düşük canlılık göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, analizden önce hazırlanması gereken kondisyonlu medyumlarda bir dizi kontrol ajanı olduğunun akılda tutulması önemlidir. Bu teknik; vasküler biyoloji, viroloji, kanser ve oftalmoloji alanlarında, liginlerde VEG-FM'nin rolünü araştırmak için yeniden canlanmaya yol açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik analiz hücrelerinin nasıl hazırlanacağı, biyolojik analizin nasıl yürütüleceği ve VEG-FM lignin aktivitesinin kantitatif veya semikantitatif analizlerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.