Name: Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Keşfedin, kromatin immünopresipitasyonu ile embriyonik kök hücrelerde kardiyak farklılaşmanın epigenetik düzenlenmesini nasıl analiz edebilirsiniz. Bu yöntem, gen transkripsiyonunun hücre kaderi kararlarındaki rolünü anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, finansman kuruluşlarına, IMI StemBANCC Avrupa topluluk programına, leducq Vakfı'na (SHAPEHEART) ve Agence Nationale de la Recherche'ye (Genopath) teşekkür eder.

1. DNA-protein çapraz bağlanması <ol><li> ES hücreleri ve embriyonik kalpte üretilen 15 ml tüpler saptamak hasat-ES hücreleri (normal yongası için 2 x 10 6 hücre, mikroçip 2 x 10 5 hücre), embriyoid organları (EBS) E9.5 fare embriyolarının (atriyoventriküler kanal, çıkış yolu ve ventrikül) hücreleri ya da embriyonik dokular için permeabilizasyon tampon maddesi içinde PB2 PBS içinde% 1 formaldehid kullanılmıştır. tam olarak 10 dakika için oda sıcaklığında 60 rpm&#39;lik bir hızda orbital çalkalayıcı üzerinde tüpler yerleştirin. </li><li> 125 mM&#39;lik bir son konsantrasyona değin glisin eklenerek çapraz bağlanma reaksiyonu durdurun ve 60 rpm bir hızda orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li></ol> 2. Hücre Lizis ve Kromatin Parçalanma <ol><li> PBS 1X veya embriyo dokular 1 mi PB2 içinde yeniden süspansiyon haline mi iki kez 10 içinde yeniden süspansiyon haline çapraz bağlanmış hücreleri yıkayın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. süpernatantlar atın. &lt;/ Li&gt; <li> PB1 ve PB2 (2 ug / ml löpeptin, 1 ug / ml Aprotinin, ve 0.1 mM PMSF) (Tablo 1) tampon proteaz inhibitörleri ekleyin. sırasıyla, Tampon PB1 ve PB2 1 ml Aşama 2.1 hücre pelleti veya embriyonik doku yeniden süspanse edin. Pipet yukarı ve aşağı ve hücreleri ya da dokuları tekrar süspansiyon. hücreler veya doku homojenize etmek için bir 21 gauge iğne ile 1 ml şırınga kullanın. 10 dakika süre ile (bir tekerlek), 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 3.000 xg&#39;de Spin ve süpernatant atın. </li><li> Temiz bir tüp içinde, proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş, ilgili SB tampon (Tablo 1) 300 ul pelletini (RNase-, DNase- onaylı ve pirojensiz) herhangi bir DNA bozulmasını önlemek için. Buz üzerinde 15 ila 30 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Her malzeme için, Tablo 2&#39;de listelenen programlara göre bir sonikatör kullanılarak kromatin kesme 4 ° C&#39;de örnekleri sonikasyon. &lt;(Sonraki uygulamaya bağlı olarak sonikasyon süresini ayarlamakem&gt; yani PCR veya sıralama). Kesilmiş DNA boyutlu PCR için 500 bp ve dizileme için 300 bp civarında olmalıdır. </li><li> Santrifüj temiz 1.5 ml tüp içinde süpernatant (kromatin) transferi ve pelet atmak 4 ° C&#39;de 6,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca hücre lizat sonike. </li><li> su ile 10 kez çözelti içinde kromatin (süpernatan tampon B) ile seyreltilir ve nano spektrofotometre 1.5 ul kullanılarak optik yoğunluk değerlendirmek. 0.76 x OD 260-1,55 x OD 280: aşağıdaki formül kullanılarak mikrogram / ​​ul protein konsantrasyonu elde. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tampon </td><td> kullanım </td><td colspan="4"> kompozisyon </td><td> Malzemeler </td></tr><tr><td rowspan="2"> bir </td><td rowspan="2"> permeabilization </td><td colspan="4"> PB1: 5 mM PIPES pH 8; 85 mM KCI; % 0.5 NP40 </td><td> Bütün </td></tr><tr><td colspan="4"> PB2: 15 mM HEPES pH 7.6, 15 mM NaCI, 4 mM MgCI2 60 mM KCI,% 0.5 Triton X-100 </td><td> embriyonik doku </td></tr><tr><td rowspan="3"> B </td><td rowspan="3"> Lizis / Sonikasyon </td><td colspan="4"> SB1:% 1 SDS; 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI pH 8 </td><td> ESC </td></tr><tr><td colspan="4"> SB2: 50 mM HEPES-KOH pH7.9; 140 mM; 1 mM EDTA; % 0.1 deoksikolat; % 0.1 SDS </td><td> EBS </td></tr><tr><td colspan="4"> SB3: 15 mM Hepes pH 7.6, 15 mM NaCl; 60 mM KCI, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA; % 1 Triton-X100, 0 .1% SDS,% 0.5 laurilsarkozin </td><td> embriyonik doku </td></tr><tr><td> C </td><td> ChIP tampon </td><td colspan="4"> 150 mM NaCI; 50 mM Tris-HCI, pH 7.5; 5 mM EDTA, % 0.5 NP40, % 1 Triton-X100. </td><td> Bütün </td></tr><tr><td> D </td><td> DNA / Protein elüsyonu </td><td colspan="4"> D1:% 1 SDS; 100mM NaHCO 3 D2: 50 mM Tris pH 7.6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT,% 2 SDS </td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> DNA bağlama boncuk hazırlama </td><td colspan="4"> E:% 20 PEG 8000; 2.5 M NaCl; 10 mM Tris-HCI, pH 8; 1 mM EDTA </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Çips tamponlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Malzeme </td><td> sonication programı </td></tr><tr><td> Embriyonik kök hücreleri </td><td> 30 sn ON 15 döngüleri ve KAPALI 30 sn </td></tr><tr><td> embriyoid organları </td><td> 30 sn ON 30 döngü ve KAPALI 30 sn </td></tr><tr><td> Embriyonik dokular </td><td> 30 sn ON 21 döngüleri ve KAPALI 30 sn </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Sonikasyon Programları. 3. immünopresipitasyon veyıkama <ol><li> tampon C ile 3 kez Protein A-eşlenik boncuklar yıkayın. Temiz bir 1.5 ml tüp içinde tanelerin 100 ul alın ve tampon C (Tablo 1) 1 ml. Tüp daha sonra bir mıknatıs aktarılır; 1 dakika bekleyin ve süpernatant aspire. iki yıkama adımı yineleyin. </li><li> Temiz bir 1.5 ml tüp içinde proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş 20 yıkanmış protein ul bir konjüge boncuk ve tampon C 1 ml değiştirilmiş histonlann veya transkripsiyon faktörü (Tablo 3&#39;te listelenen konsantrasyonlar) karşı bir antikorun inkübe edin. 4 ° C&#39;de en az 2 saat boyunca 40 rpm&#39;de, bir döndürücü üzerinde örnekleri ayarlayın. </li><li> Yıkama antikor boncuklar tampon C, 1 ml (3.1 tarif manipülasyon) ile 3 kez kompleksleri. </li><li> Hazırlayın 2 tüpler içeren bir 150 kromatin ve antikor-boncuk komplekslerinin ug ve yıkanmış boncuk 150 kromatin mikrogram ve 20 ul içeren diğer tüp; Her tüpe proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş tampon C 1 ml ekleyinve 4 ° C&#39;de bir gece boyunca 40 rpm&#39;de dönen bir tekerlek üzerinde örnekleri inkübe edin. Not: kromatin konsantrasyonu, en az 300 | ig bir transkripsiyon faktörü veya ardışık yongasının immünopresipitasyon olmalıdır. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Standart </td><td> yoğunluğu (ng / ml) </td><td> Hacim (ul) </td><td> Toplam DNA konsantrasyonu (ng) </td></tr><tr><td> bir </td><td> 10.0 </td><td> 1 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> B </td><td> 5.00 </td><td> 1 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> C </td><td> 2.50 </td><td> 1 </td><td> 2.50 </td></tr><tr><td> D </td><td> 1.25 </td><td> 1 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> E </td><td> 0.625 </td><td> 1 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> F </td><td> 0.3125 </td><td> 1 </td><td> 00,3125 </td></tr><tr><td> G </td><td> 0.156 </td><td> 1 </td><td> 0.156 </td></tr><tr><td> H </td><td> 0.0 </td><td> 1 </td><td> 0.0 </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Standartlar konsantrasyonları. 4. DNA Elüsyon, Çapraz bağ Ters ve Proteinaz K Sindirim <ol><li> Manyetik rafa örnekleri ayarlayın. bağlanmamış antikor kromatin içeren süpernatant kurtarın. Not: Örnekler hızlı bir şekilde bu aşamada sıvı azot içinde dondurulmuş ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Kromatin Diğer antikor diğer immünopresipitasyon işlemleri de kullanılabilir. tampon C, 1 ml (daha önce tarif edilen düzenleme) ile, her numune 3 kez yıkayın. </li><li> Sıralı ChIP yıkandı talaş malzemlerden (Tablo 1) yapılması gerekiyorsa tampon D1 ya da D2 150 ul ilave edilerek antikor bağlı proteinini ayrıştırmak ve bir ısıtma bloğu içinde 50 ° C&#39;de 20 dakika boyunca numune inkübe edin. </li><li> tüpleri çıkarınısıtma bloğu ve manyetik rafa örnekleri koymak, (RNase-, DNase- ve pirojensiz onaylı) temiz bir 1.5 ml tüp süpernatant kurtarmak ve boncuk atın. </li><li> tampon C 2 hacim ikinci antikorun 3 ug 1 ekleyerek sıralı çip için süpernatan kullanarak veya 200 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere 5 M NaCl ilave edilerek çapraz ters. </li><li> Temiz bir 1.5 ml tüp içinde kromatin bir giriş, örnek hazırlama (RNase-, DNase- onaylı ve pirojensiz) su, 150 ul nihai hacim içinde, IP örnek (150 ug) bu kadar kromatin aynı miktarda alarak (RNase DNaz ücretsiz su). 200 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar 5M NaCI ekleyin. 65 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Bir sonraki gün, ısıtma bloğundan numunelerin çıkarılması cips malzemesinin 250 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek ve 2 saat süre ile 55 ° C &#39;de sindirimi 12.5 mm ve proteinaz K bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere, 250 mM EDTA ilave ısıtma bloğu. </li></ol><ol><li> tanelerin hazırlanması <ol><li> En az 30 dakika, girdap için boncuklar iyice oda sıcaklığında boncuk getirmek başlayın. Boncuk yerleşmek, bu yüzden pipetlerken zaman hızlı çalışır. Temiz bir 1.5 ml tüp Transfer boncuk 1 ml (RNase-, DNase- ve pirojensiz onaylı). </li><li> Çözelti netleştirmek için 3 dakika, ıskarta süpernatant - mıknatıs üzerinde yer alan 2 bekleyin. Mıknatısa çıkar 0.5 M EDTA 1 ml ilave edilir ve kısa bir vorteks ile karıştırın. </li><li> Adımı tekrarlayın 5.1.2 kez, ve sonunda süpernatant atın. </li><li> , Mıknatıs kaldırmak tampon E 1 ml ekleyin ve yavaş yavaş boncuklar tekrar süspansiyon. bir çalkalayıcı üzerinde bir tampon E yerine 50 ml tüm karışımı (Tampon E boncuklar) aktarmak ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın sağlar. </li><li> boncuk tanelerin 50 ul / DNA (1 hacim / 1 hacim) 50 ul, boncuk 100 ul: test 3 deney koşulları kullanılarak aşağıda tarif saflaştırma protokolü takip boncuk DNA bağlayıcıDNA / 50 ul (2 hacim / 1 hacim) ve boncuk 125 ul / DNA 50 ul (2.5 hacim / 1 hacim). Fragmanları (Şekil 1A) boyutunu kontrol etmek için bir% 1.5 agaroz jel üzerinde saflaştırılmış DNA göç edelim. </li></ol></li><li> DNA saflaştırma <ol><li> Her bir DNA örneği (yaklaşık 170 ul) manyetik boncuk bağlama DNA 425 ul (2.5 hacim) ilave. Aşağı (yaklaşık 10 kat) ve yukarı pipetlenerek yavaş yavaş yeniden süspanse edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Daha sonra süpernatant aspire ve (mıknatıs üzerine) atmak, 5 dakika mıknatıs üzerine yerleştirin. </li><li> 1 dakika, aspirat süpernatant bekleyin ve atın ve sonra bir kez daha önceki adımı tekrarlayın, mıknatıs üzerinde tüp taze yapılmış% 80 etanol 600 ul ekleyin. </li><li> Hızlı bir spin vermek 5 sn (mikrofujü) için, mıknatıs üzerinde tüp yerleştirmek ve etanol son damla kaldırın. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca kuruması </li><li> DNaz RNazsız su 20 ul ekleyerek DNA Zehir. mıknatıs çıkarın ve örnek vorteks. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra bir mıknatıs üzerinde örnekleri yer. yeni bir tüp içine aspire Yıkanarak ayrılan DNA (RNase-, DNase- ve pirojensiz onaylı). </li><li> DNA fragmanları (Şekil 1B) boyutunu kontrol etmek için bir% 1.5 agaroz jel üzerinde giriş fraksiyonu DNA çalıştırın. </li></ol></li></ol> 6. DNA Niceleme bir Floresan Algılama Instrument kullanma <ol><li> Seri olarak 7 dilüsyon artı herhangi bir DNA alanına (Tablo 3 &#39;de elde edilen seyreltme) bir toplamını elde etmek üzere su 1 ug DNA (1 kb merdiven) içerisinde seyreltin. </li><li> PCR Green I bir boya çözeltisi hazırlanır, bütün örneklerde (saflaştınldı, DNA ve standart dilüsyonlar AH) için yeterli: 1X TE tampon maddesi içinde yeşil boya 10,000X seyreltin. </li><li> kılcal damarların küvetlerde 10 ul 1x yeşil boya karışımı her DNA örnekleri (saflaştırılmış DNA ve standart dilüsyonlar AH) 1 ul ekleyin 488 nm dalga boyunda bir florimetrede okunmalıdır. Resim-DNA testi için, 1 x TE tamponu 1 ul kullanımı. </li><li> İnşa etmekBir kalibrasyon eğrisi grafik yazılımı kullanılarak ve ng / | il DNA örneklerinin aralığına görece derişimlerini saptamak. DNA, PCR için hazır bir hale gelir ve dizileme kütüphaneler için. </li></ol> 7. PCR <ol><li> primerlerin seçimi <ol><li> ilgi astar tasarımı ilgi genomik bölgeleri sorgulamak için. Tasarım primerler UCSC genom tarayıcısı kullanarak genlerin arttırıcı bölgelerini yükseltmek için. Arttırıcılar daha GEO veri kümesinde 9 Eldeki veriler H3K4me1 veya p300 ChIP-seq kullanılarak tahmin edilmektedir. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> 45 döngü (8 saniye 95 ° C, 8 saniye 60 ° C, 8 saniye, 72 ° C) 25 ul yeşil boya karışımı, 2 u.g DNA ve 0.5 ul primer karışımı bir gerçek-zamanlı PCR PCR kullanarak Çalışma PCR reaksiyonları (20 mcM stok çözelti) 10. </li></ol></li><li> zenginleştirme analizi <ol><li> Nükleozom en çok% 1 11 immunoprecipitated olduğunu varsayarak Mutlak zenginleştirmeyi hesaplayın. </li><li> inceler giriş DNA 0.1 ng ile karşılaştırıldığında 10 ng IP örnekleri daha büyük bir zenginleşme gösteriyorsa zenginleştirilmiş olarak genomik. </li><li> spesifik olmayan bir kontrol numunesi ile giriş ve ayarlamasına normalleştirme sonra zenginleştirilmemiş bölge üzerinde zenginleştirme misli artış olarak sonuçları ifade eder. </li><li> giriş DNA 100 (seyreltme faktörü veya DF) ile seyreltilmesi düşünün. </li><li> Ct [DF x Girdi] - aşağıdaki denklem 2 -ΔCt x 100%, -ΔCt = Ct [IP] kullanarak giriş normalleştirmek. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak kontrolünü ayarlayın (ACt [IP] -ΔCt [NS]) AD spesifik olmayan numune (hiçbir antikor IP veya IgG IP) olduğu. </li><li> 2 -ΔΔCt olarak numunenin kat zenginleştirme hesaplayın. sadece her PCR örneklerinin sonuçlarının analizini kolaylaştıracak girilebilir hangi formülleri ile hesaplamaların tüm adımları içeren bir dosya. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li>
<li>Chen, T., Dent, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+and+remodellers%3A+regulators+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation.</a> Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li>
<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+retardation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li>
<li>Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cardiac+development%3A+a+view+from+stem+cells+to+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).</li>
<li>Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+bivalent+epigenetic+marks+in+two+human+embryonic+stem+cell+lines+reveals+a+different+cardiogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential.</a> Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).</li>
<li>Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li>
<li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162, 948-959 (2015).</li>
<li>Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cohesin-OCT4+complex+mediates+Sox+enhancers+to+prime+an+early+embryonic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage.</a> Nat Commun. 6, 6749(2015).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q2ChIP%2C+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay%2C+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).</li>
<li>Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 315-326 (2006).</li>
<li>Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151, 206-220 (2012).</li>
<li>Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154, 888-903 (2013).</li>
<li>Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nat Commun. 6, 6033(2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Epigenetik gelişim biyolojisinde önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. genetik program embriyonik soyu içinde özel bir kimlik edinme hücreleri izin embriyonik hücreler aktive nasıl uzun süre gelişimsel biyologlar için bir kilit soru olmuştur. ChIP genel olarak son yıllarda içinde kullanılan ve sıralama çözünürlükte iyileştirilmesi ile DNA sekanslaması için kombine edilmiştir. Bu geniş bağımlı şekilde bir genom hücreleri veya belirli embriyonik ve yetişkin dokularda epigenetik manzara ...

<html> Kalp ilk organ oluşturulacak ve embriyo fonksiyonel olmaktır. Kalp birinci ve ikinci embriyonik kalp alanları 1 kaynaklanan birçok hücre soyları inşa edilmiştir. sonrası fertilizasyon blastosist şekilli kalp kadar sahneleyecek itibaren, embriyonik hücreler birçok hücre kader kararlar dolayısıyla var. Gen transkripsiyonu zaman ve uzay-bağlı bir şekilde düzenlenir ve embriyonik gelişim esnasında hücre kaderi karar altında yatan temel biyolojik bir süreçtir. Bu tür bir işlem arttırıcılar ve kardiyak yapısal genlerin promoterleri de dahil olmak üzere genomu içindeki düzenleyici bölgeleri bağlanan spesifik transkripsiyon faktörleri tarafından aracılık edilir. DNA, asetilasyon, metilasyon, ubikuitinilasyon ve / veya fosforilasyon gibi modifikasyonlara maruz histonlar sarılır. Histon modifikasyonu histonun lizin tortusu 2 modifiye edildiği olarak aktif, baskılanmış ya da kendine hakim gen transkripsiyonu yol açar. jove_content &quot;&gt; Kromatin immünopresipitasyon deneyi (ChIP) yıl önce 3 kurulmuştur ve en yaygın olarak kullanılan teknoloji modifiye histon ya da transkripsiyon faktörleri 4. histon veya transkripsiyon faktörlerinin immunoprecipitation takiben ya hedeflerini belirlemek için şu anda, ciltli DNA olabilir ya da polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilir veya dizilenmiştir. ChIP teknik olarak daha zor jel retardasyon testleri 5 üstesinden gelmiştir. Bununla birlikte yonga DNA, jel retardasyon tahlilinde bir avantajı, bir transkripsiyon faktörü bağlanma doğrudan anlamına gelmez. Öte yandan, bir çip üzerinde DNA dizilimi kombine gen düzenlemesi üzerinde yeni bir genom perspektif açtı. ES hücreleri (ES hücreleri) embriyoid organları içinde özetlemek (yani., Hücre agrega) veya 2D kültürü kalp gelişimi 6 erken aşamaları ve ChIP için prensip yeterli malzemenin sağlamaktadır. Ayrıca insan ES hücreleri bir Ca insan hücre modeli temsil ederbunların kardiyojenik potansiyeli, ancak rdiogenesis kendi epigenetik imza 7 bağlıdır. gelişimin ileriki aşamalarında, fare embriyonik dokular, hücre kimliğinin belirlenmesi için gerekli olan özel epigenetik manzara soruşturma için izin verir. Bununla birlikte, genom, bir zaman ve hücre tipine özgü bir şekilde 8 transkripsiyonu. Gen transkripsiyonu epigenetik düzenlemesi lokalize bölgelerde çalışılması gerekmektedir. Bu yazıda, PCR veya sıralama ES hücreleri, embriyoid organları ve kardiyak spesifik embriyonik bölgeleri kullanarak takip ChIP, ardışık ChIP protokollerini tanımlar. Bu protokoller kardiyak gen transkripsiyonu epigenetik düzenleme soruşturma için izin verir.

<table><tbody><tr><td>Formaldehit&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Hücre Fiksasyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>Çapraz bağlantı durdurma</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fluka</td><td>10820</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Leupeptin hemisülfat</td><td>Sigma</td><td>L2882</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Protein A manyetik boncuklar&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>10001D</td><td>İmmünopresipitasyon</td></tr><tr><td>SPRI manyetik boncuklar</td><td>Thermo Scientific</td><td>15002-01</td><td>DNA saflaştırma</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>25530-015</td><td>Protein sindirimi&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA BR standardı&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>Q32850</td><td>Kalibrasyon aralığı&nbsp;</td></tr><tr><td>Syber yeşil</td><td>Moleküler Problar</td><td>S-11484</td><td>DNA miktar tayini</td></tr><tr><td>TE tamponu&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>DNA miktar tayini</td></tr><tr><td>PBX 1x</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>14190-094</td><td>DNase</td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su</td><td>yıkama Yaşam teknolojileri</td><td>10977-035</td><td>Seyreltme</td></tr><tr><td>Axygen tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td>ChIP saflaştırma</td></tr><tr><td><güçlü>Antikor&nbsp; </güçlü></td><td><güçlü>Şirket</güçlü</td><td>><güçlü>Referans</güçlü></td><td><güçlü>ChIP konsantrasyonu</güçlü></td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td>3 ve mikro; ESC ve EB'ler için g, 1 ve mikro; dokular için g</td></tr>, <tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410194 (pAb-194-050)</td><td>3 & mikro; ESC ve EB'ler için g, 1 ve mikro; dokular için g</td></tr>, <tr><td>H3K36me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410058 (pAb-058-050)</td><td>3 & ESC ve EB'ler için g, 1 ve mikro; dokular için g</td></tr><tr><td>H3K9me2</td><td>Diagenode</td><td>C15410060 (pAb-060-050)</td><td>3 & mikro; ESC ve EB'ler için g, 1 ve mikro; dokular için g</td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410030 (pAb-030-050)</td><td>3 & mikro; ESC ve EB'ler için g, 1 ve mikro; dokular için g</td></tr><tr><td>, H3K27me3</td>, <td>Diagenode</td><td>C15410069 (pAb-069-050)</td><td>3 & mikro; ESC ve EB'ler için g, 1 ve mikro; dokular için g</td></tr></tbody></table>

embriyonik kök hücre ve doku kardiyak farklılaşma epigenetik yönetmelik

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Özgü gen transkripsiyonu embriyonik gelişim sırasında hücre kaderi kararı altında yatan önemli bir biyolojik süreçtir. Biyolojik işlem arttırıcılar ve kardiyak yapısal genlerin promoterleri de dahil olmak üzere genomik düzenleyici bölgeleri bağlanan transkripsiyon faktörleri tarafından aracılık edilir. DNA, kimyasal modifikasyonlar maruz histonlar sarılır. histon modifikasyonları daha böylece gen transkripsiyonu ince ayar düzenlemesi bir seviye getiren, aktif, bastırılmış ya da kendine hakim gen transkripsiyonu yol açar. Embriyonik Kök hücreler (ES hücreleri) kalp gelişiminin erken adımlar embriyoid organları (yani, hücre agrega) içinde veya 2D kültüründe özetlemek. Onlar kromatin immunoprecipitation (ChIP) için prensip yeterli malzemenin temin, teknik geniş gen düzenleyici bölgeleri tanımlamak için kullanılan. Ayrıca insan ES hücreleri cardiogenesis bir insan hücre modeli temsil etmektedir. gelişimin ileriki aşamalarında, fare embriyonik dokular için izinHücre kimliğinin belirlenmesi için gerekli olan özel epigenetik manzara soruşturma. Bu yazıda, PCR veya ES hücreleri, embriyoid organları ve kardiyak spesifik embriyonik bölgeleri kullanarak ChIP-dizileme ile takip ChIP, ardışık ChIP protokollerini tanımlar. Bu protokoller kardiyak gen transkripsiyonu epigenetik düzenleme soruşturma için izin verir.

Şekil 1A, ilk DNA bağlayıcı boncuk ve farklı boyutlarda (1 kb merdiven) DNA kullanılarak kalite kontrol hazırlanmasını görüntülemektedir. 0NE, boncuk 2 ve 2.5 hacim (1 ila 3), yüksek ve düşük moleküler boy DNA fragmanlarının saflaştırmak için örnek bir hacim ilave edilmiştir. Şekil 1 B, C, D, sırasıyla fare ES hücreleri, embriyoid organları ya da (25 E9.5 ventrikül toplanmış), bir kalp embriyo...

Gen transkripsiyonu bir ince ayar düzenlemesi embriyonik hücre kaderi kararı temelini oluşturmaktadır. Bu yazıda, kök hücre ve fare embriyoları kalp gelişimi hem kalp farklılaşma epigenetik düzenleme araştırmak için kullanılan kromatin immünopresipitasyon analizler açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Bu kromatin immünopresipitasyon yaklaşımlarının farklılaşan embriyonik kök hücrelere veya kardiyak embriyonik dokulara uygulanmasının genel amacı, kardiyak gelişimin epigenetik düzenlemesini ortaya çıkarmaktır. Embriyonik kalp gelişimi sırasında gen transkripsiyonunun ince ayarı epigenetik bileşenler tarafından düzenlendiğinden, kromatin immünopresipitasyon bu süreci anlamak için uygun bir yaklaşımdır.Bu tekniğin temel avantajı, spesifik bir lokusu hedefleyebilmemiz ve DNA'nın o belirli parçasında bulunan epigenetik işaretleri inceleyebilmemizdir. Bu yöntem, kardiyak gelişimin epigenetik düzenlenmesine dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca diğer organlara veya herhangi bir hücre tipine de uygulanabilir.Bu Imen. Kendisi laboratuvarda doktora öğrencisidir ve deneyi bugün gerçekleştirecektir. Bu prosedürde embriyonik kök hücreler veya ES hücreleri kullanılmaktadır.ES hücrelerinden oluşturulan embriyoid cisimcikler ve E9.5 fare embriyolarından diseke edilen embriyonik kalp dokuları. Hücreleri ve dokuları fikse edin. Hücreler için PBS içinde %1 formaldehit, embriyonik dokular için ise PB2 permeabilizasyon tamponu kullanın.Tüpleri, oda sıcaklığında, 60 RPM hızındaki bir orbital çalkalayıcıya

epigenetic-regulation-cardiac-differentiation-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz bir fare ES hücre tabanlı testin Wnt / β-katenin ve kardiyojenik indüksiyon sırasında BMP sinyal aktivasyonu için kritik zaman pencere tanımlamak için kullandıklarını açıklarlar. Bu yöntem, güvenilir bir kardiyojenik verimliliği rakamlarla standart bir platform sağlar ve diğer hücre soylarının çalışma için geçerlidir.

Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Bu protokolde, hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesi gösterilecektir. Bu protokoldeki ana strateji, embriyonik kök hücre hatlarına tasarlanmış floresan raportörler kullanarak kardiyak progenitör hücreleri akış sitometrisi ile zenginleştirmektir.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Pluripotent kök hücrelerden in vitro kardiyomiyositlerin üretilmesi, temel bilim ve klinik uygulamalar için in vitro olarak büyük miktarlarda kalp dokusuna erişim sağlar.  Bu protokol, hem elde edilen kardiyomiyositlerin sayısını artırmak hem de atriyal fenotipli kardiyomiyositler oluşturmak için atriyalize edici faktör Grem2'yi kullanır.

BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma

Bu protokol, yüksek verim, saflık ve canlılığa sahip yetişkin fare kardiyomiyositlerinin tekrarlanabilir izolasyonu ve uzun süreli kültürü için adım adım bir yöntemi açıklar.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Bu el yazması, Gata4, Hand2, Mef2c ve Tbx5'in retrovirüs aracılı bir iletimini kullanarak çeşitli yeniden programlanmış kardiyak alt tiplerin oluşturulması ve ölçülmesi için adım adım bir protokolü açıklar.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Burada ilk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes insan pluripotent kök hücre üretmek için aktivin A ve lentivirus-aracılı ID1-overexpression, basit bir birleşimini kullanarak ölçeklenebilir bir yöntem açıklanmaktadır.

İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil

Keşfedin, kromatin immünopresipitasyonu ile embriyonik kök hücrelerde kardiyak farklılaşmanın epigenetik düzenlenmesini nasıl analiz edebilirsiniz. Bu yöntem, gen transkripsiyonunun hücre kaderi kararlarındaki rolünü anlamanıza yardımcı olur.

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Daha fazla video keşfet