Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Bu kromatin immünopresipitasyon yaklaşımlarının farklılaşan embriyonik kök hücrelere veya kardiyak embriyonik dokulara uygulanmasının genel amacı, kardiyak gelişimin epigenetik düzenlemesini ortaya çıkarmaktır. Embriyonik kalp gelişimi sırasında gen transkripsiyonunun ince ayarı epigenetik bileşenler tarafından düzenlendiğinden, kromatin immünopresipitasyon bu süreci anlamak için uygun bir yaklaşımdır.

Bu tekniğin temel avantajı, spesifik bir lokusu hedefleyebilmemiz ve DNA'nın o belirli parçasında bulunan epigenetik işaretleri inceleyebilmemizdir. Bu yöntem, kardiyak gelişimin epigenetik düzenlenmesine dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca diğer organlara veya herhangi bir hücre tipine de uygulanabilir.

Bu Imen. Kendisi laboratuvarda doktora öğrencisidir ve deneyi bugün gerçekleştirecektir. Bu prosedürde embriyonik kök hücreler veya ES hücreleri kullanılmaktadır.

ES hücrelerinden oluşturulan embriyoid cisimcikler ve E9.5 fare embriyolarından diseke edilen embriyonik kalp dokuları. Hücreleri ve dokuları fikse edin. Hücreler için PBS içinde %1 formaldehit, embriyonik dokular için ise PB2 permeabilizasyon tamponu kullanın.

Tüpleri, oda sıcaklığında, 60 RPM hızındaki bir orbital çalkalayıcıya tam olarak 10 dakika boyunca yerleştirin. Final konsantrasyonu 125 millimolar olacak şekilde glisin ekleyerek çapraz bağlanma reaksiyonunu durdurun ve oda sıcaklığında, 60 RPM hızındaki orbital çalkalayıcıda beş dakika boyunca inkübe edin. Bu prosedüre başlamak için, peleti 10 mililitre PBS içinde yeniden süspande edin.

Ve 1 mL PB2 içindeki embriyonik dokular. 4 °C'de, 1000 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve ikinci bir yıkama için ilgili tampon çözeltiyi ekleyin.

Buz üzerinde PB1 ve PB2 tamponlarına proteaz inhibitörleri ekleyin. Hücre pelletine, proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş bir mililitre PB1 tamponu ekleyin ve hücreleri yeniden süspande etmek için pipetle alt üst ederek karıştırın. Aynı şekilde, embriyonik dokuları proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş bir mililitre PB2 tamponunda yeniden süspande edin.

Ardından, hücreleri veya dokuları homojenize etmek için 21 gauge iğneli bir mililitre şırınga kullanın. Hücre süspansiyonunu temiz bir 1,5 mililitre tüpe aktarın. Homojenize edilmiş hücreleri ve dokuları 4 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

4 °C'de, 3000 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve her peleti, proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş, ilgili sonikasyon tamponunun 300 µL'sinde yeniden süspande edin. Herhangi bir DNA degradasyonunu önlemek için hücre süspansiyonunu sertifikalı RNase, DNase ve pirojen içermeyen bir tüpe aktarın ve buz üzerinde 15 ila 30 dakika inkübe edin.

Kromatini parçalamak için, her bir materyal için uygun sonikasyon programını kullanarak numuneleri dört derece Celsius'ta sonike edin. Sonikasyon süresini, DNA'nın PCR veya sekanslama için kullanılıp kullanılmayacağına göre ayarlayın. Ardından, sonike edilmiş hücre lizatlarını 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Her bir örnekteki çözelti halindeki kromatin olan süpernatantı temiz bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve peleti atın. Her örnekten 1,5 mikrolitrelik bir alikot alın ve su ile 1:10 oranında seyreltin. Protein konsantrasyonunu belirlemek için tüm örneklerin optik yoğunluğunu bir nano spektrofotometrede ölçün.

Kromatin immünopresipitasyonundan önce, protokol metninde açıklandığı şekilde yıkayarak protein A konjuge boncukları hazırlayın. Temiz bir 1,5 mililitre tüpte, modifiye histonlara veya transkripsiyon faktörlerine karşı geliştirilmiş antikoru, 20 mikrolitre yıkanmış protein A konjuge boncuğu ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş bir mililitre tampon C'yi birleştirin. Örnekleri bir rotatörde, 4 °C'de en az iki saat boyunca 40 RPM'de inkübe edin.

Antikor boncuk komplekslerini, protokol metninde açıklandığı gibi, bir mililitre Tampon C ile üç kez yıkayın. Biri 150 mikrogram kromatin ve antikor boncuk kompleksleri içeren, diğeri ise 150 mikrogram kromatin ve 20 mikrolitre yıkanmış boncuklar içeren iki tüp hazırlayın. Her tüpe proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş bir mililitre Tampon C ekleyin ve örnekleri döndürmeli bir düzenekte 40 RPM'de, dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin.

Gece boyu süren immünopresipitasyon tamamlandığında, örnekleri manyetik rafa yerleştirin ve bağlanmamış antikor kromatinini içeren süpernatantı geri kazanın. Yıkanmış materyallere 150 µL buffer D1 ekleyerek antikora bağlı proteini elüe edin. Örnekleri bir ısıtma bloğunda 50 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.

20 dakika sonra örnekleri ısıtma bloğundan çıkarın ve manyetik rafa yerleştirin. Süpernatantı temiz bir 1.5 mililitrelik tüpe alın ve boncukları atın. Çapraz bağlamayı geri çevirmek için, süpernatanta 200 milimolar nihai konsantrasyon elde edecek şekilde beş molar sodyum klorür ekleyin.

Temiz bir 1,5 mililitrelik tüpte bir kromatin giriş örneği hazırlayın. 150 mikrolitre RNaz ve DNaz içermeyen su ile son konsantrasyonu 200 milimolar olacak şekilde beş molar sodyum klorür içeren nihai hacimde, immünopresipitasyon örneğiyle aynı miktarda kromatin kullanın. Örnekleri 65 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, örnekleri ısıtma bloğundan çıkarın. 12,5 millimolar nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde EDTA ve mililitre başına 250 micrograms nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde Proteinase K ekleyin ve 55 degree Celsius'ta iki saat boyunca sindirin. Bu prosedüre boncukları hazırlayarak başlayın.

Öncelikle boncukları en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığına getirin. Ardından boncukları çok iyi şekilde vorteksleyin ve bir mililitre boncuğu temiz bir 1,5 mililitrelik tüpe hızlıca pipetleyin. Çözeltinin berraklaşması için boncuk içeren tüpü iki ila üç dakika boyunca mıknatıs üzerinde bekletin ve süpernatantı atın.

Tübü mıknatıstan çıkarın. Bir mililitre 0.5 molar EDTA ekleyin ve kısa süreli vorteksleyerek karıştırın. Boncukları bu şekilde iki kez yıkayın ve son yıkamadan sonra süpernatantı atın.

Tüpü mıknatıstan çıkarın. Bir mililitre tampon E ekleyin ve boncukları yavaşça resüspande edin. Tüm karışımı 50 mililitre tampon E içerisine aktarın. Bir çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca yavaşça karışmaya bırakın.

Ardından, DNA bağlama boncuklarını bir 1 KB DNA merdiveni ve üç farklı boncuk hacmi/DNA hacmi oranı kullanarak test edin. 2.5/1 oranının DNA bağlama için en iyi sonucu verdiği belirlenmiştir. Boncukları DNA saflaştırması için kullanmak üzere, her DNA örneğine 425 mikrolitre veya 2,5 hacim boncuk ekleyin ve pipetle yaklaşık 10 kez yukarı-aşağı yaparak yavaşça yeniden süspande edin.

Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Beş dakika boyunca mıknatıs üzerinde bekletin. Ardından süpernatantı aspire edin ve atın.

Her tüpe 600 microliters ekleyerek, taze hazırlanmış %80 ethanol ile iki kez yıkayın. Bir dakika bekleyin, ardından süpernatantı aspire edin ve atın. Tüpleri kısa süreli santrifüjleyin.

Tüpleri mıknatıs üzerine yerleştirin. Kalan son etanol damlalarını uzaklaştırın ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca kurumaya bırakın. Örneği mıknatıstan ayırın ve 20 µL DNaz ve RNaz içermeyen su ekleyerek DNA'yı elüe edin. Vorteksleyin.

Agaroz jel elektroforezi; fare ES hücrelerinden, embriyoid gövdelerden ve embriyonik kalp dokusundan ekstrakte edilen, sonikasyona uğramış toplam DNA'nın ters çapraz bağlarının çözündürülmesinden sonra elde edilen DNA fragmanlarının boyutlarını ortaya koymuştur. Bir kromatin immünopresipitasyon deneyi, ES hücreleri mezodermal bir hücre kaderine doğru farklılaştığında, epitelyal-mezenşimal geçiş genlerinin epigenetik regülasyonunu vahşi tip veya genetik olarak mutasyona uğramış hücrelerde incelemek üzere tasarlanmıştır. Modifiye histonların bağlanması, E-Cadherin ve Twist genlerinin promoterlerinin veya enhancerlarının PCR analizi ile izlenmiştir.

Ardışık kromatin immün çöktürme, dört insan ES hücre hattından ekstrakte edilen kromatin üzerinde, önce kromatin aktive edici bir marköre, ardından baskılayıcı bir marköre yönelik antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu markörler, hücreler morfogenlere maruz kaldığında modifiye olur ancak insan ES hücre hatlarına bağlı olarak değişkenlik gösterir. Bu durum muhtemelen, türetildikleri orijinal blastokistler nedeniyle gerçekleşmektedir.

Kromatin immünopresipitasyonu, belirli embriyonik kalp bölgelerinden ekstrakte edilen kromatin üzerinde de uygulanabilir. Bu şekil, modifiye histonla zenginleşmiş olan Nkx2.5 ve TBx5 kalp genlerinin genomik bölgelerini ve ventrikülde eksprese edilmeyen ve zenginleşmemiş olan Shox2 pacemaker spesifik geninin bir genomik bölgesini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde üç saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, IP protokolüne başlamadan önce bir sonikasyon verimliliği ölçümü yapmayı hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kromatinin açık veya kapalı olan eski durumunu sorgulamak veya nükleozom aralıklarını izlemek gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla Eth-ek-se-ek gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, epigenetik alanındaki araştırmacıların herhangi bir hücre tipinde veya embriyonik organda hücre kaderi kararlarının epigenetik düzenlemesini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, kromatin immünopresipitasyon analizlerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.