Name: DOĞRU gen susturma: Potansiyel Kanser Tedavi Ajanlar için heptamer tipi Küçük Rehberi RNA Kütüphanesi Taranması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Keşfedin heptamer tipi sgRNA kütüphanesi tarama protokolünü kan kanserlerine yönelik potansiyel tedavi ajanlarını belirlemek için. Bu yöntem ilaç keşfi sürecini hızlandırarak yeni tedavi seçenekleri sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Hedef odaklı Ar-Ge, Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı, Japonya Özel Okullar Tanıtım ve Yardımlaşma Corporation Bilim Araştırma Teşvik Fonu aracılığıyla Uyarlanabilir ve Dikişsiz Teknoloji Transferi Programı tarafından desteklenen ve JSPS KAKENHI Hibe Numaraları 24300342 ve 15H04313 oldu .

Bir heptamer tipi 1. İnşaat sgRNA Kütüphanesi <ol><li> Tam ölçekli bir kütüphane inşa edilecek sürece 16.384 (4 7) 7-nt dizilerinin bir alt kümesini seçin. Not: dizileri rasgele ve / veya belirli bir hücre RNA&#39;lar hedeflemek için tasarlanmış olabilir. İkincisi, saç tokası yapıları 4,10 hemen alt baş 7-nt dizilere tamamlayıcı uygun bir bilgisayar programı ve / veya görsel olarak basıp dizilerin yardımı ile, bir hedef RNA tRNA T kolunu benzer saç tokası yapıları bulmak 17,18. </li><li> Seçilen heptamerlerin her sentezleme tam 2&#39;- O metillenmiş, 5&#39;- ve bir DNA / RNA sentezleyici ile 3&#39;-fosforile edilmiş RNA. Kontrollü gözenekli cam (CPG) Zemin üzerinde fosforamidit yöntemini kullanarak, ve 5&#39;-terminal 4,4&#39;-dimetoksitritil (DMT) sentezin son döngüde (5 &#39;fosfat ilave) koruma grubu terk 23. NOT: Özel synthetic RNA da oligonükleotid tedarikçilerden elde edilebilir. </li><li> Son sentez döngüsünün tamamlanmasından sonra, 8 saat boyunca 55 ° C &#39;de, 1 ml 29%&#39; si amonyum hidroksit ekleyin Teflon astar vidalı kapaklı bir cam şişeye sütun sentezlenen oligonükleotid ile CPG transferi ve inkübe CPG, oligonükleotidin ayrılması ve bazlar ve fosfatlar koruma gruplarını kaldırmak. </li><li> 40 ° C &#39;de santrifüj lü bir evaporatörde amonyum hidroksit buharlaştınn ve 0.2 ml 0.1 M n-hexylammonium asetat içinde oligonükleotid yeniden çözülür. </li><li> % 10-50 asetonitril / 0.1 M n-hexylammonium asetat ihtiva eden bir tampon maddesi ile bir polistiren-divinilbenzen kolonu kullanılarak ters-faz yüksek performans sıvı kromatografi yoluyla sentetik oligonükleotit saflaştınlır. 80 ° C de 25 dakika süreyle / 2.0 ml dk sütun çalıştırın. </li><li> % 20 asetik asit solüsyonu yapmak için kısımlara ayrılmış örnek (1-2 mi) konsantre asetik asit 0.25-0.5 ml ilave edilir, ve doğmuş iyileşmesinite oda sıcaklığında 1 saat boyunca bu çözelti, DMT grubu çıkarmak için. </li><li> 40 ° C &#39;de santrifüj lü bir evaporatörde örnek kurutun, 1 mi 29% amonyak içinde yeniden çözülür ve 5&#39; fosfat yan zincirini çıkarmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca çözeltiden inkübe edin. </li><li> 40 ° C &#39;de santrifüj lü bir evaporatörde 0.3 ml numune hacmi (1 mi) azaltır. </li><li> kesme 1000, 4 ° C&#39;de bir gece boyunca moleküler ağırlığa sahip bir diyaliz tüpü kullanılarak damıtılmış su karşı tüm konsantre edildi örneği (500 mi) diyaliz. </li><li> Daha sonra, bir pipet ile 1.5 ml tüp diyaliz tüpünden diyaliz örnek aktarın 40 ° C &#39;de santrifüj lü bir evaporatörde kurutun ve hacmi arasında olmalıdır, su için enjeksiyon dereceli su içinde yeniden çözülür daha büyük bir 100 uM çözelti yapmak için yeteri kadar küçük olabilir. </li><li> bir spektrofotometre ile 260 nm&#39;de RNA numunesinin optik yoğunluğunun ölçülmesi ve 100 olan konsantrasyonunu ayarlamakSu için enjeksiyon dereceli su ilave edilerek uM. -20 ° C Kullanmadan önce aşağıda RNA çözümü saklayın. </li></ol> Hücre Canlılığına için sgRNA Kütüphanesi 2. Eleme <ol><li> Hazırlama 10 3 hücre / 99 ul / göz (ör HL60 ve RPMI-8226),% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde bir 96-yuvalı tabak üzerinde. Sadece arka plan çıkarma için ortam içeren kuyu hazırlayın. numune kuyuları çevreleyen kuyu boş steril su ekleyin, kenar etkilerini ortadan kaldırmak için. </li><li> her bir suda için enjeksiyon dereceli su içinde çözülmüş heptamer tipi sgRNA (100 uM) 1 ul ekle. üç kez, her sgRNA deneyi. 3 gün boyunca% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> Her bir oyuğa, bir ticari olarak temin edilebilir WST-8 çözeltisinin uygun bir hacmi ekleyin. 1 ila 4 saat boyunca, aynı inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> absorbans a ölçünBir mikro levha okuyucusu ile 450 nm t. NOT: Bir çok durumda, emme ve canlı hücre sayısı arasındaki doğrusal absorbans değeri 1.0 aşmadıkça muhafaza gibi görünmektedir. </li></ol> Akış Sitometrisi ile Etkili sgRNAlardır 3. Değerlendirilmesi <ol><li> Hazırlama 10 3 hücre /% 10 fetal bovin serumu ve% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde bir 96-yuvalı tabak üzerinde 99 ul / göz (ör HL60). bir sgRNA test edilecek en az 10 kuyu hazırlayın. numune kuyuları çevreleyen kuyu boş steril su ekleyin, kenar etkilerini ortadan kaldırmak için. </li><li> her bir suda için enjeksiyon dereceli su içinde çözülmüş heptamer tipi sgRNA (100 uM) 1 ul ekle. 3 gün boyunca% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> bir pipet, bir 5-ml&#39;lik bir tüp içine en az 10 kuyu aynı sgRNA ile muamele hücreleri toplamak. 30 ° C&#39;de bir santrifüj içinde 5 dakika boyunca tüp spin0 xg ve medya atın. </li><li> tüpe 1X fosfat tamponlu salin (PBS) 2 ml ilave edilir ve hücreler yeniden askıya. 300 x g&#39;de santrifüj içinde 5 dakika boyunca tüp spin ve PBS atın. tüp 1x anneksin V bağlayıcı tampon 150 ul ekleyin ve hücrelerin yeniden askıya. </li><li> , Fikoeritrin 2 ul (PE) ile konjüge edilmiş anneksin V çözeltisi ve tüp 7-aminoactinomycin D (7AAD) çözeltisi 1 ul ekle iyice karıştırın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tüp inkübe edin. 24 debi sitometresinde örnek analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScherer%2C+L+%22RNA+and+the+Regulation+of+Gene+Expression%3A+A+hidden+layer+of+complexity%22">RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity</a>. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5%E2%80%B2+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li>
<li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3%E2%80%B2+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).</li>
<li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li>
<li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+mRNA+cleavage+by+3%E2%80%B2+tRNase+under+the+direction+of+2%E2%80%B2-O-methyl+RNA+heptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li>
<li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li>
<li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li>
<li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5%E2%80%B2-half-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908(2009).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li>
<li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631(2015).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li>
<li>Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis">http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis</a> (2015).</li>
<li>FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf">http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf</a> (2007).</li>
<li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729(2014).</li>
</ol>

Niigata Eczacılık ve Uygulamalı Yaşam Bilimleri Üniversitesi'nin, heptamer tipi sgRNA'ların bir alt kümesi üzerinde bekleyen bir patent başvurusu vardır.

Çoğu durumda, enjeksiyonluk su dereceli suda (100 μM konsantrasyonda) çözünmüş tamamen 2′-O-metillenmiş, 5′- ve 3′-fosforile heptamer tipi sgRNA'lar, kanser hücrelerinde apoptozu indükleme aktivitelerine bakılırsa, en az bir yıl boyunca -20 °C'nin altında stabil görünmektedir. Bununla birlikte, kararlılıkları sıralarına, kalitelerine ve saflıklarına bağlı olarak değişecektir. Bazı durumlarda, kütle spektrometrisi analizine bakılırsa, sgRNA moleküllerinin bir kısmının 5′- veya 3′-fosfatı, aktivitelerini ciddi şek...

(TR Nase Z L sonra adlandırılan - u E fficacious gen susmasının tilizing) DOĞRU gen susturma RNA yönelik gen susturma teknolojileri 1 biridir. Bu teknoloji geliştirdi tRNase Z L (ya da 3 &#39;tRNase), tRNA 3&#39; işleme endoribonuclease özelliklerine dayanarak olmuştur: Bir tanıyarak yapay küçük bir rehber RNA (sgRNA) yönetimindeki herhangi beklenen yerinde herhangi bir hedef RNA yarabilir 9 - hedef RNA ve sgRNA 2 arasında oluşturulmuş önceden tRNA benzeri ya da mikro-ön-tRNA-benzeri bir yapı. uzunluğunda nt genellikle 7-31 olan sgRNA, dört gruba, 5&#39;-yarım-tRNA, heptamer RNA, 14-nt lineer RNA ve kanca RNA kategorize edilir. 15 - Biz hücreler 10 canlı içine çeşitli yapay olarak tasarlanmış sgRNAlardır sunarak DOĞRU gen susturma etkinliğini göstermiştir. Biz de sgRNAlardır hücrelerin wi tarafından alınabilir göstermiştirherhangi bir transfeksiyon reaktifleri thout ve hedef RNA seviyelerini bozulduğunu ve / veya insan kanser hücrelerinin 16 apoptosis doğurabileceği - 18. 21 - DOĞRU gen susturma tRNase Z L ve doğal sgRNAlardır 19 üzerinden hücre içi ve hücreler arası gen düzenleyici ağ sistemi üzerinde çalışması için görünür. Kan kanserleri 22 potansiyel terapötik heptamer tipi sgRNAlardır aramak için 156 heptamer tipi sgRNAlardır içeren bir sgRNA kütüphane inşa ettik. İnsan miyeloma ve lösemi hücrelerinin ömrü üzerindeki etkisi için filtrelenmiş ve 20 tanesi etkin kanser hücre çizgilerinin en az biri apoptosis bulmuşlardır. Ve bunların 4 fare ksenogreft deneylerinde tümör büyüme oranlarını azaltmak için gösterilmiştir. Burada kan kanserlerine karşı potansiyel terapötik ilaçların bir heptamer tipi sgRNA kitaplığının taranması için bir protokol mevcut. protokol nasıl dahilhücre canlılığı ve nasıl daha fazla flow sitometri ile etkili sgRNAlardır değerlendirmek için her sgRNA etkisini değerlendirmek için nasıl sgRNA kütüphanesini oluşturmak için. Bunlar, bu protokolde yer almaz, ancak fare ksenogreft modellerinde sgRNA hücresel hedef RNAlar için analiz ve etkili sgRNAlardır değerlendirilmesi, geleneksel yöntemlerle 17,22 göre gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>Özel heptamer RNA</td><td>Nippon Bioservice</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoSep Hazırlık HC Kartuş</td><td>Transgenomik</td><td>99-3860</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon için su sınıfı Su</td><td>Otsuka İlaç&nbsp;</td><td>7131400A2129</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 orta</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Karışık Çözelti</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyu Plakası</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sayma Seti-8</td><td>DOJINDO</td><td>343-07623</td><td>WST-8 Çözüm</td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu, Sunrise Thermo RC-R</td><td>TEKAN</td><td>510-82851</td><td></td></tr><tr><td>FACS Yuvarlak Tabanlı Boru</td><td>BD Falcon</td><td>60819-820</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Bağlayıcı Tampon</td><td>BD Biosciences</td><td>51-66121E</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V</td><td>BD Biosciences</td><td>51-65875X</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Akış Sitometresi, FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342973</td><td></td></tr></tbody></table>

doĞru gen susturma: potansiyel kanser tedavi ajanlar için heptamer tipi küçük rehberi rna kütüphanesi taranması

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

DOĞRU gen susturma (tR Nase Z L sonra adlandırılan - u, e fficacious gen susturulması tilizing) tRNA 3 &#39;işleme endoribonuclease, tRNase Z L rehberlik edecek bir yapay küçük bir rehber RNA (sgRNA) kullanır teknolojileri susturma RNA yönettiği genin, biri bir hedef RNA tanımak için. sgRNAlardır bir transfeksiyon reaktifleri olmayan hücreler tarafından alınabilir ve hedef RNA seviyelerini bozulduğunu ve / veya insan kanser hücrelerinde apoptosisi teşvik edebilir. İnsan miyeloma ve lösemi hücrelerinin canlılığı üzerindeki etki için 156 heptamer tipi sgRNAlardır ihtiva eden bir sgRNA kitaplığı tarandı ve bunların 20 verimli, kanser hücre çizgilerinin en az biri apoptosis bulmuşlardır. Burada kan kanserlerine karşı potansiyel terapötik ilaçların bir heptamer tipi sgRNA kitaplığının taranması için bir protokol mevcut. protokol hücre canlılığı ve her sgRNA etkisini değerlendirmek nasıl fu için nasıl, sgRNA kütüphane oluşturmak için nasıl dahilrther flow sitometri ile etkili sgRNAlardır değerlendirir. Yaklaşık 2000 hit 16.384 heptamerlerin oluşan tam ölçekli sgRNA kütüphanenin taranması ile elde edilebilir olması beklenmektedir.

Altı heptamer tipi sgRNAlardır 5&#39;-AUCUUCA-3 &#39;(H1885), 5&#39;-ACACACA-3&#39; (H3277), 5&#39;-GGGGGCG-3 &#39;(H10927), 5&#39;-GGGGCCC-3&#39; (H10944), 5&#39;-GCCCCCG-3 &#39;(H12287), ve 5&#39;-CACCAGC-3&#39; (H13260) kimyasal 5&#39;- ve 3&#39;-fosfat ihtiva eden 2&#39;-O-metil RNA sentez edildi. Bu sgRNAlardır insan lösemi hücre hattı, HL60, ve bir insan miyeloma hücre hattı RPMI-8226 canlılığı üzerindeki etkile...

Burada kan kanserlerine karşı potansiyel terapötik ilaçların bir heptamer tipi sgRNA kitaplığının taranması için bir protokol mevcut.

DOĞRU gen susturma: Potansiyel Kanser Tedavi Ajanlar için heptamer tipi Küçük Rehberi RNA Kütüphanesi Taranması

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

Bu taramanın genel amacı, kan kanserlerine karşı potansiyel terapötik ilaçlar bulmaktır. Bu prosedüre, Heptamer dizilerinin bir alt kümesini seçerek başlayın. Diziler rastgele olabilir veya belirli hücresel RNA'ları hedeflemek üzere tasarlanabilir. Belirli hücresel RNA'ları hedeflemek için, hedef bir RNA'daki T-koluna benzeyen saç tokası yapılarını bulmak amacıyla uygun bir bilgisayar programı kullanın. Saç tokasının hemen aşağısındaki tamamlayıcı yedi nükleotidlik dizileri seçin. Kontrollü gözenekli cam veya CPG destek üzerinde fosforamidit yöntemini kullanarak, seçilen Heptamerlerin her birini DNA-RNA sentezleyici ile tamamen 2-prime O-metillenmiş, 5-prime ve 3-prime fosforile edilmiş RNA olarak sentezleyin. Sentezin son döngüsünde 5-prime terminal DMT koruyucu grubunu bırakın. Son döngünün tamamlanmasının ardından, sentezlenmiş oligonükleotidi içeren CPG'yi kolondan teflon kapaklı vidalı bir cam şişeye aktarın. 1mL %29 amonyum hidroksit ekleyin ve tüpü 55

true-gene-silencing-screening-heptamer-type-small-guide-rna-library

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada bir insan esiRNA kütüphane ilgili genler hücre bölünmesi için yüksek verimli bir ekran kullanın. Biz nasıl bir esiRNA ekranlarının yanı sıra, sonuçları nasıl analiz etmek ve doğrulamak için kurmak ve yürütmek göstermektedir.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

Burada hücre sağkalım teşvik gen hedefleri belirlemek için sıralama yöntemlerini bir insan LentiPlex toplanmış kütüphane ve geleneksel kullanın. Biz kurmak ve deconvolute bir LentiPlex ekran ve sonuçları doğrulamak nasıl göstermektedir.

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite...

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.

HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için, çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi kullanarak dizili lentiviral veya retroviral RNAi kitaplıklarını taramak için bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, tek bir deneyde yüzlerce adayı taramak için hızlı ve nispeten ucuz bir yol sunar.

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Bir lentiviral shRNA havuzu kullanılarak yüksek verimli RNA girişimi (RNAi) taraması, malignitelerde terapötik olarak ilgili sentetik ölümcül hedefleri tespit etmek için bir araç olabilir. Akut miyeloid lösemide (AML) epigenetik efektörleri araştırmak için havuzlanmış bir shRNA tarama yaklaşımı sunuyoruz.

Bir İlaç Direnci Fenotipini Modüle Eden Faktörleri Tanımlamak için Havuzlanmış shRNA Kütüphanesi Taraması

Genetiği değiştirilmiş fare modellerinde ortaya çıkan tümörlerde terapötik hedefleri ve karşılık gelen insan tümör tipini belirlemek ve karşılaştırmak için genomik analizler ve fonksiyonel genomik ekranlar kullanan türler arası karşılaştırmalı bir onkogenomik yaklaşım geliştirdik.

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörünün Fare Modellerinde Terapötik Hedefleri Belirlemek için Genetik Profilleme ve Genom Ölçeğinde Bırakma Taraması

Keşfedin heptamer tipi sgRNA kütüphanesi tarama protokolünü kan kanserlerine yönelik potansiyel tedavi ajanlarını belirlemek için. Bu yöntem ilaç keşfi sürecini hızlandırarak yeni tedavi seçenekleri sunar.

DOĞRU gen susturma: Potansiyel Kanser Tedavi Ajanlar için heptamer tipi Küçük Rehberi RNA Kütüphanesi Taranması

Daha fazla video keşfet