Name: Yetişkin Cilt Fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir Güvenli ve Basit Yöntem olarak epigenetik Dönüşüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Öğrenin yetişkin cilt fibroblastlarını epigenetik dönüşümle insülin salgılayan hücrelere dönüştürme yöntemini. Bu güvenli teknik, retroviral vektör kullanmadan diyabet hücre tedavisinde umut vadeden bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Carraresi Vakfı ve Diyabet Araştırmaları için Avrupa Vakfı (EFSD) tarafından finanse edildi. GP Milano Üniversitesi&#39;nden bir post-doc bursu tarafından desteklenmektedir. Epigenetik ve Periconception çevre ve BM1308 Paylaşımı büyük hayvan modellerinde gelişmeler MALİYET Eylem (Salaam): Yazarlar MALİYET Eylem FA1201 EPICONCEPT üyeleridir. TALB&#39;e MALİYET Eylem CM1406 epigenetik Kimyasal Biyoloji (EPICHEM) üyesidir.

Not: Aşağıda tarif edilen tüm işlemler, steril koşullar laminer akış başlığı altında yapılmalıdır. kendi kullanım boyunca 37 ° C&#39;de tüm kültür prosedürleri termostatik kontrollü aşamalarında yürütülmektedir ve hücreler korunur emin olun. 1. Cilt fibroblast İzolasyonu <ol><li> Kültür kabı kaplama solüsyonu hazırlamak <ol><li> su (nihai konsantrasyon% 0.1), 100 ml domuz jelatin 0.1 g. otoklav ile çözüm sterilize edin. </li><li> 35 mm Petri tabaklarda steril% 0.1 domuz jelatin 1.5 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında onları korumak, kaplamak için 2 saat bekleyin. Not: İnsan deri biyopsileri ön kol ön yüzünde bir avasküler bölgesine lokal anestezi altında eksizyon ile toplanmış ve kullanımdan önce + 4 ° C&#39;de% 2 antibiyotik antimikotik çözelti takviye edilmiş Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde depolanır. </li></ol></li><li> Yeni PBS ile yıkayın biyopsileri% 2 antibi ile takviyeotik antimikotik çözüm. </li><li> Bir yerde bir 100 mm Petri kabındaki biyopsileri ve steril neşter ile yaklaşık 2 mm 3 parça halinde kesilmiş. </li><li> fragmanları kaplama hemen önce kaplama çözeltisi aşırı çıkarın. </li><li> önceden kaplanmış 35 mm Petri kabı içine 5-6 deri parçaları yerleştirin. </li><li> fibroblast kültür ortamı hazırlayın:% 77 Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), yüksek glukoz,% 20 fetal sığır serumu (FBS),% 1 L-Glutamin çözeltisi ve% 2 antibiyotik antimikotik çözelti. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C de, her parçanın (fragman genellikle her 100 ul) ve kültür onları fibroblast ortamının bir damlacık ekleyin. </li><li> 24 saat sonra,% 5 CO2 içinde 37 ° C sıcaklıkta nemli tutmak için parçaları üzerinde fibroblast kültür ortamında 500 ul ekle. </li><li> en az bir kez pipet her 48 saat ile orta değiştirin. </li><li> İnkübasyon 6 gün sonra, dikkatlice doku parçaları kaldırmak ve atın. Not: 6 gün sonra, fibroblasts doku parçaları dışında büyümek ve bir hücre tek tabaka oluşturacak şekilde başlarsınız. </li><li> , Orta Yenile fibroblast kültür ortamının 2 ml ilave edilir ve CO2 inkübatör% 5, 37 ° C &#39;de, hücre tek tabakalı kültürü, devam etmektedir. </li></ol> 2. fibroblast Kültür <ol><li> 37 ° C &#39;de kültür fibroblastlar% 5 CO2 içinde 80% konfluansa kadar </li><li> doku kültürü yemekleri Pasajlanması, aspirat fibroblast kültürü ortamı için. PBS 4 ml hücreleri üç kez yıkayın% 1 antibiyotik antimikotik çözelti ile takviye edilmiştir. </li><li> Tripsin-EDTA solüsyonu (0.5 g / L domuz tripsin ve 0.2 g / L EDTA) ince bir tabaka (kültür ortamı hacminin% 10&#39;u) ekleyin ve hücre tekli-tabakası doku altından ayırmak başlayana kadar 37 ° C&#39;de inkübe kültür çanak ve hücreler ayırmak. </li><li> tripsin eylemi etkisiz hale getirmek fibroblast kültürü ortamında 9 parça ile hücre süspansiyonu seyreltilir. Santrifüj gerekli değildir. </li><li> Yeni kültür yemekleri Levha hücreleri (ilejelatin üzerinden) ve Kültür,% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de dayanıklılığı. Büyüme hızına bağlı olarak, 4: 2 ve 1: 1 arasında geçiş oranı tutun. </li><li> Hücreler (haftada genellikle iki kez)% 80 civarında izdiham, geçit onlara ulaşır. </li></ol> Epigenetik Dönüşüm 3. fibroblast Kaplama <ol><li> Hücre kültür tabaklarına 0.26 ml /% 0.1 domuz jelatin cm2 (1.1 de tarif edildiği gibi hazırlandı) ekleyin. kaplamak için 2 saat bekleyin. </li><li> fibroblastlar kaplama öncesinde kaplama çözümü fazlalığı 10-30 dk çıkarın. </li><li> kültür kaplarından fibroblast kültürü ortamı çıkarın. PBS ile hücreleri üç kez yıkayın% 1 antibiyotik antimikotik çözüm ile desteklenmiş. </li><li> Tripsin-EDTA solüsyonu (0.5 g / L domuz tripsin ve 0.2 g / L EDTA) ince bir tabaka (kültür ortamı hacminin% 10&#39;u) ekleyin ve hücre tekli-tabakası doku altından ayırmak başlayana kadar 37 ° C&#39;de inkübe kültür çanak ve hücreler ayırmak. </li><li> fibrobl 9 parça hücre süspansiyonu seyreltilirAST kültür ortamı tripsin işlemi nötralize etmek. </li><li> Oda sıcaklığında, bir mikroskop altında bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın. / Cm2 7.8 x 10 4 fibroblastlann bir hücre konsantrasyonu elde etmek üzere, hücreler tekrar süspansiyon fibroblast kültür ortamı gerekli hacmi hesaplanır. Bu, kullanılan odanın belirli türüne bağlı olacaktır. Hücreler / ul = küçük ızgara x 90 (çarpım faktörü) x seyreltme başına hücre ortalama sayısı </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 g&#39;de santrifüje hücre süspansiyonu. fibroblast kültürü ortamı önceden hesaplanmış hacmi ile supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak. </li><li> % 0.1 jelatin önceden kaplanmış tabaklar ve% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 24 saat süre ile kültür bunları plakası hücreleri. </li></ol> De-metile Ajan 5-aza-CR Kullanılması 4. Artış Hücre Plastisitesi <ol><li> gün 0 <ol><li> DMEM yüksek glükoz medi 10 ml 5-aza-CR 2.44 mg çözülmesiyle 5-aza-CR stok çözelti hazırlayınum. filtrasyon ile sterilize edin. kullanımdan hemen önce 5-aza-CR stok hazırlayın. </li><li> fibroblast kültür ortamında (nihai konsantrasyon 1 uM), 1 ml 5-aza-CR stok çözeltisi 1 ul seyreltilir. </li><li> Hücre esneklik, hücre kaplama (alt pozisyon 3.8) 24 saat sonra artırmak için, tohumlanmıştır fibroblastlardan kültür ortamı çıkarın ve CO2 inkübatör% 5, 37 ° C de 18 saat 1 uM 5-aza-CR stok çözeltisi ve kültürü ilave edin. </li></ol></li><li> 1.gün <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, taze insan pluripotent (HP) orta hazırlayın. </li><li> 1 uM 5-aza-CR inkübasyondan sonra, 5-aza-CR uzaklıkta durulanır sağlamak için üç kez PBS ile Ortamı çıkarın ve hücreleri yıkayın. </li><li> Inkübe 5-aza-CR,% 5 CO2 içinde 37 ° C de 3 saat (geri kazanım dönemi) için HP ortam ile muamele edilmiş fibroblastlar. </li><li> iyileşme süresinden sonra, orta kaldırmak üç kez PBS ile yıkayın. </li><li> 5-aza-CR tedavisinin etkinliğini izlemek için, bu adım f kontrolveya morfolojik değişikliklerin varlığı (Sonuçlar bölümünde ayrıntılı). Hücreler fibroblast tipik uzatılmış morfoloji kaybeder ve genişlemiş çekirdekleri ile, boyut olarak daha küçük olma yuvarlak veya oval bir şekil kazanır. </li><li> Pankreas farklılaşma ile devam edin. </li></ol></li></ol> 5. Pankreas Farklılaşma Protokolü <ol><li> gün 1-6 <ol><li> Tablo 2&#39;de tarif edildiği gibi pankreatik bazal ortam hazırlar. </li><li> Bir stok solüsyonu aktivin hazırlayın: steril su 166.6 ul bir rekombinant insan proteini aktivin 5 ug çözülür. </li><li> Kültür 5-aza-CR,% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 6 gün boyunca (5.1.2 bakınız) 1 ul / ml aktivin bir stok çözelti ile desteklenmiş, 0.26 mL / cm Pankreas bazal maddesi 2 fibroblastlar işlemden geçirildi. orta gazetesine değiştirin. </li></ol></li><li> gün 7-8 <ol><li> retinoik ACI 50 mg dimetil sülfoksit (DMSO) 16.6 ml ekleyerek retinoik asit stok çözelti hazırlayınd. </li><li> Pankreas Bazal Ortamda 0.26 ml / cm2 Kültür hücreleri 1 ul / ml 37 ° C de bir stok çözelti (5.1.2) ve 2 gün süre ile 1 ul / ml retinoik asit stok çözeltisi (5.2.1 bakınız) aktivin Cı ile desteklenmiş % 5 CO 2. orta gazetesine değiştirin. </li></ol></li><li> gün 9-36 <ol><li> Pankreas Bazal Ortamda 0.26 ml / cm2 Kültür hücreleri (h / h), insülin transferin-selenyum (ITS),% 2 (v / v) ile B27 ve% 0.1 (h / h) Rekombinan insan FGF bazik% 1 ile desteklenen % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de (bFGF) stok çözeltisi (Tablo 1 e bakınız). İlk 15 gün boyunca günde orta değiştirin. </li><li> günden sonra 16, kültür çanak alt ayırmak olabilir agrega hücreleri oluşturan bu yana, bir mikroskop altında, her gün orta yenileyin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475, 386-389 (2011).</li>
<li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Lineage+Conversion+of+Terminally+Differentiated+Hepatocytes+to+Functional+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Pig+Dermal+Fibroblast+into+Insulin+Secreting+Cells+by+a+Brief+Exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Brevini, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Molecular+Changes+of+Human+Granulosa+Cells+Exposed+to+5-Azacytidine+and+Addressed+Toward+Muscular+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
<li>Thoma, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).</li>
<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Plath, K., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+reprogramming+to+the+induced+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state.</a> Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+induced+by+5-azacytidine+does+not+affect+fragile+X+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression.</a> Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).</li>
<li>Do, J. T., Scholer, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+of+embryonic+stem+cells+reprogram+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells.</a> Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).</li>
<li>Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+pluripotency+determined+and+maintained%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How is pluripotency determined and maintained?</a> Development. 134 (4), 635-646 (2007).</li>
<li>Kahan, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

bu yazıda bir dokuya özgü indüksiyon protokolü takiben 5-aza-CR geçici ve kısa maruz kalma ile, insülin üreten hücreler, insan deri fibroblast dönüşümünü sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım transkripsiyon faktörleri veya microRNA zorla ifade ne de hücreler daha istikrarsız ve hatalar 14 eğilimli kılan istikrarlı bir pluripotent devletin satın alma olmadan, mezodermden endoderm ilgili hücrelere bir anahtar verir. İlk adımda, hücre plastisite terminal açıdan farklılaşmı...

rejeneratif tıbbın temel bir amacı tamir veya hasarlı değiştirmek için kullanılabilecek yeni, fonksiyonel hücrelerin nesil, doku dejenere. başka bir hücre tipinden dönüştürerek, yeni olanları içine kolayca kullanılabilir yetişkin hücrelerinin yeniden şekillendiriyor, gerekli hücre popülasyonu erişimi bol ya da zor değil, özellikle bir özellikle çekici bir yaklaşımdır. Ancak, yetişkin hücreleri son derece stabildir. Onlar olgun terminali uzmanlık ulaştığında, bunlar stabil bunu 1 korumak onların seçeneklerinde kademeli kısıtlama yoluyla farklılaştırılmış devlet kazanmak ve. Somatik hücre (iPS) bir pluripotency için yeniden programlama sağlayacak protokoller bir dizi geliştirilmiştir Son yıllarda, transkripsiyon bir dizi 2,3 faktörleri zorla sentezlenmesi yoluyla elde etti. Alternatif olarak, hücre dönüşüm 4 tek sokulması doğrudan nesilli transdiferansiasyon ile elde edilebilir </sup&gt; ya da transkripsiyon bir arada 5-7 faktörleri. Bu strateji, bir de-farklılaştırılmış devlet aracılığıyla geçiş dahil ancak belirli transkripsiyon 8 faktörleri yüksek ifade gerektiriyor. Son zamanlarda sitidin analog 5-azasitidin (5-aza-CR), iyi karakterize edilmiş DNA metiltransferaz inhibitörünün demetile özelliklerine yetişkin hücrelerinin Kısa süreli dayanan bir dönüşüm protokolü geliştirilmiştir. Demetilasyon adım hemen gerekli terminali fenotip elde etmek için izin veren bir özel farklılaşma protokolü 9-11 tarafından takip edilir. Bu yöntem, farklı soy hücreleri içine olgun farklılaşmış hücreleri dönüştürmek mümkün olup viral vektörlerin kullanımı ve bir egzojen transkripsiyon faktörleri transfeksiyon hem de önlemek için önemli bir avantaja sahiptir. istikrarlı bir pluripotent devletin satın alma ve istikrarsızlık hücre ile ilgili artmış duyarlılık da önlenir. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Burada sunulan tamamen işlevsel insülin salgılayan hücrelerin içine yetişkin insan deri fibroblast dönüşüm sağlayan detaylı bir protokol. Bununla birlikte, teknik, farklı hücre tipleri uygulanmış ve çeşitli farklılaşma yollarının doğru hücreleri ele alırken, olumlu sonuçlar üretti dikkati çekiyor. Ayrıca, epigenetik dönüşüm başarılı bir şekilde, insan, domuz cinsi 9-13 hem de köpek kullanılmıştır yaklaşım, geniş bir etkinlik ve dayanıklılık göstermektedir (Eser sunulmuştur).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td>PBS; hücre yıkama ve çözelti hazırlama için</td></tr><tr><td>Antibiyotik Antimikotik</td><td>Çözelti Sigma</td><td>A5955</td><td>Fibroblast, HP ve Pankreas ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>Fibroblast izolasyonu için</td><td>100 mm Petri kabı</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td></tr><tr><td>Bulaşık kaplama için</td> <td>Domuz Jelatini</td><td>Sigma</td><td>G1890</td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Çözelti hazırlama için</td></tr><tr><td>35 mm Petri kapları</td><td>Sarstedt</td><td>83.39</td><td>Fibroblast izolasyonu için</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, piruvat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>41966052</td><td>Fibroblast kültür ortamı için</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10500064</td><td>FBS; Fibroblast ve HP ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>L-Glutamin çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Fibroblast, HP ve Pankreas ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Fibroblast ayrışması için</td></tr><tr><td>KOVA GLASSTIC SLIDE 10 IZGARALI</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Hücre sayımı</td></tr><tr><td>5-Azasitidin</td><td>Sigma</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, inkrimeraz hücresi için Fibroblastlarda plastisite</td></tr><tr><td>Ham'ın F-10 Besin Karışımı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31550031</td><td>HP orta</td></tr><tr><td>DMEM, düşük glikoz, piruvat</td><td>için Yaşam Teknolojileri</td><td>31885023</td><td>HP ortamı için</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replasmanı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10828028</td><td>HP ortamı</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitlerin Bileşeni Çözelti Ömrü</td><td>Teknolojileri</td><td>11140035</td><td>HP ve Pankreatik Bazal ortamın bileşeni</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>HP ve Pankreas Bazal ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Guanozin</td><td>Sigma</td><td>G6264</td><td>Nükleosit karışım stoğu HP ortamının</td></tr> bileşeni <tr><td>Adenozin</td><td>Sigma</td><td>A4036</td> HP <td>ortamının nükleosit karışım stoğu bileşeni</td></tr><tr><td>Cytidine</td><td>Sigma</td><td>C4654</td><td>HP ortamının nükleosit karışım stoğu bileşeni</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td> HP orta Timidin Sigma T1895'in <td>nükleosit karışım stoğu bileşeni</td></tr> HP orta Millex-GS 0,22 <tr><td></td><td></td><td></td> ve <td>mikro'nun nükleosit karışım stoğu bileşeni</td></tr><tr><td>; m</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Çözeltinin sterilizasyonu için</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Rekombinant İnsan Protein</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>PHG0261</td><td>bFGF; HP ve Pankreas Bazal ortamı</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>BSA'nın bileşeni; Pankreas Bazal Ortamı</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Bileşeni</td><td>Pankreas Bazal Ortam</td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi için 11320074 Eksi A Vitamini</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12587010</td><td>Pankreas Ortamı</td></tr><tr><td>Bileşeni N-2 Takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502048</td><td>Pankreas Bazal Ortamı</td></tr><tr><td>Bileşeni Aktivin A Rekombinant İnsan Proteini Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>PHG9014</td><td>Pankreas ortamı</td></tr><tr><td>için Retinoik Asit</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Pankreas ortamı</td></tr><tr><td>için Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO; Retinoik Asit stok hazırlama için</td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>41400045</td><td>ITS; Pankreas için Son ortam</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin antikoru&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>İmmünositokimyasal analiz için. Çalışma seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür</td><td>Sigma</td><td>32670</td><td>DAPI. İmmünositokimyasal analizler için. Çalışma seyreltme&nbsp; 1 ve mikro; </td></tr><tr>İmmünositokimyasal analisys için g / ml<td>5-Metilsitidin</td><td>Eurogentec</td><td>MMS-900P-B</td><td>. Çalışma seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Anti-C Peptid antikoru&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab14181</td><td>İmmünositokimyasal analizler için. Çalışma seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Anti-PDX1 antikoru&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>İmmünositokimyasal analizler için. Çalışma seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Mercodia İnsülin ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-10</td><td>İnsülin salınımı tespiti için</td></tr></tbody></table>

yetişkin cilt fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir güvenli ve basit yöntem olarak epigenetik dönüşüm

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Rejeneratif tıp, dejenere olmuş veya hasar görmüş dokuları onarmak için hastalara verilen yeni, tamamen işlevsel hücreler gerektirir. Bu tür hücreler kolayca bulunamadığında, farklı tekniklere özgü avantajlar ve sınırlamalar ile birlikte yeniden programlama ve trans-farklılaşmayı içeren farklı yaklaşımlar kullanılarak elde edilebilirler. Burada, yetişkin bir olgun fibroblastın, keyfi olarak epigenetik dönüştürülmüş hücreler (EpiCC) olarak adlandırılan insülin salgılayan bir hücreye dönüştürülmesi için yeni bir strateji açıklanmaktadır. Yöntem, hücre kaderinin epigenetik regülasyonunu ve farklılaşmasını kontrol eden mekanizmaların artan anlayışına dayanarak geliştirilmiştir. Özellikle, ilk adım, yetişkin hücreleri "son derece izin verilen" bir duruma getirmek için epigenetik bir değiştirici, yani 5-aza-sitidin kullanır. Daha sonra, hücreleri farklı bir soya doğru yeniden ele almak için bu kısa ve geri dönüşümlü epigenetik plastisite penceresinden yararlanır. Yaklaşım "epigenetik hücre dönüşümü" olarak adlandırılır. Verimli, kontrollü ve kararlı bir hücresel soylar arası geçiş elde etmenin basit ve sağlam bir yoludur. Protokol herhangi bir gen transfeksiyonunun kullanımını içermediğinden, viral vektörlerden arınmış olduğundan ve stabil bir pluripotent durum içermediğinden, translasyonel tıp uygulamaları için oldukça umut vericidir.

deri biyopsisi primer kültürün oluşturulması Deri biyopsileri, küçük parçalar halinde kesilmiş ve jelatin önceden kaplanmış tabaklar içine yerleştirilmiştir. 6 gün sonra, fibroblastlar doku parçaları dışında büyümeye başladı ve bir hücre tek tabaka (Şekil 1A) kurdu. Hücreler tipik ince uzun bir şekle gösterdi ve beklendiği gibi, fibroblast spesifik bir işaretleyici vimentin (um, Şekil 1B) için tek tip bir bağışıklık-pozitif gösterilir. <p clas...

Burada, erişkin cilt fibroblastlarının insülin salgılayan hücrelere dönüştürülmesine izin veren yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu teknik epigenetik dönüşüme dayanır, retroviral vektörlerin kullanımını veya stabil bir pluripotent durumun elde edilmesini içermez. Bu nedenle translasyonel tıp uygulamaları için oldukça umut vericidir.

Yetişkin Cilt Fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir Güvenli ve Basit Yöntem olarak epigenetik Dönüşüm

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Bu prosedürün genel amacı, pluripotensiyi indüklemeden veya retroviral vektörler kullanmadan fibroblastları insülin salgılayan hücrelere dönüştürmektir. Bu yöntem, rejeneratif tıp alanındaki ve özellikle diyabetin hücre tedavisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, dönüştürülen hücrelerde stabil bir pluripotent durum oluşturmadan ve retroviral vektörler kullanmadan fenotipte bir değişim sağlayabilmemizdir.Prosedürü, laboratuvarımızdaki doktora sonrası araştırmacı Georgia Pennarossa gösterecektir. İşleme başlamak için, 35 milimetrelik petri kaplarına 1,5 mililitre steril %0,1 porsin jelatin ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca kaplanmaya bırakın. Ardından, insan deri biyopsilerini %2 antibiyotik antimikotik solüsyon ile tamamlanmış PBS ile yıkayın.Ardından, biyopsileri 100 mm'lik bir petri kabına yerleştirin ve steril bisturilerle yaklaşık iki mm³ boyutunda parçalara ayırın. Daha sonra, beş ila altı deri parçasını önceden kaplanmış 35 mm'lik petri kabına yerleştirin. Her parçanın üzerine bir damla fibroblast medyumu ekleyin ve bunları 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren ortamda kültüre edin.Altı günlük inkübasyonun ardından, doku parçalarını dikkatlice atın. Fibroblastlar doku parçalarının dışına doğru büyümeye başlamalı ve bir hücre monokatmanı oluşturmalıdır. Bu prosedürde, fibroblastları %5 karbondioksit içeren 37 °C sıcaklıkta, %80 konfluense ulaşana kadar kültüre edin.Ardından hücreleri yeni kültür kaplarına ekleyin. Hücreleri 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda kültüre edin ve büyüme hızına bağlı olarak pasaj oranını 1:2 ile 1:4 arasında tutun. Sonrasında, hücre kültür kaplarına %0,1 porcine gelatin ekleyin ve iki saat boyunca kaplanmaya bırakın.Fibroblastları ekmeden 10 ila 30 dakika önce fazla kaplama çözeltisini uzaklaştırın. Ardından, kültür kaplarındaki fibroblast kültür ortamını boşaltın. Hücreleri, %1 antibiyotik antimikotik çözeltisi eklenmiş PBS ile üç kez yıkayın.Ardından, ince bir tabaka Trypsin-EDTA solüsyonu ekleyin. Hücre monokatmanı doku kültürü kabının tabanından ayrılmaya başlayana ve hücreler disosiye olana kadar 37 °C'de inkübe edin. Bundan sonra, tripsin etkisini nötralize etmek için hücre süspansiyonunu dokuz birim fibroblast kültür medyumu ile seyreltin.Ardından, hücreleri oda sıcaklığında mikroskop altında bir sayım kamarası kullanarak sayın. Hücreleri yeniden süspande etmek ve santimetrekare başına 7,8 x 10⁴ fibroblast hücre konsantrasyonunu elde etmek için gereken fibroblast kültür ortamı hacmini hesaplayın. Sonrasında, hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 150 g'de santrifüjleyin.Ardından, süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri hesaplanmış hacimdeki fibroblast kültür ortamı ile yeniden süspande edin. Sonrasında, hücreleri %0,1 jelatin ile ön kaplanmış kaplara ekin ve 37 °C'de %5 karbon dioksit ortamında 24 saat boyunca kültüre edin. Sıfırıncı günde, kullanımdan hemen önce, 2,44 mg 5-aza-CR'yi 10 mL DMEM yüksek glikoz ortamında çözerek 5-aza-CR stok çözeltisini hazırlayın.Filtrasyon yoluyla sterilize edin. Ardından, bir mikrolitre 5-aza-CR stok çözeltisini bir mililitre fibroblast kültür besiyerinde seyreltin. Hücre plastisitesini artırmak için, hücre ekiminden 24 saat sonra ekilen fibroblastların kültür besiyerini uzaklaştırın.Bir mikromolar 5-aza-CR stok çözeltisi ekleyin ve %5 karbondioksit içeren 37 °C'de 18 saat boyunca kültüre edin. Birinci günde taze HP ortamı hazırlayın. Bir mikromolar 5-aza-CR ile inkübasyon sonrası, 5-aza-CR'nin tamamen temizlendiğinden emin olmak için ortamı uzaklaştırın ve hücreleri üç kez HP ortamı ile yıkayın.Ardından, 5-aza-CR ile işlem görmüş fibroblastları HP medyumunda, 37 °C'de ve %5 karbondioksit altında üç saat boyunca inkübe edin. 5-aza-CR işleminin etkinliğini izlemek için herhangi bir morfolojik değişiklik olup olmadığını kontrol edin. Hücreler, fibroblastların tipik uzamış morfolojisini kaybetmeli ve genişlemiş çekirdeklere sahip, daha küçük yuvarlak veya oval bir şekil kazanmalıdır.Birinci günden altıncı güne kadar, pankreatik Bazal Besiyeri ve Activin A stok çözeltisini hazırlayın. Ardından, 5-aza-CR ile işlem görmüş fibroblastları, Activin A stok çözeltisi ile desteklenmiş pankreatik Bazal Besiyeri içinde, 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında altı gün boyunca kültüre edin ve besiyerini her gün değiştirin. Yedinci ve sekizinci günlerde, 50 mg retinoik asite 16,6 mL DMSO ekleyerek retinoik asit stok çözeltisini hazırlayın.Hücreleri, Activin A stok çözeltisi ve retinoik asit stok çözeltisi ile desteklenmiş pankreatik Bazal Medium içerisinde, 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında iki gün boyunca kültüre edin ve besiyerini günlük olarak değiştirin. Dokuzuncu günden 36. güne kadar hücreleri, ITS, B27 ve BFGS stok çözeltileri ile desteklenmiş pankreatik Bazal Medium içerisinde kültüre edin; besiyerini ilk 15 gün boyunca günlük olarak değiştirin ve 16. günden itibaren gün aşırı yenileyin. Hücreleri 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında kültüre edin.Bu şekil, endokrin pankreas diferansiyasyonu sırasında meydana gelen morfolojik değişiklikleri göstermektedir. Yedi günlük indüksiyonun ardından insan hücreleri kademeli olarak kümeler oluşturur. Retinoik asit eklenmesine yanıt olarak, retiküler bir yapıda yeniden düzenlenirler ve belirgin agregatlar halinde kümelenirler.Bu oluşumlar zamanla ilerleyerek hücreleri bünyesine katar ve genişlemiş 3D koloniler oluşturur. Sonunda koloniler, in vitro'daki tipik pankreas adacıklarını anımsatan, kopma ve kültür ortamında serbestçe hareket etme eğiliminde olan sferik yapılara dönüşür. 36 günlük pankreatik indüksiyonun ardından, insan epigenetik olarak dönüştürülmüş hücrelerinin küresel DNA metilasyon seviyeleri, tedavi edilmemiş fibroblastlarda gözlemlenen seviyelere geri dönmüştür.PDX1'in CPEP ile ko-lokalizasyonu, konversiyon döneminin sonunda gözlemlenirken, bu endokrin pankreas markerları tedavi edilmemiş fibroblastlarda tamamen eksiktir. Bu grafik, epigenetik olarak konvert edilmiş hücrelerden 20 millimolar D-glukoz ve 20 millimolar L-glukoz maruziyetine yanıt olarak salınan insülin miktarını göstermektedir. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülürse 38 günde tamamlanabilir.Bu araştırma, geliştirilmesinin ardından rejeneratif tıp alanındaki araştırmacıların insanlarda diyabetin hücre tedavisi üzerine çalışmalar yapmasının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, pluripotens indüklemeden veya retroviral vektörler kullanmadan fibroblastların nasıl insülin salgılayan hücrelere dönüştürüleceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.

epigenetic-conversion-as-safe-simple-method-to-obtain-insulin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Doğrudan nöronal yeniden programlama başlangıç somatik hücre çağı korumak neurons oluşturur. Burada, indüklenen nöronlar dermal fibroblastlar yetişkin insan bağış elde oluşturmak için tek bir vektör tabanlı yöntemi açıklanmaktadır.

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

İnsan derisinden türetilmiş fibroblastları indüklenmiş Nöronal Progenitör Hücrelere (iNPC' ler) yeniden programlamak için bir protokol ve daha sonra indüklenmiş Astrositlere (iAs) farklılaşmalarını açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük miktarlarda iNPC'lerin ve iA'ların hızlı ve tekrarlanabilir üretimine yol açar.

Fibroblastlardan Nöronal Progenitör Hücrelere Doğrudan Dönüşüm ve Astrositlere Farklılaşma Kullanarak Nörolojik Hastalıklar için İn vitro Modelleme

Burada, melanositler için optimize edilmiş bir doğrudan yeniden programlama sistemi ve sorunsuz doğrudan yeniden programlama sağlayan yüksek verimli, konsantre bir virüs paketleme sistemi açıklanmaktadır.

Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

Kök hücrelerin adacık hücrelerine farklılaşması, geleneksel diyabet tedavisine ve hastalık modellemesine alternatif bir çözüm sunar. Bir tabakta insülin salgılayan, kök hücreden türetilen adacıkların üretilmesine yardımcı olmak için ticari bir farklılaşma kitini önceden onaylanmış bir yöntemle birleştiren ayrıntılı bir kök hücre kültürü protokolünü açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Adacık Kümelerine Farklılaşması

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

Öğrenin yetişkin cilt fibroblastlarını epigenetik dönüşümle insülin salgılayan hücrelere dönüştürme yöntemini. Bu güvenli teknik, retroviral vektör kullanmadan diyabet hücre tedavisinde umut vadeden bir yaklaşım sunar.

Yetişkin Cilt Fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir Güvenli ve Basit Yöntem olarak epigenetik Dönüşüm

Daha fazla video keşfet