Yetişkin Cilt Fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir Güvenli ve Basit Yöntem olarak epigenetik Dönüşüm

Bu prosedürün genel amacı, fibroblastları pluripotentliği indüklemeden veya retrovital vektörler kullanmadan insülin salgılayan hücrelere dönüştürmektir. Bu yöntem, rejeneratif tıp alanındaki ve özellikle diyabetin hücre tedavisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, dönüştürücü hücrelerde stabil bir pluripotent durumu indüklemeden ve retroviral vektörler olmadan fenotipte bir anahtar elde edebilmemizdir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımızda doktora sonrası araştırmacı olan Georgia Pennarossa olacak. Bu işleme başlamak için, 35 milimetrelik petri kaplarına 1,5 mililitre steril, %0,1 domuz jelatini ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat kaplamaya izin verin. Daha sonra, insan derisi biyopsilerini% 2 antibiyotik antimikotik solüsyon ile takviye edilmiş PBS ile yıkayın.

Daha sonra biyopsileri 100 milimetrelik bir petri kabına yerleştirin ve steril neşterlerle yaklaşık iki milimetreküp parçaya bölün. Ardından, önceden kaplanmış 35 milimetrelik petri kabına beş ila altı deri parçası yerleştirin. Her parçanın üzerine bir damla fibroblast ortamı ekleyin ve% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede kültürleyin.

Altı günlük inkübasyondan sonra, doku parçalarını dikkatlice atın. Fibroblastlar doku parçalarından çıkmaya başlamalı ve bir hücre tek tabakası oluşturmaya başlamalıdır. Bu prosedürde, fibroblastları 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde% 80 birleşene kadar kültürleyin.

Daha sonra hücreleri yeni kültür kaplarında kaplayın. Bunları %5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede kültürleyin ve büyüme hızına bağlı olarak geçiş oranını bir ila iki ve bir ila dört arasında tutun. Daha sonra, hücre kültürü kaplarına% 0.1 domuz jelatini ekleyin ve iki saat boyunca kaplamaya izin verin.

Fibroblastları kaplamadan 10 ila 30 dakika önce fazla kaplama solüsyonunu çıkarın. Daha sonra, fibroblast kültür ortamını kültür kaplarından çıkarın. Hücreleri% 1 antibiyotik antimikotik çözeltisi ile desteklenmiş PBS ile üç kez yıkayın.

Ardından, ince bir tabaka Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Hücre tek tabakası doku kültürü kabının altından ayrılmaya başlayana ve hücreler ayrışana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, tripsin etkisini nötralize etmek için hücre süspansiyonunu dokuz parça fibroblast kültür ortamı ile seyreltin.

Ardından, oda sıcaklığında mikroskop altında bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri yeniden askıya almak ve santimetre kare başına 7.8 kez 10 ila 4. fibroblast hücre konsantrasyonunu elde etmek için gereken fibroblast kültür ortamının hacmini hesaplayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 150 g'da santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve hücreleri hesaplanmış bir hacimde fibroblast kültür ortamı ile yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri %0.1 jelatinli önceden kaplanmış tabakların üzerine yerleştirin ve %5 karbondioksit içinde 37 derece Cantius'ta 24 saat boyunca kültürleyin. Sıfırıncı günde, kullanımdan hemen önce, 2.44 miligram 5-aza-CR'yi 10 mililitre DMEM yüksek glikoz ortamında çözerek 5-aza-CR stok çözeltisi hazırlayın.

Süzülerek sterilize edin. Daha sonra, bir mililitre fibroblast kültür ortamında bir mikrolitre 5-aza-CR stok çözeltisini seyreltin. Hücre plastisitesini arttırmak için, hücre kaplamasından 24 saat sonra, tohumlanmış fibroblastlardan kültür ortamını çıkarın.

Bir mikromolar 5-aza-CR stok çözeltisi ekleyin ve% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede 18 saat kültürleyin. Birinci gün, taze HP medium hazırlayın. Bir mikromolar 5-aza-CR ile inkübe edildikten sonra, ortamı çıkarın ve 5-aza-CR'nin durulandığından emin olmak için hücreleri HP ortamı ile üç kez yıkayın.

Daha sonra,% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede üç saat boyunca HP ortamı ile 5-aza-CR ile muamele edilmiş fibroblastları inküabate edin. 5-aza-CR tedavisinin etkinliğini izlemek için herhangi bir morfolojik değişiklik olup olmadığını kontrol edin. Hücreler, fibroblastların tipik uzamış morfolojisini kaybetmeli ve genişlemiş çekirdeklerle daha küçük yuvarlak veya oval bir şekil almalıdır.

Bir ila altıncı günlerde, pankreas Bazal Ortamı ve Activin A stok çözeltisini hazırlayın. Daha sonra, 5-aza-CR ile muamele edilmiş fibroblastları, Activin A stok çözeltisi ile takviye edilmiş pankreas Bazal Ortamında% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede altı gün boyunca kültürleyin ve ortamı günlük olarak değiştirin. Yedi ila sekizinci günlerde, 50 miligram retinoik aside 16.6 mililitre DMSO ekleyerek retinoik asit stok çözeltisi hazırlayın.

Hücreleri, Activin A stok çözeltisi ve retinoik asit stok çözeltisi ile desteklenmiş pankreas Bazal Ortamındaki hücreleri, %5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede iki gün boyunca kültürleyin ve ortamı günlük olarak değiştirin. Dokuzuncu ila 36. günlerde, ITS, B27 ve BFGS stok çözeltisi ile desteklenmiş hücreleri ve pankreas Bazal Ortamını kültürleyin ve ortamı ilk 15 gün boyunca günlük olarak değiştirin ve 16. günden itibaren her gün yenileyin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte kültürleyin.

Bu şekil, endokrin pankreas farklılaşması sırasında meydana gelen morfolojik değişiklikleri göstermektedir. Yedi günlük indüksiyondan sonra, insan hücreleri yavaş yavaş kümeler halinde düzenlenir. Retinoik asit ilavesine yanıt olarak, retiküler bir düzende yeniden düzenlenirler ve ayırt edilebilir agregalarda kümelenirler.

Bu oluşumlar zamanla ilerler, hücreleri işe alır ve genişlemiş 3D kolonileri toplar. Son olarak, koloniler, in vitro olarak tipik pankreas adacıklarını anımsatan, kültür ortamında serbestçe ayrılma ve akma eğiliminde olan küresel yapılar haline gelir. 36 günlük pankreas indüksiyonundan sonra, insan epigenetik dönüştürülmüş hücrelerin küresel DNA metilasyon seviyeleri, tedavi edilmemiş fibroblastlarda gözlenenlere geri döndü.

PDX1'in CPEP ile ko-lokalizasyonu, konversiyon periyodunun sonunda gözlenirken, bu endokrin pankreas belirteçleri tedavi edilmemiş fibroblastlarda tamamen yoktur. Bu grafik, 20 milimolar D-glukoz ve 20 milimolar L-glukoz maruziyetine yanıt olarak epigenetik dönüştürülmüş hücrelerden insülin salınım miktarını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa 38 gün içinde yapılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu araştırma, rejeneratif tıp alanındaki araştırmacıların insanlarda diyabetin hücre tedavisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, fibroblastları pluripotentliği indüklemeden veya retroviral vektörler kullanmadan insülin salgılayan hücrelere nasıl dönüştüreceğinizi iyi anlamalısınız.