Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

Bu immün boyama protokolünün genel amacı, yaprak biti embriyolarında protein ekspresyonunu tespit etmektir. Doku geçirgenliğini artıran ve arka plan lekelenmesini azaltan kritik durumlar tanımlanır, her ikisi de yaprak bitlerinin embriyonik dokularını boyarken uzun süredir devam eden problemlerdir. Bu tekniğin temel avantajı, genellikle standart bir immün boyama protokolünde tarif edilmeyen antikorların etkili bir şekilde penetrasyonu ve arka plan lekelenmesinin azaltılması için özel koşullar sağlamasıdır.

Bu önlem fikrine ilk olarak, genomik ve çevresel çalışmalar için çeşitli böcek modellerinde bir bezelye yaprak bitinde germ hücrelerinin nasıl belirlendiğini incelerken sahip olduk. Bezelye yaprak bitinin laboratuvar türü, a. pisum, aslen Tayvan'ın merkezinde toplanmıştır ve 300 nesilden fazla bir süredir konukçu bitkilerde yetiştirilmiştir.

Çimlenmek için, konukçu bitkilerin tohumlarını oda sıcaklığında üç ila beş gün musluk suyunda bekletin. Tatlı suyu günde bir kez doldurun. 20 santigrat derecede 16 saat aydınlık, sekiz saat karanlık bir fotoğraf periyodu altında, büyüme odasında toprakla birlikte küçük bir tencerede on çimlenme tohumu yetiştirin.

Büyüme başladıktan yaklaşık 10 gün sonra, bitkilerin yüksekliği genellikle sekiz santimetreden fazladır. Her bir bitki saksısını bir litrelik cam beher içinde tutun ve yetişkin yaprak bitlerini bir boya fırçası kullanarak bitkilerin üzerine aktarın. Ardından, yaprak bitlerinin kaçmasını önlemek için kabı gazlı bez ağ gibi hava geçirgen bir kapakla kapatın.

Yaprak bitlerini, 20 santigrat derecede 16 saat aydınlık, sekiz saat karanlıkta bir foto periyodu altında büyüme odasında kuluçkaya yatırın ve her bir saksıyı günde bir kez sulayın. Bir spot plakanın bir kuyusunu yaklaşık 500 mikrolitre yüzde 4 paraformaldehit ile doldurun. Plakayı düşük büyütmede bir stereomikroskop altına yerleştirin ve yetişkin bir yaprak bitini diseksiyon için paraformaldehite batırın.

Başı ve karnı bir set forseps ile tutarak, karnın dorsal kütikülünü keserek ve yumurtalıkları karın boşluğundan uzağa sürükleyerek yumurtalıkları inceleyin. Daha sonra, bir mililitre paraformaldehit içeren 1.5 mililitrelik tüpe üç çift yumurtalığı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca sabitleyin ve bir karıştırıcı üzerinde hafifçe çalkalayın. Sabitleme tamponunu bir cam damlalık ile atın ve ardından yumurtalıkları PBST ile 10 dakika boyunca üç kez hafif çalkalayarak yıkayın.

Yumurtalıkları tedavi etmek için, embriyonik dokuların geçirgenliğini artırmak için önce hafif çalkalama ile 10 dakika boyunca Proteinaz K ile inkübe edin. İnkübasyondan sonra, Proteinaz K çözeltisini atın ve ardından yumurtalıkları beş dakika boyunca üç kez 700 mikrolitre glisin ile yıkayın. Daha sonra, yumurtalıkları PBST ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.

Yumurtalıkları tekrar sabitleme tamponu ile oda sıcaklığında 15 dakika hafif çalkalayarak sabitleyin. Engoenöz peroksidaz aktivitesini baskılamak için, yumurtalıkları bir ila üç, bire bir ve üçe bir hacim oranlarıyla yüzde 0.2 PBST'de farklı yüzdelerde metanol ile seri olarak kurutun ve daha sonra yumurtalıkları yüzde 100 metanol ile oda sıcaklığında bir saat boyunca hafif çalkalama ile. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi yumurtalıkları seri olarak yeniden sulandırın.

1.5 mililitrelik bir tüpteki üç çift yumurtalık için, numune bloke etme ve antikor boyama için minimum hacim 200 mikrolitredir. Yumurtalıkları 1x DIG-B bloke etme solüsyonu ile oda sıcaklığında dört saat veya gece boyunca dört santigrat derecede hafif çalkalama ile inkübe edin. İnkübasyonun ardından, süpernatanı atın ve uygun seyreltme oranında birincil antikoru içeren taze 1x DIG-B bloke edici solüsyon ile değiştirin.

Yumurtalıkları oda sıcaklığında dört saat veya gece boyunca hafif çalkalama ile dört santigrat derecede boyayın. Yumurtalıkları metin protokolünde tarif edildiği gibi yıkadıktan sonra, süpernatanı atın ve uygun seyreltme oranında ikincil antikoru içeren taze 1x DIG-B bloke edici solüsyon ile değiştirin ve yumurtalıkları daha önce olduğu gibi boyayın. İmmünofloresan boyama için, karanlıkta boyama yapın, çünkü ikincil antikor ışığa duyarlıdır.

Yaprak biti embriyolarının kalınlığı gelişim aşamaları arasında değişir. Montaj stratejileri böylece erken, orta ve geç embriyolara uyacak şekilde değiştirilir. Yumurtalıkları, montaj ortamıyla birlikte plastik bir damlalık ile hücre tepsisine aktarın ve numuneleri düşük büyütmede bir stereomikroskop altında gözlemleyin.

Böcek pimleri kullanarak lateral yumurta kanalı ile ilişkili nasırları kesin ve ardından izole edilmiş bir yumurtalığı bir damlalık ile boş bir cam kuyuya aktarın. Montaj ortamını kullanarak son hacmi 50 ila 100 mikrolitre arasında yapın. Ardından, bir cam damlalık ile bir yumurtalığı slaydın üzerine aktarın.

Böcek pimleri kullanarak yumurta odalarını inceleyin. Gelişimin altıncı aşamasından daha eski embriyolar için, yumurta odalarının ayrılması önerilir. Germaria ve ilk iki yumurta odası için ayırma isteğe bağlıdır.

Kesilmiş bir yumurta odasını bir cam damlalık kullanarak temiz bir slayta yerleştirin. Gelişimin bir ila 10. aşamalarındaki embriyolar için, kabarcıkları önlemek için disseke edilmiş germaria veya yumurta odalarının üzerine yavaşça bir örtü fişi yerleştirin. Alternatif olarak, gelişimin 11 ila 18. aşamasındaki embriyolar için, yumurta odalarını tek taraflı bir örtü kayma köprüsü olan bir kızak üzerine monte edin ve numunenin üzerine başka bir örtü fişi yerleştirin.

Gelişimin 19. aşamasından daha eski embriyolar için, yumurta odalarını çift taraflı bir örtü kayma köprüsü olan bir kızağa monte edin ve numunenin üzerine başka bir örtü kızağı yerleştirin. Ardından, numunenin kurumasını önlemek için üst kapak sürgüsünün altındaki boşluğu montaj ortamıyla doldurun. Gözlem için doğru yönlendirmeyi elde etmek için üst kapak kızağını hafifçe yuvarlayın.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi, görüntü analizi yapmadan önce köprü kapak fişleri de dahil olmak üzere kapak fişlerinin kenarını oje ile kapatın. Burada gösterilen, bir dişi yetişkinden diseke edilen bir çift yumurtalıktır. Bir yumurtalık, bir germaryum, bir ila iki O bölgesi ve beş ila yedi embriyodan oluşur ve bunların tümü bir montaj hattı tarzında yumurta odalarına yerleştirilir.

Paraformaldehit fiksasyonundan sonra, yumurtalıkların Proteinaz K çözeltisi içinde 10 dakika boyunca mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonda sindirilmesi şiddetle tavsiye edilir. Boyama sonuçları, Poteinase K sindirilmiş embriyolarda sinyal yoğunluğunun önemli ölçüde arttığını göstermektedir. DIG bazlı bir tampon setinden bloke edici çözelti içindeki embriyoların inkübasyonu, normal keçi serumu ve sığır serum albüminindeki embriyolarınkinden daha fazla arka plan lekelenmesini azaltır.

Peroksidazın endojen aktivitesi de yüksek arka plan lekelenmesine neden olabilir. Bu çalışmalar, yaprak biti embriyolarının metanole batırılmasının, peroksidaz aktivitesini, embriyoları hidrojen peroksit ile tedavi etmekten çok daha verimli bir şekilde baskılayabildiğini ortaya koymaktadır. Bu çalışmada ortaya konan kritik koşullar, hem germ hücrelerinde hem de somatik hücrelerde sinyal tespiti için uygulanabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sinyal yoğunluğunun yükselmesi ve arka plan lekelenmesinin azaltılması da dahil olmak üzere yaprak biti embriyoları üzerinde başarılı bir immün boyamanın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, iyi bir embriyo şekli elde etmek için her embriyoyu nazikçe manipüle etmeyi unutmamak önemlidir.

Paraformaldehit ve DAPI ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu prosedürü takiben, messanger RNA'nın embriyonik hücrelerde protein ürünü ile lokalize olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için in situ hibridizasyon gibi diğer önlemler gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, böcek çevre biyolojisi alanında, germ hücrelerinin nasıl belirlendiği ve yaprak bitlerinde farklı üreme aşamalarında yumurta hücrelerinin nasıl belirlendiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.