Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

Bu immünboyama protokolünün genel amacı, yaprak biti embriyolarındaki protein ekspresyonunu tespit etmektir. Yaprak bitilerinin embriyonik dokularının boyanmasında uzun süredir sorun teşkil eden doku geçirgenliğinin artırılması ve arka plan boyamasının azaltılmasına yönelik kritik koşullar belirlenmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, standart bir immünboyama protokolünde genellikle açıklanmayan, antikorların etkili şekilde nüfuz etmesi ve arka plan boyamasının azaltılması için spesifik koşullar sağlamasıdır.

Bu ölçüm fikri ilk olarak, genomik ve çevresel çalışmalar için bir böcek modeli olan bezelye afidi üzerinde germ hücrelerinin nasıl belirlendiğini incelerken ortaya çıktı. Bezelye afidinin laboratuvar suşu olan a. pisum, başlangıçta Tayvan'ın merkezinden toplanmış olup 300'den fazla nesildir konukçu bitkiler üzerinde yetiştirilmiştir.

Çimlendirmek için, konukçu bitkilerin tohumlarını oda sıcaklığında üç ila beş gün boyunca musluk suyunda bekletin. Taze suyu günde bir kez yenileyin. Çimlenen on tohumu, büyüme odasında 16 saat ışık, sekiz saat karanlık fotoperiyodu altında, 20 °C sıcaklıkta, toprak içeren küçük bir saksıda yetiştirin.

Büyüme başladıktan yaklaşık 10 gün sonra, bitkilerin boyu genellikle sekiz santimetreden fazla olur. Her bir bitki saksısını bir litrelik cam bir beher içinde tutun ve yetişkin afidleri bir boya fırçası kullanarak bitkilerin üzerine aktarın. Ardından, afidlerin kaçmasını önlemek için beheri gazlı bez gibi hava geçirgen bir kapakla kapatın.

Yaprak bitlerini, 16 saat ışık ve sekiz saat karanlık fotoperiyodu altında, 20 °C sıcaklıktaki büyüme odasında inkübe edin ve bitki saksılarının her birini günde bir kez sulayın. Bir spot plakanın bir kuyucuğunu yaklaşık 500 µL %4 paraformaldehit ile doldurun. Plakayı düşük büyütmeli bir stereomikroskop altına yerleştirin ve diseksiyon için yetişkin bir yaprak bitini paraformaldehitin içine daldırın.

Baş ve abdomeni bir pens ile tutarak, abdomenin dorsal kütikülünü kesin ve yumurtalıkları abdomen boşluğundan uzaklaştırarak yumurtalıkları diseke edin. Ardından, üç çift yumurtalığı, oda sıcaklığında, bir karıştırıcı üzerinde hafifçe sallayarak, bir mililitre paraformaldehit içeren 1,5 mililitrelik tüplerde 20 dakika boyunca sabitleyin. Sabitleme tamponunu bir cam damlalıkla boşaltın ve ardından yumurtalıkları hafifçe sallayarak, 10 dakika boyunca üç kez PBST ile yıkayın.

Overleri işleme almak için, önce embriyonik dokuların geçirgenliğini artırmak amacıyla hafifçe çalkalayarak Proteinaz K ile 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından Proteinaz K solüsyonunu dökün ve ardından overleri 700 µL glisin ile beşer dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun. Sonrasında, overleri iki kez 10 dakika boyunca PBST ile yıkayın.

Overleri, oda sıcaklığında hafif çalkalama ile 15 dakika boyunca fiksasyon tamponu ile tekrar fikse edin. Endojen peroksidaz aktivitesini baskılamak için, overleri %0,2 PBST içinde bir ila üç, bir ila bir ve üç ila bir hacim oranlarında farklı yüzdelerde metanol ile seri olarak dehidre edin ve ardından overleri oda sıcaklığında hafif çalkalama ile bir saat boyunca %100 metanol ile inkübe edin. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi overleri seri olarak rehidre edin.

1,5 milliliter tüpteki üç çift over için, örnek bloklama ve antikor boyama işlemleri için minimum hacim 200 microliters'dır. Overleri 1x DIG-B bloklama çözeltisi ile oda sıcaklığında dört saat veya dört degrees Celsius'ta gece boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin. İnkübasyonun ardından, süpernatanı uzaklaştırın ve yerine uygun dilüsyon oranındaki primer antikoru içeren taze 1x DIG-B bloklama çözeltisi ekleyin.

Overleri oda sıcaklığında dört saat veya 4 °C'de hafif çalkalama ile gece boyunca boyayın. Overleri metin protokolünde açıklandığı şekilde yıkadıktan sonra, süpernatantı atın ve uygun dilüsyon oranındaki sekonder antikoru içeren taze 1x DIG-B bloklama çözeltisi ile değiştirip overleri daha önce yaptığınız gibi boyayın. İmmünofloresan boyama için, sekonder antikor ışığa duyarlı olduğundan boyama işlemini karanlıkta gerçekleştirin.

Afid embriyolarının kalınlığı gelişim evrelerine göre farklılık gösterir. Bu nedenle, montaj stratejileri erken, orta ve geç evre embriyolara uygun şekilde modifiye edilir. Yumurtalıkları, montaj medyumuna beraber plastik bir damlalıkla hücre tepsisine aktarın ve örnekleri düşük büyütmede bir stereomikroskop altında gözlemleyin.

Lateral oviduct ile ilişkili kallusları böcek iğneleri kullanarak kesin ve ardından izole edilen bir ovariole'u damlalık yardımıyla boş bir cam kuyuya aktarın. Montaj medyumu kullanarak nihai hacmi 50 ile 100 µL arasına tamamlayın. Daha sonra, bir ovariole'u cam damlalık ile lam üzerine aktarın.

Yumurta odacıklarını böcek iğneleri kullanarak diseke edin. Gelişimin altıncı evresinden daha ileri aşamadaki embriyolar için yumurta odacıklarının ayrılması önerilir. Germaria ve ilk iki yumurta odacığı için ayrılma işlemi isteğe bağlıdır.

Diseke edilmiş bir yumurta odasını cam bir damlalık kullanarak temiz bir lama aktarın. Gelişimin 1 ile 10. evreleri arasındaki embriyolar için, hava kabarcıklarını önlemek amacıyla disseke edilmiş germaria veya yumurta odalarının üzerine yavaşça bir lamell yerleştirin. Alternatif olarak, gelişimin 11 ile 18. evreleri arasındaki embriyolar için, yumurta odalarını tek taraflı lamell köprüsü şeklinde bir lama monte edin ve örneğin üzerine başka bir lamell yerleştirin.

Gelişiminin 19. evresinden daha büyük embriyolar için, yumurta odacıklarını çift taraflı bir lamel köprüsü ile bir lama monte edin ve örneğin üzerine başka bir lamel yerleştirin. Ardından, örneğin kurumasını önlemek için üst lamelin altındaki boşluğu montaj medyası ile doldurun. Gözlem için doğru yönelimi elde etmek amacıyla üst lameli hafifçe yuvarlayın.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı üzere, görüntü analizi gerçekleştirmeden önce köprü lamelleri de dahil olmak üzere lamel kenarlarını oje ile mühürleyin. Burada, yetişkin bir dişiden diseke edilmiş bir çift yumurtalık gösterilmektedir. Bir ovariole; bir germarium, bir ila iki O-sitesi ve beş ila yedi embriyodan oluşur ve bunların tamamı bir montaj hattı düzeninde yumurta odacıkları içinde yer alır.

Paraformaldehit fiksasyonunun ardından, overlerin 1 µg/mL konsantrasyondaki Proteinaz K çözeltisi ile 10 dakika boyunca sindirilmesi şiddetle tavsiye edilir. Boyama sonuçları, Proteinaz K ile sindirilmiş embriyolarda sinyal yoğunluğunun önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Embriyoların DIG tabanlı bir tampon setinden gelen bloklama çözeltisinde inkübe edilmesi, normal keçi serumu ve sığır serum albümini ile inkübe edilen embriyolara kıyasla arka plan boyamasını daha fazla azaltır.

Peroksidazın endojen aktivitesi aynı zamanda yüksek arka plan boyanmasına neden olabilir. Bu çalışmalar, afid embriyolarının metanole daldırılmasının, embriyoların hidrojen peroksit ile işlenmesine kıyasla peroksidaz aktivitesini çok daha etkili bir şekilde baskılayabildiğini ortaya koymaktadır. Bu çalışmada belirlenen kritik koşullar, hem germ hücrelerinde hem de somatik hücrelerde sinyal tespiti için uygulanabilir.

Bu teknik bir kez kavrandığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde iki günde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sinyal yoğunluğunun artırılması ve arka plan boyamasının azaltılması da dahil olmak üzere, afid embriyolarında başarılı bir immün boyamanın nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, embriyoların iyi bir formda kalmasını sağlamak için her bir embriyoyu nazikçe manipüle etmeyi hatırlamak önemlidir.

Paraformaldehit ve DAPI ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken eldiven gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu prosedürün ardından, haberci RNA'nın embriyonik hücrelerde protein ürünüyle birlikte yerelleşip yerelleşmediği gibi ek soruları yanıtlamak için in situ hibridizasyon gibi diğer önlemler gerçekleştirilebilir. Bu yöntem; germ hücrelerinin nasıl belirlendiği ve yapraklılarda yumurta hücrelerinin farklı üreme evrelerinde nasıl tayin edildiği gibi böcek çevre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.