Name: Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Öğrenin, bezelye afit embriyolarında immün boyama için doku geçirgenliğini artırma ve arka plan boyamasını azaltma koşullarını. Bu yöntem, protein ekspresyonu tespitini geliştirerek embriyonik gelişim araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Monoklonal 4D9 antikorunu sağladığı için Chau-Ti Ting'e (Tayvan'daki Fly Core), konfokal mikroskopi için College of Life Science NTU'nun Technology Commons'ına (TechComm), el yazmasını düzelttiği için Hsiao-Ling Lu'ya ve çekimlere yardımcı olduğu için Chen-yo Chung'a minnettarız. CC, stratejik öneriler sağladığı ve makalenin eleştirel düzenlemesi için Charles E. Cook'a özellikle teşekkür eder. Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (GWL ve CC için 101-2313-B-002-059-MY3 ve 104-2313-B-002-022-MY3) ve Ulusal Tayvan Üniversitesi (CC için NTU-CESRP 101R4602D3; GWL için 103R4000) tarafından desteklenmiştir.

Yaprak bitleri 1. Kültür NOT:. Partenogenetik viviparous bezelye yaprak biti A laboratuvar zorlanma Pisum başlangıçta merkezi Tayvan&#39;da toplandı ve 300&#39;den fazla nesiller için uzun gün fotoperiyodunda konak bitkileri (bahçe bezelye Pisum sativum veya bakla Vicia faba) yetiştirilen olmuştur (bir kuşak: ~ 10 gün). <ol><li> Tohum Çimlenme <ol><li> Oda sıcaklığında 3-5 gün boyunca musluk suyu konakçı bitkilerin tohumlarının bekletin. Günde bir kez temiz su ile doldurun. NOT: Alternatif olarak, düz nemli toprağa konukçu bitkilerin tohumları koyarak yanı sıra çimlenme neden olabilir. </li><li> Işık periyodu 16 saat aydınlık / 20 ° C&#39;de 8 saat karanlık altında bir büyüme odasında toprak ile küçük bir kap (9 cm çapında x 7 cm boyunda) içinde 10 çimlenme tohum büyütün. </li><li> Büyüme başlıyor Yaklaşık 10 gün sonra, kimin yüksekliği en fazla 8 cm bitkiler üzerine kurtları aktarmak. </li></ol></li><li> Yaprak bitleri Devri <ol&gt; <li> , 1 L&#39;lik bir cam beher içinde bitkilerin her saksı tutun bir boya fırçası ile bitkiler üzerine 8, yetişkin kurtları aktarmak ve sonra kaçmasını önlemek için yaprak bitleri gibi gazlı mesh olarak hava geçirgen bir kapak ile beher mühür. </li><li> Işık periyodu 16 saat aydınlık / 20 ° C&#39;de 8 saat karanlık altında bir büyüme odasında inkübe yaprak bitleri. Her gün bir kez bitkilerin her bitki pot sulayın. </li><li> Yaprakbitlerinin nesil elde etmek için, adımları 1.1.3-1.2.2 on gün birincil yaprak biti transferinden sonra yineliyoruz. </li></ol></li></ol> 2. Diseksiyon ve Yumurtalıkların Fiksasyon <ol><li> Taze sabitleme tampon 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlar. </li><li> PFA (yaklaşık 500 ul) ile bir nokta plakasının bir kuyu doldurun düşük büyütme stereo mikroskop altında plaka yerleştirin ve diseksiyon için PFA içinde yetişkin bir afidi daldırın. </li><li> , Forseps bir set ile baş ve karın tutan dorsal açık keserek yumurtalıkların teşrihKarın manikür ve karın boşluğunun uzak yumurtalıklar sürükleyerek. </li><li> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında PFA 1 ml ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içinde yumurtalık üç çift sabitleyin. </li><li> Bir transfer pipet (cam ya da tek kullanımlık) 1x PBS içinde% 0.2 TritonX-100 (PBST) 10 dakika her 3 kez yumurtalıkların yıkayın ve sonra birlikte Durusu sabitleme tampon. Hafif (dönüş açısı: 60 ° (F60) / devir hızı: 8 RPM) bir mikser / rotator sallayarak sabitleme ve yıkama hem de tavsiye edilir. </li></ol> 3. proteinaz K (PK) ile tedavi Embriyonik Dokuların Geçirgenlik Artırma NOT: PK tedavisi ileriye mikrop bant uzantısı (evre gelişme 11) embriyolar uygulanır. Genç embriyoların için, bu adım isteğe bağlıdır. <ol><li> Seri olarak çalışma konsantrasyonu 1 mg / ml&#39;ye 1x PBS ile PK&#39;nin stok solüsyonu (10 mg / ml) seyreltin. </li><li> Hafif çalkalama ile 10 dakika için PK (yaklaşık 500 ul) 1 ug / ml yumurtalık inkübe edin. </li><li> Durusu PK solutive Glisin 700 ul (2 mg / ml) 5 dakika her biri için 3 kez yumurtalıkların yıkama ile. </li><li> 10 dakika her biri iki kez% 0.2 PBST ile yumurtalıkları yıkayın. </li><li> Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sabitleme tamponu ile tekrar yumurtalıkların sabitleyin. </li><li> Süpernatantı atın ve 10 dakika her biri için iki kez% 0.2 PBST ile yumurtalıkların yıkayın. </li></ol> 4. Metanol Kuluçka Endojen peroksidaz Bastırma (POD) faaliyeti için Not: Metanol inkübasyon metanol duyarlı Phalloidin boyama veya antikor epitoplarının tutulan embriyolarda uygulanmaz. <ol><li> Seri olarak% 0.2 PBST içinde metanol farklı yüzdesi yumurtalıkların dihidrat (3: 1: 1: 1, 3: 1 h / h) hafif ajitasyon ile, 10 dakika boyunca metanol çözeltisinin her konsantrasyonunda yumurtalıkları inkübe edilerek. </li><li> Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 100 metanol ile yumurtalıkları kurutmak. Not: boyama tatmin edici sonuçları hala% 100 metanol içinde depolanmıştır biti dokulardan elde edilebilir ve -20# 176; C bir ay. </li><li> Seri olarak% 0.2 PBST içinde metanol farklı yüzdesi yumurtalıkların rehidrate (1: 1: 1: 3, 1: hac / hac 3) hafif ajitasyon ile, 10 dakika boyunca metanol çözeltisinin her konsantrasyonunda yumurtalıkları inkübe edilerek. </li></ol> 5. Antikor Boyama <ol><li> DIG-tabanlı tampon kümesinden 10x engelleme çözümü sulandırmak (DIG-B) 1x için. Not: 1x DIG-B bloke edici solüsyonu (BSA standardı bloke% 5 oranında reaktif maddesi (hac / hac) normal keçi serumu (NGS) ve% 0.5 (v / v) inek serumu albümini daha boyama arka azaltmak için daha etkilidir )% 0.2 PBST içinde. </li><li> Hafif çalkalanarak 4 ^ &#39;de oda sıcaklığında ya da O / N oranında 2,5 saat 4 için 1x DIG-B bloke edici bir solüsyonuyla yumurtalıkların inkübe edin. NOT: 1.5 ml tüp içinde yumurtalıkların üç çift için 200 ul örnek engelleme ve antikor boyama için minimum hacimdir. </li><li> Süpernatant Durusu ve uygun diluti birincil antikor içeren taze 1x DIG-B engelleme çözümü ile değiştirinoranı. Hafif çalkalanarak 4 ^ &#39;de oda sıcaklığında ya da O / N 4 saat boyunca yumurtalıkları Leke. Not: (1) ApVas1 antikoru: 1: Burada anlatılan deney için, primer antikorların müteakip optimum dilüsyonları kullanımı kromojenik boyama 500, immünofloresan boyama 1:50; (2) anti-α tübülin antikoru: 1: 500; (3) 4D9 monoklonal antikoru: 01:25. </li><li> 15 dakika her biri için,% 0.2 PBST ile 4 kez yumurtalıkların yıkayın. </li><li> Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat süre ile 1x DIG-B bloke edici bir solüsyonuyla yumurtalıkların inkübe edin. </li><li> Süpernatant Durusu ve taze 1x DIG-B engelleme çözümü uygun seyreltme oranında ikincil antikor içeren değiştirin. Hafif çalkalanarak 4 ^ &#39;de oda sıcaklığında ya da O / N 4 saat boyunca yumurtalıkları Leke. <ol><li> İkincil antikor, aşağıdaki seyreltme oranları kullanın: (1) için immünofloresan boyama: 1: Alexa Fluor 633 keçi anti-tavşan IgG veya Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG ile 500; (2) boyama için kromojenik: 1: 200 biyotinile keçi anti-tavşan IgG. Not: biyotinlenmiş sekonder antikor boyama sinyalleri önemli ölçüde güçlendirilmiş olan, alt-tabaka bazlı (kromojenik) algılama bölgesi avidin-biyotin-kompleksi (ABC) etkileşime girmek için uygulanır. </li><li> Ikincil antikor duyarlı hafif olduğu için immünofloresan boyama için, karanlıkta boyama yürütmek. </li></ol></li><li> 10 dakika her biri için% 0.2 PBST ile 4 kez ikincil antikor yıkayın. </li></ol> 6. Nükleer ve F-aktin Boyama Not: Bu yalnızca immünofloresan boyama uygulanır. <ol><li> Karanlıkta oda sıcaklığında DAPI (2 ng / | il) ve 2 saat Phalloidin-TRITC (100 nM) ihtiva eden% 0.2 PBST ile yumurtalıkları Leke. </li><li> 10 dakika her biri için,% 0.2 PBST ile 4 kez yumurtalıkların yıkayın. </li><li> Hafif çalkalanarak 4 ^ &#39;de montaj orta O / N yumurtalıkların inkübe edin. </li></ol> 7. Sinyal Geliştirme Not: Bu yalnızca kromojenik boyanması için uygulanır. <ol><li> 100 ul hazırlayınbiyotin yaban turpu peroksidaz ile konjüge edilmiş (Reaktif B 1 ul,% 0.2 PBST 98 ul Reaktif A (avidin) 1 ul ekleyerek yumuşak pipetleme ile iyice karıştırarak ve ekleyerek sinyali artırmak için (ABC) reaktif avidin-biyotin-kompleksi ), anında karıştırılması, ardından. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca belirteç, A ve B karışımı içinde (kopuk yumurta odaları dahil) yumurtalık inkübe edin. </li><li> 10 dakika her biri için,% 0.2 PBST ile 4 kez belirteç, A ve B karışımı yıkayın. </li><li> Plastik damlalık ile nokta plaka üzerinde bir kuyuya PBST batmış yumurtalıklar aktarın. </li><li> 3,3&#39;-diaminobenzidin (DAB) içinde alt-tabaka çözeltisi hazırlayın: Bir DAB tablet artı 1 dakika boyunca güçlü döndürülerek ile GKD 2 O, 1 ml bir tane ihtiva eden üre hidrojen peroksit çözülür. NOT: DAB, peroksidaz bir tetikleyici substrat, immün için popüler bir Kromojen olduğunu. Bir br üretirperoksidaz tarafından okside sonra kendi ve çözünmez çökelti. Zayıf sinyalleri alt-tabaka çözeltisi (nihai konsantrasyon 0,05-0,08%) nikel klorit ilave edilerek artırılabilir. </li><li> Oyuk kalan PBST solüsyonu çıkarın ve sinyal gelişimi için DAB alt-tabaka çözeltisi 100 ul ile doldurun. </li><li> Düşük büyütme stereo mikroskop altında sinyallerin yoğunluğunu izleyin. </li><li> Hemen 1x PBS ile dolum ardından DAB çözüm kaldırarak tepkilerini durdurun. İki kez yıkama tekrarlayın. </li><li> 1,5 ml&#39;lik bir tüpe geri yumurtalıkların aktarın ve daha sonra 15 dakika her biri için iki kez 1 x PBS veya PBST ile yıkanır. </li><li> Hafif çalkalanarak 4 ^ &#39;de, bir gliserol tabanlı bir montaj ortamına (70% gliserol) O / N olarak yumurtalıkların inkübe edin. </li></ol> 8. Yaprak biti Embriyolar Montaj NOT: Yaprak biti embriyoların kalınlığı gelişim aşamaları arasında değişmektedir. Montaj stratejileri, böylece erken uyacak şekilde modifiye (germaria ve 0-10 aşamaları), orta (aşamaları vardırŞekil 2B gösterilmiştir 11-18), ve geç embriyolar (aşamaları 19-20), - D. Embriyonik evreleme Miura ve ark izledi. 12 <ol><li> Düşük büyütme stereo mikroskop altında örnekleri plastik damlalık ile hücre tepsisine montaj orta ile birlikte yumurtalıkların aktarın ve gözlemleyin. </li><li> Böcek pimleri kullanarak yan yumurtalık ile ilgili kaliksi kesin ve daha sonra bir damlalık ile de boş cam bir izole ovaryol aktarın. Montaj orta kullanarak ul 50-100 son hacim Makyaj. </li><li> Cam damlalık ile slayt üzerine bir ovaryol aktarın ve ardından böcek pimleri kullanarak yumurta odaları incelemek. NOT: geliştirme aşamasında 6 yaşından büyük embriyolar için yumurta odaları ayrılması tavsiye edilir; germaria ve evre 6 yaşından küçük ilk iki yumurta odaları için, ayrılık isteğe bağlıdır. </li><li> Cam damlalık kullanarak temiz bir slayt bir disseke yumurta odasına yerini değiştirin. </li><li> Bir Lamel (boyut koyun: 22 x 22disseke germaria ya da yavaş kabarcıkları önlemek için yumurta odaları (aşamaları gelişimin 1-10 embriyolar içeren) üzerinden mm). <ol><li> Dağı yumurta odaları tek taraflı lamel köprü ile bir slayt (aşamaları gelişimin 11-18 embriyolar içeren) ve başka bir lamel yerleştirin: numune üstünde (boyut 18 x 18 mm). </li><li> Dağı yumurta odaları çift taraflı lamel köprü ile bir slayt (geliştirme aşamasında 19 yaşından büyük embriyoları içeren) ve başka bir lamel yerleştirin: numune üstünde (boyut 18 x 18 mm). </li></ol></li><li> Numuneyi kurumasını önlemek için montaj medya ile üst lamel altında boşluğu doldurmak. </li><li> Hafif gözlem için doğru yönlendirmeyi elde etmek için lamel kaydırarak embriyo döndürün. </li><li> Oje ile (köprü lamelleri dahil) lamelleri kenarına etrafında mühür. </li></ol> 9. Görüntüleme Analizi <ol><li> Fotoğraf diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri compou ile embriyolar tüm montajnd mikroskop DIC optik ve kameraya bağlı bir kuru objektif lens (10X, 20X, 40X) ile donatılmış. Üreticinin talimatlarını kullanarak kamera ve bilgisayar arasındaki görüntü aktarımı için yazılımı yükleyin. </li><li> Bir lazer-tarama konfokal mikroskop 14 floresan etiketli embriyoların projeksiyonlar elde edin. , Fotoğraf z-istifleme ve 3D görüntüleme yazılımı ile projelendirme için üreticinin yönergelerini izleyin. <ol><li> 10X amacı ile monte örneği bulmak, baş aşağı slayt çevirin ve ince yağlı bazlı kalem ile örnek alan daire. NOT: Bu konfokal mikroskop hedefleri doğrultusunda bunun ararken örnek daha kolay belirlenmesi yapar. </li><li> Karşı tarafta 9.2.1 de açıklandığı gibi etiketlenmiş lamel alanının üstünde bir damla yağ ekleyin. </li></ol></li><li> 40X yağ daldırma amaca odak düzlemi daha sonra bir 63X yağ daldırma hedefi değiştirmek bulun. Manuel olarak ince odak denetimi taşımak ve yapılacakwn iyi odak düzlemi yakalamak için. NOT: germaria ve erken embriyo yapısal ayrıntıları gözlemleyerek için, 40X hedefleri veya daha yüksek büyütme olanlar kullanmanızı öneririz. </li><li> Farklı uyarma kanallarda embriyo tarayın ve z-yığın görüntü elde. Not: bezelye yaprak biti dokuları, 1.5 um ya da daha az kadar her bir optik bölümünde kalınlığını azaltır. </li></ol>

<ol><li>Blackman, R. L. Reproduction, cytogenetics and development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlackman%2C+RL+%22Aphids%3A+their+biology%2C+natural+enemies%22">Aphids: their biology, natural enemies</a>. Minks, A. K., Harrewijn, P. , Elsevier Press. Amsterdam. 163-195 (1987).</li>
<li>Davis, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclical+parthenogenesis+and+viviparity+in+aphids+as+evolutionary+novelties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties.</a> J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).</li>
<li>The International Aphid Genomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> PLoS Biol. 8 (2), e1000313(2010).</li>
<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+there+yet%3F+Tracking+the+development+of+new+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).</li>
<li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apvasa+marks+germ-cell+migration+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum+%28Hemiptera%3A+Aphidoidea%29%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)).</a> Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).</li>
<li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+identification+of+gene+transcripts+in+aphids%3A+Protocols+and+evaluation+of+probe+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem%22%5BJournal%5D)">Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility.</a> Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).</li>
<li>Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+protocols+for+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%3A+a+comprehensive+survey+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis.</a> Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).</li>
<li>Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+knockdown+of+a+salivary+transcript+leading+to+lethality+in+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.</a> J. Insect Sci. 6, 38(2006).</li>
<li>Jaubert-Possamai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+by+RNAi+in+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> BMC Biotechnol. 7, 63(2007).</li>
<li>Sapountzis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insight+into+the+RNA+interference+response+against+cathepsin-L+gene+in+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%3A+Molting+or+gut+phenotypes+specifically+induced+by+injection+or+feeding+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).</li>
<li>Braendle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+and+evolution+of+bacteriocytes+in+the+aphid-Buchnera+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis.</a> PLoS Biol. 1 (1), e21(2003).</li>
<li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+parthenogenetic+and+sexual+embryogenesis+of+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum+%28Hemiptera%3A+Aphidoidea%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea).</a> J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).</li>
<li>Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-plasm+specification+and+germline+development+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%3A+Vasa+and+Nanos+as+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers.</a> Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).</li>
<li>Koshy, A. A., Cabral, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+and+analysis+of+neurons+infected+in+vivo+with+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii.</a> J. Vis. Exp. (94), e52237(2014).</li>
<li>Brisson, J. A., Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%3A+an+emerging+genomic+model+system+for+ecological%2C+developmental+and+evolutionary+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies.</a> Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Method.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+divergent+expression+aspects+of+the+Drosophila+segmentation+gene+hunchback+in+the+short+germ+band+embryo+of+the+flour+beetle+Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium.</a> Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23 (4), 345-358 (2001).</li>
<li>Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+localization+of+ApVas1+positions+the+preformed+germ+plasm+in+the+sexual+oviparous+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> Evodevo. 5, 18(2014).</li>
<li>Straus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+peroxidase+by+methanol+and+by+methanol-nitroferricyanide+for+use+in+immunoperoxidase+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures.</a> J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biz bezelye yaprak biti A başarılı immün kritik uygun koşulları belirledi. Pisum, genomik ve gelişim çalışmalarında 3,15 için gelişmekte olan bir model organizmadır. Doku geçirgenliğini artırarak ve arka plan boyama azaltmak için optimize edilmiş koşullar yoğunluğu ve sinyallerin özgüllüğünü geliştirilmiş. Bunlar, hücre zarlarında gözenekleri oluşturma ve spesifik olmayan bağlanma bloke edici antikor için aşamalar diğer hayvan modellerinde immün için standart protokollere göre farklılık göst...

Yaprak bitleri küçük (1-10 mm) yumuşak organları ile hemipteran böceklerdir. Onlar piercing, ağız parçaları ile floem öz suyunu emerek bitkiler üzerinde beslenirler. Ek olarak, floem özsuyu diyet eksiktir esansiyel amino asitleri sentezlemek için, bir zorunlu endosimbiyotik bakterinin, Buchnera aphidicola güveniyor. Yaprak bitleri bahar ve yaz uzun gün fotoperiyodların ve kışlama yumurta 1,2 sınırlı sayıda yatıyordu sırasında kısa gün fotoperiyodların tarafından tetiklenen cinsel yumurtlayarak çoğalan üreme sırasında partenogenetik viviparous üreme içeren karmaşık bir hayat öyküsü var. İlkbaharda bu yumurtalar sonbahara kadar partenogenetik üreme çok sayıda mermi takip, hepsi kadın yaprak bitleri (fundatrices) birinci nesil üretmek için yumurtadan. Yıllık yaşam döngüsünde eşeysiz ve cinsel fazlar alternatif, evrimsel yenilik 1,2 olarak kabul edilmiştir yaprak bitleri, devresel parthenogenesis. Partenogenetik viviparous yaprak bitleri içinde, Embryogenesis yumurtalık tübül (ovaryolden) yumurta odaları içinde yer alır. Buna karşılık, cinsel yumurtlayarak çoğalan embriyolar döllenmiş yumurtanın içinde gelişir. Ayrı üreme plastisite gelen, yaprak bitleri kuşaklararası kanat polyphenism görüntüleyebilirsiniz: kalabalık sinyalleri ve predatör tehditlerine yanıt olarak, unwinged aseksüel dişiler viviparously uzun mesafe göç kanatlı yavrular üretebilir. Bezelye yaprak biti genom dizisinin Yayın Acyrthosiphon Pisum -the ilk genom sekansı, bir bazal hemimetabolus böcek sağlar üreme plastisitesi, kanat polyphenism ve molekül üzerindeki yaprak biti böcek bitki etkileşimleri viral vektör ve ortak yaşam dahil olmak üzere diğer özelliklerin daha da araştırma temeli 3. Sıralı genom ek olarak, gen ekspresyonu ve fonksiyonunu karakterize etmek için araçlar, olgun bir model organizma olarak 4 bezelye yaprak biti teşvik etmek için gereklidir. Biz bütün-mount sağlam protokoller tanımlamışlardır <em&gt; biti embriyoların 5-7 mRNA ekspresyonunu tespit etmek için in situ hibridizasyon. Çift kollu bir RNA enjeksiyon ve besleme ile RNA interferans (RNAi) biti nimf ve yetişkinlerde gen susturma kullanılmaktadır, ancak embriyolar demonte gen için stabil şartlar yapılmamış 8-10 rapor edilmemiştir. Immün ve RNAi demonte sonra bezelye yaprak biti embriyolar 11-13 yapılmadan önce numuneler içindeki protein ifadesi tespit edebilir bir antikor-bazlı yaklaşım. Ancak, doku geçirgenliği ve arka plan boyama ortadan kaldırılması artış bezelye yaprak biti aseksüel viviparous embriyolar immün standart protokolleri kullanarak henüz tatmin edici değildir. Örneğin, dokulara antikorun bu penetrasyon Gastrulasyon embriyolarda azaldığı bulundu (8-10 evre) ve morfolojik olarak tanımlanabilir ekstremite tomurcukları (aşamaları 13-14) ile embriyolar antikor zorlukla geçirgen olduğunu. Buna ek olarak, arka plan renklenmesi eşeysiz viviparo görüntülenmiştir edildigerm işaretleyici Vasa yanı sıra buna karşı embriyonik segmentlerde 12,13 olarak ifade Engrailed / Invected proteinine karşı antikor kullanılarak boyandı bize bezelye yaprak biti embriyolar. Aslında arka plan renklenmesi yine tek başına ikincil antikor ile boyandı embriyolar açıkça görülebilir. Yaprak biti dokuların bütünlüğünü bozmadan geçirgenliğini arttırmak için dikkatli bir şekilde proteinaz K konsantrasyonunun titre edildi ve yaprak biti embriyolar Doku sindirimi için en uygun koşulları belirlendi. Bezelye yaprak biti spesifik olmayan lekelenmenin engellenmesi için, etkili bir şekilde bloke eder ve embriyolar endojen peroksidaz (POD) aktivitesini, immün sırasında sinyallerini yükseltmek için kullanılan bir enzim baskılayabilir bileşikleri aramışlardır. Geleneksel olarak kullanılan normal keçi serumu yerine (NGS) bir digoxigenin (DIG) bazlı tampon seti tarafından temin edilen bir bloke edici tepkin maddesi / sığır serum albümini (BSA), önemli ölçüde bir arka plan renklendirmesini azalttı. Ayrıca, metanol inhi bulunmuşturHidrojen peroksit daha etkili endojen POD faaliyetini bit (H 2 O 2). Embriyoların üzerinde immün için bu yaprak biti özgü koşullarına ilişkin ayrıntılar aşağıdaki bölümlerde açıklanacaktır.

<table><tbody><tr><td>% 30 hidrojen perksidaz (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>Embriyoların endojen peroksidazının ağartılması için.</td></tr><tr><td>4' 6-diamidino-2-fenil-indol dihidroklorür (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Çift sarmallı DNA'yı etiketlemek için. ZEHİRLİ. Eldiven giyin, küçük alikotlara dağıtın ve maruziyeti en aza indirmek için feeze</td></tr><tr><td>4D9 anti-engrailed / invected fare monoklonal antikoru</td><td>Gelişimsel çalışmalar hibridoma bankası</td><td>AB_528224</td><td>Embriyonun gelişmekte olan segmentlerini etiketlemek için.</td></tr><tr><td>ApVas1 tavşan poliklonal antikoru</td><td>Laboratuvarımız</td><td>N/A</td><td>Embriyolarda yaprak biti germ hattına özgü Vas1 proteinini etiketlemek için. Bu antikor laboratuvarımız tarafından yapılmıştır.</td></tr><tr><td>Austerlitz Böcek pimleri</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>Her bir yumurta odasını bir yumurtalıktan ayırmak için kullanılır. Boyut 000, SİYAH EMAYE LED.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için.</td></tr><tr><td>Yaprak biti embriyolarının fotoğrafını çekmek için</td> <td>bileşik mikroskop</td><td>Canon</td><td>EOS 5D'ye</td> bağlı kamera.</tr><tr><td>Kolorimetrik 8 hücre tepsisi</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>Yaprak biti embriyolarının boyama sinyalini geliştirmek için. Çap 95 x 57 mm, hücre derinliği 2 mm.</td></tr><tr><td>DIC optikli bileşik mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMR</td><td>Slaytlara monte edilmiş yaprak biti embriyosunun fotoğrafını çekmek için.</td></tr><tr><td>DIG Yıkama ve Blok Tampon Seti</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için. 10x Bloke etme solüsyonunu bloke edici reaktif olarak 1x'e seyrelttik.</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>İdeal-tek</td><td>N/A Yaprak</td><td>bitlerinden yumurtalıkların diseksiyonu için. Üretici parça No 5: 5 SA.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam damlalık</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Yaprak bitlerinin yumurtalıklarını splot plakasından tüplere aktarmak için. 150 mm toplam uzunluk ve 5 3/4" uç uzunluğu.</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Yaprak biti embriyolarının temizlenmesi ve montajı için.</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>Proteinaz K'nin (PK) enzim aktivitesini bloke etmek için.</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG konjuge Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Fareden primer antikorun tespiti için.</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG konjuge Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Tavşandan primer antikorun tespiti için.</td></tr><tr><td>Intelli karıştırıcı</td><td>ELMI laboratuvar ekipmanları</td><td>RM-2M</td><td>Reaktiflerin yumurtalıklarla şiddetli reaksiyonunu iyileştirmek için.</td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskopi</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Florecent etiketli slaytlara monte edilmiş yaprak biti embriyosunun fotoğrafını çekmek için.</td></tr><tr><td>metanol ve nbsp;</td><td>Burdick ve Jackson</td><td>AH2304</td><td>Embriyoların endojen peroksidazının ağartılması için.</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları&nbsp;</td><td>Termo bilimsel</td><td>10143560</td><td>Embriyoların montajı için. SUPERFROST zemin kenarları, ca./env. 76 x 26 mm.</td></tr><tr><td>Mikroskop Kapak camları</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>Embriyoları slaytlara monte etmek için. Boyut: 18 x 18 mm. Kalınlık No. 1 (0,13 ila 0,16 mm)</td></tr><tr><td>Mikroskop Kapak camları</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>Embriyoları slaytlara monte etmek için. Boyut: 22 x 22 mm. Kalınlık No. 1 (0,13 ila 0,16 mm)</td></tr><tr><td>fare monoklonal anti-alfaTubulin antikoru (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>Hücrelerin alfa-tubulin dağılımını etiketlemek için.</td></tr><tr><td>Oje</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Slaytlardaki lamellerin sızdırmazlığı için kullanılır.</td></tr><tr><td>Normal keçi serumu (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için.</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>Yaprak biti yumurtalıklarının fiksasyonu için.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>F-aktinin embriyolar üzerindeki dağılımını etiketlemek için.</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>N/A</td><td>N/A</td><td>Yaprak biti yumurtalıkları için izotonik çözelti olarak.</td></tr><tr><td>Plastik damlalık</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Yaprak bitlerinin yumurtalıklarını tüpten hücre tepsisine aktarmak için kullanılır. Boyut 3 ml.&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>Hücre zarı üzerinde gözenekler oluşturmak (delme) ve antikorların erişimini kolaylaştırmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Pyrex spot plakası</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mikroskopi altında yaprak biti yumurtalıklarının diseksiyonu ve renk reaksiyonları için. Çapı 22 mm olan her boşluk ve&nbsp; derinlik 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidin (DAB) tabletleri&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>Alt tabakalı sinyallerin geliştirilmesi için. DAB peroksidaz substrat tablet seti olarak da adlandırılır.</td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>Yaprak biti yumurtalıklarının diseksiyonu ve gözlemi için.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Hücre zarında gözenekler oluşturmak (delme) için.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kiti (Tavşan IgG)</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>PK-6101</td><td>Sinyalin iyileştirilmesi için. Biyotinile keçi anti-tavşan IgG ikincil antikoru, A ve B reaktifleri dahil.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD montaj ortamı</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>H1000</td><td>Yaprak biti embriyolarının temizlenmesi ve montajı için.</td></tr></tbody></table>

bezelye afit embriyolar immün için kritik koşulların belirlenmesi: doku geçirgenliğini arttırarak ve arka plan boyama azaltılması

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Bezelye yaprak biti Acyrthosiphon Pisum, bir sıralı genom ve bol fenotipik plastisite ile genomik ve gelişimsel çalışmalar için gelişmekte olan bir model haline gelmiştir. Diğer yaprak bitleri, A gibi. Pisum embriyoları ovaryol bir montaj hattı moda yumurta odaları içinde geliştirmek partenogenetik doğuran üreme yoluyla hızla yaymak. Daha önce biz yaprak biti embriyolarda mRNA ifadesinin tespiti sağlayan in situ hibridizasyon tam mount güçlü bir platform kurduk. Protein ifadesini analiz etmek için olsa da, tatmin edici sonuçlar üretmek değil aseksüel viviparous Yaprakbitlerinin ovaryolden immün için protokol kurdu. Burada doku geçirgenliğini artırarak ve kurulan yaklaşımları uygularken sorunlarla her ikisi de arka plan boyama, azaltmak için optimize edilmiş koşulları bildirmektedir. Optimizasyon içerir: esas f bulunmuştur proteinaz K (1 ug / ml, 10 dakika), (1) inkübasyonorta ve geç evre yaprak biti embriyolarda veya antikor penetrasyon; Bir digoxigenin (DIG) tarafından tedarik edilen bir bloke edici tepkin madde ile normal keçi serumu / büyükbaş hayvan serum albümin (2) yerine ayarlanmış tampon ve endojenez peroksidazı ağartılması için, metanol yerine hidrojen peroksit (H2O 2), (3) bir uygulama merkezli; bu anlamlı biti dokularda bir arka plan renklendirmesini azaltmıştır. Immün için optimize Bu kritik şartlar A. Pisum ve diğer Yaprakbitlerinin embriyolar gen ürünlerinin etkin algılama sağlayacaktır.

Bu çalışmada, biz aseksüel bezelye yaprak bitleri (Şekil 1A) embriyolar üzerinde tüm montaj immün uygulandı. Bu dişiler partenogenetik ve viviparously yavrular üretirler. Bu kadın embriyolar yumurtalık tübül (ovaryolden) (Şekil 1B ve Şekil 2A) yumurta odaları içinde gelişir. Mikroskopi önce disseke ovaryolden boyama hedefleri; Bununla birlikte, yumurta bölmelerinin ayrılması, bir mikroskop (- D Şekil <st...

Yaprak biti embriyoları üzerinde tam montajlı immün boyama protokolü sunulmuştur, burada arka plan boyamasını azaltmak ve doku geçirgenliğini artırmak için kritik koşullar ele alınmaktadır. Bu koşullar, yaprak bitlerinin embriyonik dokularında protein ekspresyonunun etkili bir şekilde tespit edilmesi için özel olarak geliştirilmiştir.

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Bu immünboyama protokolünün genel amacı, yaprak biti embriyolarındaki protein ekspresyonunu tespit etmektir. Yaprak bitilerinin embriyonik dokularının boyanmasında uzun süredir sorun teşkil eden doku geçirgenliğinin artırılması ve arka plan boyamasının azaltılmasına yönelik kritik koşullar belirlenmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, standart bir immünboyama protokolünde genellikle açıklanmayan, antikorların etkili şekilde nüfuz etmesi ve arka plan boyamasının azaltılması için spesifik koşullar sağlamasıdır.Bu ölçüm fikri ilk olarak, genomik ve çevresel çalışmalar için bir böcek modeli olan bezelye afidi üzerinde germ hücrelerinin nasıl belirlendiğini incelerken ortaya çıktı. Bezelye afidinin laboratuvar suşu olan a. pisum, başlangıçta Tayvan'ın merkezinden toplanmış olup 300'den fazla nesildir konukçu bitkiler üzerinde yetiştirilmiştir.Çimlendirmek için, konukçu bitkilerin tohumlarını oda sıcaklığında üç ila beş gün boyunca musluk suyunda bekletin. Taze suyu günde bir kez yenileyin. Çimlenen on tohumu, büyüme odasında 16 saat ışık, sekiz saat karanlık fotoperiyodu altında, 20 °C sıcaklıkta, toprak içeren küçük bir saksıda yetiştirin.Büyüme başladıktan yaklaşık 10 gün sonra, bitkilerin boyu genellikle sekiz santimetreden fazla olur. Her bir bitki saksısını bir litrelik cam bir beher içinde tutun ve yetişkin afidleri bir boya fırçası kullanarak bitkilerin üzerine aktarın. Ardından, afidlerin kaçmasını önlemek için beheri gazlı bez gibi hava geçirgen bir kapakla kapatın.Yaprak bitlerini, 16 saat ışık ve sekiz saat karanlık fotoperiyodu altında, 20 °C sıcaklıktaki büyüme odasında inkübe edin ve bitki saksılarının her birini günde bir kez sulayın. Bir spot plakanın bir kuyucuğunu yaklaşık 500 µL %4 paraformaldehit ile doldurun. Plakayı düşük büyütmeli bir stereomikroskop altına yerleştirin ve diseksiyon için yetişkin bir yaprak bitini paraformaldehitin içine daldırın.Baş ve abdomeni bir pens ile tutarak, abdomenin dorsal kütikülünü kesin ve yumurtalıkları abdomen boşluğundan uzaklaştırarak yumurtalıkları diseke edin. Ardından, üç çift yumurtalığı, oda sıcaklığında, bir karıştırıcı üzerinde hafifçe sallayarak, bir mililitre paraformaldehit içeren 1,5 mililitrelik tüplerde 20 dakika boyunca sabitleyin. Sabitleme tamponunu bir cam damlalıkla boşaltın ve ardından yumurtalıkları hafifçe sallayarak, 10 dakika boyunca üç kez PBST ile yıkayın.Overleri işleme almak için, önce embriyonik dokuların geçirgenliğini artırmak amacıyla hafifçe çalkalayarak Proteinaz K ile 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından Proteinaz K solüsyonunu dökün ve ardından overleri 700 µL glisin ile beşer dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun. Sonrasında, overleri iki kez 10 dakika boyunca PBST ile yıkayın.Overleri, oda sıcaklığında hafif çalkalama ile 15 dakika boyunca fiksasyon tamponu ile tekrar fikse edin. Endojen peroksidaz aktivitesini baskılamak için, overleri %0,2 PBST içinde bir ila üç, bir ila bir ve üç ila bir hacim oranlarında farklı yüzdelerde metanol ile seri olarak dehidre edin ve ardından overleri oda sıcaklığında hafif çalkalama ile bir saat boyunca %100 metanol ile inkübe edin. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi overleri seri olarak rehidre edin.1,5 milliliter tüpteki üç çift over için, örnek bloklama ve antikor boyama işlemleri için minimum hacim 200 microliters'dır. Overleri 1x DIG-B bloklama çözeltisi ile oda sıcaklığında dört saat veya dört degrees Celsius'ta gece boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin. İnkübasyonun ardından, süpernatanı uzaklaştırın ve yerine uygun dilüsyon oranındaki primer antikoru içeren taze 1x DIG-B bloklama çözeltisi ekleyin.Overleri oda sıcaklığında dört saat veya 4 °C'de hafif çalkalama ile gece boyunca boyayın. Overleri metin protokolünde açıklandığı şekilde yıkadıktan sonra, süpernatantı atın ve uygun dilüsyon oranındaki sekonder antikoru içeren taze 1x DIG-B bloklama çözeltisi ile değiştirip overleri daha önce yaptığınız gibi boyayın. İmmünofloresan boyama için, sekonder antikor ışığa duyarlı olduğundan boyama işlemini karanlıkta gerçekleştirin.Afid embriyolarının kalınlığı gelişim evrelerine göre farklılık gösterir. Bu nedenle, montaj stratejileri erken, orta ve geç evre embriyolara uygun şekilde modifiye edilir. Yumurtalıkları, montaj medyumuna beraber plastik bir damlalıkla hücre tepsisine aktarın ve örnekleri düşük büyütmede bir stereomikroskop altında gözlemleyin.Lateral oviduct ile ilişkili kallusları böcek iğneleri kullanarak kesin ve ardından izole edilen bir ovariole'u damlalık yardımıyla boş bir cam kuyuya aktarın. Montaj medyumu kullanarak nihai hacmi 50 ile 100 µL arasına tamamlayın. Daha sonra, bir ovariole'u cam damlalık ile lam üzerine aktarın.Yumurta odacıklarını böcek iğneleri kullanarak diseke edin. Gelişimin altıncı evresinden daha ileri aşamadaki embriyolar için yumurta odacıklarının ayrılması önerilir. Germaria ve ilk iki yumurta odacığı için ayrılma işlemi isteğe bağlıdır.Diseke edilmiş bir yumurta odasını cam bir damlalık kullanarak temiz bir lama aktarın. Gelişimin 1 ile 10. evreleri arasındaki embriyolar için, hava kabarcıklarını önlemek amacıyla disseke edilmiş germaria veya yumurta odalarının üzerine yavaşça bir lamell yerleştirin. Alternatif olarak, gelişimin 11 ile 18. evreleri arasındaki embriyolar için, yumurta odalarını tek taraflı lamell köprüsü şeklinde bir lama monte edin ve örneğin üzerine başka bir lamell yerleştirin.Gelişiminin 19. evresinden daha büyük embriyolar için, yumurta odacıklarını çift taraflı bir lamel köprüsü ile bir lama monte edin ve örneğin üzerine başka bir lamel yerleştirin. Ardından, örneğin kurumasını önlemek için üst lamelin altındaki boşluğu montaj medyası ile doldurun. Gözlem için doğru yönelimi elde etmek amacıyla üst lameli hafifçe yuvarlayın.Son olarak, metin protokolünde açıklandığı üzere, görüntü analizi gerçekleştirmeden önce köprü lamelleri de dahil olmak üzere lamel kenarlarını oje ile mühürleyin. Burada, yetişkin bir dişiden diseke edilmiş bir çift yumurtalık gösterilmektedir. Bir ovariole; bir germarium, bir ila iki O-sitesi ve beş ila yedi embriyodan oluşur ve bunların tamamı bir montaj hattı düzeninde yumurta odacıkları içinde yer alır.Paraformaldehit fiksasyonunun ardından, overlerin 1 µg/mL konsantrasyondaki Proteinaz K çözeltisi ile 10 dakika boyunca sindirilmesi şiddetle tavsiye edilir. Boyama sonuçları, Proteinaz K ile sindirilmiş embriyolarda sinyal yoğunluğunun önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Embriyoların DIG tabanlı bir tampon setinden gelen bloklama çözeltisinde inkübe edilmesi, normal keçi serumu ve sığır serum albümini ile inkübe edilen embriyolara kıyasla arka plan boyamasını daha fazla azaltır.Peroksidazın endojen aktivitesi aynı zamanda yüksek arka plan boyanmasına neden olabilir. Bu çalışmalar, afid embriyolarının metanole daldırılmasının, embriyoların hidrojen peroksit ile işlenmesine kıyasla peroksidaz aktivitesini çok daha etkili bir şekilde baskılayabildiğini ortaya koymaktadır. Bu çalışmada belirlenen kritik koşullar, hem germ hücrelerinde hem de somatik hücrelerde sinyal tespiti için uygulanabilir.Bu teknik bir kez kavrandığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde iki günde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sinyal yoğunluğunun artırılması ve arka plan boyamasının azaltılması da dahil olmak üzere, afid embriyolarında başarılı bir immün boyamanın nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, embriyoların iyi bir formda kalmasını sağlamak için her bir embriyoyu nazikçe manipüle etmeyi hatırlamak önemlidir.Paraformaldehit ve DAPI ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken eldiven gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu prosedürün ardından, haberci RNA'nın embriyonik hücrelerde protein ürünüyle birlikte yerelleşip yerelleşmediği gibi ek soruları yanıtlamak için in situ hibridizasyon gibi diğer önlemler gerçekleştirilebilir. Bu yöntem; germ hücrelerinin nasıl belirlendiği ve yapraklılarda yumurta hücrelerinin farklı üreme evrelerinde nasıl tayin edildiği gibi böcek çevre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

identification-critical-conditions-for-immunostaining-pea-aphid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video tüm montaj immünhistokimya, bir antijen mekansal ve zamansal ifade desenini genç civciv embriyolarında görüntülendi edilebilecek bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem başlangıçta Jane Dodd ve Tom Jessell tarafından piyasaya sürüldü.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Xenopus laevis embriyosu, büyük boyutu ve manipülasyon kolaylığı nedeniyle erken gelişim çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor.   Bu model sistemde belirli organların tanımlanmasında kullanılabilecek tam montajlı in situ hibridizasyon protokolü için basitleştirilmiş bir protokol sağlanmıştır.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Gelişmekte olan embriyoya Drosophila küçük moleküllerin giriş yeni bileşikler, ilaçlar, toksinler ve biyolojik aktivitesini karakterize edici hem de temel geliştirme yolunu tarama için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Açıklanan yöntemler burada Drosophila embriyo modelin programını genişleterek, bu yaklaşımın doğal engelleri aşmak adımları özetlemektedir.

Geçirgenliği için bir yöntem<em&gt; Drosophila</emKüçük Molekül Faaliyet Tahliller için&gt; Embriyolar

Drosophila'nın yetişkin yapıları, hayali diskler adı verilen kese benzeri yapılardan türetilmiştir. Bu disklerin analizi, doku tayini, kompartman sınırı oluşturma, hücre proliferasyonu, hücre kaderi spesifikasyonu ve düzlemsel hücre polaritesi dahil olmak üzere birçok gelişimsel süreç hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, ışık/floresan mikroskobu için hayali diskleri hazırlamak için kullanılır.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster

Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Zebra balığı interrenal bezi memeli adrenal bezin teleostean karşılığıdır. Enzimatik aktivite deneyi, gelişmekte olan Zebra balığı farklılaşmış steroidogenik hücreleri tespit; Bu protokol 3-β hidroksisteroid dehidrojenaz (3β-Hsd Δ 5-4 izomeraz) nasıl gerçekleştirileceği tanıtır.

Interrenal steroidogenik Doku ve Zebra balığı Onun Vasküler Mikroçevre görselleştirme

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Bu iletişim kuralı embriyonik Astyanax cavefish gen ifadesinde görselleştirme sağlar. Bu yaklaşım belirsiz arka plan boyama en aza indirerek gen ifade sinyal, en üst düzeye çıkarma amacı ile geliştirilmiştir.

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

Bu protokoller, kontrol ve mutant Drosophila embriyonik epitelisindeki pileli septat bağlantılarının organizasyonu ve kapatma fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini açıklar.

Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

Öğrenin, bezelye afit embriyolarında immün boyama için doku geçirgenliğini artırma ve arka plan boyamasını azaltma koşullarını. Bu yöntem, protein ekspresyonu tespitini geliştirerek embriyonik gelişim araştırmalarına katkı sağlar.

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması (Video) | JoVE Journal

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

Daha fazla video keşfet