Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Bu prosedürün genel amacı, porcine deri altı beyaz yağ dokularından, mezenkimal adipositlere, osteositlere ve kondrositlere farklılaşma yeteneklerinin değerlendirilmesi için adipoz kaynaklı kök hücreleri izole etmektir. Bu yöntem, obezite araştırmalarının temel sorularının yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yağ dokusu gelişiminin düzenlenmesinde yer alan moleküler mekanizmaların ortaya çıkarılması için etkili bir araçtır.

Bu tekniğin temel avantajı, adiposit farklılaşmasının ve biyolojisinin derinlemesine analiz edilmesine olanak tanıyan bol miktarda stromovasküler hücrenin hasat edilebilmesidir. Domuz adipoz kaynaklı kök hücrelerin birden fazla hücre soyuna transdiferansiyasyon için multipotens sergilemesi nedeniyle, bu tekniğin önemi kök hücre tedavisi araştırmaları yönündedir. İşleme, domuzcağığı temiz bir cerrahi masa üzerine pron pozisyonda yatırarak başlayın.

Boyundan kuyruğa kadar orta hat boyunca tüm tüyleri tıraş edin ve dorsal deriyi %7,5'lik Povidon iyot ile üç kez fırçalayarak temizleyin. Üçüncü temizleme işleminden sonra, iyodun deri yüzeyinde yaklaşık 10 dakika boyunca kalmasını sağlayın. Ardından, deriyi %70'lik etanol ile spreyleyerek temizleyin.

Ardından, belirgin bir renk gözlemlenmeyene kadar dezenfektanı temizlemek için etanolle doyurulmuş gazlı bezleri kullanarak cildi tek bir yöne doğru silin. Daha sonra, boyun bölgesinden bacağa doğru bir insizyon yapın. Ardından, yağ ve cildi pensle kaldırarak, porcine dorsal cilt altı adipoz doku yağ tabakasını ve bitişik deri tabakasını kaslardan ayırmak için bir skalpel kullanın.

Deri ve yağ dokusunu, serum içermeyen 37 °C DMEM içeren steril bir 200 mL behere hemen daldırın ve beherin dış kısmını %70 etanol ile spreyleyin. Ardından, beheri laminar akışlı bir hücre kültürü kabinine yerleştirin ve beherin yanına 40 x 30 cm boyutlarında steril, üç katmanlı bir folyo örtü koyun. Dokuyu, deri kısmı aşağı gelecek şekilde folyo üzerine aktarın.

Kalan kas dokusunu yağ dokusundan temizlemek için pens ve makas kullanın. Yağı 7 x 7 santimetrelik kare parçalar halinde kesin ve ardından yağ parçalarını, serumsuz 37 °C DMEM içeren yeni, sterilize edilmiş 200 mL'lik bir behere aktarın. Şimdi, karbon çelik dilimleyici bıçakla donatılmış özel bir dilim tutucuyu örtü folyosunun üzerine yerleştirin ve yağ parçalarından birini, yağ tabakası aşağı bakacak şekilde dilimleyiciye yerleştirin.

Yağı, deriye mümkün olduğunca yakın ancak deriyi kesmeden, yaklaşık 1 mm kalınlığındaki parçalar halinde dilimleyin. Ardından, yağ dokusu parçalarını makas kullanarak mümkün olduğunca ince şekilde kıyın ve parçaları kollajenaz ile desteklenmiş filtrelenmiş sindirim ortamı içeren 250 mL'lik bir Erlenmeyer flaskına ekleyin. Flaskı, 37 °C'de, orbital sarsıcının içinde 45 RPM'de döndürerek 90 dakika boyunca inkübe edin.

Sindirim ortamı, belirgin doku topakları olmadan bir bulamaç kıvamına geldiğinde, sindirimi %10 FBS içeren DMEM F-12 kültür ortamının eşit bir hacmi ile durdurun. Domuz adipoz kaynaklı kök hücreleri toplamak için, sindirilmiş adipoz doku süspansiyonunu, şifonun ortasını pens ile bastırarak sindirilen materyalin geçişini yönlendirmek ve kolaylaştırmak suretiyle tek bir şifon katmanından steril bir 250 mililitrelik serolojik şişeye filtreleyin. Geçişi tamamlamak için şifonu pens ile süzün ve döndürün, ardından ortamı dört adet 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne paylaştırın.

Stromal vasküler hücreleri santrifüjleme yoluyla toplayın. Ardından, olgun adipositleri içeren üstteki yağ tabakasının çoğunu uzaklaştırmak için pelletleri bozmadan süpernatanı dökün. Sonrasında, pelletleri pipetleme ve hafifçe çalkalama yoluyla 10 milliliters DMEM içinde yeniden süspande edin.

Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve pelletleri 10 mililitre ACK liziz tamponunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında yedi dakika bekledikten sonra, her tüpe 10 mililitre DMEM ekleyip tüpleri karıştırmak için nazikçe çalkalayarak eritrosit lizini durdurun. Ardından, hücreleri tekrar santrifüjleyin.

Hücreleri 10 mililitre DMEM ile iki kez daha yıkayın ve ardından süpernatantları 100 mikronluk bir süzgeç aracılığıyla tek bir 50 mililitrelik konik tüpe toplayın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için hücre süspansiyonunu pipetle birkaç kez nazikçe karıştırın ve hücreleri Trypan Blue dışlama yöntemiyle sayın. Son olarak, domuz adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerini, hücre kültür ortamı içeren uygun boyutlu kültür kabına santimetrekare başına 6 × 10⁴ yoğunlukta ekleyin.

Hücrelerin tek tabaka oluşturmasını kolaylaştırmak için hücreleri 37 °C ve %5 CO2 altında inkübe edin. Stromal-vasküler fraksiyondan türetilen domuz adipoz kaynaklı kök hücrelerin morfolojisi, ekimden 24 saat sonra gözlenen genişlemiş fibroblast benzeri morfoloji ile fare veya insan adipoz kaynaklı kök hücrelerine benzerdir. Domuz adipoz kaynaklı kök hücreler 72 saat içinde konfluens hale gelir ve bu aşamada adiposit veya diğer mezenkimal tip farklılaşmalar için hazır hale gelirler.

Bu hücreler ayrıca kimyasal indüksiyon sonrası güçlü bir adipojenik potansiyel sergiler ve dokuz günlük farklılaşmanın ardından, domuz adipoz türevli kök hücrelerinin %90'ından fazlası adipojenik farklılaşma göstererek olgun adipositler gözlemlenebilir. CD 29, CD 44, CD 90 ve MHC 1 dahil olmak üzere mezenkimal kök hücre yüzey markerları, domuz adipoz türevli kök hücrelerinde yüksek düzeyde eksprese edilirken; CD 4a, CD 31, CD 45 ve MHC II neredeyse tespit edilemez düzeydedir; bu durum, söz konusu domuz adipoz türevli kök hücrelerinin, belirgin bir endotelyal veya hematopoetik kök hücre kontaminasyonu olmaksızın mezenkimal tip özellikler sergilediğini kanıtlamaktadır. Ayrıca, farklılaşmış domuz adipoz türevli kök hücreleri, spesifik doku boyama boyalarının kullanımıyla adipositler, osteositler veya kondrositler olarak tanımlanabilir; bu da stromal vasküler fraksiyondan türetilen bu hücrelerin, mezenkimal tip öncüllere özgü multipotensiyi koruduğunu göstermektedir.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücre kültürü için iyi bir aseptik teknik uygulamayı ve hücre canlılığını maksimize etmek için tüm adımları mümkün olduğunca hızlı tamamlamayı hatırlamak önemlidir. Teknik düzgün bir şekilde uygulandığında, yöntem uzmanlaşıldıktan sonra altı saat içinde iki ila üç domuzdan hücre hasadı yapılabilir.

Bu standart teknik, diyabet alanındaki obezite araştırmacılarının, adiposit diferansiyasyonunu kontrol eden transkripsiyon faktörleri gibi moleküler anahtarları keşfetmelerine öncülük etmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, domuz adipoz kaynaklı kök hücrelerin nasıl izole edileceğini ve bu hücrelerin adipositlere, osteositlere ve kondrositlere diferansiye olma çok yönlü yeteneklerinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.