Name: Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma yüksek Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Keşfedin immunomanyetik ayırma ve kollagenaz sindirimi kullanarak fare yağ dokusundan Sca1 pozitif mezenkimal kök hücre izolasyonunu. Bu yöntem doku rejenerasyonu ve metabolik hastalık araştırmaları için yüksek verimli hücre zenginleştirme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser (THC) NIH DK095137 tarafından desteklenmektedir. Biz anlatılan yöntemlerin geliştirilmesine ve gelişmişliği katkıda mevcut ve eski laboratuar üyelerine teşekkür ederim.

Etik Beyanı: Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Michigan Komitesi Üniversitesi (UCUCA) (Laboratuar Hayvan Araştırma Enstitüsü, Ulusal Araştırma Konseyi) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca tüm yöntemleri ve protokolleri onayladı. Fareler bir Michigan Üniversitesi vivari tutulur ve gıda ve suya ücretsiz erişim verildi ve 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü üzerinde tutulur. 1. hazırlıklar <ol><li> DMEM,% 10 FBS, 1x P / S / G, ve 1x antibiyotikler / antifungal ile primer kültür ortamı hazırlayın. Bu daha önce sindirime dokuları tutmak için kullanılır. 37 ºC su banyosunda stok ve kısım yerleştirin. </li><li> 5 mg / ml (+ Ca, Mg), yağ yastığı her bir tipi için beş fare kadar yalıtıldıktan HBSS içinde çözülmüş tip III kolajenaz çözeltisi, beş mililitre hazırlayın. Tek bir genotipten SQ ve VIS izole edilirken, vahşi tip ve mutant kare olduğu ve VIS, 20 ml yapmak, örneğin, 10 ml yapmak. 7.4 Ste pH ayarlamaFiltreyi rile. 50 ml tüpler içine kısım. kenara ışıktan uzakta ayarlayın. </li><li> Cerrahi alan dezenfekte% 70 etanol kullanın. aşağı silin ve mavi ped ile kaplayın. Mavi pad üzerinde bazı etanol püskürtün. </li><li> strafor kurulu bir emici ped aşağı pin ve makasla kesme 22 G iğne kullanın. sonra mavi pad üzerinde kurulu ayarlayabilir ve diseksiyon başlamadan kadar başka bir mavi ped ile kaplayın etanol ile pedi püskürtün. </li><li> cerrahi alan bitişik bir stand etanol ve yer ile iki 50 ml tüpler doldurun. Etanol makas ve forseps yerleştirin. </li><li> cerrahi aletleri etanol kapalı durulama için PBS artı 1x anti-anti başka 50 ml tüp doldurun. </li><li> kaputu, her bir doku tipi etiket 60 mm yemekleri ve 37 ºC ısıtılmış kültür ortamı ile doldurun. Cerrahi alana bitişik tabak yerleştirin. </li></ol> Subkütan (SQ) Yağ Pads 2. izolasyonu <ol><li> izofluran ve pnömotoraks aşırı dozda fare Euthanize. </li><li> Nazikçe% 70 etanol ile fare sprey ve sırtüstü yatıyordu. 22 G iğne ile köpük kuruluna pençeleri sabitleyin. </li><li> Alt karın derisinde küçük bir kesim yapın. forseps ile kesilen üst Holding, makas almak ve periton cilt ayırmak. </li><li> Cilt karından göğüse periton ayrılır sonra, vücudun yan tarafında deride yan keser yaparak uzak kafasına doğru periton cilt yansıtır. </li><li> vücuttan uzak kasık yağ tutma kalan cilt yansıtır ve 22 G iğne ile kuruluna aşağı pin. </li><li> ince makas ve forseps geçin. periton yakın kökeni forseps ile kasık yağ yastığı tut ve deri ile SQ kirletici kaçınarak kasık doğru ilerleyen deri ve kasık yağ arasında uzak snip. </li><li> etiketli 60 mm çanak güneşe maruz kasık yağ yastığı yerleştirin. </li></ol> Visseral (VIS) Yağ Pads 3. İzolasyon <ol><li> Benzer bir şekilde, 2.5 adım yağ yastıkları ve bağırsak visseral maruz açık periton kesmek için. </li><li> uzakta toraks doğru gut hareket ettirin. </li><li> uzak ucunda VIS yağ yastığı tut ve yavaşça yukarı doğru çekin. doku (dişi fareler kullanıyorsanız, ya da rahim) epididimal dışlamak için dikkat ederek VIS yağ yastığı parçalara ayır. </li><li> etiketli çanak ve kalan VIS pad adımı yineleyin 3.3 yerleştirin. </li></ol> Yağ Pads 4. kollajenaz sindirimi <ol><li> doku kültürü kaputu 60 mm yemekleri taşımak ve medya aspire. </li><li> kavisli makas sonra kollajenaz çözüm eklemek ile yağ yastıkları kıyma. etanol ve PBS ile doku tipleri arasındaki makas ve forseps durulama emin olun. </li><li> dokular dijeste kadar 300 rpm&#39;de 10-20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de çalkalanır. SQ bazı parçaları hala görünür eğer kabul edilebilir. Bu bir sonraki adımda ele alınacaktır. </li><li> collag durdurmak için kollajenaz çözeltisine kültür ortamı 25 ml ilave edilir10 ml&#39;lik serolojik pipet ile enase tedavi ve pipet yukarı ve aşağı 10 kez sindirilmiş dokuları dağıtmak için. </li><li> 100 mikron hücre süzgeç kullanarak Gerilme hücreleri. 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Dikkatle pelet rahatsız ve yavaşça hücrelerin askıya pipet pelet steril su 5 ml ekleyin ve için medyayı kapalı süzün. eritrositleri lizise uğratmak üzere 2 dakika bekleyin. </li><li> yeni bir 100 mikron hücre süzgecinden% 10 FBS ve şekil hücreleri ile ortam 25 ml ilave edilir. </li><li> 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj. Durusu medya ve kültür ortamı 1 ml tekrar süspansiyon pelet. </li><li> 1 tripan mavi: 1 kullanarak bir hemasitometre ile hücre sayımı. </li><li> 6 oyuklu bir plaka üzerinde, bir oyuk Levha 1 x 10 6 hücre. </li></ol> 5. Manyetik Hücre Ayırma <ol><li> Hücre yapışması, yaklaşık 4 ila 6 saat sonra, HBSS (-Ca, -mg) ile iki kez hücreleri yıkayın. % 0.05 tripsin kullanılarak yapışkan hücreleri ayırmak. 1 ml ayırma tamponu ve spin tripsin hücre süspansiyonu seyreltilir300 x g 5 dak. </li><li> Süpernatant aspire. 500 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> 300 x g, 5 dakika boyunca Spin hücreleri. </li><li> Aspire tamamen süpernatanlarına. 90 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 10 ul anti-Sca1-FITC ile primer antikor ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> mi tampon ve santrifüj hücreler, 300 x g, 5 dakika için 1 hücreleri yıkayın. tamamen süpernatantı. </li><li> 80 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 20 ul anti-FITC mikroboncukları ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. </li><li> mi tampon ve santrifüj hücreler, 300 x g, 5 dakika için 1 hücreleri yıkayın. </li><li> 500 ul tampon süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. </li><li> Manyetik tutucu sütun yerleştirin ve 500 ul tamponu ile sütun yıkayın. </li><li> kolonuna hücre süspansiyonu ekleyin. pipetlenmesinden sırasında kabarcıkları kaçının. </li><li> Etiketsiz SCA1 toplayın - &lt;/ Sup&gt; hücreler ve 500 ul tampon ile kolon 3 kere yıkayın. rezervuar boşken sadece yeni tampon ekleyin. pipetlenmesinden sırasında kabarcıkları kaçının. </li><li> manyetik tutucu sütunu çıkarın ve 15 ml konik tüp içine yerleştirin. </li><li> Kolon rezervuar üzerinden sağlanan pistonu iterek Sca1 + kolona tampon ve Zehir ml 1 ekleyin. </li><li> 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca hücre kesirler aşağı doğru döndürün. 1 ml kültür ortamı içinde süspanse hücreleri. </li><li> etiketli ve etiketsiz kesirler 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> 6 plaka 1 kuyuda her bir hücre fraksiyonu Plate. </li></ol> Akım Sitometrisi ile Sca1 yüksek ACSS ve İmmunomanyetik Ayrılık 6. Doğrulama <ol><li> HBSS (-Ca, -MG) ile iki kez hücreleri durulayın ve% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri ayırmak. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje hücreleri. 1 ml kültür ortamı içinde süspanse edin hücreleri ve hemasitometre kullanarak saymak. </li><li> Elde&gt; 10 6 </sup&gt; 1 ml kültür ortamı içinde hücre ve 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> süpernatant ve tekrar adım 6.3 iki kez daha çıkarın. </li><li> % 2 keçi serumu, 1 ml +% 2 BSA ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir blok ile yeniden süspanse hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje hücreleri. </li><li> çözümü engelleme çıkarın. </li><li> 4 ° C&#39;de% 2 keçi serumu ve% 2 BSA + PBS ile 100 ul PBS içinde: ya da anti-SCA1 Alexa Fluor 647 (400, 0.25 ug, 1): sıçan IgG2a Alexa Fluor 647 (400, 0.25 ug, 1) ekleme karanlıkta 30 dakika karıştırıldı. </li><li> hücreler soğuk PBS ile 1 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje 300 x g. </li><li> süpernatant ve tekrar adım 6.9 iki kez daha çıkarın. </li><li> 1 ml PBS içinde yeniden süspanse hücreleri. akım sitometri analizi için hazırlık 100 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonları iletin. </li></ol>

<ol><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li>
<li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+link+between+obesity+and+MMP14-dependent+adipogenic+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.</a> Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).</li>
<li>Chun, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peri-adipocyte+ECM+remodeling+in+obesity+and+adipose+tissue+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis.</a> Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).</li>
<li>Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipose+tissue+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipose tissue dysfunction.</a> Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).</li>
<li>Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li>
<li>Welm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%28pos%29+cells+in+the+mouse+mammary+gland+represent+an+enriched+progenitor+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population.</a> Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).</li>
<li>Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+of+fat%3A+tracking+obesity+to+its+source%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental origin of fat: tracking obesity to its source.</a> Cell. 131 (2), 242-256 (2007).</li>
<li>Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322, 583-586 (2008).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ly-6A+%28Sca-1%29+GFP+Transgene+is+Expressed+in+all+Adult+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li>
<li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).</li>
<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda izolasyon ve farklı yağ pedleri gelen fare TSK immunomagnetic hücre ayırma ve in vitro deneyler için onların kullanımını göstermektedir. Sunulan yöntem TSK 9,14 arasında, teknik olarak karmaşık ve pahalı FACS aracılı izolasyon avantajlıdır Sca1 pozitif TSK sayıda hızlı izolasyonu için etkilidir. FACS aksine immünomanyetik hücre ayırma, bir hedef hücre popülasyonunun belirlenmesine ilişkin birden fazla antijenin kullanılmasına izin vermez. Yüzey antijeni iyi karakterize eğer Bununla birlikte...

Hücre antijeni 1 (SCA1 veya LY6A / e) kök ilk hematopoietik ve mezenkimal kök hücreleri 5,6 ile ifade edilen bir hücre yüzey markerı olarak tespit edilmiştir. Fare yağ depolarından elde edilen yağ dokusu stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fibroblastlar, makrofajlar, vasküler endotelyal hücreler, nöronal hücrelerin ve adiposit progenitör hücrelerin 7 hücrelerinden oluşan heterojen bir popülasyonu. Adiposit progenitör hücreleri veya adipoz kaynaklı kök hücreler (TSK) kollajen zengin perivasküler hücre dışı matriks (ECM) 8 ikamet dışı lipid yüklü hücrelerdir. CD34 +: SCA1 + 9 ve CD29 + - yaklaşık SVF% 50 soy-negatif (Lin) olarak karakterize edilmiştir TSK oluşmaktadır. In vitro adiposit farklılaşması edebilen adiposit ataları, - CD24: bu hücrelerin çoğu Sca1 + &#39;dır Bununla birlikte, hücrelerin sadece küçük bir kısmı (SVF 0.08%) SCA1 teşkil <syukarı&gt; +: çoğalan ve in vivo koşullarda 9 adipositlere farklılaşma tamamen yetenekli CD24 + hücreler. CD24 gelen CD24 + hücreler demeden Sca1 + SVF kullanarak potansiyel ihtar rağmen - immunomagnetic hücre ayırma kullanarak yağ depolarından SCA1 + TSK, hücreler izole birincil adiposit progenitör hücrelerin hücre özerk fenotip belirlemek için etkili ve pratik bir yaklaşımdır. Obezite ve diyabet, doku fibrozu ve enflamasyon alanına tip-2 diyabet 3 gelişimi ve korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Son zamanlarda, Tokunaga ve ark. (VIS veya visseral) inguinal (ya da deri altı, SQ) ve perigonadal izole Sca1 yüksek hücreler C57BL6 / J yağ depoları vitro 10 farklı gen imzalar ve ECM biçimlenme sergilerler gösterdi. MMP14 (MT1-MMP), membran-t prototip üyesiYPE matriks metalloproteinaz (MMP) ailesi kolajenolitik aktiviteye 1 ile beyaz adipoz dokuda (WAT) gelişimini aracılık eder. Aşağıdaki protokol ile izole edilmiş ve zenginleştirilmiş hücreleri ile gerçekleştirilebilir deney örnekleri arasında, üç boyutlu bir kültür, farklılaşma çalışmaları, kolajen alçalmasının tahlilleri ve RNA sıralaması 10,11 bulunmaktadır. Parçalanma deneyleri telopeptit 11,12 korunmasını sağlamak için asit ekstre kollajen ile yapılmalıdır. Aşağıdaki protokol farklı yağ depolarından birincil vasküler stroma hücreleri izole ve immunomagnetic hücre ayırma yöntemi adiposit progenitör hücreler zenginleştirmek için yöntemler gösterecektir. Hücre sıralama geçerliliği akım sitometri ile ve bir Sca1 promotör 13 tarafından tahrik SCA1 + hücrelerde GFP ifade Sca1-GFP fareler kullanılarak yoluyla değerlendirilecektir.

<table><tbody><tr><td>Tip 3 Kollajenaz</td><td>Worthington Biyokimyasal</td><td>LS004182</td><td>Doku sindirimi</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Yüksek glikoz kültür ortamı</td></tr><tr><td>Kalem / Strep / Glutamin (100x)</td> <td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Medya antibiyotik</td></tr><tr><td>Anti-anti (100x)</td> <td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Medya mantar önleyici</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin (%0,05)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&mu; m hücreli süzgeç</td></tr><tr><td>60 mm plakalar</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Büyük</td></tr><tr><td>Makas</td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>İnce, kavisli uç</td></tr><tr><td>Büyük Forseps</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>İnce Forseps</td><td>Herhangi bir satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8" iğneler</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>22G 1.5" iğneler</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS ayırma kolonları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1 mikroboncuk kiti (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&ordm; Ab ve anti-FITC mikro boncuklar 2 &ordm; Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS çalışan tampon</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Mavi chux pedleri</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Emici pedler</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Strafor levha</td><td></td><td></td><td>50 ml'lik tüplerden kullanım</td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Herhangi bir satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a anti-fare Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a anti-fare F4 / 80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı tüp</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash; Ca, &ndash; Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Kollajenaz çözeltisi için</td></tr><tr><td>Tip I kollajen (37 mm asetik asit içinde 2,7 mg / ml</td><td>Evde hazırlayın12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0.34 N NaOH</td><td>Evde</td> <td>hazırlayın</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 karboksilik asit, süksinimidil ester, karışık izomerler</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0.89 M NaHCO3&nbsp; </alt></td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

yağ deposu özgü sca1 ve İmmunomanyetik ayırma<sup&gt; yüksek</sup&gt; yağ türetilmiş kök hücreler (tsk)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) izolasyonu, adipoz doku biyolojisi, adipogenez ve hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesi alanında önemli bir yöntemdir. İn vivo, fibriller kollajenlerden oluşan ECM'den zengin ortam, obezitenin ilerlemesi ve gerilemesi sırasında yağ dokularına yapısal bir destek sağlar. Matriks metalloproteinazların (MMP'ler) aracılık ettiği fizyolojik ECM yeniden şekillenmesi, yağ dokusu boyutunun ve fonksiyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynar1,2. Fizyolojik kollajenolitik ECM yeniden şekillenmesinin kaybı, aşırı kollajen birikimine (doku fibrozu), makrofaj infiltrasyonuna ve nihayetinde insülin direnci de dahil olmak üzere metabolik homeostaz kaybına yol açabilir3,4. Gen hedefli fare modellerinde yağ dokusunda fenotipik bir değişiklik gözlendiğinde, in vitro çalışmalar için primer ASC'lerin yağ depolarından izole edilmesi, ASC'lerin işlevini düzenlemede spesifik genin rolünü tanımlamak için etkili bir yaklaşımdır. Aşağıda, Sca1yüksek ASC'lerin immünomanyetik bir ayrımını tanımlıyoruz.

Farklı Yağ Pads gelen Sca1 yüksek TSK zenginleştirilmesi. SQ yağ görüntüleme fibroblast benzeri izole vasküler stromal hücreler SCA1 sentezleme seviyesi (Şekil 1A) bağımsız hücre şekli uzanıyordu. VIS Öte yandan, (eWAT türevi), yüksek Sca1 ve Sca1 düşük hücreleri, hücre şekli belirgin farkı göstermektedir. VIS SQ (IWAT türevi) Sca1 yüksek hücreler gibi VIS Sca1 ...

Gen ekspresyonlarını ve kollajenolitik aktivitelerini değerlendirmek için stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fare inguinal (subkütan) ve perigonadal (viseral) yağ dokusu depolarından izole etmek için gerekli teknikleri sunuyoruz. Bu yöntem, immünomanyetik hücre ayrımı kullanılarak Sca1yüksek yağ kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) zenginleştirilmesini içerir.

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma<sup&gt; yüksek</sup&gt; Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli fare yağ yastıklarından Sca1 pozitif mezenkimal kök hücreleri izole etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, immünomanyetik boncuk tabanlı hücre ayırma yöntemi kullanılarak, farklı yağ depolarından elde edilen adipoz kaynaklı kök hücrelerin sonraki deneyler için etkili bir şekilde zenginleştirilebilmesidir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan araştırmacılar, ayırma işlemi için yeterli sayıda hücre elde etmek amacıyla kollajenaz aracılı doku sindiriminin gücünün ve süresinin optimize edilmesi gerektiği için zorluk yaşayabilirler.Subkutan yağ yastıkçıklarını izole etmek için, fareyi sırt üstü pozisyonda köpük bir diseksiyon tahtasına yerleştirerek ve hayvanı %70 etanol ile püskürterek başlayın. Patileri tahtaya sabitledikten sonra, alt karın derisinde küçük bir kesi yapın. Ardından, kesi yerini pensle tutarak, makas yardımıyla deriyi ve peritonyumu karından toraksa kadar ayırın.Vücudun yan hattı boyunca deride lateral kesiler yaparak, deriyi peritondan başa doğru sıyırın. Ardından, inguinal yağı vücuttan uzak tutarak kalan deriyi geri çekin ve deriyi tahtaya sabitlemek için 22 gauge iğneler kullanın. Sonrasında, pensle peritona yakın olan başlangıç noktasından bir inguinal yağ yastığını tutun ve ince makasla deri ile inguinal yağ arasını, kasığa doğru ilerleyerek ve deriyle deri altı yağ yastığını kontamine etmemeye dikkat ederek kesin.Ardından, izole edilen inguinal yağ yastığını 37 °C kültür ortamı içeren SQ etiketli 60 mm'lik bir kaba yerleştirin ve hayvanın diğer tarafındaki inguinal yağ yastığını aynı şekilde hasat edin. Viseral yağ yastıklarını izole etmek için, viseral yağ yastıklarını ve bağırsakları açığa çıkaracak şekilde peritonyumu kesin. Ardından bağırsakları göğüs bölgesine doğru yana çekin.Viseral yağ yastıkçığını distal ucundan kavrayın, yağ dokusunu nazikçe yukarı doğru çekin ve epididim dokusunu dahil etmemeye dikkat ederek diseke edin. Ardından yağ yastıkçığını, içerisinde 37 °C kültür ortamı bulunan VIS etiketli 60 mm'lik bir kaba yerleştirin. Tüm yağ yastıkçıkları toplandığında, kapları doku kültürü kabinine aktarın ve ortamı aspire edin.Pedleri kıymak için kavisli makas kullanın. Ardından, yağ parçalarını taze hazırlanmış kollagenase içeren ayrı 50 milliliter tüplere ekleyin. Sonrasında, dokular sindirilene kadar tüpleri 300 RPM ve 37 degrees Celsius'ta 10 ila 20 dakika boyunca çalkalayın.Bazı deri altı yağ yastığı doku parçaları hala görünür olabilir. Sindirimi durdurmak için kollajenaz çözeltisine 20 mililitre kültür ortamı ekleyin ve sindirilmiş dokuların tamamen ayrışması için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak doku bulamacını 10 kez aspire edip dağıtın. Hücreleri 100 mikronluk hücre süzgeçlerinden filtreleyin ve dokuları santrifüjleyin.Ardından, pelletlerin bozulmamasına dikkat ederek besiyerini dikkatlice üstten dökün ve her iki hücre grubunu beş mililitre steril su içerisinde nazikçe yeniden süspande edin. Eritrositlerin lize olması için iki dakika bekleyin. Daha sonra, her tüpteki reaksiyonu FBS ile takviye edilmiş 25 mililitre besiyeri ile durdurun.Her iki adiposit popülasyonunu yeni 100 mikronluk hücre süzgeçlerinden geçirin, tekrar santrifüjleyin ve ardından peletleri bir ila üç mililitre besiyerinde yeniden süspande edin. Trypan mavi dışlama yöntemiyle sayım yaptıktan sonra, 1 × 10⁶ subkütan yağ pedi hücresini ve visseral hücreleri altı kuyucuklu bir hücre kültür plağının ayrı kuyucuklarına ekleyin. Hücreleri tripsinizasyon işleminden geçirdikten sonra, tripsini bir mililitre ayırma tamponu ile seyreltin ve ardından kültür plaklarını santrifüjleyin.Hücreleri tüp başına 500 µL ayırma tamponu içinde süspanse ediyoruz ve hücreleri tekrar santrifüjden geçiriyoruz. Şimdi, hücreleri tüp başına 90 µL ayırma tamponu içinde yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonuna 10 µL anti-Sca1 FITC primer antikor ekleyip karıştırın. Karanlıkta, dört °C'de 10 dakikalık inkübasyonun ardından, hücreleri tüp başına bir mL ayırma tamponu ile yıkayın.Santrifüjden sonra, hücreler her bir hücre süspansiyonu için 80 µL ayırma tamponu içerisinde yeniden süspande edilir. Ardından, her bir kuyuya 20 µL Anti-FITC Microbeads ekleyip karıştırın ve plakaları ışıktan koruyarak 4 °C'de 15 dakika boyunca bekletin. İnkübasyon sonunda hücreleri 1 mL ayırma tamponu ile yıkayın ve tüp başına 500 µL taze tampon içerisinde yeniden süspande edin.Şimdi, manyetik tutucuya bir kolon yerleştirin ve kolonu 500 µL ayırma tamponu ile durulayın. Subkütan yağ pedi doku kültüründeki hücreleri, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek kolona aktarın ve işaretlenmemiş Sca1 negatif hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın. Tüm hücreler geçtikten sonra kolonu, 500 µL ayırma tamponu ile üç kez yıkayın.Ardından kolonu magnetten yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve Sca1 pozitif hücreleri elüe etmek için kolon üzerinden bir mililitre taze ayırma tamponu geçirin. Son olarak, hem Sca1 pozitif hem de negatif hücre fraksiyonlarını santrifüjleyin ve peletleri bir mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra her fraksiyondaki hücre sayısını sayın ve fraksiyonları yeni bir altı kuyucuklu hücre kültürü plağının ayrı kuyucuklarına ekleyin.Subkütan yağdan izole edilen vasküler stromal hücreler, Sca1 ekspresyon düzeylerinden bağımsız olarak fibroblast benzeri, uzamış bir hücre şekli sergilerler. Subkütan inguinal yağ türevli Sca1 yüksek hücreler gibi, visseral epididimal yağ türevli Sca1 yüksek hücreler de uzamış fibroblast benzeri bir hücre şekli gösterirler. Buna karşın, VIS Sca1 düşük hücreler epitelioid bir şekil sergilerler.Sca1-GFP farelerden izole edilen Sca1 yüksek hücreler, doku kültüründe GFP pozitif hücreler olarak kolayca tanımlanabilir. Nitekim, bu hücreler akış sitometrisi ile değerlendirildiğinde, GFP pozitif hücrelerin çoğunun anti-Sca1 antikoru ile tespit edildiği üzere hücre yüzeylerinde Sca1 proteinleri ekspres ettiği doğrulanmıştır. Gerçek zamanlı PCR analizleri ile birlikte, inguinal ve epididimal yağ kaynaklı Sca1 yüksek adipoz kaynaklı kök hücreler arasında kolajenolitik matriks metalloproteinazların diferansiyel ekspresyonu gösterilebilir.Ayrıca, perisellüler degradasyon aktivitesini değerlendirmek için floresein işaretli tip I kolajen jeller kullanıldığında, viseral Sca1 yüksek adipoz kaynaklı kök hücreler aracılığıyla belirgin şekilde artmış bir kolajen yeniden modelleme aktivitesi gözlenir. Uzmanlaşıldığında, yağ pedi hücre izolasyonu uygun şekilde gerçekleştirilirse iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, verimli bir yağ pedi izolasyonu sağlamak için temiz ve düzenli bir cerrahi alanın korunmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir.Bu prosedürü takiben, yağ dokusundan türetilmiş kök hücre aracılı doku yeniden şekillenmesine ilişkin ek soruları yanıtlamak için kollajen yıkım analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, obezite ve matriks biyolojisi alanındaki araştırmacıların, farelerde ve insanlarda yağ dokusu yeniden şekillenmesi ve fonksiyonunda yağ dokusundan türetilmiş kök hücrelerin rolünü keşfetmelerine ön ayak olmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, yağ dokusu depolarından primer Sca1 pozitif hücrelerin nasıl elde edileceği ve zenginleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

immunomagnetic-separation-fat-depot-specific-sca1high-adipose-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, murin periaortik ark yağ dokusundan floresan etiketli nöral krestten türetilmiş adipoz türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. İzolasyonu takiben, NCADSC'ler tespit edilir, floresanla aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak sıralanır ve daha sonra hücre proliferasyonunu teşvik ederek bir plaka üzerinde kültürlenir.

Murin Periaortik Yağ Dokusundan Yağ Kaynaklı Kök Hücrelerin İzole Edilmesi

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

İnsan adipoz kaynaklı stromal hücrelerindeki transkripsiyonel heterojenlik, hücre yüzeyi belirteçleri ve osteojenik genler kullanılarak tek hücre düzeyinde tanımlanabilir.  Bu çalışmada, kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonunu arttırmak için kullanılabilecek artmış osteojenik potansiyele sahip hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için akış sitometrisi kullanan bir protokol tanımlanmıştır.

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

Bu protokol, ekstrektif bir yöntem kullanılarak abdominoplasti ve lipoaspirate örneklerinden mezenkimal kök hücrelerin izole imal etmek için enzimsiz bir yöntem sağlar. Sert enzimlerin veya santrifüj adımlarının olmaması, in vitro çalışmalarda kullanılabilecek veya kliniğe geri transfer edilebilen klinik olarak ilgili kök hücreleri sağlar.

İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Floresan aktif hücre sıralamasını kullanarak fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek oranda uygulanabilir yağ progenitör hücrelerini izole etmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Mevcut protokol, literatüre kıyasla zaman kazanımı ile muazzam bir hücresel verim ile sonuçlanan ADSC izolasyonu için geliştirilmiş bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu çalışma aynı zamanda uzun süreli kriyoprezervasyondan sonra nispeten çok sayıda canlı hücre elde etmek için basit bir yöntem sunmaktadır.

Uzun Süreli Kriyoprezervasyonda Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücre Elde Etme Tekniği ve Stromal Vasküler Fraksiyon Karakterizasyonu

Hücre tedavisi hazırlığı/manipülasyon aşamalarında kullanılmaya başlanan ksenojenik (kimyasal veya hayvansal türevli) ürünler, konakçı hastalarda immün reaktivite ve patojenik bulaşma riskinin artmasıyla ilişkilidir. Burada, insan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için tam bir ksenojenik içermeyen yöntem açıklanmaktadır.

İnsan Tedavisi için Yenilikçi Bir Ksenojenik İçermeyen Yöntemle İnsan Adipoz Türevi Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Bu protokol, insan yağ kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (ADSC'ler) kültürlenmesinden ve süpernatantın toplanmasından ultrasantrifüjleme kullanılarak hücre dışı veziküllerin (EV'ler) çıkarılmasına kadar tüm prosedürleri açıklar.

İnsan Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Burada, &gt;90% işlem süresi azalması, yüksek hücre canlılığı ve geniş uyumlulukla karakterize edilen yağ kaynaklı kök hücreleri ve adipositleri verimli şekilde izole etmek için standart bir yöntem sunuyoruz.

Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu

Keşfedin immunomanyetik ayırma ve kollagenaz sindirimi kullanarak fare yağ dokusundan Sca1 pozitif mezenkimal kök hücre izolasyonunu. Bu yöntem doku rejenerasyonu ve metabolik hastalık araştırmaları için yüksek verimli hücre zenginleştirme sağlar.

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma

Daha fazla video keşfet