Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma ^yüksek Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)

Bu prosedürün genel amacı, Sca1 pozitif mezenkimal kök hücreleri çeşitli fare yağ pedlerinden izole etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, immünomanyetik boncuk bazlı hücre sınıflandırması kullanılarak, farklı yağ depolarından adipoz türevli kök hücrelerin sonraki deneyler için etkili bir şekilde zenginleştirilebilmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan araştırmacılar mücadele edeceklerdir, çünkü kollajenaz aracılı doku sindiriminin gücü ve süresi, sıralama için yeterli sayıda hücre elde etmek için optimize edilmelidir.

Deri altı yağ yastıkçıklarını izole etmek için, fareyi sırtüstü pozisyonda bir köpük diseksiyon tahtasına yerleştirerek ve hayvana% 70 etanol püskürterek başlayın. Pençeleri tahtaya sabitledikten sonra, alt karın derisinde küçük bir kesi yapın. Daha sonra, kesiğin üst kısmını forseps ile kavrayarak, cildi ve peritonu karından göğsüne ayırmak için makas kullanın.

Deride, vücudun yan tarafı boyunca yanal kesikler yapmak, cildi peritondan başa doğru yansıtır. Ardından, kasık yağını vücuttan uzak tutarak kalan cildi geri çekin ve cildi tahtaya sabitlemek için 22 gauge iğne kullanın. Daha sonra, peritonun yakınındaki orijininde bir kasık yağ yastığını tutmak için forsepsleri kullanın ve cilt ile kasık yağı arasında kesmek, kasıklara doğru ilerlemek ve deri altı yağ pedini deri ile kirletmekten kaçınmak için ince makas kullanın.

Daha sonra, izole edilmiş kasık yağ pedini 37 santigrat derece kültür ortamı içeren SQ etiketli 60 milimetrelik bir tabağa yerleştirin ve kasık yağ pedini hayvanın diğer tarafından aynı şekilde toplayın. Viseral yağ yastıkçıklarını izole etmek için, viseral yağ yastıkçıklarını ve bağırsakları ortaya çıkarmak için peritonu kesin. Sonra bağırsakları bir kenara, göğüs kafesine doğru hareket ettirin.

Distal uçta viseral yağ yastığını kavrayarak, yağ dokusunu nazikçe yukarı çekin ve epididimal dokuyu dışlamaya özen göstererek inceleyin. Ardından yağ pedini 37 santigrat derece kültür ortamı içeren VIS etiketli 60 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Tüm yağ yastıkçıkları toplandığında, bulaşıkları bir doku kültürü başlığına aktarın ve ortamı aspire edin.

Pedleri kıymak için kavisli makas kullanın. Daha sonra, yağ parçalarını taze hazırlanmış kollajenaz içeren 50 mililitrelik tüplere ekleyin. Daha sonra, tüpleri dokular solana kadar 10 ila 20 dakika boyunca 300 RPM ve 37 santigrat derecede çalkalayın.

Deri altı yağ yastıkçığı dokusunun bazı parçaları hala görülebilir. Sindirimi durdurmak için kollajenaz çözeltisine 20 mililitre kültür ortamı ekleyin ve sindirilen dokuları tamamen ayırmak için doku bulamacını 10 kez aspire etmek ve dağıtmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Hücreleri 100 mikronluk hücre süzgeçlerinden süzün ve dokuları santrifüj edin.

Daha sonra, peletleri rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamı dikkatlice boşaltın ve her iki hücre grubunu da beş mililitre steril suda nazikçe yeniden süspanse edin. Eritrositlerin parçalanması için iki dakika bekleyin. Daha sonra, her tüpteki reaksiyonu FBS ile desteklenmiş 25 mililitre ortam ile durdurun.

Her iki adiposit popülasyonunu yeni 100 mikron hücre süzgeçlerinden süzün, tekrar döndürün ve ardından peletleri bir ila üç mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlaması ile saydıktan sonra, altıncı deri altı yağ yastığı hücrelerini ve viseral hücreleri altı oyuklu bir hücre kültürü plakasının ayrı oyuklarına bir kez on kez ayrı ayrı plakalayın. Hücreleri tripsinasyondan sonra, tripsini bir mililitre ayırma tamponu ile seyreltin ve ardından kültür plakalarını santrifüjleyin.

Hücreleri ayırma tamponu tüpü başına 500 mikrolitre içinde askıya alıyoruz ve hücreleri tekrar santrifüjlüyoruz. Şimdi, hücreleri ayırma tamponu tüpü başına 90 mikrolitre içinde yeniden süspanse edin ve 10 mikrolitre anti-Sca1 FITC birincil antikorunu hücre süspansiyonuna karıştırın. Karanlıkta dört santigrat derecede 10 dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri tüp başına bir mililitre ayırma tamponu ile yıkayın.

Eğirme işleminden sonra hücreler, hücre süspansiyonu başına 80 mikrolitre ayırma tamponunda yeniden süspanse edilir. Daha sonra her bir oyuğa 20 mikrolitre Anti-FITC Mikro boncuk karıştırın ve plakaları 15 dakika boyunca ışıktan koruyarak dört santigrat dereceye yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri bir mililitre ayırma tamponunda yıkayın ve hücreleri tüp başına 500 mikrolitre taze tamponda yeniden süspanse edin.

Şimdi, manyetik tutucuya bir sütun yerleştirin ve sütunu 500 mikrolitre ayırma tamponu ile durulayın. Hücreleri deri altı yağ yastığı doku kültüründen kolona aktarın, kabarcıklardan kaçınmaya dikkat edin ve etiketlenmemiş Sca1 negatif hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Tüm hücreler bittiğinde, sütunu 500 mikrolitre ayırma tamponu ile üç kez yıkayın.

Daha sonra sütunu mıknatıstan yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve Sca1 pozitif hücreleri ayırmak için sütundan bir mililitre taze ayırma tamponu daldırın. Son olarak, hem Sca1 pozitif hem de negatif hücre fraksiyonlarını döndürün ve peletleri bir mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra her bir fraksiyondaki hücre sayısını sayın ve fraksiyonları yeni bir altı oyuklu hücre kültürü plakasının tek tek kuyucuklarında plakalayın.

Deri altı yağdan izole edilen vasküler stromal hücreler, Sca1 ekspresyon seviyelerinden bağımsız olarak fibroblast benzeri, gerilmiş bir hücre şekli gösterir. Deri altı kasık yağından türetilmiş Sca1 yüksek hücreleri gibi, viseral epididimal yağdan türetilmiş Sca1 yüksek hücreleri de gerilmiş bir fibroblast benzeri hücre şekli gösterir. VIS Sca1 düşük hücreleri ise epiteloid bir şekil sergiler.

İzole edilmiş Sca1-GFP farelerinden izole edilen Sca1 yüksek hücreleri, doku kültüründe GFP pozitif hücreler olarak kolayca tanımlanır. Gerçekten de, bu hücreler akış sitometrisi ile değerlendirildiğinde, GFP pozitif hücrelerin çoğunun, anti-Sca1 antikoru tarafından tespit edildiği gibi, hücre yüzeylerinde Sca1 proteinlerini eksprese ettiği doğrulanır. Gerçek zamanlı PCR analizleri ile birleştiğinde, kasık ve epididimal yağ türevi Sca1 yüksek yağ kaynaklı kök hücreler arasındaki kollajenolitik matris metaloproteinazların diferansiyel ekspresyonu gösterilebilir.

Ayrıca, periselüler bozunma aktivitesini değerlendirmek için floresein etiketli tip I kollajen jeller kullanıldığında, viseral Sca1 yüksek yağ türevi kök hücrelerin aracılık ettiği belirgin şekilde artmış bir kollajen yeniden şekillenme aktivitesi gözlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, yağ yastıkçığı hücresi izolasyonu, uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, verimli yağ yastığı izolasyonunu sağlamak için temiz ve düzenli bir cerrahi alan sağlamayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, yağ kaynaklı kök hücre aracılı doku yeniden şekillenmesi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için kollajen bozunma testi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, obezite ve matris biyolojisi alanındaki araştırmacıların, farelerde ve insanlarda adipoz dokusunun yeniden şekillenmesi ve işlevinde adipoz kaynaklı kök hücrelerin rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, yağ dokusu depolarından birincil Sca1 pozitif hücrelerin nasıl temin edileceğini ve zenginleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.