Sıçanlar Naif Şeker ve Yağ Yeme ardından mezolimbik ve mezokortikal Dopamin Ödül Siteleri c-Fos Aktivasyon Eşzamanlı Algılama

Bu deneysel protokolün genel amacı, VTA'nın ve majör mezotelensefatik DA projeksiyon bölgelerinin, mısır yağı, glikoz, fruktoz veya sakarin çözeltilerinin yeni alımından sonra koordinat ve eşzamanlı c-Fos aktivasyonu gösterip göstermeyeceğini belirlemektir. Bu yöntem, motivasyon gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya ve lezzetli uyaranlara yanıt olarak birden fazla beyin bölgesinin koordineli bir şekilde aktive edilip edilmediğini belirlemeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yerleşik davranışsal tahlilleri, hücresel aktivasyon tekniklerini ve istatistiksel analizleri birleştirmesidir.

Aparatı kurmak için, fareye sunulan çözeltinin doğru bir ölçümünü sağlamak için bir soyguncu durduruculu kalibre edilmiş bir santrifüj tüpü ve 45 derecelik açılı bir metal yudum tüpü kullanın. Kalibrasyonun görünür olmasını sağlamak için gergin bir metal yay ile ev kafesine sabitleyin. Antrenmandan üç ila beş gün önce, çözeltiyi tüketme motivasyonunu artırmak için vücut ağırlığını orijinal ağırlığının% 85'ine düşürmek için sıçanın yiyecek rasyonlarını kısıtlayın.

Bu arada, sıçanın sonraki test çözeltisini kısa gecikmeyle örnekleme olasılığını en üst düzeye çıkarmak için, bir saatlik bir seans boyunca dört gün boyunca% 0.2 sakarin içeren 10 mililitre ön eğitim çözeltisi sağlayın. Giriş ölçümünü elde etmek için tüpü her seanstan önce ve sonra tartın. Ardından, altı çözeltiden birini alan alt gruplar üzerinde beşinci günde bir giriş testi yapın.

Sıçanların kısa gecikmeli çözelti örneklediğinden emin olun ve bu gereksinim karşılanmazsa denekleri çalışmadan çıkarın. Dokuyu hazırlamak için, hayvanı kurban ettikten sonra, beyni kafatasından hızlı bir şekilde çıkarın. Arkadan öne doğru kemiği beyinden dikkatlice kırmak ve çıkarmak için rongeurları kullanın.

Beyinciğin altındaki alanda çalışın ve rongeurların kemik ile meningeal pia mater arasında olduğundan emin olun. Kafatasının üst ve yan kısımları çıkarıldıktan sonra, beyni tabanından kaldırmak için küçük bir spatula kullanın ve kraniyal sinirleri küçük bir makasla kesin. Daha sonra beyni gece boyunca dört santigrat derecede% 4 paraformaldehit çözeltisine sabitleyin.

Ertesi gün, beyni, kabın dibine yerleşene kadar oda sıcaklığında sükroz çözeltisine yerleştirin. Bundan sonra, koku ampulünü çıkarın. Daha sonra, beyincik ve ponsu çıkarın.

Daha sonra, kaudal kısım mikrotom aşamasına sabitlenmiş olarak beyni koronal olarak monte edin ve 40 mirometrelik koronal bölümleri kesin. Bu prosedürde, bölümleri bir saat boyunca beş mililitre% 5 normal keçi serumu ve% 0.2 Triton x-100 PBS ile tedavi edin. Daha sonra, tedavi edilen bölümleri, bir mililitre PBS içeren kuyucuklarda 36 saat boyunca dört santigrat derecede birincil antikor ile inkübe edin.

36 saat sonra, bölümleri her seferinde 10 dakika boyunca beş mililitre PBS ile üç kez durulayın. Daha sonra, ikincil antikor ile bölümleri, bir mililitre PBS içeren kuyucuklarda oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, bölümleri her seferinde 10 dakika boyunca beş mililitre PBS'de üç kez durulayın.

Daha sonra, durulanmış bölümleri ticari olarak temin edilebilen bir Avidin yaban turpu peroksidaz karışımında iki saat inkübe edin. İki saat sonra, bölümleri her seferinde on dakika boyunca beş mililitre PBS'de üç kez durulayın. Daha sonra, bölümleri hidrojen peroksit varlığında beş ila on dakika boyunca DAB ile reaksiyona sokun.

Bundan sonra, VTA bölümlerini, gece boyunca dört santigrat derecede beş mililitre PBS'de bir tirozin hidroksilaz antikoru ile inkübe ederek çift etiketleyin. Ertesi gün, bölümleri her seferinde on dakika boyunca beş mililitre PBS'de üç kez durulayın. Bunu takiben, ikincil antikor ile bölümleri beş mililitre PBS'de oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

İki saat sonra, bölümleri her seferinde on dakika boyunca beş mililitre PBS'de üç kez durulayın. İkincil bir antikor peroksidaz kompleksi kullanarak antikoru görselleştirmek için, beş ila on dakika boyunca bir DAB ve% 0.3 nikel sülfat çözeltisi kombinasyonu ile reaksiyona sokun. Yazılım simgesini çift tıklatarak hücreleri sayın.

Menü çubuğuna gidin, Edinim'e ve ardından Canlı Görüntü'ye tıklayın. Bundan sonra, ilgilenilen bölgeyi odak noktasına getirin ve bir referans noktası oluşturmak için ekrana tıklayın. Ardından, ızgara araç çubuğuna gidin ve Izgarayı Görüntüle ve Izgara Etiketlerini Kullan'ı tıklayın.

İlgilenilen bölgeyi önceden belirlenmiş bir izle ana hatlarıyla belirtin. Ardından, ilgilenilen her bölgedeki tüm hücreleri sayın ve c-Fos hücrelerinin sayılarını kaydetmek için sol kenar çubuğunda Artı'yı seçin. Tanımlanmış bir koyu kırmızı daire gözlendiğinde c-Fos için pozitif bir hücre düşünün.

Bu işlemi her site için tekrarlayın ve her bir ilgi bölgesindeki her bölüm için bilgisiz iki değerlendiricinin değerlendiriciler arası güvenilirliğinin her zaman 0,8'i aştığından emin olun. Daha sonra, ilgilenilen bölgelerdeki c-Fos pozitif nöronları sayın. VTA'daki TH-pozitif ve TH-negatif hücrelerde c-Fos immünoreaktivitesinin mevcut olup olmadığını tanımlayın.

Bu görüntü, yağ veya şeker alımının, tüm amigdalada ve ayrıca bazolateral ve merkezi kortiko-medial amigdala alt alanlarında c-Fos aktivasyonunu farklı şekilde arttırdığını göstermektedir. Bu görüntüde, mısır yağı, glikoz ve fruktoz alımına maruz kalan hayvanlarda gerçek amigdala c-Fos aktivasyonu gözlendi. VTA'daki C-Fos aktivasyonu, mısır yağı ve suya maruz kalan hayvanlarda da gözlenmiştir.

Siyah oklar temsili, çift etiketli, TH c-Fos pozitif hücreleri gösterirken, gri oklar yalnızca temsili c-Fos hücrelerini gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç ila dört hafta içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kesin metodolojiyi, depolamayı ve saymayı takip etmeyi unutmamak önemlidir.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.