Name: Sıçanlar Naif Şeker ve Yağ Yeme ardından mezolimbik ve mezokortikal Dopamin Ödül Siteleri c-Fos Aktivasyon Eşzamanlı Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Öğrenin, sıçanlarda yağ ve şeker alımı sonrası dopamin ödül yollarında c-fos aktivasyonunu eşzamanlı olarak tespit etmek için immünohistolojik teknikleri. Bu yöntem, davranışsal ve hücresel analizleri birleştirerek ödül işleme mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje üzerinde yaptıkları yoğun çalışmalardan dolayı Diana Icaza-Culaki Cristal Sampson ve Theologia Karagiorgis teşekkürler.

Bu deneysel protokoller tüm konular ve prosedürler Ulusal Bakımı Sağlık Rehberi Enstitüleri ve Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ile uyumlu olmasını onaylayan Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Başlık <ol><li> Alma ve / veya cins erkek Sprague-Dawley sıçanları (260-300 g). </li><li> bireysel tel örgü kafeslerde Ev fareleri. Fare yiyeceği ve su ad libitum ile 12:12 saat ışık / karanlık döngüsünde onları korumak. </li><li> Uygun numune boyutlarını atayın (örneğin, n ≈ 6-8) rastgele gruplar halinde. </li></ol> 2. Test Aparatı ve Emme Prosedürler <ol><li> lastik tapalar ile kalibre santrifüj tüplerine kullanın ve 45 ° açı metal siper tüp sunulan çözümlerin (0.1 ml ±) doğru ölçüm sağlamak. kalibrasyon görünürlüğünü sağlamak için gergin metal yay tarafından ev kafeslerine sabitleyin. </li><li> ~ (Gıda zahire sınırlasıçanların 15 / g / gün) çözümleri tüketmek motivasyonunu arttırmak için orijinal vücut ağırlığının% 85 ağırlığı azaltmak için. Not: ağırlık azaltma 3 arasında almalı - 5 gün. </li><li> Sıçanlar kısa (en az 1 dakika) gecikme ile sonraki test çözümleri örnek olasılığını maksimize etmek için bir 1 saat oturumu üzerinden dört gün boyunca% 0.2 sakarin öncesi eğitim çözümleri (10 ml) sağlayın. </li><li> bir kaç damla dökerek santrifüj tüpüne akışı onaylayın. </li><li> Emme ölçümü elde etmek için önce ve her seanstan sonra tüpleri tartılır. </li><li> a) su, b) yeni bir aromalı (% 0.05 kiraz aroması)% 0.2 sakarin, c)% 8 fruktoz, d); 8: bir giriş altı çözümlerden bir alıcı alt Beşinci günde testi (10 mi, 1 saat) gerçekleştirmek % glukoz, e)% 0.3 ksantan zamkı içinde süspansiyon% 3.5 mısır yağı, ve f)% 0.3 ksantan sakızı. </li><li> besin çözeltileri İzokalorik olduğundan emin olun; böylece,% 3.5 mısır yağı konsantrasyonu% 8 şeker çözümleri izokalorik olduğunu. </li><li> th sağlamakkısa gecikme (en az 1 dakika) sıçanlar örnek çözümler. Bu gereklilik yerine değilse, o zaman çalışma konusunu atın. </li></ol> 3. Doku Hazırlanması <ol><li> Her bir test çözeltisi için ilk maruz kaldıktan sonra pentobarbital 90 dakika bir intraperitoneal enjeksiyon yoluyla her bir hayvanın anestezisi. hayvanlar düzgün hayvan artık derin kulak kepçesi stimülasyon sallayarak direkt kornea basınç veya kafa aşağıdaki yanıp sönen ayak tutam çekilmesi gibi refleksler, duyarlı olduğunu göstererek anestezi onaylayın. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 69 transkardiyal her hayvan serpmek. <ol><li> Sodyum pentobarbital (65 mg / kg) aşırı dozda sıçan anestezisi, göğüs kafesi kaldırmak ve kalp 69 ücretsiz erişim için göğüs maruz kalmaktadır. </li><li> Sol kalp kapakçığı apeks iğne yerleştirin ve vena kava kesti. bir fosfat tamponlu sabitleyici CO, ardından fosfat tamponu çözeltisi (PBS, ~ 180 mi) yönetme% 4 paraformaldehid (~ 180 mi) ntaining. </li><li> hayvan aslında sıvı gibi burun, ağız ve genital bölgelerde gibi diğer boşlukları bırakarak olup olmadığını inceleyerek doğru perfüze ediliyor emin olun. Not: paraformaldehid ile uygun sabitleme büyük kas hareketleri ile eşlik edecek. Bu oluşmazsa bu reaksiyon oluşuncaya kadar, iğne yeniden ayarlayın. </li></ol></li><li> çabucak kafatası kürk ve deriyi keserek kafatası beyin kaldırmak. çatlak ve arkadan öne doğru hareket beyinden kemiği kaldırmak için rongeurs kullanın. rongeur kemik ve meningeal Pia mater arasında olmasını sağlamak altında ve beyincik arkasındaki alanda başlangıçta çalışma. Kafatasının üst ve yanları kaldırıldıktan sonra, tabandan beyin kaldırmak için küçük bir spatula kullanın ve küçük makas ile kranial sinirler snip. kemik kaldırılmaya çalışılırken beyin zarar vermemek için dikkatli olun. </li><li> gece boyunca 4 ° C &#39;de% 4 paraformaldehit solüsyonunda beyinleri düzeltildi.bunlar, kabın dibinde biriken kadar oda sıcaklığında% 30 sakroz /% 70 PBS çözeltisi içinde beyinleri yerleştirin. </li><li> beyin engelle <ol><li> koku ampul enlemesine kaudal kesme beynin rostral kısmını çıkarın. </li><li> beyincik ve pons düzeyinde enine kesme beynin kaudal kısmını çıkarın. </li></ol></li><li> MPFC aracılığıyla kayar mikrotom aşamasında sabit kaudal kısmı ile koronal beyin monte edin ve kesme koronal kesitler (40 mikron) (2,86 - bregma 2,20 mm rostral), NAC çekirdek ve kabuk ve dorsal striatum (+ 1,76-1,60 mm bregma rostralinde), AMY (-2,12 - bregma -2,92 mm kaudal) ve VTA (-5,20 - -5,60 mm kaudal bregma). Rehberlik için bir sıçan beyin atlası 70 kullanın. </li><li> Nihai immünohistokimyasal analiz 71 PBS ile dolu bir 24-çukurlu plaka bireysel çukurlar halinde serbest yüzen bölümleri toplayın. 24 biz mühür Parafilm kullanınll plaka PBS kapta buharlaşması ve beyin kadar kuru değil emin olmak için. 4 ° C beyin dokusu saklayın. </li></ol> 4. c-fos Prosedürleri (71 uyarlanmıştır) <ol><li> % 5 normal keçi serumu içinde 5 ml% 0.2 Triton X-100, PBS içinde 1 saat süre ile, her bölüm tedavi edin. </li><li> PBS 1 ml içeren tüpler içinde 36 saat boyunca 4 ° C &#39;de: primer antikorlar ile muamele edilmiş bölüm (5000 tavşan anti-c-fos, 1) inkübe edin. </li><li> Durulama bölümler 10 dakika her biri için, PBS (5 mi) ile 3 kez. </li><li> sekonder antikor ile inkübe (biyotinile keçi anti-tavşan, 1: 200), oda sıcaklığında 2 saat süre ile PBS 1 ml içeren Wells. </li><li> 10 dakika her biri için PBS içinde, her bölüm, 3x (5 mi) yıkayın. </li><li> 5 ml PBS içinde Avadin DH (100 ul) ve biyotinile yaban turpu peroksidaz H (100 ul) oluşan bir kit gelir ticari olarak temin edilebilen Avidin-yaban turpu peroksidaz karışımı içinde 2 saat süreyle çalkalandı bölümleri inkübe edin. </li><li> Yeniden durulama bölümleri PB 3xS 10 dakika her biri için (5 mi). </li><li> DAB çözeltisi 5 ml ihtiva eden oyuklara doku reaktivitesine bağlı olarak, 10 dakika - 5 için% 0.0015 H2O 2 varlığında,% 0.05 diaminobenzidin (DAB) ile bölümleri React. </li><li> Çift etiket VTA bölümleri. gece boyunca 4 ° C&#39;de PBS içinde (5 mi) bir tirosin hidroksilaz (TH) antikoru (2.000 tavşan anti-fare TH, 1) ile inkübe edin. </li><li> Durulama bölümler 10 dakika her biri için, PBS (5 mi) içinde 3 kat. </li><li> sekonder antikor ile inkübe (biyotinile keçi anti-tavşan, 1: 200), PBS (5 mi) içinde, oda sıcaklığında 2 saat karıştırıldı. </li><li> Durulama bölümler 10 dakika her biri için, PBS (5 mi) içinde 3 kat. </li><li> ikinci bir antikor peroksidaz kompleksi ile antikor görselleştirme. DAB / NiCl çözeltisi 5 ml ihtiva eden oyuklara doku reaksiyona bağlı olarak, 10 dakika - 5 için,% 0.05 DAB bir kombinasyonu ve% 0.3 nikel sülfat çözeltisi ile tepkimeye sokulur. </li><li> DAB çözümü ondan renk sütlü açık yeşil olduğundan emin olun% 0.3 nikel sülfat ile tepkisi. çözüm çok yeşil ise, reaksiyon çok karanlık olacaktır. </li><li> jelatin kaplı slaytlar üzerine tüm bölümleri monte edin. Bir Toluen Tabanlı Çözüm (TBS) bir kaç damla-kayma kapak sonra onları kuru gecede edelim ve. </li><li> Deneysel durum gözlemcilere bilinmemektedir, böylece kod slaytlar. </li></ol> c-fos 5. Belirlenmesi İmmünoeaktif Sayıları <ol><li> prelimbic MPFC, infralimbic MPFC, NAC çekirdek, NAC kabuk, bazolateral AMY çekirdekleri, merkezi-kortiko-medial AMY, dorsal striatum ve VTA: ilgi bu bölgelerde (YG) Fos-pozitif nöronlar saymak için tarafsız gözlemcilerin çiftleri atayın. . C-Fos immunreaktivitesi TH + ve VTA TH- hücrelerde bulunan olup olmadığını Delineate 1 mikroskop NAC bir ekran çekilen resim sağlar Şekil. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53897/53897fig1.jpg" /> <strong&gt; c-fos Sayımlar Are Made hangi Grid tarafından özetlenen İlgi Şekil 1. nukleus accumbensde Temsilcisi Bölüm (NAC) gösteriliyor Bölgeler. NAC kabuk NAC çekirdek medial ve ventral bulunur. NAC çekirdek ön komissürü çevreler (anterior Comm.). Lateral ventrikül (Lateral Ort.) Ventral ölçüde görülebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53897/53897fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="2"><li> test koşullarında tüm tüm hayvanlar için ortak site başına en az üç Örnek dilim analiz edin. </li><li> Anahat (Şekil 1) takip ederek her ROI için tüm bölgeyi analiz yazılımı ve bir optik mikroskop kullanın. <ol><li> Belirli bir site için, uygulamayı açın ve satın alma açılır menüsünü tıklayın ve &quot;Canlı Image&quot; tıklayın. odak haline ROI getirin ve bir referans noktası oluşturmak için ekrana tıklayın. Sonra trBir kılavuz olarak ızgara kullanarak seçilen beyin bölgesini ace. iz tamamlandığında, hücreler (- 5.3.1.3 5.3.1.1 adımlar) sayılır. <ol><li> yazılım simgesine çift tıklayın. &quot;Acquisition&quot; ve ardından &quot;Canlı Image&quot; tıklayın, menü çubuğuna gidin. odak haline ROI getirin ve bir referans noktası oluşturmak için ekrana tıklayın. </li><li> ızgara araç çubuğuna gidin ve &quot;Ekran Izgara&quot; ve &quot;Use ızgara etiketleri&quot; butonuna tıklayınız. önceden belirlenmiş bir iz ROI anahat. </li><li> c-fos hücrelerin sayısını tutmak için sol kenar çubuğunda bir &quot;+&quot; seçeneğini, her ROI alanındaki tüm hücreleri saymak. sayar kaydetmek için tek başına her bir hücreyi tıklayın. Tanımlanmış bir koyu kırmızı daire (Şekil 1) gözlendiğinde c-fos pozitif bir hücreyi ele alalım. </li></ol></li><li> her site için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Tutanak bir laboratuar notebook ve gelecek analizi için bilgisayar üzerinde sayar. izleme ve sayıları kaydetmek için, &quot;Kaydet Veri Dosyası&quot; &quot;Dosya&quot; tıklayın menü çubuğuna gidin. </li></ol&gt; </li><li> Her ROI her bölüm için iki bilgisiz gözlemcinin (sayıları korelasyonu kullanarak) bu hakemlerarası güvenilirliğini sağlamak her zaman 0,8 aşıyor. </li></ol> 6. İstatistik <ol><li> Gün 1, 2, 3 ve 4 69 sakarin alımı karşılaştıran bir tekrarlanan-ölçer varyans (ANOVA) 1-yönlü analizi kullanılarak ilk dört gün boyunca bazal sakarin alımı değerlendirin. </li><li> Bir randomize blok 2-yönlü ANOVA 69 kullanılarak altı gruba test alımı (Gün 5) ile sakarin alımının (Gün 4) karşılaştırın. </li><li> Bireysel önemli etkileri 69 belirlemek için Tukey karşılaştırmalar (p &lt;0.05) kullanın. </li><li> hakemlerarası güvenirliğini belirlemek ve daha sonra ortak bir gözlemcinin sayıları kullanın. </li><li> Her site 69 üç temsilci dilim için ortalama c-fos sayar. <ol><li> Altı çözeltiler (% 3.5 mısır yağı,% 8 glükoz,% 8 fruktoz,% 0.2 aromalı sakarin, Xa alımı ile uyarılan c-fos aktivasyon 1-yönlü ANOVA gerçekleştirmeperilimbic MPFC 69 nthan sakız kontrolü ve su). </li><li> infralimbic MPFC, NAC çekirdek, NAC kabuk, bazolateral AMY, merkezi-kortiko-medial AMY, VTA ve dorsal striatum altı gruba tekrarlayın paralel analizleri. Bireysel önemli etkileri 69 ortaya çıkarmak için Tukey karşılaştırmalar (p &lt;0.05) kullanın. </li></ol></li><li> onun süspansiyon ajanı su alımı ve alımı, ksantan zamkı hem mısır yağı alımını karşılaştırın. su alımı ve besleyici olmayan tatlandırıcı, sakarin alımı hem de fruktoz ve glukoz alımı karşılaştırın. </li><li> sitelerin her çözüm girişleri ve c-fos aktivasyonu arasında anlamlı ilişkiler Bonferroni r korelasyon (p &lt;0.05) kullanılarak gözlendi olmadığını tespit. <ol><li> Sistematik olarak% 3.5 mısır yağı grubundaki her hayvan için perilimbic ve infralimbic ön frontal kortekste c-fos sayımları karşılaştırın. </li><li> Altı sitelerin her çiftinin sistematik paralel analizler tekrarlayın (VTA, dorsal striatum, infralimbic MPFC, perilimbic MPFC% 3.5 mısır yağı için, NAC çekirdek, NAC kabuk, bazolateral AMY, merkezi-kortiko-medial AMY). </li><li> Diğer beş deneysel emme koşulları (% 8 glükoz,% 8 fruktoz,% 0.2 aromalı sakarin, ksantan sakızı kontrolü ve su) için bu altı siteye sistematik Benzer analizler, tekrarlayın. </li></ol></li><li> Bir çözüm koşulu içinde aynı hayvanlar çözümleri arasında ve Bonferroni kullanarak her çözümün içinde c-fos aktivasyonu arasında anlamlı ilişkiler belirlenerek tüm sitelerde değerlendirildi gerçeği yararlanın korelasyonu (p &lt;0.05) r. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.

Çalışmanın amacı, kaynağı (VTA) ve ön beyin projeksiyon hedefleri DA ödül ile ilgili nöronların (NAC, AMY, MPFC) aynı anda sıçanlarda yağ ve şeker yeni alımından sonra aktive eğer hücresel c-fos tekniği kullanılarak belirlenmesi amaçlanmıştır . Bu çalışmada, daha önce 69 yayınlanan bir çalışmanın protokollerin ayrıntılı bir açıklamasıdır. Bu VTA, prelimbic ve infralimbic MPFC, NAC çekirdek ve kabuk ve bazolateral ve merkez kortiko-medial AMY yanı sıra dorsal striatum onun büyük projeksiyon bölgeleri dağıtılmı...

Beyin dopamininin (DA) ile kabul edilebilir şekerlerin alımı için merkezi tepkilerine dahil edilmiştir önerilen hedonik 1,2, çaba ile ilgili 3 ve eylem 4,5 mekanizmaları alışkanlık alınmıştır. Bu etkilerin karışmış birincil DA yolu, ventral tegmental bölgeden (VTA) kaynaklanır, ve çekirdeğin akumbens (NAC) çekirdek ve kabuk, bazolateral ve orta-kortiko-medial amigdala (AMY) ve prelimbic ve infralimbic mediale projeler prefrontal korteks (MPFC) (değerlendirmeleri 6,7 bakınız). VTA sükroz alımı 8,9 sorumlu tutulmuştur ve DA sürümü NAC 10-15, AMY 16,17 ve MPFC 18-20 aşağıdaki şeker alımını görülmektedir. Yağ alımı da DA NAC 21 serbest uyarır ve dorsal striatum (kaudat-putamen) başka DA zengin projeksiyon bölgesi de DA-aracılı 22,23 besleme ile ilişkili olmuştur. Kelley 24-27 bu çoklu bir proje önerdiBu DA-aracılı sistemin iyon bölgeleri kapsamlı ve samimi bağlantıları 28-34 ile entegre ve interaktif dağıtılan beyin ağını kurdu. Şekerler 35-37 ve yağlar 38-40 alımını azaltmak için DA D1 ve D2 reseptör antagonistlerinin yeteneğinin yanısıra, DA sinyali ayrıca şekerler ve klimalı bir lezzet tercihlerine üretmek için yağ (CFP) yeteneğini aracılık etmektedir edilmiş 41- 46. NAC, AMY veya MPFC 47-49 içine DA D1 reseptör antagonisti olan Microinjections mide içi glukoz tarafından ortaya OBP edinimi ortadan kaldırır. MPFC içine DA D1 ya da D2 ya reseptör antagonistleri microinjections fruktoz-CFP 50 edinilmesini ortadan kaldırır Oysa edinimi ve fruktoz-OBP ifadesi farklı şekilde NAC ve AMY 51,52 DA antagonistleri tarafından bloke edilir. C-fos tekniği 53,54 nöral activatio araştırmak için kullanılan edilmiştirn kabul edilebilir alımı ve nöral aktivasyon tarafından uyarılan. şekliyle &quot;c-fos aktivasyon&quot; el yazması boyunca kullanılacak ve operasyonel nöronal depolarizasyon sırasında C-Fos artmış transkripsiyonu ile tanımlanır. Sükroz alımı NAC 55-57 arasında VTA yanı sıra kabuk değil, çekirdek, merkez AMY çekirdeğindeki fos benzeri immunreaktivitesi (FLI) arttı. Sahte beslenen sıçanlarda sükroz alımı ise anlamlı AMY ve NAC FLI arttı, ancak VTA 58, mide sakaroz veya glukoz infüzyonu anlamlı NAC ve AMY 59,60 merkez ve bazolateral çekirdeklerde FLI arttı. Planlanan chow erişim sakaroz tekrarlanan eklenmesi NAC kabuk ve çekirdek 61 yanı sıra MPFC içinde FLI arttı. Bir sakaroz konsantrasyon vites küçültme paradigma büyük Fli artar bazolateral AMY ve NAC meydana geldiğini ortaya ama VTA 62. Aşağıdaki klima, şeker ilişkili doğal Rewa söndürmerd davranışları bazolateral AMY ve NAC 63 FLI arttı. Dahası, bir sesi eşleştirme şeker kullanılabilirliği sonradan bazolateral AMY 64 FLI düzeyleri artan bir tonda sonuçlandı. Yüksek yağ alımı da NAC ve MPFC sitelerinde 65-67 yılında FLI arttı. Daha önce belirtilen çalışmaların çoğu ödül ile ilgili dağıtılan beyin ağları 24-27 tanımlanması hakkında bilgi vermemektedir tek sitelerinde c-fos aktivasyonu şeker ve yağ etkilerini inceledik. Ayrıca, çalışmaların çoğu da göreceli (bazolateral ve orta-kortiko-medial) NAC (çekirdek ve kabuk), AMY ve MPFC alt alanlarının katkılarını tasvir etmedi (prelimbic ve infralimbic) potansiyel tarafından muayene edilebileceğini c-Fos haritalama 68 mükemmel mekansal, tek hücreli çözünürlükte avantajı. Laboratuvarımız 69 geçenlerde VTA DA yolunun ve yanlısı c-fos aktivasyonu ve eş zamanlı olarak ölçülen değişiklikler kullanılanjection bölgeleri (NAC, AMY ve MPFC) sıçanlarda yağ ve şekerlerin yeni alımından sonra. Bu çalışma aynı zamanda farklı şekilde NAC, AMY alt alanlarında FLI aktive edip akut altı farklı çözümler maruz kalma (mısır yağı, glikoz, fruktoz, sakarin, su ve yağ emülsiyonu denetimi) analiz etmek usul ve metodolojik adımları açıklar, MPFC yanı sıra sırt striatum. Farklılıkların Bu eşzamanlı tespiti için her site ve belirlenmesi FLI üzerinde önemli etkilerinin onay izin ister ve böylece dağıtılmış beyin ağı 24-27 için destek sağlayan, ilgili siteleri değişiklikler ile ilişkili belirli bir sitede değişiklikler. Test edilen bu işlemler VTA, prelimbic ve infralimbic MPFC, NAC çekirdek ve kabuk ve bazolateral ve merkezi kortiko-medial AMY) ve dorsal striatum olup koordine görüntüleyecektir oral, koşulsuz alınmasından sonra eş zamanlı FLI aktivasyon glikoz (% 8), fruktoz (% 8), mısır yağı (% 3.5) ve sakarin (% 0.2) çözümler.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sprague-Dawley sıçanları</td><td>Charles River Laboratuvarları</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>Hasır Kafesler</td><td>Laboratuvar Ürünleri, Seaford, DE</td><td>30 Kafesli raf</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan Chow</td><td>PMI Beslenme Uluslararası</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>Gergin Metal Yay</td><td>Laboratuvarı Ürünleri, Seaford, DE</td><td>yok</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan Tartı Kantarı</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Santrifüj Tüpleri</td><td>Laboratuvar Ürünleri, Seaford, DE</td><td>10-0501</td><td></td></tr><tr><td>Kauçuk Tıpa</td><td>Laboratuvarı Ürünleri, Seaford, DE</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Metal Sippers</td><td>Laboratuvar Ürünleri, Seaford, DE</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Saccharin</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>82385-42-0</td><td></td></tr><tr><td>Kool-Aid, Kiraz</td><td>Kool-Aid</td><td>Ticari</td><td></td></tr><tr><td>Kool-Aid, Üzüm</td><td>Kool-Aid</td><td>Ticari</td><td></td></tr><tr><td>Fruktoz</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Mısır Yağı</td><td>Mazzola</td><td>Ticari</td><td></td></tr><tr><td>Ksantan Sakızı</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>11138-66-2</td><td></td></tr><tr><td>Kayar Mikrotom</td><td>Microm International</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Kamera</td><td>MBF Bioscience</td><td>Yazılım uygulaması</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin kaplı Slaytlar</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>Altın Naylon Fırçalar</td><td>Loew-Cornell&nbsp;</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>Doğal Saç Samur&nbsp;</td><td>Loew-Cornell&nbsp;</td><td>2022</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyu Plakaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyu Plakaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>1 L Pyrex şişeler</td><td>Fisher Scientific</td><td>1395-1L</td><td></td></tr><tr><td>Doku eki (doku süzgeci)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7200214</td><td></td></tr><tr><td>Eagle pipetleri&nbsp;</td><td></td><td>1-10 & # 956 için Dünya Hassas Aletler E10; l</td><td></td></tr><tr><td>Kartal pipetleri&nbsp;</td><td></td><td>20-100 & # 956 için Dünya Hassas Aletler E100; l</td><td></td></tr><tr><td>Kartal pipetleri&nbsp;</td><td></td><td>50-200 & # 956 için Dünya Hassas Aletler E200; l</td><td></td></tr><tr><td>Kartal pipetleri&nbsp;</td><td></td><td>100-1000&#956 için Dünya Hassas Aletler E1000; l</td><td></td></tr><tr><td>Kartal pipetleri&nbsp;</td><td></td><td>1000-5000&#956 için Dünya Hassas Aletler E5000; l&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Evrensel İpuçları .1-10 &# 956; l</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>500192</td><td></td></tr><tr><td>Evrensel İpuçları 5-200 & # 956; l</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>500194</td><td></td></tr><tr><td>Evrensel Uçlar 500-5.000 & # 956; l</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>500198</td><td></td></tr><tr><td>Bıçak Vibroslice 100</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>BIÇAK</td><td></td></tr><tr><td>DPX Montaj Ortamı&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu&nbsp;</td><td>13510</td><td></td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpleri</td><td>Biologix Araştırma A.Ş.</td><td>10-0501</td><td></td></tr><tr><td>Slayt Kutuları</td><td>Biologix Araştırma A.Ş.</td><td>41-6100</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Çalkalayıcı&nbsp;</td><td>Madell Şirketi&nbsp; &nbsp;</td><td>ZD-9556</td><td></td></tr><tr><td>kantar tekneleri&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>5 ml tek kullanımlık pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-5AM</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Araştırmacı Yazılımı</td><td>Mikro Parlak Alan</td><td>Yazılımı uygulama</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Paraformaldehit</td><td>Granül Fisher Scientific</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Monobazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Diphasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear II&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-044-192</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Vektör</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Vektör</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>ABC Kiti Peroksidaz Standart</td><td>Vektör</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-cFos (Ab-5) Tavşan</td><td>EMD Kimyasal / Cal Biyokimya</td><td>PC38</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>SigmaAldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>3,3' Diaminobenzidin tetra hidroklorür&nbsp;</td><td>SigmaAldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>SigmaAldrich</td><td>5881</td><td></td></tr><tr><td>Birincil TH anti cor</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Euthosol</td><td>Virbac AH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sıçanlar naif Şeker ve yağ yeme ardından mezolimbik ve mezokortikal dopamin Ödül siteleri c-fos aktivasyon eşzamanlı algılama

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

Bu çalışma, sıçanlarda beyin dopamin (DA) yollar üzerinde yağ ve şeker yeni yenmesi etkilerini değerlendirmek üzere hücresel c-fos aktivasyonu kullanır. şeker ve yağ girişleri onların doğuştan konumlar yanı sıra öğrenilen tercihleri ​​aracılık eder. Beyin dopamin özellikle meso-limbik ve ventral tegmental alan (VTA) için mezokortikal çıkıntılar, bu bilgisiz ve öğrenilmiş yanıtların hem de implike edilmiştir. Birkaç site ve verici / peptid sistemleri etkileşim burada dağıtılan beyin ağları kavramı, lezzetli gıda alımını aracılık ettiği ileri sürülmüştür, ancak ampirik tür eylemleri gösteren sınırlı kanıt bulunmaktadır. Böylece, şeker alımı DA bırakma ve artar c-fos benzeri nukleus akkumbenlere (NAC), amigdala (AMY) da dahil olmak üzere bireysel VTA DA projeksiyon bölgelerinden immunreaktivitesi (FLI) ve prefrontal korteks (MPFC) yanı sıra sırt striatum medial ortaya çıkarır. Bu siteye seçici DA reseptör antagonistleri Ayrıca, merkezi yönetimşeker veya yağ tarafından ortaya klimalı lezzet tercihleri ​​edinimi ve ifadesini azaltmak farklı şekilde s. tarafından bir yaklaşım bu sitelerin değerlendirmek eşzamanlı olacaktır şeker veya yağ alımı yanıt olarak dağıtılmış beyin ağı olarak etkileşime belirlemek isteyip VTA ve onun büyük mesotelencephalic DA projeksiyon bölgeleri (prelimbic ve NAC infralimbic MPFC, çekirdek ve kabuk, bazolateral ve merkezi kortiko-medial AMY) ve dorsal striatum koordine görüntüleyecektir ve mısır yağı (% 3.5), glikoz (% 8), fruktoz (% 8) ve sakarin, oral, şartsız alınmasından sonra eş zamanlı FLI aktivasyonu (0.2 %) çözümleri. Bu yaklaşım kemirgenlerde palatable gıda alımından ödül ile ilgili öğrenme incelemek için ilgili beyin siteler arasında eşzamanlı olarak hücresel c-fos aktivasyonu kullanılarak uygulanabilirliğini belirlemede başarılı bir ilk adımdır.

Aşağıda açıklanan tüm temsilcisi sonuçları önceden 69 yayımlanmıştır ve tekniğin etkinliğini gösteren içinde &quot;kavramının kanıtı&quot; desteklemek için burada yeniden sunulmuştur. çözüm Alım bazal sakarin alımının önemli farklılıklar bütün hayvanlarda (F (3,108) = 57.27, p &lt;0.001) girişleri ile (Gün 1 için ilk dört gün boyunca gözlendi: 1.3 (± 0.2) ml; 2. Gün: 3.9 (0.4 ±) ml ; 3. Gün: ...

Bu çalışmanın amacı, sıçanlarda yağ ve şeker yeni alımından sonra dopamin yollar ve terminal sitelerinde eş zamanlı değişiklikleri ölçmek için hücresel c-fos aktivasyonu kullanılarak güvenilir bir immünohistolojik tekniği ortaya koymaya tarafından ödül ile ilgili dağıtılan beyin ağları tespit etmektir.

Sıçanlar Naif Şeker ve Yağ Yeme ardından mezolimbik ve mezokortikal Dopamin Ödül Siteleri c-Fos Aktivasyon Eşzamanlı Algılama

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

Bu deneysel protokolün genel amacı, mısır yağı, glukoz, fruktoz veya sakarin çözeltilerinin ilk kez alınmasından sonra VTA'nın ve buradaki ana mezotelensefalik DA projeksiyon bölgelerinin koordineli ve eş zamanlı c-Fos aktivasyonu gösterip göstermediğini belirlemektir. Bu yöntem, nörobiyoloji alanındaki motivasyon gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve lezzetli uyaranlara yanıt olarak birden fazla beyin bölgesinin koordineli bir şekilde aktive olup olmadığını tanımlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yerleşik davranışsal analizleri, hücresel aktivasyon tekniklerini ve istatistiksel analizleri birleştirmesidir.Düzeneği kurmak için, sıçana sunulan çözeltinin doğru ölçümünü sağlamak amacıyla kauçuk tıpalı, kalibre edilmiş bir santrifüj tüpü ve 45 derecelik açılı metal bir emici tüp kullanın. Kalibrasyonun görünür olmasını sağlamak için düzeneği gergin bir metal yay ile ana kafese sabitleyin. Çözeltiyi tüketme motivasyonunu artırmak amacıyla, eğitimden üç ila beş gün önce sıçanın vücut ağırlığını orijinal ağırlığının %85'ine düşürmek için gıda rasyonlarını kısıtlayın.Bu süre zarfında, sıçanın sonraki test çözeltisini kısa bir gecikmeyle tatma olasılığını maksimize etmek için hayvana dört gün boyunca, birer saatlik seanslar halinde, %0,2 sakarin içeren 10 mililitre ön eğitim çözeltisi verin. Alım miktarını belirlemek için tüpü her seans öncesinde ve sonrasında tartın. Ardından, beşinci günde altı çözeltiden birini alan alt gruplara alım testi uygulayın.Sıçanların düşük latanslı örnekleme çözümlerine sahip olduğundan emin olun ve bu gereksinimin karşılanmadığı denekleri çalışmadan hariç tutun. Dokuyu hazırlamak için, hayvanı sakrifiye ettikten sonra beyni kafatastan hızlıca çıkarın. Kemikleri beyinden dikkatlice kırmak ve uzaklaştırmak için rongeur kullanarak arkadan öne doğru ilerleyin.Serebellum'un altındaki bölgede çalışın ve kemik ile meningeal pia mater arasında rongeurların olduğundan emin olun. Kafatasının üst ve yan kısımları çıkarıldıktan sonra, beyni tabanından kaldırmak için küçük bir spatula kullanın ve kranial sinirleri küçük makaslarla kesin. Ardından, beyni dört derece santigrat sıcaklıkta, %4 paraformaldehit çözeltisinde gece boyunca sabitleyin.Ertesi gün, beyin kabın dibine çökene kadar oda sıcaklığındaki sakkaroz çözeltisine yerleştirin. Ardından olfaktör bulbusu çıkarın. Sonrasında serebellum ve ponsu çıkarın.Ardından, beyni koronal düzlemde, kaudal kısmı mikrotom tablasına sabitlenecek şekilde yerleştirin ve 40 mirometre kalınlığında koronal kesitler alın. Bu prosedürde, kesitleri bir saat boyunca beş mililitre %5 normal keçi serumu ve PBS içinde %0,2 Triton x-100 ile işleme tabi tutun. Daha sonra, işlenen kesitleri bir mililitre PBS içeren kuyucuklarda, primer antikor ile dört derece santigrat sıcaklıkta 36 saat boyunca inkübe edin.36 saat sonra, kesitleri beş mililitre PBS ile her seferinde 10 dakika olacak şekilde üç kez yıkayın. Ardından, bir mililitre PBS içeren kuyucuklarda, kesitleri oda sıcaklığında iki saat boyunca ikincil antikor ile inkübe edin. Sonrasında, kesitleri beş mililitre PBS ile her seferinde 10 dakika olacak şekilde üç kez yıkayın.Ardından, durulanan kesitleri ticari olarak temin edilebilen bir Avidin horseradish peroxidase karışımı içinde iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra, kesitleri beş mililitre PBS ile her seferinde on dakika süreyle üç kez durulayın. Sonrasında, kesitleri hidrojen peroksit varlığında beş ila on dakika boyunca DAB ile reaksiyona sokun.Ardından, VTA kesitlerini beş mililitre PBS içinde, dört santigrat derecede gece boyunca tirozin hidroksilaz antikoru ile inkube ederek çift etiketleme yapın. Ertesi gün, kesitleri beş mililitre PBS içinde, her seferinde on dakika boyunca üç kez durulayın. Bunun ardından, kesitleri beş mililitre PBS içinde, oda sıcaklığında iki saat boyunca sekonder antikor ile inkube edin.İki saat sonra, kesitleri beş mililitre PBS ile her seferinde on dakika boyunca üç kez durulayın. Antikoru, ikincil antikor peroksidaz kompleksi kullanarak görüntülemek için DAB ve %0,3 nikel sülfat çözeltisi karışımı ile beş ila on dakika boyunca reaksiyona sokun. Yazılım simgesine çift tıklayarak hücreleri sayın.Menü çubuğuna gidin, Acquisition'a ve ardından Live Image'a tıklayın. Daha sonra, ilgilenilen bölgeyi odağa getirin ve referans noktası belirlemek için ekrana tıklayın. Son olarak, ızgara araç çubuğuna gidin, Display Grid ve Use Grid Labels seçeneklerine tıklayın.İlgi bölgesini önceden belirlenmiş bir iz ile ana hatlarıyla belirleyin. Ardından, her ilgi bölgesindeki tüm hücreleri sayın ve c-Fos hücrelerinin sayımlarını kaydetmek için sol kenar çubuğundaki Plus seçeneğini seçin. Belirgin, koyu kırmızı bir daire gözlemlendiğinde hücreyi c-Fos pozitif olarak değerlendirin.Bu işlemi her bölge için tekrarlayın ve her bir ilgi bölgesindeki her bölüm için, bilgilendirilmemiş iki değerlendiricinin değerlendiriciler arası güvenilirliğinin her zaman 0,8'in üzerinde olduğundan emin olun. Ardından, ilgi bölgelerindeki c-Fos pozitif nöronları sayın. VTA'daki TH-pozitif ve TH-negatif hücrelerde c-Fos immünoreaktivitesinin mevcut olup olmadığını belirleyin.Bu görüntü, yağ veya şeker alımının tüm amigdalanın yanı sıra basolateral ve merkezi-kortiko-medial amigdala alt alanlarında c-Fos aktivasyonunu farklı şekilde artırdığını göstermektedir. Bu görüntüde, mısır yağı, glukoz ve fruktoz alımına maruz kalan hayvanlarda gerçek amigdala c-Fos aktivasyonu gözlemlenmiştir. VTA'daki c-Fos aktivasyonu da mısır yağı ve suya maruz kalan hayvanlarda gözlemlenmiştir.Siyah oklar temsili, çift işaretli, TH c-Fos pozitif hücrelerini; gri oklar ise yalnızca c-Fos pozitif olan temsili hücreleri göstermektedir. Bu teknikle yeterince çalışıldıktan sonra, doğru şekilde uygulandığında işlem üç ila dört hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken kesin metodolojiye, saklama koşullarına ve sayım yöntemlerine uyunca dikkat edilmesi önemlidir.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

simultaneous-detection-c-fos-activation-from-mesolimbic-mesocortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu yazıda, aynı anda çoklu bilişsel davranışları test ve kemirgenler için nöronal aktiviteleri kayıt yeteneğine sahip tam otomatik ve çok yönlü bir sistem sunuyoruz.

Multi-bilişsel işlevler Test ve Kemirgenler Nöronal Etkinlikler kayıt için Tam Otomatik ve Çok Yönlü Sistemi

Bu rapor detayları farelerin yüksek yağlı yiyecek ödüllendirici etkisini ölçmek için kullanılan protokol ilerici bir oranı edimsel koşullanma görev kullanarak.

Aşamalı-oranı Farelerde Palatable Yüksek yağ ve yüksek şeker Gıda tepki

Bu makalede, gıda ile ilgili motivasyon ve insanlarda gıda ile ilgili hedef değerlerinin ölçülmesi için yöntemler kümesini tarif etmektedir.

İnsanlardaki Gıda Ödül ve Motivasyon incelenmesi

Hücre dışı dopamindeki (DA) hızlı dalgalanmalar, memelilerde hem ödül işlemeye hem de motive edilmiş davranışa aracılık eder. Bu el yazması, tastantların uyanık, serbestçe hareket eden sıçanlarda hızlı dopamin salınımını nasıl değiştirdiğini belirlemek için hızlı taramalı döngüsel voltametri (FSCV) ve ağız içi tatır uygulamasının birlikte kullanımını açıklamaktadır.

Uyanık Sıçanlarda Intra-Oral tat yoğunluğu arttırıcı madde İdaresi Sırasında Hızlı Tarama Dönüşümlü Voltametri Rapid Dopamin Dynamics incelenmesi

Burada taze ve dondurulmuş hem de beyin dokusundan nöronal topluluklarından Fos-ifade moleküler değişiklikler incelemek için bir Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) protokol mevcut. dondurulmuş doku kullanımı değerli hayvan deneklerin kullanımını maksimize için birden fazla seans boyunca birçok beyin bölgelerinin FACS izolasyonu sağlar.

Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi

İşaret reaktivite duyarlılık ipuçlarını özlem için katkıda bulunmak ve kanaatkâr insanlarda relaps uyuşturucu alma deneyimleri ile bağlantılı olarak kavramsallaştırma. İşaret reaktivite Rat appetitive yaklaşım davranış kendi kendine Yönetim takip ve oruç zorla bir işaret reaktivite testi sonuçları ölçme dikkatte yönlendirme uyuşturucu ilgili ipuçlarını doğru tarafından modellenmiştir.

Cue reaktivite kokain kullanımı bozukluğu bir sıçan modelinde ölçmek için bir protokol

Bu kağıt dopamin ve Glutamat yüksek zamansal çözünürlük ile serbest bırakılması sırasında doğal tatmin edici davranışlara ölçmek için karbon fiber elektrotlar ve enzimatik Biyoalgılayıcı teknoloji kullanarak sabit potansiyel amperometric kayıtları kullanımı detayları kadın hamster.

Doğal olarak kadın Suriye hamster davranışları ödüllendirme sırasında hücre dışı nörotransmitter ölçüm Vivo içinde değişimler

Bu protokolün amacı, ventral tegmental alan reseptörlerini, alt bölüm dopamin salınımı için katkılarını incelemek için doğrudan manipüle etmektir.

Phasic Dopamin'in Ventral Tegmental Alan Reseptör Reseptör Reseptör Düzenlemesini Değerlendirmek için Hızlı Taramalı Döngüsel Voltammetri (CIS-FSCV) ile Kombine infüzyon ve stimülasyon

Burada sunulan sıçanlarda depresyon benzeri ve anhedonik davranış çalışma için bir protokoldür. Bu iki köklü davranış yöntemleri birleştirir, sakaroz tercihi ve yenilik kaynaklı hipofaji testleri, otomatik bir gıda ve sıvı alımı izleme sistemi ile, dolaylı olarak vekil parametreleri kullanarak kemirgen davranışını araştırmak için.

Otomatik Gıda Alımı İzleme Sistemi Kullanan Sıçanlarda Sakaroz Tercihi ve Yenilik Kaynaklı Hipofaji Testleri

Vagus siniri tarafından kolaylaştırılan bağırsak-beyin iletişimi, gastrointestinal endokrin sistem ile beyin arasındaki iletişim için çok önemlidir. Bununla birlikte, intragastrik glukoz enjeksiyonunun kortikal aktiviteyi değiştirip değiştiremeyeceği hala anlaşılamamıştır. Burada, duodenuma glikoz enjeksiyonundan sonra kortikal aktivitedeki değişiklikleri gözlemlemek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Bağırsak-beyin Nöral İletişiminin Gerçek Zamanlı Analizi: Bağırsak Glukoz Stimülasyonuna Yanıt Olarak Korteks Çapında Kalsiyum Dinamiği

Öğrenin, sıçanlarda yağ ve şeker alımı sonrası dopamin ödül yollarında c-fos aktivasyonunu eşzamanlı olarak tespit etmek için immünohistolojik teknikleri. Bu yöntem, davranışsal ve hücresel analizleri birleştirerek ödül işleme mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Sıçanlar Naif Şeker ve Yağ Yeme ardından mezolimbik ve mezokortikal Dopamin Ödül Siteleri c-Fos Aktivasyon Eşzamanlı Algılama

Daha fazla video keşfet