Name: Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Öğrenin, hız gradyanı santrifüjasyonu kullanarak Influenza A virüsü kapsidlerinin endozomik ortamda demontajını analiz etmeyi. Bu yöntem, pH etkilerini nicel olarak değerlendirerek viral kılıf açılma mekanizmalarını araştırmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz reaktif bize sağlamış Yohei Yamauchi ve Roberta Mancini teşekkür ederiz. AH laboratuvar Marie Curie ilk Eğitim Ağları (ITN) tarafından desteklenmiştir, ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) (Sinergia).

Tamponlar ve Stok Çözümleri hazırlanması 1. <ol><li> 80 mi GKD 2 O 470 mg TRIS-hidroklorid, 390 mg MES hidrat ve 580 mg NaCI çözülmesiyle (20 mM MES, 30 mM Tris ve 100 mM NaCl) MNT tamponu hazırlayın PH 7.4 tampon ayarlamak ve GKD 2 O 100 ml&#39;lik bir nihai hacme getirmek </li><li> 80 ml ​​dH 2 O her 9.76 gr MES hidrat çözerek 500 mM MES tamponu üç özdeş çözümler hazırlayın. konsantre NaOH ile titre edilerek, sırasıyla pH 5.8, 5.4 ve 5.0, tamponları ayarlayın. DH 2 O 100 ml&#39;lik nihai hacme kadar her bir tampon getirmek </li><li> DH 2 O 80 ml, her 7.88 gr TRIS-hidroklorid çözülmesiyle 500 mM Tris tamponu, iki özdeş çözüm hazırlanması ve konsantre HCI ile titre edilerek, sırası ile 7.4 ve 6.4, pH ayarlamak. DH 2 O 100 ml&#39;lik nihai hacme kadar tampon getirmek </li><li> DH 2 O% 50 gliserol çözeltisi hazırlayın ve glisin kadar iyice karıştırınerol berrak bir karışım. Bir cam şişe içine Steritop filtre birimi (0.22 um gözenek boyutu) ile çözelti filtre. </li><li> 10% NP-40 çözeltisi ve DH 2 O 1 M NaCl hazırlanması </li><li> 4 ml GKD 2 O. iki tablet çözerek 25x konsantre proteaz inhibitörü hazırlayın </li></ol> Gliserol Gradyanların 2. Hazırlık <ol><li> 5 mi deterjan tamponu ana karışımı hazırlanması (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 ve 5.0) test etmek için, her bir pH durumu için çözeltisi (300 mM NaCl,% 2 NP-40, 2 x proteaz inhibitörü konsantre edildi). Bu amaçla, 1 M NaCI 9 mi, 10% NP-40, 6 ml 25x proteaz inhibitörü stokunun 2.4 mi, 9 mi GKD 2 0 karıştırın. </li><li> Her pH koşulu pipet için 50 ml konik tüp içine ana karışımı 4.4 ml. </li><li> pH değerleri 5.8 üzerinde tüp için ilgili pH&#39;ı ayarlanmış 500 mM Tris stok çözeltisi 0.6 ml ekleyin. pH 5.8 ve daha düşük için ilgili pH&#39;ı ayarlanmış 500 mM MES, stok çözeltisi 0.6 ml ekleyin. </li><li> 5 yapmak300 mM NaCl ihtiva eden tampon çözeltisi mi, 2x proteaz inhibitörü, 60 mM Tris pH 7.4, GKD 2 O ayarlandı Bu deterjan içermeyen kontrol degrade tampon olarak görev yapacak. </li><li> Gerekirse, sırasıyla konsantre edildi HCI ve NaOH çözeltileri eklenerek pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 ve 5.0 için çözeltilerin pH ince ayarlar. </li><li> altı farklı% 25 gliserol Çözeltilerin elde edilen deterjan içeren deterjan içermeyen tampon karışımları, 5 ml% 50 gliserol stokunun 5 ml. pH indikatör şeritleri kullanarak pH değerlerini kontrol edin. Not: ölçülü bir pH istenen değerden önemli ölçüde farklıdır durumda, ilgili çözümleri tekrar hazırlanmalıdır. </li><li> 7 oranında a 3 dH 2 O ile% 50 gliserol stok karıştırılarak% 15 gliserol çözeltisi hazırlayın. </li></ol> IAV 3. Ultrasantrifüj <ol><li> 5 ml&#39;lik bir şırınga ve bir öncesine kullanılarak ultra net santrifüj tüpleri içine (13.2 mi, 14 mm x 89 mm), 3 ml% 15 gliserol solüsyonu ilavedle (9 cm uzunluğunda 21 G). Bu eğim bütünlüğünü bozacağı olarak borunun iç duvarında damla bırakmayın. Altı santrifüj tüpleri test beş pH koşulları her biri için, kontrol örneği için bir toplam için tekrarlayın. </li><li> Dikkatli bir şekilde 5 ml şırınga ve uzun bir iğne kullanılarak% 15 gliserol tabakasının altında 3.4 mL% 25 gliserol çözeltisi yerleştirin. iki kat karıştırmak değil özen gösterin. ilgili pH ayarlı gliserol çözeltileri test etmek altı koşulları için tekrarlayın. NOT: Aşağıdaki adımlar için sınıf II biyogüvenlik kabini içinde çalışmak. </li><li> Yavaşça 1 mi MNT tamponu içinde seyreltilmiş IAV (X31, H3N2) içeren alantoik akışkan açıklık 30 ul gliserol gradyanlar Bindirme her gradient (20-30 ug toplam viral proteinin karşılık gelir). </li><li> Denge tüpleri karşı ve SW41 Ultrasantrifügasyon rotor içine koyun. 55.000 x g&#39;de 150 dakika, ve 12 ° C santrifüj. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, dikkatli bir şekildeTemiz bir Pasteur pipeti ve bir aspiratör kullanarak süpernatant, yani hem gliserol katmanlarını kaldırmak. 40 ul (1 x), LDS numune tamponu indirgeyici olmayan pelletini. Tamamen pelet çözülür aşağı birkaç kez pipetleyin ve önemlidir. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine örnek aktarmak. </li></ol> Topak bölümleri ve Coomassie boyama 4. SDS-PAGE <ol><li> 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de, tüm numuneler ısıtın. bu, SDS-PAGE ile analiz edilinceye kadar, bu noktada numune -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Yük bir prekast gradyanı (% 4-12) üzerinde eritildi pellet 20 ul Bis-Tris Mini jeli ve çalışan tampon 1x MOPS SDS içinde 200 V de 1 saat boyunca çalışır. </li><li> GKD 2 O&#39;da% 40 metanol ve% 10 buzlu asetik asit ile sabitleme çözeltisi yapmak </li><li> 1 saat için tespit çözeltisi içinde jel inkübe ve Coomassie solüsyonu yeterli bir hacmi ile 15 cm&#39;lik bir hücre kültür kabı içinde gece boyunca hafifçe lekeOda sıcaklığında çalkalayarak. NOT: boyama çözeltisi buharlaşmasını önlemek için yemek kapatmak için önemlidir. </li><li> GKD 2 O. jel destain Jel arka plan berrak hale gelinceye kadar GKD 2 O her 15-20 dakikada bir değiştirin. Bu bant ölçümü için taranır kadar 4 ° C &#39;de GKD 2 O jel saklayın. </li><li> yüksek çözünürlükte jel tarayın ve protein bandı yoğunluklarının ölçümü için piyasada mevcut veya ısmarlama yazılımı kullanın. İlgili bantları yakın bir bölgeden arka plan sinyalini çıkartın ve (pH 7.4&#39;te) deterjan içermeyen kontrol numunelerine bu değerleri normalize. </li></ol>

<ol><li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Evolution%2C+Host+Adaptation%2C+and+Pandemic+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li>
<li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry%3A+the+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).</li>
<li>de Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+a+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).</li>
<li>Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+influenza+virus+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells.</a> J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+virus+entry+via+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Dissecting virus entry via endocytosis.</a> J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).</li>
<li>Yoshimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Cell+Entry+Mechanism+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus.</a> Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).</li>
<li>White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-fusion+activity+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane-fusion activity of influenza virus.</a> Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%3A+The+viral+matrix+protein+%28M1%29+promotes+export+and+inhibits+import%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import.</a> Cell. 67 (1), 117-130 (1991).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).</li>
<li>Chou, Y. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+Different+Influenza+Viral+RNA+Segments+in+the+Cytoplasm+before+Viral+Budding+as+Shown+by+Single-molecule+Sensitivity+FISH+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+incoming+influenza+virus+nucleocapsids+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus.</a> Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).</li>
<li>Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+M1+protein+and+low+pH+on+nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.</a> Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Controlled+Two-Step+Uncoating+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus.</a> Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).</li>
<li>Stauffer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+priming+by+acidic+pH+and+high+K%2B+is+required+for+efficient+uncoating+of+influenza+A+virus+cores+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration.</a> Journal of Virology. , (2014).</li>
<li>Zhirnov, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+matrix+protein+M1%2FM+from+virions+occurs+at+different+pH+for+orthomyxo-+and+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses.</a> Virology. 176 (1), 274-279 (1990).</li>
<li>Banerjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+uses+the+aggresome+processing+machinery+for+host+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry.</a> Science. 346 (6208), 473-477 (2014).</li>
<li>Huotari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin-3+regulates+late+endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cullin-3 regulates late endosome maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylase+8+Is+Required+for+Centrosome+Cohesion+and+Influenza+A+Virus+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).</li>
<li>Bachmayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Solubilization+of+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+from+Influenza+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses.</a> Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).</li>
<li>Reginster, M., Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Characterization+of+Influenza+Virus+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores.</a> Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).</li>
<li>Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+Investigation+on+the+Fine+Structure+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus.</a> Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).</li>
<li>Schulze, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+influenza+virus%3A+II.+A+model+based+on+the+morphology+and+composition+of+subviral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles.</a> Virology. 47 (1), 181-196 (1972).</li>
<li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+virus+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of virus uncoating.</a> Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).</li>
<li>Yamauchi, Y., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+entry+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Virus entry at a glance.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+Influenza+C+Viruses%2C+Distinct+from+That+of+Influenza+A+and+B+Viruses+Requires+Neutral-Alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH.</a> Virology. 200 (1), 284-291 (1994).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Viral kapsidler metastabil makromoleküler kompleksler bulunmaktadır. virionlar montaj virüs genomunun encapsidation ve yoğunlaşmayı gerektirir, enfeksiyon sonraki turda başlanması bu kompakt kapsid yapısının sökülmesi bağlıdır. Virüsler hücresel reseptörler, şaperonlar, proteolitik enzim, motor protein ve helikazlar yanı sıra pH ve iyonik anahtarları 26,27 tarafından sağlanan fiziksel kuvvetler de dahil olmak üzere kılıf kılıfının döngüsü kontrol etmek için çeşitli hücresel mekanizmalar yararlanmaya gelişmişt...

İnfluenza A virüsü (IAV) zarflı bir virüstür ve Ortomiksoviridae ailesine aittir. Bu genler, parça parça, negatif sens, tek iplikçikli bir RNA genomu üzerindeki kodlanır. İnsanlarda, IAV mevsimsel salgın salgınlar meydana solunum yolu enfeksiyonları, nedenleri ve küresel salgın hastalıklar 1 potansiyelini taşımaktadır. Ev sahibi hücre yüzeyi 2 sialik asit artıkları bağlanma üzerine, IAV klatrin bağlı endositoz ve klatrin bağımsız yollar 3-8 ile yerleştirilebilir. Endositik vakuollerde asidik ortam (pH &lt;5.5), viral füzyonu ve geç endosomal zarı 9 sonuçlanır IAV başak glikoprotein hemaglutinin (HA), büyük bir yapısal değişim tetikler. Site o - IAV kapsid kez geç endosomes (LES), bu çekirdeğin içine viral ribonükleoproteinlerin (vRNPs) taşınması ve ardından sitozolde kaplanmamış olan kaçan (burada da viral &quot;çekirdek&quot; olarak anılacaktır)f virüs replikasyonu ve transkripsiyonu 10-13. HA asit aktivasyonu öncesinde virüs ileride bunun demontajı 14-16 çekirdek hazırlar endositik sistemi, pH tedrici bir azalma yaşar. Bu &quot;priming&quot; proton ve K +10,14,16 akını aracılık viral membran M2 iyon kanallarını adım. Virüs iç iyonik konsantrasyon değişim etkileşimleri, viral matriks protein M1 ve sekiz vRNP demet tarafından inşa rahatsız ve membran füzyon 10,14-17 aşağıdaki sitoplazmada IAV olmama kolaylaştırır. hazırlama aşamasında doğrudan ve kantitatif analiz endozomlar deneysel ulaşılması zor olduğu gerçeği engel olmuştur. giriş süreci, dahası, son derece olmayan eşzamanlı olduğunu. Buna ek olarak, bu tür serbest viral RNA veya enfekte ölçümlerinin QRT-PCR gibi son nokta tahlilleri, viral capsi biyokimyasal durumu hakkında detaylı bir resmini sağlamazgiriş herhangi bir aşamasında, d. SiRNA veya ilaç tedavisi ile endozomlardan pertürbasyon anlamlı IAV girişi 18-20 anlayışına katkıda bulunurken, ince ayar sıkı kontrol endosome olgunlaşma programında belirsiz yan etkileri zor ve eğilimli. Bu sorunları önlemek için, hız gradyanı ile santrifüjleme 17 kullanımına dayanmaktadır, daha önce geliştirilmiş in vitro protokol adapte edilmiştir. Çoğunlukla proteolitik bölünme EM analizi ile izlenmiştir deterjan muamelesi kombinasyonları dayanmaktadır diğer girişimlerde 21,22, 23,24, aksine, bu yaklaşım kolayca ölçülebilir bir sonuç sağladı. Farklı gradyan katmanları üzerinden Santrifüj çöktürülmesi parçacıklar maruz bırakılmış ve kontrollü bir şekilde değişen koşullara reaksiyona sağlar. Sunulan protokol olarak, IAV açıklık allantoik akışkan ya da saflaştınlmış viral parçacıkların elde edilen iki tabakalı bir gliserine çöktürülürgradyan olup, buradaki alt tabaka, iyonik olmayan bir deterjan NP-40 (Şekil 1) içerir. Virüs, ikinci deterjan içeren katmanı girdiğinde, viral lipid zarfı ve zarf glikoproteinleri yavaşça çözülmüş ve geride bırakılır. çekirdek, sekiz vRNP demet oluşan ve bir matris tabakasıyla çevrili, pelet fraksiyonu içine kararlı bir yapı olarak çökelleri. M1 ve vRNP ilişkili nükleoprotein (NP) ve viral çekirdek proteinleri, SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile pelet içinde tespit edilebilir. Özel olarak, ticari olarak temin edilebilen gradyan jelleri yararlanarak ve son derece hassas Coomassie 25 ile boyama, yüksek hassasiyet ve viral çekirdek ilişkili proteinlerin küçük miktarlarda bile tespitini sağlar. Bu pH, tuz konsantrasyonu ve varsayılan kılıfının faktörler temel bileşenleri ve çekirdek stabil ve sedimantasyon davranışları üzerindeki etkileri gibi farklı koşullar olup olmadığını test etmek için temel ayarlar<html> Sığ. Bu amaç için, gliserol geçişi olarak sadece düşük, deterjan içeren katman faktörü ya da ilgi duyulan durum girerek modifiye edilir. Teknik IAV çekirdek 16 bütünlüğüne pH değerleri ve tuz konsantrasyonları farklı etkisini araştıran özellikle değerli olmuştur. IAV olmama arasında ara adımlar pH 5.5 ve daha düşük 16,17 (Şekil 1) vRNP ayrışma ardından hafif asidik pH&#39;ta (&lt;6.5) matris tabakasının dahil olmak üzere ayrılmasını takip edilebilir. Ikinci adım geç endositik ortamı 16 yansıtan gliserol tabakasında yüksek K + konsantrasyonu varlığında tarafından geliştirilmiştir. Virüs ve çekirdek degrade ile tortulaşmış Böylece, onlar bir değişen ortam endosemelerde taklit koşullar yaşadı. Sonuç hücre biyolojisi deneyleri türetilen sonuçları tamamlayan, in vitro viral çekirdek kademeli sökme oldu. t &quot;&gt; Burada sunulan yöntem, hızlı etkin ve IAV son derece tekrarlanabilir analiz etti (X31 ve A / KAA / 33) ve IBV (B Lee / 40 /) asidik pH ile tetiklenir ve demontaj yanı sıra K +16,17 artan olmama Bu düşünülebilir alkali pH maruz 17 üzerine paramiksovirüs çekirdeklerin. yaklaşım hücre girişi sırasında viral kapsid yapısı ve kapsid sökme biyokimyasal özellikleri içgörü kazanmak için diğer zarflı virüsler adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>cOmplete&trade;, EDTA içermeyen proteaz inhibitör tabletleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11873580001</td><td>Stok çözeltisi 2 ila 8 ° C'de saklanabilir; 1 ila 2 hafta boyunca C</td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Merck Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol susuz BioChemica</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Merck Millipore</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Uzun enjeksiyon iğnesi (21 & nbsp; G, 9 cm, eğim veya kör uçlu)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>Şimdi ticari olarak IGEPAL&reg olarak mevcuttur; CA-630</td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris mini jeller, 10&nbsp; kuyular, 1.0 mm</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS numune tamponu (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS çalışan tampon (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>pH indikatör şeritleri, pH 4.0-7.0</td><td>Merck Millipore</td><td>109542</td><td></td></tr><tr><td>QC Kolloidal Coomassie Lekesi</td><td>BIO RAD</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Merck Millipore</td><td>106406</td><td></td></tr><tr><td>Sodyumhidroksit</td><td>Merck Millipore</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Steritop filtre ünitesi</td><td>Merck Millipore SCGPT05RE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti, ultrasantrifüj rotor seti</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>İnce duvar, Ultra şeffaf santrifüj tüpleri, 13.2 & nbsp; ml, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris hidroklorür&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td></td></tr><tr><td>X31 İnfluenza A virüsü (H3N2), yumurtada yetiştirilen, arıtılmış allantoik sıvı</td><td>Virapur</td><td></td><td>4 &° C'de taze çözülmüş; Ç</td></tr></tbody></table>

gradient santrifüj tarafından İnfluenza a virüsü kapsidlerin vitro demontaj içinde

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Asitle tetiklenen moleküler süreçler, endositik sistemden giren birçok virüsün hücre girişini yakından kontrol eder. İnfluenza A virüsü (IAV) durumunda, endozomal membran ile virüs füzyonu ve ardından viral kapsidin soyulma adı verilen sökülmesi, endositik veziküller içindeki iyonik koşullar tarafından yönetilir. Virüs yaşam döngüsündeki erken adımların incelenmesi zordur, çünkü endozomlara deneysel olarak doğrudan erişilemez ve bu da in vitro bir yaklaşıma ihtiyaç yaratır. Burada, IAV çekirdeğinin ve stabilitesinin analizini sağlayan iki katmanlı bir gliserol gradyanı yoluyla saflaştırılmış virionların hız gradyanı santrifüjlenmesine dayanan bir yöntemi açıklıyoruz. Gradyan, virüs dibe doğru çökelirken çözündürme yoluyla viral zarı çıkarmak için alt katmanında iyonik olmayan bir deterjan (NP-40) içerir. Nötr pH'ta, viral çekirdekler stabil yapılar olarak peletlenir. Ana çekirdek bileşenler, matris proteini (M1) ve viral ribonükleoproteinler (vRNP'ler), SDS-PAGE ile pelet fraksiyonunda açıkça tanımlanabilir. Alt katmanda pH'ın 6.0 veya daha düşük bir seviyeye düşürülmesi, M1'i peletten seçici olarak uzaklaştırır ve ardından daha asidik koşullarda vRNP'lerin salınması gelir. Coomassie ile boyanmış jeller üzerindeki viral protein bantları, IAV demontajının ara durumlarını izlemek için dansitometrik kantifikasyona tabi tutulabilir. PH'ın yanı sıra, tuz konsantrasyonu ve varsayılan viral kaplama açma faktörleri gibi viral çekirdek stabilitesini etkileyen diğer faktörler, deterjan içeren gliserol tabakasının buna göre modifiye edilmesiyle değerlendirilebilir. Birlikte ele alındığında, sunulan teknik, in vitro viral kaplamanın yüksek oranda tekrarlanabilir ve kantitatif analizine izin verir. Karmaşık kaplama açma işlemlerinden geçen diğer zarflı virüslere uygulanabilir.

Daha önce tartışıldığı gibi, endosemelerde priming yetkili olmama IAV çekirdeğini oluşturmak için gereklidir. çekirdeğin protonlanma M1 ve vRNPs etkileşimini zayıflatır (viral RNA, NP oluşan ve polimeraz kompleksi PB1 / PB2 / PA). Gelen virüsü erken endozomlarda (AİS) 6.5 (veya daha düşük) bir pH değerine maruz kalmış ve LES yaklaşık pH 5.0&#39;a virüs sigorta kadar devam eder, bu işlem başlatılır. pH düşmesi taklit etmek amac...

Virüsün konak hücrelere girişi sırasında influenza A virüs çekirdeklerinin sökülmesi çok adımlı bir işlemdir. Viral kaplamanın erken aşamalarını analiz etmek için bir in vitro yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımda, tanımlanmış koşullar altında kaplamayı başlatan adımları biyokimyasal olarak incelemek için hız gradyan santrifüjlemesi kullanılır.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Bu hız gradyanı santrifügasyonunun genel amacı, influenza A virüs kapsidlerini, hücreye giriş sırasında gelen virüslerin karşılaştığı endositik ortama benzer koşullar altında analiz etmektir. Bu yöntem, hafif asidik pH'ın kapsid stabilitesi üzerindeki spesifik etkisi gibi, influenza A virüs kapsidlerinin hücreye giriş sırasında nasıl parçalandığına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, influenza A virüsü paket açma sürecinin tanımlanmış deneysel koşullar altında kantitatif analizine olanak tanımasıdır.İnfluenza A virüsünün kılıf açılmasının nasıl başladığına dair içgörüler sağlamanın yanı sıra, bu yöntem benzer kılıf açılma mekanizmalarına sahip diğer zarflı virüslerin çalışılmasına da uygulanabilir. Prosedür, laboratuvarımdaki eski bir öğrencim olan Firat Nebloglu tarafından gösterilecektir. Stok tamponlar ve reaktifler metin protokolüne göre hazırlandıktan sonra, test edilecek her pH koşulu için dokuz mililitre 1 Molar sodyum klorür, altı mililitre %10 NP40, 2,4 mililitre 25X proteaz inhibitörü stoğu ve dokuz mililitre çift distile suyu karıştırarak deterjan tamponu master mix'ini hazırlayın.Ardından, her pH koşulu için 50 mililitrelik konik tüpe 4,4 mililitre master mix pipetleyin. 5,8'in üzerindeki pH değerleri için tüpe ilgili pH-ayarlı 500 milliMolar Tris stok çözeltisinden 0,6 mililitre ekleyin. 5,8 ve altındaki pH değerleri için ise ilgili pH-ayarlı 500 milliMolar MES stok çözeltisinden 0,6 mililitre ekleyin.300 milliMolar sodyum klorür, 2X proteaz inhibitörü, pH 7.4'e ayarlanmış 60 milliMolar Tris ve çift distile su içeren beş mililitre tampon çözelti hazırlayın. Bu çözelti, deterjan içermeyen kontrol gradyan tamponu olarak kullanılacaktır. Ardından, beş mililitre %50 gliserol stok çözeltiyi, deterjan içeren ve deterjan içermeyen tampon karışımlarının beşer mililitresine ekleyerek toplam altı farklı %25 gliserol çözeltisi elde edin.pH değerlerini doğrulamak için pH şeritleri kullanın. %50'lik gliserol stokunu distile su ile üçte yedi oranında karıştırarak %15'lik gliserol çözeltisi hazırlayın. Beş mililitrelik bir şırınga ve iğne kullanarak, altı adet ultraclear santrifüj tüpüne üçer mililitre %15'lik gliserol çözeltisi ekleyin.Her adımdan sonra iğneyi çift distile su ile yıkayın. İki tabakanın karışmamasına dikkat ederek, %15 gliserol tabakasının altına 3,4 mililitre %25 gliserol çözeltisini dikkatlice enjekte etmek için beş mililitrelik bir şırınga ve uzun bir iğne kullanın. Her iki tabaka arasındaki ara yüzeyle net bir şekilde görülmektedir.Sırasıyla pH'ı ayarlanmış gliserol çözeltileriyle test edilecek olan altı koşulun tamamı için bu işlemi tekrarlayın. Ardından, Sınıf II biyogüvenlik kabininde, influenza A virüsü içeren bir mililitre berraklaştırılmış, seyreltilmiş allantoik sıvıyı gliserol gradyanlarının üzerine nazikçe ekleyin. Tüpleri rotor kovalarına aktarın, karşıt tüpleri dengeleyin ve dikkatlice önceden soğutulmuş bir SW-41 ultrasentrifüj rotoruna yerleştirin.2100 rpm'de ve 12 °C'de 150 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, her iki gliserol tabakasını da dikkatlice uzaklaştırmak için temiz bir Pasteur pipeti ve bir aspiratör kullanın. Ardından, 40 mL 1X indirgen olmayan LDS örnek tamponu ile, örneği 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmadan önce pipetle aşağı yukarı çekerek peleti tamamen resüspande edin.SDS-PAGE gerçekleştirmek için tüm numuneleri 95 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Çözünmüş peletlerin 20 µL'sini ön dökümlü gradyan Bis-Tris mini-jele yükleyin ve 1X MOPS SDS çalıştırma tamponu içerisinde 200 Volt'ta bir saat boyunca çalıştırın. Jeli bir saat boyunca tespit çözeltisinde inkübe edin.Bir ila iki kez suyla durulayın ve oda sıcaklığında nazikçe sallayarak, yeterli hacimde kolloidal Coomassie çözeltisi içeren 15 santimetre çapında bir hücre kültürü kabında gece boyunca boyayın. Jel arka planı berraklaşana kadar sıvıyı her 15 ila 20 dakikada bir yenileyerek jeli çift distile suda boyasızlaştırın. Bant kantifikasyonu için taranana kadar jeli dört derece santigrat sıcaklıkta çift distile su içinde saklayın.Son olarak, jeli yüksek çözünürlükte tarayın ve protein bant yoğunluklarının miktar tayini için ticari olarak mevcut özel yazılımları kullanın. İlgili bantlara yakın bir bölgeden gelen arka plan sinyalini çıkarın ve değerleri deterjan içermeyen kontrol değerlerine göre normalize edin. Bu deneyde, berraklaştırılmış allantoik sıvıdan türetilen X31, 7.4 ile 5.0 arasındaki pH seviyelerinde hız gradyanlı santrifüjasyona tabi tutulmuş ve SDS-PAGE ile analiz edilmiştir.Gradyanda deterjan bulunmadığında, Coomassie ile boyanmış jelde HA, NP ve M1'i temsil eden karakteristik bant deseniyle görüldüğü üzere, sağlam viryonlar çöktürülür. Alt gliserol tabakasına NP40 eklendiğinde, HA, NA ve M2'yi içeren viral zar çözülmüş ve ultrasantrifügasyon sırasında yalnızca viral çekirdek pellet kısmına çökmüştür. 6.5'in altındaki bir pH değerinden başlayarak, M1 kademeli olarak pellet fraksiyonundan kaybolur ve pH 5.8 ile pH 5.4 arasında minimum seviyeye ulaşır.pH 5,8'in altında, vRNP'ler ayrışmış ve dolayısıyla peletten kaybolmuştur. Analiz edilen protein bantlarından, M1 tabakasının sökülmesi ve vRNP demetlerinin ayrışması için sırasıyla pH 6,5 ve pH 5,8 olmak üzere iki belirgin pH eşiği ortaya çıkmıştır. Bu prosedürü uygularken, belirli influenza A virüsü suşuna veya mutantına bağlı olarak farklı sökülme özelliklerinin gözlemlenebileceğini unutmamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, izole edilmiş influenza virüsü kapsidlerinin yapısı gibi ek bilgiler edinmek amacıyla elektron mikroskopisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

in-vitro-disassembly-influenza-virus-capsids-gradient

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Influenza A virüsünün genomu sekiz ayrı kompleksleri, RNA ve protein olarak adlandırılan viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) oluşur. Bu yazıda, gliserol degrade arıtma ve influenza A vRNPs transmisyon elektron mikroskobu görselleştirme açıklamaktadır.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

Biz enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirus nucleocapsid DNA izole süreci tanımlamak. Çözüm yakalanan son DNA ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonlar, ve yeni virüs rekombinantlar üretmek için transfections için uygun, yüksek konsantrasyon ve saflık.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Uncoating HIV-1 yaşam döngüsünün ilk aşamasında önemli bir adım ve kapsid kabuk sökülmesi ve viral ribonükleoprotein kompleksi (vRNP) serbest bırakılması olarak tanımlanır. Burada, HIV-1 virionlar sağlam çekirdek tecrit ve bunların uncoating ölçülmesi için teknikleri...

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

Ile bitki hücreleri için birden fazla viral bileşenlerinin teslim senkronize etmek için basit, verimli ve sağlam bir...

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro</emVirüs Meclisi Öğrenmenin> Yaklaşım

Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Source: Stauffer, S. et al. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the pH-dependent disassembly of influenza A virus (IAV) cores using gradient ultracentrifugation. It outlines glycerol gradient preparation, ultracentrifugation, and how different pH conditions affect IAV core disassembly.

In Vitro Disassembly of the Influenza A Virus Core Using pH-Controlled Gradient Centrifugation

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Visualizing the Effect of pH on Solubilization of the Influenza A Viral Core

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Rekombinant retroviral integrase ve DNA reaksiyonlar viral DNA uçları taklit eden bir intasome bilinen bir enzimatik etkin kompleks oluşabilir. Intasomes biyokimyasal, yapısal ve Kinetik çalışmalar için kullanılır. Bu protokolü nasıl bir araya getiren ve prototip köpüklü virüs intasomes arındırmak ayrıntılı.

Derleme ve prototip köpüklü virüs Intasomes arıtma

Adeno ilişkili virüs, süspansiyon hücre kültüründe üretilir ve çift iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile saflaştırılır. Toplam virüs verimini artırmak, virüs çökelme riskini azaltmak ve nihai virüs ürününü daha da konsantre etmek için adımlar dahil edilmiştir. Beklenen nihai titreler 1012 viral partikül/mL'ye ulaşır ve klinik öncesi in vivo kullanım için uygundur.

İn Vivo Uygulamalar için İodiksanol Yoğunluk Gradyan Santrifüjü ile Adeno İlişkili Virüsün Süspansiyon Kültürü Üretimi ve Saflaştırılması

Gen terapisi alanı gelişmeye devam ettikçe, bu zorlukların üstesinden gelebilecek yenilikçi yöntemlere artan bir ihtiyaç var. Burada, in vivo çalışmalar için kalite standartlarını karşılayan, bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran benzersiz bir yöntem sunulmaktadır.

Bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek titre, yüksek kaliteli adeno-ilişkili virüs vektörleri oluşturmak için kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış bir prosedür

Öğrenin, hız gradyanı santrifüjasyonu kullanarak Influenza A virüsü kapsidlerinin endozomik ortamda demontajını analiz etmeyi. Bu yöntem, pH etkilerini nicel olarak değerlendirerek viral kılıf açılma mekanizmalarını araştırmaya olanak tanır.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Daha fazla video keşfet