Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Bu hız gradyanlı santrifüjlemenin genel amacı, gelen virüslerin hücre girişi sırasında karşılaştıkları endositik ortamı taklit eden koşullar altında influenza A virüsü kapsidlerini analiz etmektir. Bu yöntem, hafif asidik pH'ın kapsid stabilitesi üzerindeki spesifik etkisi gibi, influenza A virüsü kapsidlerinin hücre girişi sırasında nasıl parçalandığına dair önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tanımlanmış deneysel koşullar altında influenza A virüsü soyma işleminin kantitatif analizini mümkün kılmasıdır.

yöntem, influenza A virüsünün soyulmasının nasıl başlatıldığına dair içgörüler sağlamanın yanı sıra, ilgili kılıf açma mekanizmalarına sahip diğer zarf virüslerinin incelenmesine de uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan eski bir öğrenci olan Fırat Nebloglu olacak. Metin protokolüne göre stok tamponlarını ve reaktifleri hazırladıktan sonra, test edilecek her pH koşulu için, dokuz mililitre bir Molar sodyum klorür, altı mililitre %10 NP40, 2,4 mililitre 25X proteaz inhibitör stoğu ve dokuz mililitre çift damıtılmış suyu karıştırarak deterjan tamponu ana karışımını hazırlayın.

Daha sonra her pH koşulu için, ana karışımın 4,4 mililitresini 50 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin. 5.8'in üzerindeki pH değerleri için, tüpe ilgili pH ayarlı 500 miliMolar Tris stok çözeltisinden 0.6 mililitre ekleyin. 5.8 ve daha düşük pH değerleri için, ilgili pH ayarlı 500 miliMolar MES stok çözeltisinden 0.6 mililitre ekleyin.

300 miliMolar sodyum klorür, 2X proteaz inhibitörü, 60 miliMolar Tris, pH 7.4'e ayarlanmış ve çift damıtılmış su içeren beş mililitre tampon çözeltisi yapın. Bu, deterjan içermeyen kontrol gradyan tamponu görevi görecektir. Daha sonra, beş mililitre deterjan içeren ve deterjan içermeyen tampon karışımlarına beş mililitre %50 gliserol stoğu ekleyin ve altı farklı %25 gliserol çözeltisi elde edin.

pH değerlerini doğrulamak için pH şeritleri kullanın. %50 gliserol stoğunun üç ila yedi oranını damıtılmış su ile karıştırarak %15'lik bir gliserol çözeltisi hazırlayın. Beş mililitrelik bir şırınga ve bir iğne kullanarak, altı ultra net santrifüj tüpüne üç mililitre% 15 gliserol çözeltisi ekleyin.

Her adımdan sonra iğneyi çift damıtılmış suda yıkayın. Beş mililitrelik bir şırınga ve uzun bir iğne kullanarak, 3.4 mililitre% 25 gliserol çözeltisini% 15 gliserol tabakasının altına dikkatlice enjekte edin ve iki tabakayı karıştırmamaya dikkat edin. Her iki katman arasında bir arayüz açıkça görülebilir.

İlgili pH ayarlı gliserol çözeltileri ile test etmek için altı koşulun tümü için bunu tekrarlayın. Daha sonra, Sınıf II bir biyogüvenlik kabininde, gliserol gradyanlarını nazikçe kaplamak için influenza A virüsü içeren bir mililitre arıtılmış, seyreltilmiş allantoik sıvı kullanın. Tüpleri rotor kovalarına aktarın, karşıt tüpleri dengeleyin ve bunları dikkatlice önceden soğutulmuş bir SW-41 ultrasantrifüj rotoruna yerleştirin.

2100 rpm'de ve 12 santigrat derecede 150 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, her iki gliserol tabakasını dikkatlice çıkarmak için temiz bir Pasteur pipeti ve bir aspiratör kullanın. Daha sonra 40 mililitre 1X indirgeyici olmayan LDS numune tamponu ile, numuneyi 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmadan önce yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti tamamen yeniden süspanse edin.

SDS-PAGE'i gerçekleştirmek için tüm numuneleri 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. 20 mikrolitre çözünmüş peletleri prekast gradyan Bis-Tris mini jel üzerine yükleyin ve 1X MOPS SDS çalışma tamponunda bir saat boyunca 200 Volt'ta çalıştırın. Jeli bir saat boyunca fiksasyon çözeltisinde inkübe edin.

Bir ila iki kez suyla durulayın ve oda sıcaklığında hafifçe çalkalarken yeterli hacimde kolloidal Coomassie çözeltisi ile 15 santimetrelik bir hücre kültürü kabında gece boyunca boyayın. Jeli iki kez damıtılmış suda lekeleyin ve jel arka planı berraklaşana kadar sıvıyı her 15 ila 20 dakikada bir değiştirin. Jeli, bant ölçümü için taranana kadar dört santigrat derecede iki kez damıtılmış suda saklayın.

En sonunda, jeli yüksek çözünürlükte tarayın ve protein bandı yoğunluklarının miktarını belirlemek için ticari olarak temin edilebilen özel yapım yazılımı kullanın. Arka plan sinyalini ilgili bantlara yakın bir bölgeden çıkarın ve değerleri deterjan içermeyen kontrol değerlerine normalleştirin. Bu deneyde, arıtılmış allantoik sıvıdan türetilen X31, 7.4 ile 5.0 arasındaki pH seviyelerinde hız gradyan santrifüjlemeye tabi tutuldu ve SDS-PAGE ile analiz edildi.

Degradede deterjan bulunmadan, bozulmamış virionlar, Coomassie lekeli jeldeki HA, NP ve M1'i temsil eden bantların karakteristik modeli tarafından yansıtıldığı gibi peletlenir. Alt gliserol tabakasına NP40 eklendikten sonra, HA, NA ve M2 dahil olmak üzere viral zarf çözündürüldü ve tek başına viral çekirdek ultrasantrifüjleme sırasında peletin içine çökeltildi. 6,5'in altındaki bir pH'tan başlayarak, M1 pelet fraksiyonundan kademeli olarak kaybolur ve pH 5,8 ile pH 5,4 arasında minimuma ulaşır.

PH 5.8'in altında, vRNP'ler ayrıştı ve böylece peletten kayboldu. Analiz edilen protein bantlarından, sırasıyla pH 6.5 ve pH 5.8 dahil olmak üzere M1 tabakasının sökülmesi ve vRNP demetlerinin ayrışması için iki farklı pH eşiği ortaya çıkarıldı. Bu prosedürü denerken, belirli influenza A virüsü suşuna veya mutantına bağlı olarak, farklı sökme özelliklerinin gözlenebileceğini hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, izole influenza virüsü kapsidlerinin yapısı gibi ek bilgiler elde etmek için elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.