Name: İletken Airways Desenlendirme sırasında Wnt Sinyalizasyonu incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Keşfedin Wnt sinyalizasyonunun trakea gelişimindeki rolünü, genetik olarak modifiye edilmiş fare modelleri ve boyama teknikleri kullanarak. Bu yöntemler solunum yolu desenlenmesini ve kıkırdak oluşumunu incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz histolojik prosedürleri ile Mike Muntifering ve konfokal görüntüleme ile Matt Kofron ve Gail Macke yardım kabul. Bu çalışma kısmen Sağlık-NHLBI National Institutes (DS K01HL115447) tarafından desteklenmiştir.

Hayvanlar patojenden bağımsız koşullarda barındırıldı. Fareler CCHMC Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Cincinnati, OH ABD) tarafından onaylanan protokollere göre ele alınmıştır. Bu çalışmaları boyunca kullanılan fareler karışık arka muhafaza edilmiştir. 1. Tüm Dağı X-galaktosidaz Boyama <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla, E14.5 için E11.5 hamile kadın euthanize. CO 2 odasında hayvan yerleştirin CO 2 ile odasını şarj edin. 5 dakika, en az odası içinde hayvanları korumak. servikal dislokasyon ile ötenazi ikincil yöntemi gerçekleştirmek. </li><li> etanol (EtOH)% 70 ve tek bir karın orta hat kesi ile laparotomi gerçekleştirmek Temiz karın bölgesi. cerrahi makas ve standart desen (düz serrat) forseps yararlanın. </li><li> petri koyun hemen forseps ve ince makas kullanılarak rahim boynuzları izole etmek ve doku PBS solüsyonu soğutulmuş içeren. Devam kadar buz üzerinde doku korumakembriyoların izolasyonu. </li><li> rahim boynuzları embriyolar izole edin. diseksiyon mikroskobu kullanılarak embriyonik trakea, akciğer dokusunun parçalara ayır. Tutun ve rahim dokusu delinme ve embriyoları serbest concepti için ince uçlu forseps ve makas yararlanın. <ol><li> embriyonik membranlar kalan çıkarın. embriyoların iğne bıçaklarının yardımı kesti baş ve diyaframın altında alt vücut kısmı ile. bir dönüm noktası olarak karaciğer bulun. </li><li> Embriyonun göğüs bölgesinde izole edildikten sonra, vücut duvarı, omurga ve kalp kullanarak iğne bıçakların yan yüzüne çıkarmak için devam edin. trakeal doku yaralanmasını önlemek için kalbi çıkarırken özen gösterin. Son olarak, dikkatli bir şekilde, iğne kanatlarının yardımıyla yemek borusu çekerek trakeadan yemek borusu ayırın. Buz üzerinde PBS çözeltisi içinde doku bakımı. </li></ol></li><li> 4 ml yerleştirin doku cam veya transfer pipet kullanarak vida kapaklı küçük şişelerden. 30 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) trakeal akciğer dokusunun düzeltildi. Tespit edildikten sonra,PBS ile doku durulayın. Durulama sırasında, X-gal ile boyama çözeltisi (5 mM K3Fe (CN ekleme) 6, (100 ul, 0.5 M stok), 5 mM K 4 Fe (CN) 6 (100 ul, 0.5 M stok), 2 mM MgCI2, (hazırlanması 20 ul 1 M stok),% 0.01 NaDOC (50 ul% 2 stoğu),% 0.02 NP 4 O (100 uL% 2 stoğu), 1 mg / ml X-gal (20 mg, 500 ul / ml stok) ve 9.13 mi 10 ml&#39;lik bir nihai hacim) elde etmek için su damıtıldı. </li><li> Kalan PBS çıkarın ve bir cam şişeye X-gal ile boyama çözeltisi 2 ml ekleyin. çalkalayıcıda tepsisine şişeleri yerleştirin. Leke dokular 1 X-gal ile boyama çözeltisi içinde saat ile 2. daha fazla işleme ve yerleştirilmesi için 4 saat için X-Gal çözeltisi doku inkübe edin. </li><li> % 3, dimetil sülfoksit-PBS içinde yıkama dokuları reaksiyonu durdurun. 5 dakika boyunca PBS içinde% 70 etanol içinde her bir yıkama ve mağaza 3 kez yıkayın. </li><li> bir% 1 agaroz / PBS çözeltisi ile Petri kapları doldurmak. agaroz katılaşmaya izin verin. Cam transferi pipetler kullanılarak, agaroz co doku yerleştirinPBS çözeltisi ile doldurulmuş ATED plakalar. diseksiyon mikroskobu kullanılarak tüm bağlar fotoğraf. Aydınlık için uygun filtre seçin. </li><li> Daha iyi parafine ve kesit X-gal boyama işlemi örneklerinin siteleri ayırt etmek. İnce ekran kasetlerinde yer örnekleri. <ol><li> Altı alkol değişiklikler: 5 dk ilk değişim ve kalan her değişim başına 3 dakika parafine gömme için numuneler otomatik işlemci kullanmak ve aşağıdaki gibi kısa bir döngü kurmak işlemek için. Ksilen Üç değişiklikler: 5 dk ilk değişiklik ve 3 dk sonraki iki değişiklik. Önceki adımlar 30 ° C&#39;de gerçekleştirilir. 25 dakikada, 8 dakika ve 5 dakika: Son olarak, 62 ° C &#39;de parafin üç değişiklikler yapar. </li></ol></li><li> Doku tekne gömme altındaki düz yalan ile gömme Orient örnekleri. Dikkatle gömme tekne doldurmak için parafin ekleyin. parafin katılaşır kadar istasyon gömme soğuk plaka üzerinde hemen soğutun. Tekneyi gömme blok çıkarın. Bir mikrotom kullanılarak, 6 mikron s oluşturmakections. ön işleme tabi-slaytlar ve 1 saat 42 ° C&#39;de sıcak slayt sette kuru slaytlar Mount bölümleri. </li><li> Fırında 56 ºC fırında gecede slaytlar. raflara slaytlar yerleştirin. Deparaffinize% 100 Ksilen üç değişiklikler, 10 dakika her slaytlar. Ksilen, 200 ml dolu yemekler boyama kullanın. </li><li> 10 ila 30 saniye boyunca nükleer hızlı kırmızı ile karşıt önce PBS&#39;de için kademeli EtOH serisi (% 100,% 70,% 50 ve% 30, adım başına 1 dakika) kullanılarak slaytlar rehidrate. musluk suyu ile 5 dakika Nükleer Hızlı Kırmızı fazlalığını ortadan kaldırmak için her zaman üç defa slaytlar durulayın. </li><li> Ksilen merkezli montaj medya ile kayma Ksilen üç değişiklikleri yıkamadan önce bir kademeli EtOH serisinde slaytlar (% 50,% 70 ve% 100 EtOH) (20 dips her değişiklik) ve kapağı kurutmak. </li></ol> 2. Lektin Boyama <ol><li> adım 1.4 1.1 de tarif edildiği gibi E 13.5 ve E14.5 trakeal akciğer dokusunun teşrih. vidalı kapaklı şişeleri cam transferi pipetler yer dokusunu kullanarak. 2 ml ile trakea akciğer dokusunun Fix4 ° C&#39;de bir gece% 2 PFA çözeltisi. Tespit edildikten sonra, PBS içinde 10 dakika her bir yıkama için üç kez numune yıkayın. </li><li> tampon çözelti 10 ml, genellikle bir son hacim bloke hazırlayın. PBS 8 ml BSA (% 1) 0.1 g ekleyin. BSA çözmek için izin verin. keçi serumu (% 2), Triton X-100 (% 0.3) ve 0.03 ml 0.2 ml ilave edilir. PBS ile 10 ml nihai hacme getirmek. Oda sıcaklığında 0,5 blokaj tampon çözeltisi ml 1 saat blok örnekleri. </li><li> Bir transfer pipeti kullanarak Bloklama tamponunu çıkarın ve lektin 50 ug / ml,% 10 keçi serumu ve PBS oluşan lektin çözeltisi ile değiştirin. örnek başına lektin çözeltisi 250 ul kullanın. 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. alüminyum folyo ile doku içeren cam şişe kapağı emin olun. Lektin çözeltisi ile inkübe edildikten sonra, 10 dakika boyunca PBS içinde üç kez örnekleri yıkayın. </li><li> örnekleri karşılamak için yeterli PBS içeren agaroz kaplı petri kaplarına yerleştirin eksplantlar. Bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak tüm bağlar fotoğraf. approp seçinyaklaşımlarına yön filtre floresan algılamak için. Lektin PNA genellikle GFP kuple edilir. </li></ol> 3. Tüm Dağı İmmünofloresan Boyama ve Konfokal Mikroskop <ol><li> 4 ml&#39;lik cam vidalı kapaklı şişeleri transfer ve% 4 PFA gecede düzeltmek, trakea, akciğer dokusu izole edin. E11.5 dokusu% 2 PFA sabitlenebilir. metanol içinde saklayın% 100. Numuneler -20 ° C&#39;de birkaç ay kadar saklanabilir. </li><li> Transfer pipeti kullanarak, metanolün çıkması ve 2 saat Dent Bleach (4 kısım metanol, 1 kısım DMSO ve 1 kısım% 30 H2O 2) kullanarak örnekleri geçirgenliği. şu şekilde PBS içinde seyreltilmiş metanol kademeli dizi Hidrat doku:% 100 metanol,% 75 metanol,% 50 metanol,% 25 metanol,% 100 PBS ile yıkandı. Hidrasyon her aşamasında oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkalayın. </li><li> PBS içinde seyreltilmiş,% 0.5 bloke edici reaktif engelleme doku çalkalanarak oda sıcaklığında iki saat boyunca (ayrıntılar için Materyaller bakınız). </li><li> engelleme birincil antikor seyreltinçözeltisi (SOX9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) ve 4 ° C&#39;de bir gece örnekleri inkübe edin. oda sıcaklığında PBS beş defa yıkayın örnekler. 1 saat süre ile, her yıkama yapın. </li><li> % 0.5 bloke edici çözelti içinde 500 oranında seyreltilmiş bir 1: ikincil antikor uygulayın. Dikkatle ikincil antikorlar arasında bağlayıcı önlemek için sekonder antikor seçin. karanlık bir odada 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. Yıkama numuneler, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca üç kez. şu şekilde PBS içinde seyreltilmiş metanol kademeli dizi örnekleri kurutmak:% 25 metanol,% 50 metanol% 75 metanol,% 100 metanol, 10 dakika, her bir adım. NOT: Numuneler alüminyum folyo ile kaplanmış kalır emin olun ve ışığa maruz kalmasını en aza indirmek. fotoğraflandı kadar doku Birkaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Aktarım örnekleri özel Murray&#39;in berrak çözelti yaklaşık 200 ul 19,20 (2 parça Benzil benzoat, 1 kısım Benzil alkol) hemen bef ile metanol ve net çıkarmak, sahne plakaları yapılan içincevher görüntüleme. konfokal mikroskop kullanılarak fotoğraflamak. Süreç ve görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüyü analiz. </li></ol> 4. Hücre Çoğalması <ol><li> Vücut ağırlığının 100 ug BrdU / g bir konsantrasyonda BrdU çözeltisi ile intraperitoneal olarak E11.5 hamile farelere enjekte edilir. E12.5 veya E13.5 embriyolar protokolünün 1. bölümünde anlatıldığı ve izole olarak kadın Kurban. Bıçak bıçakları, tüketim başkanları ve göğüs boşluğu altında vücudun alt kısmını kullanarak. </li><li> 4 ml vida kapaklı küçük şişelerden torasik doku yerleştirin ve bir gecede% 4 PFA 1 ml düzeltmek. % 30,% 50 ve% 70 etanol, 5 dakika her adım için: yıkama 5 dakika boyunca PBS ile iki kez numune aşağıdaki şekilde% 70 etanol için distile su içinde seyreltildi, bir etanol dizi örnekleri dihidrat. <ol><li> orta boy ekran kasetlerde yer örnekleri. kullanılarak parafine ve otomatik işlemci için işlem dokusu. 8 dakika için alkol altı tazelenmiş her biri 6 dakika her biri üç Cı ksilen üç değişiklikleri aşağıdaki gibidir: bir döngü ayarlama25 dakikada, 9 dakika ve 8 dakika için parafin Hanges. </li></ol></li><li> 1 saat boyunca 42 ° C&#39;de sıcak slayt grubu üzerinde kaymasına uymak için doku örneklerinin bölüm 1. bölümlerde tarif edildiği gibi 6 um enine ya da uzunlamasına bölümleri oluşturmak ve izin vermek için arzu edilen pozisyonda doku yönlendirme parafine yerleştirme. </li><li> Fırında slaytlar, bunların iki tarafta, bir gece boyunca 56 ° C&#39;de bir fırında. plastik raflara slaytlar yerleştirin. % 100 Ksilen üç değişiklikler, değişiklik başına 10 dakika batırılarak De-paraffinize slaytlar. tamamen slaytları batırmak için Ksilen 200 ml kullanın. PBS (5 dakika) kademeli EtOH serisi (% 100,% 70,% 50 ve% 30, çalkalama ile adım başına 5 dakika) kullanılarak slaytlar rehidrate. </li><li> 0.1 M sitrik asit, 18 ml monohidre sitrat tampon karışımı, 100 ml 0.1 M sodyum sitrat 82 ml hazırlamak için, 10 mM sitrat tamponu, pH 6 kullanılarak antijen alımı gerçekleştirmek. <ol><li> yüksek güçte 6.5 dakika boyunca antijen alma çözeltisi ve mikrodalga ile dolu plastik coplin kavanozlara yerleştirin örnekleri. dis ekle6 dakika boyunca 40% güçte buharlaştınldı-sitrat tamponu ve tekrar ısıtma telafi etmek için Coplin kavanoza su sürülmüş. </li><li> su ile üst ve 6 dakika 40% güçte daha yeniden ısıtmak için Coplin kavanoza doldurun. Mikrodalga süreleri, kullanılan mikrodalga göre değişebilir. </li><li> kayar parçalar 5 dakika boyunca PBS, ardından 1 dakika için damıtılmış su içinde yıkanması slaytlar önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca soğumaya bırakın. PBS sonra TBS içeren çözelti (Tris baz 2.425 g, 1 damıtılmış su L ile seyreltilmiş NaCI 8,765 g),% 10 eşek serumu ve% 1 BSA bloke 2 saat blok slaytlar yıkayın. </li></ol></li><li> çözeltisi (% 10 eşek serumu ve% 1 BSA ihtiva eden TBS) bloke seyreltilmiş primer antikor ekleyin. BrdU (mitoz işaretleyici), Nkx2.1 (solunum yolu epitel), SOX9 ve αSMA (düz kas hücreleri) (hücreler kıkırdak yol verecektir). 4 ° C&#39;de, gece boyunca slaytlar inkübe edin. antikorları korumak için bindirme yöntemi kullanın. bir conta antikor 180 ul uygulayın ve ardından kapak kayma sanki slayt eklemekping. </li><li> damıtılmış su içine slaytlar batırarak conta ayırın. conta çıkarılmasından sonra TBS,% 0.1 Tween-20 ihtiva eden altı 5 dakika yıkama yapılarak, bağlanmamış birincil antikor yıkayın. <ol><li> Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, 1: 200 arasında bir seyreltme çözeltisi engelleme seyreltilmiş sekonder antikor ile slaytlar inkübe edin. aralarında istenmeyen bağlama önlemek için dikkatli bir şekilde ikincil antikorlar seçin. % 0.1 Tween içeren TBS ile üç ila beş dakikalık bir yıkama gerçekleştirerek Bağlanmamış ikinci antikorları ayıklamak. </li><li> 5 dakika boyunca iki kez 0.1 M Tris baz slaytlar yıkanır ve 5 dakika boyunca iki kez daha sonra 0.05 M Tris baz. veya DAPI (1.5 ug / ml) olmadan montaj medyayı kullanarak coversliping ederken Slaytlar 0.05 M Tris baz bırakılabilir. Mağaza, 4 ° C slayt klasöründeki slaytlar ve alüminyum folyo ile kaplayarak klasörü ışıktan korumak. </li></ol></li><li> boyama ve fotoğraf otomatik bir floresan mikroskop kullanılarak gözünüzde canlandırın. fotoğraflanan etiketli-hücreleri ve alan başına toplam hücreleri saymak20X ve 40X toplam hücrelere çoğalan hücrelerin oranlarını belirlemek için. </li></ol>

<ol><li>Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of lung morphogenesis.</a> Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).</li>
<li>Morrisey, E. E., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+for+the+first+breath%3A+genetic+and+cellular+mechanisms+in+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development.</a> Dev Cell. 18, 8-23 (2010).</li>
<li>Fausett, S. R., Klingensmith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+the+foregut+tube%3A+developmental+origins+of+the+trachea+and+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).</li>
<li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt2%2F2b+and+beta-catenin+signaling+are+necessary+and+sufficient+to+specify+lung+progenitors+in+the+foregut%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut.</a> Dev Cell. 17, 290-298 (2009).</li>
<li>Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+promotes+respiratory+progenitor+identity+in+mouse+foregut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).</li>
<li>Cornett, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wntless+is+required+for+peripheral+lung+differentiation+and+pulmonary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development.</a> Dev Biol. 379, 38-52 (2013).</li>
<li>Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BEndodermal+Wnt+signaling+is+required+for+tracheal+cartilage+formation%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation&#34;.</a> Dev Biol. , (2015).</li>
<li>Shannon, J. M., Hyatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+interactions+in+the+developing+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung.</a> Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).</li>
<li>Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchyme+specifies+epithelial+differentiation+in+reciprocal+recombinants+of+embryonic+lung+and+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea.</a> Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+regulates+Shh+and+Fgf10+signaling+during+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development.</a> Dev Biol. 287, 86-97 (2005).</li>
<li>Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+pulmonary+Wnt5a+directs+airway+and+vascular+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis.</a> Development. 135, 1365-1376 (2008).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+FGF-WNT+gene+regulatory+network+controls+lung+mesenchyme+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development.</a> Dev Biol. 319, 426-436 (2008).</li>
<li>Shu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+acts+upstream+of+N-myc%2C+BMP4%2C+and+FGF+signaling+to+regulate+proximal-distal+patterning+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung.</a> Dev Biol. 283, 226-239 (2005).</li>
<li>Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+OpdA+in+rat+models+of+organic+phosphorus+%28OP%29+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning.</a> Toxicology. 257, (2009).</li>
<li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt2+signaling+is+necessary+and+sufficient+to+activate+the+airway+smooth+muscle+program+in+the+lung+by+regulating+myocardin%2FMrtf-B+and+Fgf10+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression.</a> Dev Biol. 356, 541-552 (2011).</li>
<li>Mucenski, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+is+required+for+specification+of+proximal%2Fdistal+cell+fate+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).</li>
<li>Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-10+induces+SP-C+and+Bmp4+and+regulates+proximal-distal+patterning+in+embryonic+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).</li>
<li>Del Moral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Ott, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+in+large+insect+brains%3A+zinc-formaldehyde+fixation+improves+synapsin+immunostaining+and+preservation+of+morphology+in+whole-mounts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts.</a> J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).</li>
<li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sox9+by+Sonic+Hedgehog+%28Shh%29+is+essential+for+patterning+and+formation+of+tracheal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage.</a> Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).</li>
<li>Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+18+gives+growth+and+directional+cues+to+airway+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage.</a> Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).</li>
<li>Ahnfelt-Ronne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+protein+expression+patterns+in+intact+mouse+and+chicken+embryos+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs.</a> J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+method+for+analysis+of+chondrogenesis+in+limb+mesenchyme+from+individual+transgenic+%28hdf%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos.</a> Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).</li>
<li>Cohen, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+smooth+muscle+precursor+development+in+the+mouse+lung+via+a+tenascin+C%2FPDGFR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway.</a> J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).</li>
<li>Boucherat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+functional+redundancy+between+Hoxa5+and+Hoxb5+paralog+genes+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).</li>
</ol>

&quot;Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.&quot;

Solunum yollarının morfojenezi yatan olaylar tamamen iletken solunum yollarının desen için gerekli özel işlemler anlaşılamamıştır. Daha önceki çalışmalar, gelişmekte olan eksplantlar hava-sıvı arayüz kültüre ya Matrigel 21,22 gömülü burada eks vivo teknikleri kullanmışlardır. büyüme faktörleri, gelişmekte trakea desenlendirme ve trakeal kıkırdak oluşumunu nasıl etkilediğini Bu çalışmalar göstermiştir. Bu çalışmalara bir sınırlama doku mimarisi düzgün muhafaza değil ve bu nedenle de oldukça kondrogene...

Solunum yolu gelişimi ventral endodermal ön bağırsak 1,2 Nkx2.1 pozitif hücrelerin ortaya çıkması ile embriyonik gün 9 (E9) ile başlatılır. Tüpler ayrı varlıklar olarak ayırt edilebilir zaman Özofagus-trakeal tüp ayırma, E11.5 ile mezenkimal dokudan 3 çevrili her çözecektir. Wnt sinyal akciğer agenezisi 4,5 neden olur endodermal solunum epitel splanknik mesenkim ve β-katenin silinmesi ile ifade Wnt2 ve Wnt2b silinmesi gibi solunum yollarının tarifnamede önemli bir rol oynar. Daha önceki çalışmalar, akciğer hipoplazisi içinde Endodermal solunum yolu sonuçlarından, WLS, tüm Wnt ligandları bir kargo reseptör aracılık salgılanmasının o silinmesini tespit, pulmoner vasküler gelişim ve trakeal mezenşimin 6,7 mis-desen kusurları. Bu veriler epitelyal-mezenkimal cro önemini destekleyenAyrıca, başka çalışmalarda 8,9 gösterildiği gibi p, hücre farklılaşması ve tarifnamede söz. Akciğer gelişiminin erken aşamalarında çalışma bize daha iyi solunum kimliğini 10-16 sürüş mekanizmaları anlamak için izin vitro ve ex vivo teknikleri, genetik dayanmaktadır. Hava sıvı interfaz tüm akciğer eksplant kültürleri yaygın morfolojilerinden 10,17,18 dallanma pulmoner erken dönemlerinde büyüme faktörlerinin etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Bu yöntem morfolojik gibi dallanma morfolojilerinden olarak değişiklikler ve gen ifadesi modülasyon okuma olarak kullanılan iken, kültür kendisi damarsal 17 gelişimini desteklemek değil gibi, gelişim sürecinin erken aşamalarında çalışma ile sınırlıdır. trakeal kıkırdak gelişimi bu kültür tekniği ile uyumlu olabilir uzun inkübasyon süreleri gerektirir. onu çözümlemesolunum yolu oluşumu sırasında Wnt sinyal e rolü, bizim embriyonik çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için standart teknikleri adapte olması. Biz hacimleri, boyama süreleri, trakea-akciğer dokusunun temizlenmesi için parafine ve zamanlama için işlem bisiklet değiştirdiniz. Bu çalışmada açıklanan teknikler optimize ana hedefi E14.5 için E11 gerçekleşecek farelerde trakeal gelişiminin erken aşamalarında analiz etmektir. Muhabir fareler hat Axin2LacZ gelişen trakeal mezenşimin Wnt / β-katenin aktivitesinin biz kesin kararlı siteleri kullanma. Biz de tüm montaj trakeal doku için lektin boyama işlemini adapte var. Böylece, mezenkimal terlemeyi görselleştirmek ve kondrogenezis yer alacak siteleri tahmin başardık. Bütün montaj ve gelişmiş mikroskopi teknikleri ile birleştiğinde WlsShhCre farelerden elde edilen embriyonik doku bölümlerinin, boyanması tra tarafından üretilen Wnt ligandların rolünü açıklayacak için bize izintrakea dokusunda CHEAL epitel.

<table><tbody><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400, tavşan</td></tr><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-20095</td><td>1:50, tavşan</td></tr><tr><td>Anti Düz Kas Aktin ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, fare</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Yedi Tepe</td><td>yok</td><td>1:100, kobay</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Yedi Tepe</td><td>yok</td><td>1:400, fare</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, koyun</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, fare</td></tr><tr><td>PNA Lektin</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>İkincil antikorlar</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td></td><td>Alexa fluor Moleküler problar</td></tr><tr><td>K3Fe (CN) 6</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K4Fe (CN) 6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP4O</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Fisher marka süper don artı</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (%16)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>TSA kitinin Bloke Edici Reaktif</td><td>İnvitrojen</td><td></td><td>Bileşeni #2&nbsp; &nbsp; &nbsp; ( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montaj ortamı</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Doku lokma kasetleri Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi kasetleri</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>Farklı renklerde mevcuttur</td></tr><tr><td>Nükleer hızlı kırmızı&nbsp; Kernechtrot% 0.1</td> <td>Sigma</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit</td><td>Sigma</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat tribazik dihidrat</td><td>Sigma</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Mikro bıçaklar</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 seramik kaplı</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo / Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td>Nikon</td><td></td><td>Geniş alan mikroskobu</td></tr><tr><td>NikonA1Rsi</td><td>Nikon</td><td></td><td>Konfokal mikroskopi. Ayarlar:NikonA1 plus kamera, tarayıcı: Galvano, dedektör:DU4. Optik Plan Apo lambda 10X. Modalite: Geniş alan floresan lazer konfokal.</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Leica</td><td></td><td>Floresan Diseksiyon mikroskobu</td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Otomatik floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Leica Uygulama paketi</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Görüntüleme işleme yazılımı</td></tr></tbody></table>

İletken airways desenlendirme sırasında wnt sinyalizasyonu incelenmesi

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt sinyal yolakları, solunum yollarının gelişimi sırasında kritik roller oynar. Normal gelişim sırasında dokuların nasıl şekillendiğini anlamak için Wnt sinyali tarafından kontrol edilen kesin farklılaşma ve morfogenez mekanizmalarının tanımlanması gereklidir. Bu bilgi aynı zamanda akciğer hipoplazisi ve trakeobronkomalazi gibi doğum kusurlarının etiyolojisini belirlemek için de kritik öneme sahiptir. Solunum yolu gelişiminin en erken aşamalarının analizi, sınırlı doku miktarının doğum sonrası çalışmalar için daha uygun olan standart protokollerin performansını engellemesi nedeniyle zorluklar doğurur. Bu yazıda, solunum yollarında hücre farklılaşması ve proliferasyonunu incelemek için metodolojileri tartışıyoruz. Trakeal akciğer gelişimine uygulanan parafin kesitlerinde tüm mount boyama, dokunun konfokal mikroskopi için işlenmesi ve immünofloresan gibi teknikler anlatılmaktadır. Ayrıca, trakeal mezenşim farklılaşması, özellikle kıkırdak oluşumu için metodolojileri tartışıyoruz. Bu yazıda tartışılan yaklaşımlar ve teknikler, embriyonik doku ile çalışırken materyal sınırlamasını ortadan kaldırarak, iletken hava yollarının geliştirilmesinin modelleme sürecinin daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Wnt / β-katenin etkinliği Tüm montaj Lac-Z boyama raportör Axin2 Lac-Z fareler 11 izole edilmiş embriyolar, trakeal akciğer dokusunda tespit edilmiştir. boyama Yer Wnt / β-katenin etkinliğini gösterir. bütün montaj boyama bölgelerinin analizi Wnt / β-katenin aktivitesi trakea mezenşimin ve gelişmekte olan akciğerlerin periferal bölgelerinde mezenşimin mevcut olduğunu tespit ettik. (Sol...

Bütün montaj bağlanmış raportör fareler ve bölüm boyama, mikroskopi ve in vivo deneylerde kullanımı solunum yolu normal model oluşturmanın altında yatan mekanizmaların analizi kolaylaştırır. İşte bu teknikler trakeal gelişimi sırasında Wnt sinyal analizine katkıda açıklar.

İletken Airways Desenlendirme sırasında Wnt Sinyalizasyonu incelenmesi

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Boyama prosedürlerinin genel amacı, genetiği değiştirilmiş fare modellerinden alınan embriyonik dokuları kullanarak, üst solunum yollarının gelişiminin erken aşamalarında Wnt sinyal yolunun rolünü göstermektir. Bu yöntemler, akciğer biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, iletim yollarının destekleyici yapılarının nasıl şekillendiği gibi.Burada sunacağımız teknikler, trakeal kıkırdak oluşumunda temel olaylar olan hücre proliferasyonunu veya mezenkimal kondansasyon sürecini incelememize olanak sağlayacaktır. Bu tekniğin temel avantajı, az miktardaki dokularda kullanılabilmesidir. Buna akciğer eksplantları ve E11 embriyolarından izole edilen trakealar dahildir.Genel olarak, bu prosedürde yeni olan bireyler, örneklerin boyutu ve mevcut doku miktarının sınırlı olması nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Kişinin embriyonik dokularla çalışırken kendisini rahat hissetmesi gerekir; bu da adımlara genel olarak dikkat ederek ve her adım arasında aynı miktarda dokunun mevcut olduğundan emin olarak sağlanır. E11.5 ile E14.5 arasındaki gebe bir dişi fareyi ötanize ettikten ve metin protokolüne uygun olarak laparotomi gerçekleştirdikten sonra, uterus boynuzlarını izole etmek için pens ve ince makas kullanın ve dokuyu derhal soğutulmuş PBS çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin.Ardından kabı buz üzerine yerleştirin. Embriyoları uterus boynuzlarından ayırmak için, uterus dokusunu tutmak amacıyla ince bir pens kullanın. Ardından makasla uterus dokusunu ve konseptusu delerek embriyoları serbest bırakın.Ardından, kalan tüm embriyonik membranları temizleyin. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında iğne uçlu makas kullanarak başı ve diyaframın altında kalan gövdenin alt kısmını kesin ve referans noktası olarak karaciğeri belirleyin. Vücut duvarının yan kısımlarını, omurgayı ve kalbi çıkarmak için iğne uçlu makasları kullanın.Trakeal dokuya zarar vermemeye dikkat edin. Embriyonik trakeal akciğer dokusunu diseke etmek için, özofagusu çekmek amacıyla iğne uçlarını kullanarak özofagusu trakeadan dikkatlice ayırın. Cam veya transfer pipetleri ile dokuyu dört milimetrelik vidalı kapaklı cam tüplere aktarmadan önce dokuyu buz üzerinde PBS içine yerleştirin.PBS içinde %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Ardından dokuyu durulamak için PBS kullanın. PBS örneklerden uzaklaştırıldıktan sonra, iki milimetre X-gal boyama çözeltisi ekleyin ve bir ila iki saat veya daha ileri işlem ve gömme işlemleri için dört saat inkübe edin.Dokuyu, %3 DMSO içeren PBS ile beşer dakikalık üç yıkama yaparak reaksiyonu durdurun. Ardından dokuyu %70 etanol içinde saklayın. Örnekleri, metin protokolüne uygun olarak parafin gömme işlemi için otomatik bir işlemci kullanarak işledikten sonra, örnekleri doku gömme teknesinin tabanına düz gelecek şekilde yerleştirerek yönlendirin.Gömme teknesini dolduracak şekilde parafini dikkatlice ekleyin ve parafin katılaşana kadar hemen gömme istasyonunun soğuk plakasına yerleştirin. Ardından, bloğu gömme teknesinden çıkarın ve bir mikrotom ile altı mikrometre kalınlığında kesitler alın. Daha sonra kesitleri lamlara monte edin.Ardından kesitleri bir saat boyunca 42 °C'de lam ısıtıcıya yerleştirin. Lamları gece boyunca 56 °C'lik fırında kurutun. Daha sonra, numunelerin parafinini uzaklaştırmak için kurutulmuş lamları raklara yerleştirin ve 200 mL %100 ksilenle dolu boyama kaplarına, her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez aktarın.Lamları yeniden nemlendirmek için her birinde birer dakika kalacak şekilde dereceli bir etanol serisi kullanın. Ardından, örnekleri 10 ila 30 saniye boyunca Nuclear Fast Red ile karşı boyayın. Lamları musluk suyu ile üç kez, her seferinde beş dakika boyunca yıkayın.Slaytları dehidrate etmek için, örnekleri üç kez değiştirilen ksilen ile yıkamadan önce dereceli bir etanol serisi kullanın. Ardından, örnekleri monte etmek için ksilen bazlı bir montaj ortamı ve lameller kullanın. Lektin boyamasını gerçekleştirmek için, trakeal akciğer dokusunu sabitledikten ve metin protokolüne göre bloklama tamponunu hazırladıktan sonra, örnekleri 0,5 mililitre bloklama tamponuna aktarın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Bloke edici tamponu uzaklaştırmak için bir transfer pipeti kullanın ve her numune için 250 microliters lektin çözeltisi ekleyin. Ardından, cam şişelerin üzerini alüminyum folyo ile kapatın ve dört degrees Celsius sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri PBS ile duruladıktan sonra, eksplantları numuneleri örtecek miktarda PBS içeren agaroz kaplı Petri kaplarına yerleştirin.Ardından, bütün mount'ların fotoğraflarını çekmek için bir floresans diseksiyon mikroskobu kullanın. Bütün mount'lara immünofloresan boyama yapmak için, örnekleri metin protokolüne göre sabitledikten sonra, metanolü uzaklaştırmak için bir transfer pipeti kullanın, ardından yoğun çamaşır suyu ekleyin ve örneklerin permeabilize olması için dokuyu iki saat boyunca inkübe edin. PBS ile seyreltilmiş dereceli bir metanol serisi kullanarak, her adımda oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek dokuyu hidrate edin.Metin protokolüne uygun olarak doku blokajı yapıldıktan sonra, primer antikorlar ve bloklama çözeltisi ekleyin ve numuneleri dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Numuneler PBS ile yıkandıktan sonra, PBS içinde 1:500 dilüsyonda sekonder antikorlar ekleyin ve karanlıkta dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri PBS ile 20'şer dakikadan üç kez yıkadıktan sonra, numuneleri her adımda 10 dakika boyunca PBS içinde dereceli bir metanol serisi kullanarakydehidre edin.Numuneleri özel yapım sahne plakalarına aktarın. Metanolü uzaklaştırın. Ardından, numuneleri şeffaflaştırmak için 200 µL Murray şeffaf çözeltisi kullanın.Konfokal mikroskop kullanarak hemen görüntüleme yapın. E11.5 gebe farelere BrdU enjekte ettikten ve metin protokolüne uygun olarak embriyoları E12.5 veya E13.5 aşamasında izole ettikten sonra, embriyonik başları ve gövdenin göğüs boşluklarının altındaki alt kısımlarını çıkarmak için bıçak uçları kullanın. Göğüs dokusunu dört mililitrelik vidalı kapaklı tüplere yerleştirin ve bir mililitre %4 PFA ekleyin.Metin protokolüne uygun olarak gömme, kesme ve örneklerin yeniden hidrasyonu işlemlerinden sonra, lamları Coplin kavanozlarına yerleştirin ve pH 6 olan 10 millimolar sitrat tamponu ile doldurun. Distile su kullanarak buharlaşan sitrat tamponunu tamamlamadan ve tekrar ısıtmadan önce, örnekleri yüksek güçte altı buçuk dakika boyunca mikrodalgada ısıtın. Metin protokolüne uygun olarak lamları soğutup, yıkayıp blokladıktan sonra, bloklama çözeltisi içinde seyreltilmiş 180 microliter primer antikoru bir contaya uygulayın ve lamı bir kapatma camı uyguluyormuş gibi tutturun.Ertesi gün, contayı ayırmak için lamları distile suya batırın. Ardından lamları %0,1 Tween 20 içeren TBS ile beşer dakikalık altı yıkama işlemine tabi tutun. Lamları sekonder antikorlarla inkübe ettikten sonra, 0,5 molar Tris Base ile iki kez yıkamadan önce, 0,1 molar Tris Base kullanarak lamları beşer dakikalık iki yıkama işlemine tabi tutun.Lamları, DAPI içeren veya içermeyen montaj ortamı eklerken 05 molar Tris Baz içerisinde tutun ve bir kapatma lamı ekleyin. Son olarak, örnekleri görüntülemek için otomatik bir floresan mikroskobu kullanın ve metin protokolüne göre analiz edin. Reporter ve iki lacZ faresinden izole edilen tüm mount trakeal akciğer dokusunun bu figüründe, trakeanın mezenşiminde ve gelişmekte olan akciğerlerin periferik bölgelerinde lacZ boyanması tespit edilmiş olup, bu durum Wnt beta katenin aktivitesini göstermektedir.Bu deneyde, E12.5 ile E14.5 arası trakeal akciğer dokuları PNA lektini ile boyanmıştır. Kontrol hayvanlarda floresans, kıkırdağın oluştuğu mezenşimde periyodik bantlar şeklinde tespit edilmiştir. Ancak, Wntless sonic hedgehog Cree embriyolarında boyamanın gerçekleşmemesi, Wnt sinyal yolunun mezenşimal kondansasyonlar için gerekli olduğunu göstermektedir.E11.5 embriyolarının bütün montaj trake dokusunda, SOX9 ekspresyonu mezenşime sürekli bir şerit şeklinde sınırlıyken, gelişmekte olan akciğerde SOX9, solunum epitelinin çevresinde gözlemlenir. Burada gösterildiği gibi, NKX2.1 trakenin epiteli ile sınırlıdır. Epitelden Wnt ligandlarının salınımının önlenmesi, mezenşimdeki SOX9 ekspresyonunu azaltır, ancak periferik akciğer epitelindeki SOX9 ekspresyonunu etkilemez.Alfa düz kas aktin boyaması trake dokusunda düşük seviyelerde tespit edilirken, larenks ve midede belirgin şekilde gözlemlenmektedir. Son olarak, bu şekilde gösterildiği üzere, trake dokusunun BrdU, SOX9 ve alfa düz kas aktin ile in vivo etiketlemesi, SOX9 boyalı hücrelerin, alfa düz kas aktin boyalı hücrelere göre daha yüksek seviyede proliferasyon geçirdiğini kanıtlamaktadır. Proliferasyon paterni, Wntless sonic hedgehog Cree trake dokusunda tersine dönmüştür.Bu tekniklerin çoğu, doğru şekilde uygulandığında ve uzmanlaşıldığında iki gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, sekonder antikoru seçerken primer antikorun kaynağını hatırlamak önemlidir. Bu durum tüm immün boyamalar için geçerlidir, ancak birden fazla primer antikor kullandığınızda özellikle önem taşır.X-galaktosidaz boyamasının ardından, ek bilgiler edinmek ve Wnt sinyalleşmesi sırasında ilgilenilen belirli bir genin eksprese edilip edilmeyeceği gibi ek soruları yanıtlamak için in situ hibridizasyon gibi ek teknikler uygulanabilir. Burada sunulan teknikler, Wnt sinyalleşmesi veya gelişimi etkileyen diğer temel sinyal güçleri tarafından yönetilen sessiz örüntü mekanizmalarıyla ilgilenen araştırmacılar için faydalı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, solunum sistemi gelişimi sırasındaki farklılaşma sürecinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Ayrıca iletken hava yollarının desenlenmesinde Wnt sinyal yolunun rolü hakkında daha iyi bir anlayış edinin. Paraformaldehit ve benzil benzoat ile çalışırken eldiven giymek, çözeltileri çeker ocak altında hazırlamak ve atık çözeltileri yerel yasa ve yönetmeliklere uygun olarak bertaraf etmek gibi uygun önlemleri almayı unutmayın.

studying-wnt-signaling-during-patterning-of-conducting-airways

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada, yetişkin yenilenen zebra balığı kuyruk yüzgecinde dokuya özgü gen ekspresyonu elde etmek için TetON sistemini kullanmak için iş akışını özetliyoruz.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

El yazması burada Xenopus floresan levhası 'ligandların salgılanmasını ve difüzyon analiz yöntemleri basit bir kümesi sağlar. Bu ligand dağılımını değiştirmek için başka proteinlerin yeteneğini test ve morfojen degradeler düzenleyen mekanizmalar içgörü verebilir deneyleri izin verdiği için bir ortam sağlar.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

Birincil kirpikler çeşitli sinyal yollarını etkiler. Memeli kokleası, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalini incelemek için idealdir. Kirpikler disfonksiyonu koklear büyümeyi, hücresel paternlenmeyi ve saç hücresi oryantasyonunu, PCP okumalarını etkiler. Amacımız, fare kokleasında PCP sinyalizasyonunu fenotipik analiz, immünohistokimya ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz etmektir.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

Bu video makalede sistematik ve verimli birçok omurgasız embriyolar karmaşık sinyal yolları ve düzenleyici ağları bileşenleri karakterize etmek için kullanılabilir in vivo metodolojisi basit ayrıntıları.

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar<em&gt; Vivo</em&gt; Karmaşık Hücre-hücre Sinyal Ağ Etkileşimleri incelenmesi için Gelişim Modelleri

Burada, zebra balığı 4-boyutlu (4 D) kalbimizde geliştirme görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Işık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM), üzerinden 4-D görüntüleme gelişmekte olan kalpleri yeniden oluşturmak için zaman içinde 3 boyutlu (3-D) görüntüleri alır. Nitelik ve nicelik endocardial çentik kardiyak trabeculation teşvik odası geliştirme sırasında sinyal kesme stres etkinleştirir gösteriyoruz.

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Mikroakışkan bir çip üzerinde fare embriyonik dokusunun kültürü ve manipülasyonu için bir protokol sağlanır. Yol modülatörlerinin darbelerini uygulayarak, bu sistem fare somitogenezinin fonksiyonel araştırması için sinyal salınımlarını harici olarak kontrol etmek için kullanılabilir.

Somitogenezi Yöneten Sinyal Salınımlarının Fonksiyonel Olarak İncelenmesi İçin Bir Mikroakışkan Yaklaşımı

Bu çalışma, in vitro parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal olaylarını incelemek için oldukça tekrarlanabilir ve izlenebilir bir yöntemi özetlemektedir.  Bu protokol, parakrin Wnt5a sinyallemesinin murin nöral krest hücrelerinde ve miyoblastlarda etkisini değerlendirmek için uygulandı.

Parakrin Kanonik Olmayan Wnt Sinyalizasyonunun In Vitro Olarak Modellenmesi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşma protokollerindeki son gelişmeler, organa özgü hücre tiplerinin kademeli olarak türetilmesine izin vermektedir. Burada, iPSC türevi hava yolu bazal hücrelerinin bakımı ve genişlemesi ve hava-sıvı arayüz kültürlerinde mukosiliyer bir epitel halinde farklılaşması için ayrıntılı adımlar sunuyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Hava Yolu Epitel Hücresi Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Burada, doku etkileşimlerini, 4D görüntüleme timelapse filmini (3D artı zaman), moleküler fonksiyonun küresel veya yerel bozulmasını ve sistem biyolojisi karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilecek üç tip kuş embriyonik deri eksplant kültürü için protokolleri açıklıyoruz.

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Bu makale, T hücresi soylarının nesil, fenotip ve sayı kinetiğinin analizi ile timik çökelme öncüllerini karakterize etmek için in vivo ve in vitro metodolojiyi açıklamaktadır.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Keşfedin Wnt sinyalizasyonunun trakea gelişimindeki rolünü, genetik olarak modifiye edilmiş fare modelleri ve boyama teknikleri kullanarak. Bu yöntemler solunum yolu desenlenmesini ve kıkırdak oluşumunu incelemek için değerlidir.

İletken Airways Desenlendirme sırasında Wnt Sinyalizasyonu incelenmesi

Daha fazla video keşfet