Name: Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Öğrenin, Single-probe cihazı ile ortam koşullarında canlı tek hücre ve doku analizi için kütle spektrometresi görüntüleme yöntemini. Bu teknik, biyolojik ve farmasötik araştırmalarda yüksek çözünürlüklü moleküler dağılım haritalaması sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, motorlu sahne kontrol yazılımını ve MSI görselleştirme programını paylaştığı için Dr. Laskin'e (Pasifik Kuzeybatı Ulusal Laboratuvarı) teşekkür eder. Ayrıca fare organ örnekleri sağladığı için Dr. Mao'ya (Oklahoma Üniversitesi) ve işleme ve elektronik işlerinde yardım için Bay Chad E. Cunningham'a (Oklahoma Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu araştırma, Oklahoma Üniversitesi Norman Kampüsü Araştırma Konseyi, Amerikan Kütle Spektrometresi Araştırma Ödülü Derneği (Waters Corporation sponsorluğunda), Oklahoma Bilim ve Teknolojiyi Geliştirme Merkezi (Hibe HR 14-152) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM116116) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Hayvan kullanımı ve refah Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokoller aşağıdaki Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu&#39;na uygun olmalıdır. Fare doku örnekleri ortak çalışan Dr. Chuanbin Mao tarafından temin edildi. 1. Fare Doku Bölüm Hazırlık <ol><li> De küçük plastik merkezine çıkar (beyin, böbrek, karaciğer, vb) bir bütün fare organı (örneğin, 12-iyi hücre kültür plakası) yerleştirin ve yaklaşık 10 mm yükseklikte bileşiği kadar gömme dokuda daldırın. Doku gömme bileşikte ve organ istenen yönde (yani, sagital, koronal, vs.) yerleştirildiğinden emin oluşan hiçbir kabarcık olmadığından emin olun. </li><li> Hemen flaş dondurma sıvı azot içine dokuları yerleştirin. Uzun süreli depolama için, -80 ° C derin dondurucuda dondurulmuş örnekleri saklamak. </li><li> Donmuş fare organı alın ve bir temperatu içinde ° C -15 çözülmekontrol cryomicrotome yeniden. </li><li> Doku gömme bileşiğin yaklaşık 500 ul ve bir çelik tabanı üzerine güvenli doku istenen kesit oryantasyon bıçak sunulan böylece montaj kesit bir cryomicrotome üzerine yerleştirin. </li><li> Bölüm 12 mikron kalınlığında doku. polikarbonat mikroskop lamı üzerine kesitli doku dilimleri yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumaya bırakın. Uzun süreli depolama için, -80 ° C derin dondurucuda dondurulmuş slayt saklayın. </li></ol> 2. Hücre Kültürü Not: Hücre kültürü, steril koşullar altında, biyolojik güvenlik kabini (Biyolojik Güvenlik Seviye II) &#39;de yapılmıştır. HeLa hücre hattı, bir model sistem olarak kullanılır, ve hücreler, aşağıdaki klasik protokoller ile tam kültür ortamı içinde kültürlenmiştir: <ol><li> Sıcak reaktifler (örneğin, tripsin, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), ve hücre kültür ortamı), 37 ° C arasındadır. Not: hücre kültür ortamı inorganik sa içeriyorLTS, amino asitler, vitaminler, ve diğerleri. bileşenlerin tam listesi için, üreticiden formülasyona bakın. </li><li> Hücre örneği (örneğin, 1 mi HeLa hücre süspansiyonu) elde edilir ve standart bir 10-cm hücre kültürü plakası tam hücre kültür ortamında 9 ml ekleyin. Başlangıç ​​hücre sayısı yaklaşık 0,5 x 10 6 hücre / ml &#39;dir. Artan yüzey hücre kültür plakası üzerinde% 70-80 olarak kaplanana kadar 2-3 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de kültür içinde hücreleri tutun. Birbirini izleyen her tur için rekor hücre pasaj sayısı. </li><li> Hücre kültürü plakası hücre pasajlanmasını (yani, hücre bölünmesi) gerçekleştirin. <ol><li> Aspire büyüme ortamı ve hücreleri durulama 1x PBS 5 ml kullanın. steril aspirasyon ucunu kullanarak PBS çıkarın ve kültür plakasından hücreleri ayırmak için 37 ° C&#39;de ~ 5 dakika boyunca tripsin (% 0.25) 2.5 ml hücreleri inkübe edin. Not: Gerçek tripsin tedavi süresi belirli tripsin süreden göre optimize edilmesi gerekirct üreticisinden satın aldı. Aşırı tedavisi hücre ölümüne sebep olur ise yetersiz tedavi süresi, plakaya bağlı hücreler bırakır. </li><li> 7.5 ml tam hücre kültür ortamı eklenerek tripsin aktivitesi durdurun ve muntazam hücreleri (toplam hacim 10 mi) yeniden süspanse edin. SCMS örneklerinde (adım 2.4) kültür (adım 2.2) veya hazırlanması için hücre süspansiyonu kullanın. </li></ol></li><li> SCMS deneyler için hücre örnekleri hazırlayın. <ol><li> 12 oyuklu bir plaka içerisinde, bireysel mikro kapak slaytlar yerleştirin ve 1.8 ml hücre kültür ortamına ilave ve de hücre süspansiyonu, 0.2 mi. </li><li> Yavaşça plaka hafif bir sallama ile hücrelerin karışımı, 24 saat ~ 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ortamında inkübe edin. Kültürlenmiş hücrelere ilaç tedavisini gerçekleştirmek için, 12-iyi hücre kültür plakasına (DMSO içinde, örneğin (dimetil sülfoksit)), bir ilaç bileşiği çözeltisi ilave edilir. Not: nihai ilaç konsantrasyonu (örneğin, 10 nM, 100 nM, 1 uM ve 10 uM) ve treatment zaman (örneğin, 4 saat) çalışmaların belirli bir amaç doğrultusunda çeşitlidir. Hücreler mikro kapak slaytlar bağlı ve ÇKYS deneyleri (adım 6) için hazırdır. </li></ol></li></ol> 3. Tek-prob Fabrikasyon <ol><li> Bir lazer mikropipet çektirmenin içine çift delik kuvars tüp (iç çapı (ID) 127 mikron dış çap (OD) 500 mikron) yerleştirin ve bir çift delik kuvars iğneyi çekin. (Tüm birimler üreticinin birimleridir) Heat = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del = 150 ve Pul = 250: başlangıç ​​noktaları olarak aşağıdaki parametreleri kullanın. çekti çift delik kuvars iğne sağlamak optimum prob özellikleri için bir konik uca sahiptir. ~ Diğer ucunda terk unpulled çift lümenli kuvars kılcal 5 mm uzunluğunda olacak şekilde çekilir ucu kesilir. Not: Lazer çektirmenin gerçek parametreleri aygıtının özel koşullara göre optimize edilmelidir. </li><li> erimiş silis kılcal bir ~ 80 mm bölümünü kesmek (ID 40 mikron, OD. çözücü olarak 105 mikron) kılcal sağlayan ve çift delik kuvars iğnenin düz ucunda bir delik içine yerleştirin. </li><li> erimiş silis kılcal (ID 40 mikron, OD 105 mikron) bir ~ 40 mm bölümü kesin ve orta noktasından poliimid kaplama ~ 5 mm tıraş için bir jilet kullanın. hızlı ısı ve ince konik bir nano-elektrosprey iyonizasyon (ESI) yayıcı içine erimiş kılcal çekmek için bir propan alevi kullanın. Bir nano-ESI yayıcısı (~ 7-10 mm uzunluğunda) Kes ve çift delik kuvars iğnenin düz sonunda diğer deliğin içine yerleştirin. Seçenek olarak ise, ince bir konik üretilmesi için, lazer çektirme kullanın. </li><li> Çift delik kuvars iğnenin düz ucuna (~ 1-2 ul) UV reçine az miktarda uygulayın ve kılcal ve nano çözücü güvenli ~ 20 sn LED UV lamba kullanılarak sağlayan reçine katılaşmaya ESI yayıcı. Tek prob içine tek tek parçaları birleştirmek için prosedürler Şekil 1a gösterilmiştir. </li><li> Standart bir mikroskop gl Cuteşek slayt uzunlamasına ortadan ikiye (1 &quot;x 3&quot;). Nano-ESI yayıcı dışarı doğru sivri şekilde cam slayt bir ucuna tek sonda yerleştirin. Bu cam slayt (Şekil 1b) üzerine sabitlenmiş olur, böylece tek sonda gövdesinin düzenli epoksi uygulanır. sertleştirme için bir gece bekletin. Çift Şekil 1d &#39;de gösterildiği gibi bir kütle spektrometresi bağlı tümleşik tek prob ayarları (Şekil 1c) ile imal tek prob. </li></ol> 4. Entegre Tek prob MS Kur oluşturun <ol><li> Kütle spektrometresi iyon kaynağı arayüzü flanş değiştirmek ve dijital stereoskop (ayarlanabilir pozisyon ve yüksekliğe sahip) standı imal (Şekil 1e ve 1f). <ol><li> bir alüminyum optik kurulu eki için izin veren iki delikli bir iyon kaynağı arayüzü flanş delin. slayt demiryolu cihazı ve bir yükseklik ayarlama çubuğunu olun (ekliDijital stereoskop sistemi alüminyum optik kurulu (Şekil 1e takılabilir şekilde ince pozisyon ayarı için bir XY)). </li></ol></li><li> modifiye dijital stereo mikroskop, bir USB dijital mikroskop, esnek bir kelepçe sahibi ile bir minyatür manuel XYZ çeviri aşamasında, kütle spektrometresi özelleştirilmiş iyon kaynağı arayüzü flanş üzerine monte alüminyum optik kuruluna, Motorlu XYZ çeviri sahne sistemi takın (Şekil 1c ve 1f). Tek prob ile bağlı cam slayt düzeltmek için esnek kelepçe tutucu kullanın. </li><li> Kütle spektrometresi (Şekil 1 f) tek prob kurulumu takın. kütle spektrometresi girişinde önünde tek prob yayıcı yerleştirmek için esnek kelepçe tutucu ve minyatür XYZ sahne ayarlayın. Tek p yakınlaştırılmış görüntü sağlamak için tek prob tarafında (ayarlanabilir görüş açısı ile) USB dijital mikroskop kullanmakTek prob üzerinde elbise ucu veya nano-ESI yayıcı ve (yüksekliği ayarlanabilir), dijital stereoskop hücreleri ve prob ucunu görmek için. Not: İlgili iyon kaynağı flanş kullanarak, bu entegre tek prob sistemi ortam iyonizasyon kaynakları ile donatılmış kütle spektrometre başka türlerine bağlanabilir. </li></ol> 5. Ortam MSI <ol><li> Oda sıcaklığında örneği bölümüne çözülme ve tek prob altında motorize XYZ çeviri sahne sistemi üzerine yerleştirin. kontrol yazılımı koordinatları değiştirerek örnek konumunu ayarlayın. </li><li> Şırınga kullanılarak uygun bir hızı (örneğin, 0.2 ul / dakika) örnekleme çözücü pompa ve iyonizasyon voltajı (ör 5 kV) uygulamak. Örnekleme çözücünün seçimi esnektir ve yaygın olanları MeOH içerir: su (9: 1) ve asetonitril. Nano-ESI damlatıcının ölü hacim 3 nl ve prob-taşlama arasındaki zaman ~ olduğu tahmin edilmiştirce temas ve iyon sinyal gözlem genellikle az 1 sn 15&#39;dir. Not: özelleştirilmiş iyon kaynağı arayüzü flanş iyonizasyon voltajı bir timsah klibi ile bir iletken birliğe kütle spektrometresi teslim edilmesini sağlar. iyonlaşma gerilimi daha sonra kılcal ve tek prob kanalları içinde çözücü bir iletken sendika aracılığıyla iletilen ve örneklenmiş analitleri iyonize nano-ESI yayıcı üzerine tatbik edilir. iletken sendika ile timsah klibi bağlarken iyonizasyon voltajı kapalı olduğundan emin olun. </li><li> sadece numunenin yüzeyi üzerinde dinlenme ve metabolitleri yüzey çıkarma gerçekleştirmek mümkün böylece tek prob yüksekliğini ayarlayın. Dikkatle Z-sahne kaldırın ve ardından tek prob ucu ve doku yüzeyi arasındaki mesafe değişimini izlemek için (tek-sondasının tarafında) USB dijital mikroskop kullanıyoruz. Bu yükseklik ayarı sırasında kütle spektrumunda değişiklikleri izlemek ve asansör durdurmakDoku metabolitlere çözücü kökenli iyon sinyalinin bir değişiklik görülmektedir Z-sahne ing. </li><li> Adımı yineleyin 5.3 üç kez otomatik yüzey düzleştirme ayarlama için sahne kontrol programı kapsamında üç farklı noktalarını ayarlamak için. birbirinden yaklaşık 10 mm bir mesafede Örnek yüzeyi üzerinde üç noktada tek prob ucu yerleştirin. yukarı basarak ve simgeler aşağı yükseklik ayarı gerçekleştirin ve &quot;Plan yöntemi&quot; altında pozisyona üç puan kilitleyin. </li><li> Bu programı kullanarak numune içinde ilgi bölüm boyunca rastering diğer parametrelerini ayarlayın. Burada sunulan fare böbrek bölümleri için, 10,0 mm / sn rasterleme hızı ve satırlar arasındaki 20 mikron mesafe kullanın. Motorlu kademeli sistem 0.1 mikron minimum artış hareketi vardır. Tek prob ucu ve doku arasındaki mesafe Aşama 5.3 elde edilir. </li><li> kütle spektrometresi MS spektrumları otomatik edinimi için bir yöntem ayarlayın. foFare böbrek numune üzerinde r yüksek kütle çözünürlüğü MSI, aşağıdaki parametreleri kullanın: kütle çözünürlüğü 60.000 (m / Δm), ~ 5 kV pozitif mod, 1 MicroScan, 150 msn maksimum enjeksiyon süresi ve AGC üzerinde. MS görüntünün bireysel hat temsil tüm kazanılmış MS spektrumları üretilen görüntüler için piksel boyutları düzgün yayılı belirten, her taramada arasında düzgün zaman aralıkları ile taramalar aynı sayıda vardı. </li><li> MSI veri toplama başlatın. kütle spektrometresi MS edinme dizisi başlatmak ve daha sonra XYZ kontrol programı için rasterleme dizisini başlatır. <ol><li> Örneğin, burada kullanılan MS veri toplama programında, &quot;Yeni dizisi&quot; seçeneğini &quot;Dizi kurulumu&quot; gidin X için kullanılan satır sayısı olan X, 01 numaralandırılmış yeni bir dizi için dosyaları bir dizi oluşturmak istenilen MS görüntü alınır ve ardından &quot;Çalıştır dizisi&quot; basın. </li><li> yazılım conta üretmek için izin vermek için bir ev yapımı elektronik cihaz kullanınkütle spektrometresi için ct kapatma sinyali veri toplamak için. Devre şeması referans olarak ilave şekil (Şekil S1) gösterilmiştir. </li></ol></li><li> Uygun MSI görselleştirme yazılımı kullanarak ham MS dosyaları MS görüntüleri oluşturun. PNNL 17 at Layı grubu tarafından geliştirilen yazılım paketi kullanarak Örneğin, aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> &quot;Kaşlar Dosya&quot; yı tıklayın. MSI deneyden elde edilen ilk dosyayı seçin. Belirtin nerede altında dosya başlangıç ​​ve bitişini &quot;Hatların sayısı.&quot; &quot;Enter MZ Aralığı&quot; altında MS görüntü aralığı için, m / z değerleri bir dizi seçin. </li><li> Görüntü oluşturma işlemini başlatmak için &quot;Başlat&quot; düğmesine basın. MS görüntü yapıldıktan sonra bilgisayar görüntüleri depolamak için &quot;Araç Çubuğu&quot; altında &quot;Resmi Kaydet&quot; i tıklayın. </li></ol></li></ol> In-situ 6. Canlı SCMS <ol><li> Kurulum kullanabilmesidir göre tek prob sistemiMSI iyonlar. Akış hızı çözücü (örn MeOH / H 2 O veya asetonitril) ayarlayın (örneğin, ~ 25 nl / dk). </li><li> kültürel ortam ve hücre dışı ilaç bileşenleri kaldırmak için PBS ile, mikro kapak cam slaytlar bağlı olan kültür hücreleri, yıkayın. deney için motorize XYZ çeviri sahne sistemi üzerine cam slayt içeren hücreyi yerleştirin. Alternatif olarak kültürlenmiş hücreler durulama (fetal inek serumu ihtiva eden olmadan) taze bir hücre kültür ortamını kullanmak Not:. Az iyon bastırma gözlenmiştir. Buna ek olarak, hücre, ortam sıcaklığı (~ 20 ° C) bir kültür sıcaklığında (37 ° C) çok daha düşük bir deney sırasında uzun süre hayatta kalabilir. İlaç türü, çözüm konsantrasyonu ve tedavi süresi değişik çalışmalarda farklılık gösterir. </li><li> Analiz sırasında hücre penetrasyonu izlemek için tek prob ucuna (numune üzerinde) dijital stereo mikroskop odaklanın. s USB dijital mikroskop (kullanınTek prob ide) tek prob üzerindeki nano-ESI yayıcı çalışma koşullarını izlemek için. </li><li> ilgi hücreyi bulmak için motorize XYZ sahne kontrol programı ve (hücreler üzerinde) dijital stereo mikroskop kullanımı ve hassas numune üzerinde tek prob ucu yerleştirin. Tek prob ucu hücresine sokulur önce MS veri toplama başlatın. <ol><li> kütle çözünürlüğü 100,000 (m / Δm), ~ 3 kV pozitif ve negatif mod, 1 MicroScan, 150 msn maks enjeksiyon süresi hakkında AGC modu: MS analizi için referans yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanılarak aşağıdaki parametreleri kullanın. MS spektrumları otomatik edinimi, MS veri toplama programında &quot;Başlat&quot; tıklayarak yapılır. </li><li> hücre zarı nüfuz ve hücreden üretilen MS sinyalini kayıt tutmak için simgesini tıklatarak motorlu Z-sahne kaldırın. 1-2 saniyelik bir zaman gecikmesi genellikle sonda yerleştirilmesi ve MS sinyal tespiti arasında görülmektedir. Diğer teyidi olarakHücre penetrasyon MS sinyallerinin dramatik bir değişim hücre zarının nüfuz tespit edilebilirler. Hücre içi bileşiklerin MS sinyalleri genellikle 15-20 sn önemli ölçüde azalacaktır ~ sürebilir. </li><li> hücreden tek prob ucunu çekin plaka içeren hücreye aşağı indirin. Genellikle gürültü seviyesini yaklaşmak hücresel bileşiklerin iyon sinyalleri için &lt;15 sn sürer. ~ 3 dk tamamen tek sondayı temizlemek için çözücü akışını edelim. Bu arada, analiz edilecek bir sonraki hücreyi bulmak için motorize XYZ sahne sistemi yerleştirin. Her bir hücre deneyi ~ 3 dk gerçekleştirilebilir gerektirir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Vickerman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+and+depth+profiling+by+mass+spectrometry-SIMS%2C+MALDI+or+DESI%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging and depth profiling by mass spectrometry-SIMS, MALDI or DESI?</a> Analyst. 136 (11), 2199-2217 (2011).</li>
<li>Schwamborn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+in+biomarker+discovery+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry in biomarker discovery and validation.</a> J. Proteomics. 75 (16), 4990-4998 (2012).</li>
<li>Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+-+Painting+Molecular+Pictures%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">MALDI Imaging Mass Spectrometry - Painting Molecular Pictures.</a> Mol Oncol. 4 (6), 529-538 (2010).</li>
<li>Kraft, M. L., Klitzing, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipids+with+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1841 (8), 1108-1119 (2014).</li>
<li>Wiseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry%3A+Imaging+drugs+and+metabolites+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18120-18125 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+small+metabolites+and+lipids+in+rat+brain+tissues+at+atmospheric+pressure+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of small metabolites and lipids in rat brain tissues at atmospheric pressure by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 82 (3), 982-988 (2010).</li>
<li>Laskin, J., Heath, B. S., Roach, P. J., Cazares, L., Semmes, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Imaging+Using+Nanospray+Desorption+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tissue Imaging Using Nanospray Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 84 (1), 141-148 (2012).</li>
<li>Wu, C., Dill, A. L., Eberlin, L. S., Cooks, R. G., Ifa, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+under+ambient+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass.+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging under ambient conditions.</a> Mass. Spectrom. Rev. 32 (3), 218-243 (2013).</li>
<li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity%3A+do+differences+make+a+difference%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity: do differences make a difference?</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li>
<li>Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+MALDI-MS+as+an+Analytical+Tool+for+Studying+Intrapopulation+Metabolic+Heterogeneity+of+Unicellular+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-Cell MALDI-MS as an Analytical Tool for Studying Intrapopulation Metabolic Heterogeneity of Unicellular Organisms.</a> Anal. Chem. 82 (17), 7394-7400 (2010).</li>
<li>Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lipidomics%3A+characterizing+and+imaging+lipids+on+the+surface+of+individual+Aplysia+californica+neurons+with+cluster+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell lipidomics: characterizing and imaging lipids on the surface of individual Aplysia californica neurons with cluster secondary ion mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 85 (4), 2231-2238 (2013).</li>
<li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+metabolite+and+lipid+analysis+of+Xenopus+laevis+eggs+by+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subcellular metabolite and lipid analysis of Xenopus laevis eggs by LAESI mass spectrometry.</a> PLoS One. 9 (12), e115173(2014).</li>
<li>Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+single-cell+video-mass+spectrometry+for+cellular+and+subcellular+molecular+detection+and+cell+classification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+metabolic+analysis+of+single+plant+cells+by+capillary+microsampling+and+electrospray+ionization+mass+spectrometry+with+ion+mobility+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation.</a> Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).</li>
<li>Rao, W., Pan, N., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Tissue+Imaging+Using+the+Single-probe+Mass+Spectrometry+under+Ambient+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 26 (6), 986-993 (2015).</li>
<li>Pan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-probe%3A+a+miniaturized+multifunctional+device+for+single+cell+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis.</a> Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).</li>
<li>Thomas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+High+Resolution+Spatial+Mass+Spectrometric+Data+during+Acquisition%5BTitle%5D)+AND+%222012+Annual+International+Conference+of+the+Ieee+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society+%28Embc%29%22%5BJournal%5D)">Visualization of High Resolution Spatial Mass Spectrometric Data during Acquisition.</a> 2012 Annual International Conference of the Ieee Engineering in Medicine and Biology Society (Embc). , 5545-5548 (2012).</li>
<li>Luxembourg, S. L., Mize, T. H., McDonnell, L. A., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-spatial+resolution+mass+spectrometric+imaging+of+peptide+and+protein+distributions+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-spatial resolution mass spectrometric imaging of peptide and protein distributions on a surface.</a> Anal. Chem. 76 (18), 5339-5344 (2004).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSW-1%3A+a+natural+compound+with+potent+anticancer+activity+and+a+novel+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">OSW-1: a natural compound with potent anticancer activity and a novel mechanism of action.</a> J Natl Cancer Inst. 97 (23), 1781-1785 (2005).</li>
<li>Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Ambient+MS+Imaging+of+Negative+Ions+in+Positive+Ion+Mode%3A+Using+Dicationic+Reagents+with+the+Single-Probe%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 27 (1), 124-134 (2016).</li>
<li>Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+ion+MS+imaging+to+relatively+quantify+cholesterol+in+the+membranes+of+individual+cells+from+differentially+treated+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secondary ion MS imaging to relatively quantify cholesterol in the membranes of individual cells from differentially treated populations.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3554-3560 (2007).</li>
</ol>

Burada sunulan çalışma ile beyan edecek herhangi bir çıkar çatışmamız yoktur.

Tek prob hem MSI ve SCMS deneyleri için kullanılabilecek bir çok fonksiyonlu bir aygıttır. (Çeviri sahne sistemleri, mikroskoplar, iyon kaynağı arayüzü flanş, vb dahil) tek prob kurulumu esnek mevcut kütle spektrometresi adapte edilebilir bir eklenti bileşeni olarak tasarlanmıştır. Tek prob kurulumu ve geleneksel ESI iyon kaynağı arasında hızlı bir değişim bir dakika içinde yapılabilir. Prensip olarak, uygun bir iyon kaynağı arayüzü flanşı kullanılarak tek prob kurulumu başka bir kitle spektrometreleri uyarlanabilir. Buna ek olarak, çok çeşitli reaktif maddeler ihtiva eden numune çözücünün büyük biyomoleküllerin geniş aralıklarının tespiti artırır reaktif MSI ve SCMS deneyleri için tek prob kurulumu ile kullanılabilir. hayvan doku ve hücre hatlarına ek olarak, tek-prob ayrıca bitkiler gibi diğer biyolojik sistemleri analiz edebilir. Bu nedenle, aynı deney düzeneği ilebenzer kullanıcı eğitimi, çeşitli çalışmalarda, tek bir alet kullanılarak yapılabilir ve aynı kullanıcılar tarafından, asgari eğitim süresi ve enstrümantasyon maliyeti ile gerçekleştirilebilir verimli ve çok yönlü deneyler için izin. Tek prob MS tekniği temel bileşeni sonda kendisidir. Tek prob kalitesini büyük ölçüde hem MSI ve SCMS deneyler kalitesini belirler performansı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Tek problar üretim esnasında, çift delik boru içindeki kılcal damarlar güvenli deneyler sırasında çözücü sızıntı olasılığını ortadan kaldırmak için yapıştırılmış olduğundan emin olun. Menfezler ve kılcal prob imalat sırasında tıkalı değildir, öyle ki, UV sertleştirilebilir epoksi az miktarda kullanımı için çok önemlidir. Tek prob biyolojik numuneler 15 yüksek uzaysal ve kütle çözünürlüğü ortam MSI yapmak için kullanılır olmuştur. Ortam MSI en büyük avantajı üzerindeolmayan ortam yöntemleri numune hazırlama örneği yakın bir Yerli durumda 8 analiz edilebilir bir vakum numune çevre için ihtiyacı olan minimum tutulur olmasıdır. Diğer birçok ortam MSI tekniği önemli engellerden biri mekansal çözünürlükte 1 eksikliği olmuştur. tabanlı desorpsiyon ile karşılaştırıldığında MSI, tek prob küçük uç boyutu daha güçlü ve verimli bir yüzey sıvı mikro-ekstraksiyon yüksek uzaysal çözünürlüğü yol açan küçük bir alanın üzerinde gerçekleştirilmesini sağlayan (örneğin Desi ve LAESI gibi) teknikleri ortam MSI teknikleri 15 kullanılarak elde edilen en yüksek olanlar arasında 8.5 um. Buna ek olarak, örnekleme çözücü bileşenlerini ayarlama deneyler için ekstra esneklik sağlar. Örneğin, reaktif (örn dicationic bileşikleri) ihtiva eden çözücü numune alma metabolitleri PE sayısında önemli bir artış sağlayan reaktif MSI deneyler için kullanılmıştırr deneyi 20. Tek prob diğer avantajı tüm veri toplama sürecinde çalışma kolaylığı sağlar entegre tasarım vardır. ucu ve doku yüzeyi arasındaki mesafe iyon sinyal yoğunluğu ve istikrar, düz doku bölümü alınması ve mesafe varyansını en aza indirmek için ayarlama düzleştirme yüzey yürütülmesi için çok hassas olduğundan yüksek kaliteli MSI deneyler için bir anahtardır. Tek-prob MSI teknikleri pürüzlü yüzeylerde yüksek uzaysal MS görüntüler elde etmek için uygun olmadığını izler. Yüksek kaliteli bir sondasının imal ek olarak, dikkatli bir şekilde aleti ayarlama başarılı MSI deney için gereklidir. Tüm ayar adımlar arasında, doku bölümü yüzeyi üzerinde tek prob ucunun yüksekliğini ayarlamak en kritik biridir. Prob yüksekliğini ayarlarken, numune çözücü pompalamak ve sadece çözücü arka plan iyonu sinyalleri Observ olabilir, böylece, iyonlaşma gerilimine çevirmekEd. dikkatlice doku bölümünde güçlü ve istikrarlı bir iyon sinyalleri görülebilir kadar motorlu Z-sahne kaldırarak prob yüzeyi mesafeyi azaltırken daha sonra kütle spektrumu değişikliği izlemek; Bu sonda yüksekliği deney sırasında MSI veri toplama için kullanılacaktır. Buna ek olarak, optimize edilmiş bir solvent akış hızı MSI deneyleri için gereklidir. Optimize edilmiş prob yüksekliği ile akış hızını ayarlayın. Doku yüzeyine hiçbir çözücü yayılmış olduğundan emin olun (yani, akış hızı çok yüksek) veya nano-ESI yayıcı (yani, hızı çok düşük akış) içindeki kabarcık oluşumu. Tek prob biyo analizler için çok fonksiyonlu bir cihazdır. MSI deneylerinde ek olarak, bu SCMS diğer vakum ile karşılaştırıldığında önemli bir avantaj, canlı ökaryotik hücreler 16 detaylı kimyasal bilgiler, aydınlatmak için in-situ gerçeğe yakın zamanlı yapma yeteneğine sahip olacak şekilde MALDI 10 ve Sims şekilde göre SCMS teknikleri ( 21 </sup&gt;). Sonda ucunun küçük boyutlu yeteneği canlı bir ökaryotik hücre içine sokulabilir ve ayıklamak ve anında MS analizi için hücre içi bileşikler iyonize içerir. Benzer bir şekilde, reaktifler (örneğin, dicationic bileşikleri) ihtiva eden numune çözücüler SCMS deneylerinde kullanılabilir ve hücresel bileşenler geniş bir aralık her zamankinden daha canlı bir tek hücre içinde tespit edilebilir (devam eden bir araştırma, verilerin gösterilmemiştir). gerçek zamanlı analiz sonucu membran ve hücresel içeriği çıkarıldığı hücre penetrasyonu canlı tek hücre kimyasal profilleri, sağlayacak olsa da, soruşturma kapsamında hücre tek prob SCMS tekniği hala ima, deney sonra öldürüldü olacak yıkıcı bir metot. Buna ek olarak, tek prob prob ucu ve nano-ESI yayıcı kolayca deneyimsiz kullanıcılar için tıkanmış olabilir. Cihaz tıkanma olasılığını azaltmak için, bir cel içine tek prob ucu takarken çekirdeğini dokunmamak sağlamakl. Tıkanma meydana gelirse, cihaz tıkanmış prob ucu veya bir homebuilt ısıtma bobini 16 ile yayıcı nano-ESI ısınma ile rejenere edilebilir. Tek prob SCMS tekniğin başka bir sınırlama sadece yapıştırıcı hücreleri (yani, hücreler yüzeylere tutturulur) geçerli kurulumu kullanarak analiz edilebilir olmasıdır. Bununla birlikte, tek prob MS aparatına hücre manipülasyonu sistemi içeren, hücre geniş türleri gelecek incelenebilir. Yüksek kaliteli bir sonda ve optimize edilmiş bir solvent akış hızını elde etmek MSI deneye benzer SCMS çalışmaları için önemlidir. Solvent akış hızı ayarlama yaparken, tek prob ucu (yani, hücre ya da kültür ortamı ile hiç temas) numunenin üzerine yerleştirilen ve nano-ESI içinde prob ucu veya kabarcık oluşumu hiçbir çözücü damlama olduğundan emin olun olduğunu yayıcı.

Kütle spektrometresi görüntüleme (MSI), ilgilenilen bileşiklerin yüzeyler üzerindeki uzamsal dağılımını sağlamak için nispeten yeni bir moleküler görüntüleme tekniğidir. MSI analizi sırasında, kütle spektrometresi (MS) ölçümleri, ilgilenilen türün 2D görüntüsünü oluşturmak için yüzey boyunca tek bir piksel bazında kaydedilir 1. MSI teknikleri, çok çeşitli metabolitler için uzamsal olarak çözülmüş bir özellik dağılımı sağlama yeteneğine sahiptir, bu da bir numuneden geleneksel moleküler görüntüleme tekniklerinin kullanılmasından çok daha fazla miktarda bilgi elde edilmesine olanak tanır ve biyolojik ve farmakolojik çalışmalar için biyolojik numunelerin analizini büyük ölçüde iyileştirme potansiyeline sahiptir 2. MSI, genel olarak ortam dışı ve ortam yaklaşımları olarak ikiye ayrılabilir. Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu (MALDI) MS 3 ve uçuş süresi ikincil iyon MS (ToF SIMS) 4 gibi ortam dışı MSI analiz teknikleri, yüksek uzamsal çözünürlük (sırasıyla yaklaşık 5 μm ve 100 nm) ve yüksek hassasiyet yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, bu yöntemler, matris moleküllerinin numune yüzeyine uygulanması ve elde edilen verilere artefaktlar getirebilecek bir vakumlu numune alma ortamı gibi kapsamlı numune hazırlama gerektirir. Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu (DESI) MS 5, lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyonu (LAESI) MS 6 ve nano-DESI MS 7 gibi ortam teknikleri, ortam ortamında çok az veya hiç ön hazırlık yapılmadan numunelerin MSI'sini yapabilir, bu da numuneyi en doğal haliyle potansiyel olarak yansıtan MS görüntüleri üretebilir. Bununla birlikte, bu tekniklerin çoğu, ortam dışı tekniklere kıyasla genellikle yüksek uzamsal çözünürlük ve algılama hassasiyetinden yoksundur ve deneyler tipik olarak piksel başına yaklaşık 150 μm'de gerçekleştirilir 8.
Tek hücre analizi (SCA), biyolojik örneklerin kimyasal bileşimini hücresel düzeyde karakterize etme yeteneğine sahip büyüyen bir alandır. SCA, biyolojik sistemlerin, bir hücre popülasyonunun ortalama sonucunu üreten geleneksel hücre analiz tekniklerinden daha temel bir düzeyde analiz edilmesini sağlar ve potansiyel olarak daha önce inatçı olan içgörüler sağlar 9. MS teknikleri son zamanlarda SCA'ya (tek hücreli kütle spektrometresi veya SCMS olarak adlandırılır) MALDI MS 10 ve ToF SIMS 11 gibi hücrelerin analizden önce ön işleme tabi tutulduğu ortam dışı teknikler kullanılarak ve LAESI MS 12 gibi ortam teknikleri ve canlı tek hücreli video-MS 13, 14 gibi doğrudan ekstraksiyon yöntemleri kullanılarak uygulanmıştıryumurta, bitki ve kanser gibi çok çeşitli hücre tiplerini analiz etmek için. Ortam teknikleri, canlı hücrelere uygulanma avantajına sahiptir, bu da artefaktları en aza indirir ve canlı hücrelerdeki metabolitlerin daha iyi temsil edilmesine yol açar. Bununla birlikte, yukarıda açıklanan doğrudan ekstraksiyona dayalı yöntemler, numune ekstraksiyonu ve analiz sürecini iki farklı adımda gerçekleştirir, bu da analiz sırasında numune içinde bulunan metabolitleri potansiyel olarak değiştirebilecek bir zaman aralığı ile sonuçlanır. 
Tek prob, biyolojik doku bölümleri 15 üzerinde yüksek uzamsal çözünürlüklü ortam MSI ve canlı tek hücreler 16 üzerinde neredeyse gerçek zamanlı yerinde SCMS gerçekleştirebilen minyatür çok işlevli bir cihaz. Tek prob, bir solvent sağlayan giriş ve erimiş silika kılcal damarlardan yapılmış bir nano-ESI yayıcı ile birleştirilmiş çekilmiş çift delikli bir kuvars kılcal damardan oluşan entegre bir yapıya sahiptir ve solvent dağıtımının ve analit ekstraksiyonunun tek bir cihazdan gerçekleştirilmesini sağlar. Ortam MSI modunda, tek prob numune dokusunun üzerine yerleştirilir ve yüzey mikro ekstraksiyonu gerçekleşir, bu da yüksek uzamsal çözünürlükte rasterleştirilmiş bir MS görüntüsünün yapılmasına izin verir. Özellikle, tek probun konik ucu, yerinde SCMS analizi için canlı ökaryotik hücrelere yerleştirilecek kadar küçüktür, burada metabolit tespiti, prob yerleştirme ile MS tespiti arasında iki saniyeden daha az sürer ve kimyasal bilgilerin neredeyse gerçek zamanlı olarak alınmasına olanak tanır. Tek problu cihazı imal etmek ve tek problu MS tekniklerini kullanarak hem ortam MSI hem de SCMS modlarını yürütmek için protokoller aşağıda verilmiştir.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><güçlü>Tek problu fabrikasyon</güçlü></td></tr><tr><td>Çift delikli kuvars boru, 1.120' &rsquo; &zamanlar; 0,005 inç &zamanlar; 12 inç</td><td>Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ&nbsp;</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet lazer çektirme&nbsp;</td><td>Sutter Enstrüman A.Ş., Novato, CA&nbsp;</td><td>Model P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Sigortalı silika kılcal, ID: 40&nbsp; &mikro; m, OD: 110&nbsp; &mikro; m</td><td>Molex, Lisle, IL</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>UV kürleme reçinesi&nbsp;</td><td>Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, ABD</td><td>Ürün No. 006.030</td><td></td></tr><tr><td>LED UV lambası</td><td>Foshan Liang Ya Diş Ekipmanları, Guangdong, Çin</td><td>LY-C240</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi reçine</td><td>Devcon, Danvers, MA&nbsp;</td><td>Parça No. 20945</td><td></td></tr><tr><td>Inline MicroFilter&nbsp;</td><td>IDEX Sağlık & Bilim LLC, Göl Ormanı, IL</td><td>M-520</td><td></td></tr><tr><td>Microunion&nbsp;</td><td>IDEX Sağlık & Science LLC, Lake Forest, IL</td><td>M-539</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lamı (cam)</td><td>C & Bilimsel - Prömiyer, Manassas, VA&nbsp;</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga&nbsp;</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>1725LTN 250UL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kütle spektrometresi</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Kütle spreksenometresi</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td>LTQ Orbitrap XL</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 2.1 Yazılımı</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td></td><td></td>XCALIBUR21</tr><tr><td>Fance Sahne Kontrolü</td><td>Pasifik Kuzeybatı Ulusal Laboratuvarı, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSI Hızlı Görünüm</td><td>Pasifik Kuzeybatı Ulusal Laboratuvarı, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kontak kapatma cihazı</td></tr><tr><td>USB-6009 Çok İşlevli DAQ</td><td>Ulusal Aletleri, Austin, TX</td><td>779026-01</td><td></td></tr><tr><td>DR-5V SDS Röle</td><td>Panasonic, Kadoma, Japonya&nbsp;</td><td>DR-SDS-5</td><td></td></tr><tr><td>Mantık Kapıları 50 Ohm Hat Sürücüsü</td><td>Texas Instruments, Dallas, TX&nbsp;</td><td>SN74128N</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Tek problu kurulum</güçlü></td></tr><tr><td>Motorlu lineer kademe ve kontrolör (3 set)</td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>Conex-MFACC</td><td></td></tr><tr><td>Minyatür XYZ aşaması</td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>MT-XYZ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Çeviri XY aşaması</td><td>ThorLab, Newton, NJ</td><td>PT1 ve PT102</td><td></td></tr><tr><td>Thermo LTQ XL iyon kaynağı arayüz flanşı</td><td>Yeni Amaç, Woburn, MA&nbsp;</td><td>PV5500</td><td></td></tr><tr><td>Dijital stereo mikroskop, 250X - 2.000X</td><td>Shenzhen D& F Co., Shenzhen, Çin</td><td>Supereyes T004</td><td></td></tr><tr><td>USB Dijital Fotoğraf Mikroskobu&nbsp;</td><td>DX.com, HongKong, Çin</td><td>S02 25 ~ 500X & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Chemyx Inc., Stafford, TX&nbsp;</td><td>Nexus 3000</td><td></td></tr><tr><td>Katı Alüminyum Optik Breadboard, 8" x 8" x 1/2"</td><td>Thorlabs, Newton, NJ</td><td>MB810</td><td></td></tr><tr><td>Esnek kelepçe tutucu</td><td>Siskiyou, Grants Pass, VEYA&nbsp; &nbsp;</td><td>MXB-3h</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solvents</td></tr><tr><td>Methol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34860 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td>Su</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34967 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Hücre kültürü</strong</td></tr><tr><td>>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr>% <tr><td>10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco/Life Technologies, Long Island, NY</td><td>10100-139</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES (pH 7.4)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>TripLE Ekspres&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA&nbsp;</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu plakalar&nbsp;</td><td>Corning Inc., Corning, NY&nbsp;</td><td>Falcon 351143</td><td></td></tr><tr><td>T25 şişesi</td><td>Corning Inc., Corning, NY&nbsp;</td><td>Falcon 3055</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Kapaklı Gözlükler, Yuvarlak, No. 1</td><td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetil Sülfoksit)</td> <td>VWR Uluslararası, Radnor, PA&nbsp;</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Doku görüntüleme</td></tr><tr><td>Cyro-Cut Microtome</td><td>American Optical Coporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek, Optimum kesme sıcaklığı (OCT)&nbsp;</td><td>Sakura Finetek Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lam (polikarbonat)</td><td>Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL</td><td>P11011P</td><td></td></tr></tbody></table>

tek prob uygulamalar: ortam koşullarında kütle spektrometre görüntüleme ve tek hücre analizi

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) ve ortam koşulları altında yerinde tek hücreli kütle spektrometresi (SCMS) analizi, biyolojik örneklerden biyomoleküllerin ayrıntılı kütle spektrometresi (MS) analizi için büyük potansiyele sahip, gelişmekte olan iki alandır. Entegre örnekleme ve iyonizasyon özelliklerine sahip minyatür bir cihaz olan tek prob, hem ortam MSI hem de yerinde SCMS analizi gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Ortam MSI için, tek prob, numunenin MS analizini sürekli olarak yürütmek için yüzey mikro ekstraksiyonunu kullanır ve bu teknik, fare beyni ve böbrek bölümleri gibi biyolojik numunelerden yüksek uzamsal çözünürlüğe (8,5 μm) sahip MS görüntülerinin oluşturulmasına izin verir. Ambient MSI, analizden önce çok az numune hazırlığına ihtiyaç duyulması veya hiç numune hazırlanmasına ihtiyaç duyulmaması avantajına sahiptir, bu da veri toplamada mevcut olan potansiyel artefaktların miktarını azaltır ve elde edilecek numunenin daha temsili bir analizine olanak tanır. In-situ SCMS için, tek prob ucu, küçük örnekleme ucu boyutu (< 10 μm) nedeniyle HeLa hücreleri gibi canlı ökaryotik hücrelere doğrudan yerleştirilebilir ve bu teknik, tek tek hücrelerin içindeki çok çeşitli metabolitleri neredeyse gerçek zamanlı olarak tespit edebilir. SCMS, tek hücre düzeyinde elde edilecek kimyasal bilginin daha fazla hassasiyetini ve doğruluğunu sağlar, bu da biyolojik süreçler hakkındaki anlayışımızı daha önce mümkün olandan daha temel bir düzeyde geliştirebilir. Tek problu cihaz, çok çeşitli MSI ve SCMS çalışmaları için potansiyel olarak çeşitli kütle spektrometreleri ile birleştirilebilir.

Tek prob başarıyla kesitli fare böbrek dokusunun 15 ortam MSI analizi için kullanılmıştır. Cihaz MSI sonuçlarında bol iyon sinyalleri şiddetleri yol açan küçük bir alandan yüksek verimli analit çıkarma sağlayan yüzey sıvı mikro-ekstraksiyon (Şekil 1a), mekanizmasını kullanır. Örneğin, 10&#39;dan fazla 7 sinyal yoğunlukları bazı bol metabolitleri (Şekil 2a) için elde edilmiştir. + (725,5575 m / z) [PC (32: metabolitlerin çok sayıda, bir sfingomyelin sayısı (SM) ve fosfatidilkolin (PC) gibi türler [+ Na SM (1 34)] dahil olmak üzere, bu şekilde tespit edilmiştir: 0) + H] + (734,5700 m / z) [PC (34: 1) + Na] + (782,5696 m / z), ve [bilgisayar (38: 5 + Na)] + (814,5726 m / z). t birleştiğinde Bu bileşikler yüksek kütle çözünürlüğü ve kütle doğrulukla tespit edildioa yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi. Örneğin, kimlik (örn, gözlenen ve teorik değerler arasındaki fark) sonuçları, her metabolit için (Şekil 2b) Burada sunulan en az 4 ppm m / z kütle hassasiyeti elde edilmiştir. Buna ek olarak, ikili MS (örneğin, MS / MS) de ilgi türlerinin daha güvenli tespiti için yapılan analizleri. 15 Nedeniyle küçük bir alanda etkili sıvı mikro-çıkarma gerçekleştirme yeteneği, tek prob cihaz ortam koşulları 15 altında yüksek uzaysal çözünürlüğü MSI deneyler gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, fare böbrek bölümlerinin ayrıntılı MS görüntüler seçilen metabolitlerin (Şekil 2c) uzamsal dağılımını gösteren elde edilmiştir. MS görüntünün uzaysal çözünürlüğü TRANSITI sahip yaygın olarak kullanılan metrik ardından 8.5 mikron olduğu belirlendi. MS sinyalin bir% 20-80 yoğunluk değişim içinde belirlenen bir keskin özelliği noktasında 18 fosfolipid durumunda üzerindeki [PC (38: 5 + Na)] + fare böbrek bölümünde, iç medulla arasındaki özellik geçiş üzerinde ve dış medulla bir yoğunluk bir değişiklik daha büyük% 20-80 aralığını gösteren, zaman çizelgesi içinde bir tarama döngüsü boyunca gerçekleşir. Numune hareket hızı (10.0 mm / sn) ve MS veri toplama hızı (0.85 sn / spektrum), örnek bir MS mesafe döngüsü (8.5 mikron), yani MSI uzaysal çözünürlüğü tarama hareketli, hesaplanabilir (Şekil dayalı 2d). Bu uzamsal çözünürlük henüz biyolojik örnekler üzerinde yapılan ortam MSI teknikleri için elde edilen en yüksek arasındadır. SCMS için tek prob bireysel canlı HeLa hücrelerinde 16 analiz elde etmeyi başardı. Tek prob uç boyutu (tipik olarak Şekil 10&#39;un mikronkadar küçük ure 3a), doğrudan bu çapı ekstre ve MS analizi için, ~ 10 um olan ökaryotik hücrelerin, birçok çeşit eklenecek. Bir hücre içine, tek sonda ucunun sokma işlemi görsel olarak, bir dijital stereo mikroskop kullanılarak izlenebilir (Şekil 3b) ve hücre membran penetrasyonu PBS (ya da taze hücre kültüründen kütle spektrumlarının, hızlı ve önemli bir değişiklik ile teyit edilebilir hücre içi bileşikler (Şekil 3C ve 3D) ortamı). Deneyler, moleküler türlerin daha geniş türleri tespit etmek için, pozitif ve negatif iyon modlarında gerçekleştirilebilir. Adenosin fosfatlar (AMP, ADP ve ATP) Negatif iyon modunda (Şekil 3C ve d) &#39;de tespit edilmiştir, oysa Örneğin 18 farklı lipid türleri, sfingomyelinleri (SM) ve fosfatidilkolinler (PC) içeren, pozitif mod tespit edilmiştir. Tek prob yerleştirme i arasındaki zaman gecikmesibir hücre ve sinyal algılama nBu hücresel metabolitlerin neredeyse gerçek zamanlı tespitine olanak sağlayan, genellikle iki saniyeden daha kısa olmuştur. SCMS, hücrelerin anti-kanser ilaçları (örneğin, OSW-1, paklitaksel, ve doksorubisin) 19] ile muamele edilmiş deney uygulanmıştır. Karşılık gelen ilaçların konsantrasyonlarda (yani, 10 nM, 100 nM, 1 uM ve 10 uM), DMSO (dimetil sülfoksit), muamele edilmemiş hücreler kullanılarak (DMSO yalnızca ilave bir dizi 4 saatlik tedaviden sonra HeLa hücreleri içinde tespit edilebilir ) kontrol olarak. İlaçların MS sinyalleri hücre PBS ya da kontrol (Şekil 3e) içinde mevcut değildi, ama tek prob MS tekniği (sadece 100 nM tedavi sonuçları Şekil 3F&#39;de gösterilmektedir) kullanılarak, tek hücreler içinde tespit edildi. Hücreler, PBS (ya da taze hücre kültür aracı) durulandı için, endojen metabolitlerin (örneğin, hücre lipidler, bir algılama hücre dışı bileşikler ve kirletmesini kaldırmaD adenosin fosfatlar) ve dış bileşikler (örneğin, anti-kanser ilaçları) Bir prob MS tekniği hücre içi bileşikleri analiz etmek için kullanılabileceğini gösterir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig1.jpg" /> Şekil 1. Fabrikasyon ve ortam MSI ve SCMS analizi için tek prob kurulumu a.) Tek prob Fabrikasyon prosedürleri. B) cam slayt. C) tek Fotoğraf bağlı bir fabrikasyon tek prob Fotoğraf bir kütle spektrometresi. d bağlı prob kurulumu) bir kütle spektrometresi ile birleştiğinde tek prob kurulum şeması. bir deney sırasında, örnekleme çözücü sürekli şırınga sağlanır, iyonizasyon voltajı kütle spektrometresi iletken birliğe uygulanır, iki dijital mikroskoplar örnek yerleştirme izlemek için kullanılır, motorize XYZ sahne) özelleştirilmiş dijital stereoskop sistemi. f) Fotoğraf optik kurulu aracılığıyla iyon kaynağı arayüzü flanş bağlanan dijital Stereoskop gösteren fotoğraftır sistemi örnek hareketini kontrol etmek için kullanılır, ve bir kütle spektrometresi analizi. e kullanılmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig1large.jpg" target="_blank">için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig2.jpg" /> Şekil yüksek uzaysal ve kütle çözünürlüğe sahip bir fare böbrek bölümünün bir ortam MSI çalışma 2. Sonuçlar a.) Tek prob MSI bir temsilci kütle spektrumu. 3.39 x 10 7 (keyfi birimleri) ulaşabilir tespit metabolitlerin maksimum yoğunluk. B) tespit metabolitlerin bir seçimi) kitlesel doğruluğu. C sunulanMS görüntüleri [PC (32: 0) + H] + ve [PC (34: 1) + Na] + 8,5 mikron mekansal çözünürlükte bir fare böbrek bölümünden alınan. PC: fosfatidilkolin. Ölçek çubuğu: 2 mm; 0.20 mm (ilave) d) uzaysal MS görüntünün çözünürlüğü belirlenmesi. [PC (38: 5) + Na] + (referans 15 izni ile uyarlanmıştır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53911/53911fig3.jpg" /> Şekil yüksek kütle çözünürlüğü ile ilaç tedavisi HeLa hücrelerinin bir ortam SCMS analizinden 3. Bulgular a.) Zoomed-çapı &lt;10 mikron tipik bir boyutu gösteren tek prob ucunun fotoğrafının. B) Fotoğraf noktasında alınan bir HeLa hücre içine tek prob yerleştirilmesi. Ölçek çubuğu: 50 mikron.c) PC (fosfatidilkolin) türleri. d) HeLa hücrelerinde pozitif ve negatif iyon modlarında. EF) uygulamaları için kütle spektrumlarının SCMS analizi ile tespit edilen metabolitlerin temsili bir listesini bir dizi kimlik bilgileri ile tipik bir pozitif iyon modu kütle spektrumu kontrolü ve tedavi (100 nM OSW-1) hücreleri (referans 16 izni ile uyarlanmıştır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil S1. Kütle spektrometresi veri toplamak için kontak kapatma sinyali üretmek için kullanılan elektronik cihazın devre şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911figS1.jpg" target="_blank">Görüntülemek veya bu rakamı indirmek için tıklayınız.</a>

Burada, MS analizi için minyatür çok işlevli bir cihaz olan tek probu kullanarak hem dokuların ortam kütle spektrometresi görüntülemesini (MSI) hem de yerinde canlı tek hücreli MS (SCMS) analizini gerçekleştirmek için protokoller sunuyoruz.

Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Bu yöntemin genel amacı, ortam koşullarında kütle spektrometrisi kullanarak canlı tek hücreleri analiz etmek için mikro ölçekli bir örnekleme cihazı olan Single-probe'u oluşturmaktır. Ayrıca, biyolojik dokuların yüksek uzamsal çözünürlükte ortam kütle spektrometrisi görüntülemesini gerçekleştirmektir. Bu yöntem, biyolojik ve farmasötik çalışmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Canlı tek hücrelerde hangi moleküllerin bulunduğu ve bunların dokularda nasıl dağıldığı gibi sorulara yanıt verir. Bu tekniğin temel avantajı, tekil probun hem canlı tek hücre analizi hem de yüksek çözünürlüklü ortam kütle spektrometrisi görüntüleme deneyleri için kullanılabilen çok fonksiyonlu bir cihaz olmasıdır. Bu yöntem tek hücreleri ve dokuları analiz edebilse de, kimyasalların seyrek analizi ile canlı mikrokoloniler ve biyofilmler gibi mikro ölçekli örneklemenin istendiği diğer sistemlere de uygulanabilir.Prosedürü benimle birlikte laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Wei Rao gösterecek. İlgilenilen tam bir fare organını küçük plastik bir kuyucuğun merkezine yerleştirin. Organı, yaklaşık 10mm yüksekliğe kadar doku gömme bileşiği ile kapatın.Dokuları anında dondurmak için derhal sıvı azota yerleştirin. Fare doku kesitini hazırlamak için, dondurulmuş fare organını alın ve sıcaklık kontrollü bir kriyomikrotomda 15 °C'ye kadar çözdürün. Dokuyu yaklaşık 500 µL doku gömme bileşiği ile bir çelik tabana sabitleyin ve istenen kesme yönünün bıçağa dönük olduğundan emin olacak şekilde bir kriyomikrotom kesit montaj aparatına yerleştirin.Dokuyu 12 mikron kalınlığında kesin. Ardından, kesilen doku dilimlerini polikarbonat mikroskop lamlarına yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumaya bırakın. 1 mililitre HeLa Hücre Süspansiyonu gibi bir hücre örneği temin edin ve bunu standart 10 cm'lik bir hücre kültürü plağındaki 9 mL komple hücre kültürü ortamına ekleyin.Hücreleri, hücre kültüre plağındaki büyüme yüzeyi %70-80 oranında kaplanana kadar iki ila üç gün boyunca 37 °C'de, %5 CO2 ile kültürde tutun. Hücre kültüre plağında hücre pasajlama işlemini gerçekleştirin. Bunun için, büyüme ortamını aspire edin ve hücreleri 5 mL 1x fosfat tamponlu salin ile durulayın.Steril bir aspirasyon ucu kullanarak PBS'yi uzaklaştırın ve hücreleri kültür plakasına tutunmuş halden ayırmak için 37 °C'de yaklaşık 5 dakika boyunca 2,5 mL tripsin ile inkübe edin. 7,5 mL tam hücre kültür medyumu ekleyerek tripsin aktivitesini durdurun ve ardından hücreleri homojen bir şekilde yeniden süspanse edin. Tek hücreli kütle spektrometrisi veya SCMS deneyi için hücre örneklerini hazırlamak amacıyla, öncelikle tekil mikro-lamel camları 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin.Ardından, kuyucuğa 1.8mL hücre kültür ortamı ve 0.2mL hücre süspansiyonu ekleyin. Plakayı hafifçe çalkalayarak hücreleri nazikçe karıştırın ve ardından yaklaşık 24 saat boyunca 37 derece Celsius sıcaklıkta ve %5CO2 ortamında inkübe edin. Kültürlenen hücrelerin ilaç uygulamasını gerçekleştirmek için 12 kuyucuklu hücre kültür plağına bir ilaç bileşiği çözeltisi ekleyin.Çift lümenli kuvars tüpü bir lazer mikro-pipet çekiciye yerleştirin ve çift lümenli bir kuvars iğne çekin. Başlangıç değerleri olarak ısıyı 400, filamenti üç, hızı 80, gecikmeyi 150 ve çekme kuvvetini 250 olarak ayarlayın. Çekilen ucu, diğer uçta yaklaşık 5mm çekilmemiş çift lümenli kuvars kapiler kalacak şekilde kesin.Çözücü sağlayan kılcal boru olarak kullanılmak üzere, 80mm uzunluğunda bir erimiş silika kılcal boru parçası kesin. Ardından kılcal boruyu, çift açıklıklı kuvars iğnenin düz ucundaki açıklıklardan birine yerleştirin. nanoESI emitörü olarak erimiş silika kılcal boruyu alevle çekerek hazırlayın, 7-10mm uzunluğunda kesin ve çift açıklıklı kuvars iğnenin düz ucundaki diğer açıklığa yerleştirin.Çift lümenli kuvars iğnenin düz ucuna minimum miktarda UV kürleme reçinesi uygulayın. Solvent sağlayan kapileri ve nanoESI emitörünü sabitlemek için reçineyi bir LED UV lamba kullanarak yaklaşık 20 saniye boyunca katılaştırın. Ardından, standart bir mikroskop cam lamini boylamasına ikiye bölün.Ardından, nanoESI emiteri dışarıya bakacak şekilde tekli probu lam camının bir ucuna yerleştirin. Gece boyunca sertleşmeye bırakmadan önce, tekli probun gövdesine lam camına sabitlenmesini sağlayacak şekilde standart epoksi uygulayın. Bu sistem, kütle spektrometresinin özelleştirilmiş bir iyon kaynağı arayüz flanşını ve USB dijital mikroskop, minyatür manuel XYZ translasyon tablası ve motorlu XYZ translasyon tablası sistemi ile bağlantılı olan bir alüminyum optik kartı içerir.Kütle spektrometresinin iyon kaynağı arayüz flanşını modifiye edin ve dijital stereomikroskobun standını metin protokolünde açıklandığı şekilde imal edin. Modifiye edilmiş dijital stereomikroskobu, bir USB dijital mikroskobu, esnek bir klemps tutucuya sahip minyatür bir manuel XYZ çeviri tablasını ve motorlu XYZ çeviri tablası sistemini alüminyum optik levhaya sabitleyin. Tekli prob takılı olan lamı sabitlemek için esnek klemps tutucuyu kullanın.Ardından, tek problu düzeneği kütle spektrometresine bağlayın. Tek probun emiterini kütle spektrometresinin girişine yerleştirmek için esnek kıskaç tutucusunu ve minyatür XYZ tablasını ayarlayın. Örnek kesitini oda sıcaklığında çözdürün ve tek probun altındaki motorlu XYZ taşıma tablası sistemine yerleştirin.Kontrol yazılımındaki koordinatları değiştirerek numune konumunu ayarlayın. Numune çözücüsünü uygun bir hızda pompalamak için bir şırınga kullanın. Ardından, iyonizasyon voltajını uygulayın.Tek problu ucu, numunenin yüzeyinin hemen üzerinde duracak ve metabolitlerin yüzey ekstraksiyonunu gerçekleştirebilecek şekilde ayarlayın. Z tablasını dikkatlice kaldırın ve ardından tek problu ucun ucu ile doku yüzeyi arasındaki mesafe değişimini izlemek için USB dijital mikroskobu kullanın. Numunede ilgilenilen kesit boyunca raster tarama parametrelerini ayarlayın.Burada sunulan fare böbrek kesitleri için saniyede 10 mikrometre tarama hızı ve çizgiler arasında 20 mikrometre mesafe kullanın. Parametreleri, örnek içindeki ilgili kesit boyunca tarama yapacak şekilde ayarlayın. Burada sunulan fare böbrek kesitleri için saniyede 10.0 mikrometre tarama hızı ve çizgiler arasında 20 mikrometre mesafe kullanın.Kütle spektrometresinden MS spektrumlarının otomatik olarak elde edilmesi için bir yöntem belirleyin. Fare böbreği örneği üzerinde yüksek kütle çözünürlüklü MSI için 60.000 kütle çözünürlüğü, 5kV pozitif mod, 1 mikrotaraması, 150 milisaniye maksimum enjeksiyon süresi ve otomatik kazanç kontrolü (automatic gain control) açık ayarlarını kullanın. MSI veri toplama işlemini başlatın ve ardından metin protokolünde açıklandığı şekilde ham MS dosyalarından MS görüntüleri oluşturun.Tek prob sistemini MSI talimatlarına göre kurun ve çözücü akış hızını ayarlayın. Kültür ortamını ve hücre dışı ilaç bileşenlerini uzaklaştırmak için mikro ön cam lamlar üzerinde tutunmuş kültür hücrelerini PBS ile yıkayın. Ardından, hücre içeren cam lamı deney için motorlu XYZ translasyon tablası sistemine yerleştirin.Analiz sırasında hücre penetrasyonunu izlemek için dijital stereomikroskobu numunenin üzerindeki tekli prob ucuna odaklayın. Tekli prob üzerindeki nanoESI emitörünün çalışma koşullarını izlemek için tekli probun yan tarafındaki USB dijital mikroskobu kullanın. İlgilenilen bir hücreyi bulmak ve tekli prob ucunu numunenin üzerine hassas bir şekilde konumlandırmak için motorize XYZ tabla kontrol programını ve dijital stereomikroskobu kullanın.Tek problu uç hücreye yerleştirilmeden önce MS veri toplama işlemini başlatın. Tek problu ucu hücreden çıkarmak için hücreyi içeren plakayı aşağı indirin. Son olarak, tek probu tamamen temizlemek için çözücünün yaklaşık üç dakika boyunca akmasına izin verin.Fare böbrek kesitlerinin ortam kütle spektrometrisi görüntülemesi gerçekleştirilmiş ve doku yüzeyinde bulunan çok sayıda molekül tespit edilebilmiştir. Doku yüzeyindeki birden fazla molekülün uzaysal dağılımı ve göreceli bolluğu grafiğe dökülmüştür. Kütle spektrometrisi verilerinde mevcut olan özelliklerin keskin geçişlerinin gözlemlenmesiyle 8,5 mikronluk bir uzaysal çözünürlük elde edilmiştir.Keskin uçlu ve açık kanallı tek bir probun üretilmesi, tek hücre analizi için kritik öneme sahiptir. Hedef hücreleri belirlemek ve hücre penetrasyon sürecini izlemek için mikroskoplara ihtiyaç duyulur. Kütle spektrolarındaki sinyal değişimi, hücre penetrasyonunu onaylamak için ek bilgi sağlar.Canlı tek hücrelerden çok sayıda molekül tespit edilmiştir. Anti-kanser ilaç çalışmaları için kullanıldığında, anti-kanser ilaç tedavisinin farkını göstermek amacıyla kontrol hücre deneylerinden yararlanılır. Bu videoyu izledikten sonra, tekli probun nasıl üretildiği, bu cihazın tek hücre kütle spektrometrisi analizinde ve biyolojik dokuların ortam kütle spektrometrisi görüntülerlemesinde nasıl kullanıldığı hakkında kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, tek probun cihazının üretilmesi, tüm sistemin kurulması ve cihazların çalıştırılması için ayrıntılı talimatlar gerektiğinden zorluk yaşayabilirler. Yöntem kavrandıktan sonra, tek hücre analizi birçok hücre için sürekli olarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca her bir analiz üç dakikadan daha kısa sürer.Ortam MS görüntüleme deneyini tamamlamak; örnek boyutuna, uzamsal çözünürlüğe ve kullanılan kütle spektrometresine bağlı olarak birkaç saat sürebilir. Bu prosedürü uygularken, yüksek kaliteli tek bir prob üretmenin kilit adım olduğunu unutmamak önemlidir. Ayrıca, bir deneyi başarıyla gerçekleştirmek için cihazın ayarlanması ve çalıştırılması kritik öneme sahiptir.Burada sunulanlara benzer prosedürler izlenerek diğer yöntemler de geliştirilebilir. Örneğin, örnek çözücüsüne reaktifler eklenebilir ve örneklerdeki moleküllerin tespitini artırmak için reaktif tek hücre analizi ve ortam MSI gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, hem tek hücre analizi hem de ortam koşulları altındaki kütle spektrometrisi görüntüleme çalışmaları yapan araştırmacıların önünü açmıştır.Bu teknik potansiyel olarak hücre biyolojisi araştırmaları, farmakoloji çalışmaları ve klinik testler için kullanılabilir. Keskin kuvars kapilerler ve UV ile kürlenen epoksi ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve UV koruyucu gözlük takmak gibi önlemler alınmalıdır.

applications-single-probe-mass-spectrometry-imaging-single-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi hücreleri örnek bilenmiş bir fiber optik kablo kullanılarak, atmosferik basınç, bitki ve hayvan hücreleri üzerinde kütle spektrometresi ile tek bir hücre analizi yapılır.

Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

Ölümsüzleştirilmiş kanser hücre çizgileri, 3D hücre kültürleri, biyolojik araştırmaları için değerli bir model olarak yetiştirilebilir. Bu protokol numune hazırlama platformu gelişmeler de dahil olmak üzere 3D hücre kültürleri, kütle spektrometresi görüntüleme açıklanır. Bu protokolün amacı kütle spektrometresi görüntüleme analizi için 3D hücre kültürleri hazırlamak için kullanıcılardan etmektir.

3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune

Biz hızlı içinde in situ örnekleme yüksek kesinlik ve en az işgal kılcal tabanlı mikro-örnekleme, kimyasal bir anlık görüntüsünü metabolik aktivite karakterizasyonu kolaylaştırmak için kullanarak tek bir hücre bulunan küçük bir bölümünün etkinleştirmek adımları tarif canlı embriyolar bir ölçüye göre tek hücre Kapiler Elektroforez ve kütle spektrometresi platformu kullanarak.

Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

Numune hazırlama bir roman yöntemi görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak küçük molekül alışverişte algılamak için hücre ve doku coculture karşılamak için geliştirilmiştir.

Doku ve kütle spektrometresi Imaging kullanarak hücreleri arasında küçük molekül iletişim yakalama

Entegre hücre manipülasyon platformu, ortam koşullarında bireysel süspansiyon hücrelerinin on-line analizi için tek prob Kütle Spektrometrisi kurulumu ile birlikte kullanılmak üzere geliştirilmiştir.

Entegre hücre manipülasyon platformu tek süspansiyon hücrelerinde Ilaçların ve metabolitlerin Kütle Spektrometrisi analizi için tek prob ile birleştiğinde

Bu makalede, ortam kütle spektrometresi dayalı benzersiz bir gerçek zamanlı analitik yöntem için örnek hazırlama yöntemleri tanıtılmaktadır. Bu yöntem, herhangi bir özel ön işlem olmadan in vivo biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı analizini yapmamızı sağlar.

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Bu protokol, tek hücreli çözünürlüğe ulaşabilen entegre bir Raman spektroskopi-kütle spektrometresi (MS) platformu sunar. Raman spektroskopisi ilaçlara hücresel yanıt çalışma için kullanılabilir, MS ilaç alımı ve metabolizma hedefli ve kantitatif analizi için kullanılabilir iken.

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Bu protokolde, memeli hücrelerinin, hem manuel hem de otomatik pipetleme seçenekleriyle, ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve ekipmanlar kullanılarak kütle spektrometresi yoluyla tek hücreli proteomik analiz için nasıl hazırlanacağını açıklıyoruz.

Dondurarak Isı Lizisi ve İzobarik Taşıyıcı Kullanarak Kütle Spektrometresi Analizi için Tek Hücreli Proteomik Hazırlık

Bu protokol, floresan kılavuzlu, tek hücreli MALDI-2 kütle spektrometresi için mikroMS kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve birincil sıçan nöronal hücrelerinin gelişmiş moleküler profilini çıkarmayı sağlar.

Bireysel Sıçan Nöral Hücrelerinin Lazer Kaynaklı Postiyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Floresan Kılavuzluğunda Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon

Bu protokol, uçucu tuz çözeltisi yıkama, hızlı sıvı nitrojen söndürme, dondurarak kurutma ve -8 °C'de depolamayı birleştirerek tek hücreli kütle spektrometrisi (SCMS) için hücre metabolitlerini korumayı amaçlamaktadır. Metabolit profillerini korumak için sıvı nitrojen söndürmenin gerekli olduğunu, metabolik değişiklikleri önlemek için uzun süreli soğuk depolamanın en aza indirilmesi gerektiğini göstermektedir.

Tek Hücreli Kütle Spektrometresi Metabolomik Çalışmaları için Numune Hazırlama: Kombine Hücre Yıkama, Söndürme, Kurutma ve Depolama

Bu protokol, yüksek mekansal çözünürlüklü metabolomik analiz için desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu ve Orbitrap kütle spektrometreleriyle eşleştirilen OVCAR-8 hücrelerinin tek hücreli kütle spektrometrisi görüntülemesini açıklar.

Orbitrap Kütle Spektrometrelerine Bağlı Desorpsiyonlu Elektrosprey İyonizasyon Kullanarak Tek Hücreli Kütle Spektrometrisi Görüntüleme

Öğrenin, Single-probe cihazı ile ortam koşullarında canlı tek hücre ve doku analizi için kütle spektrometresi görüntüleme yöntemini. Bu teknik, biyolojik ve farmasötik araştırmalarda yüksek çözünürlüklü moleküler dağılım haritalaması sağlar.

Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Daha fazla video keşfet