Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Bu yöntemin genel amacı, ortam koşulları altında kütle spektrometresi kullanarak canlı tek hücreleri analiz etmek için mikro ölçekli bir örnekleme cihazı olan Tek prob oluşturmaktır. Ve biyolojik dokuların yüksek uzamsal çözünürlükle ortam kütle spektrometresi görüntülemesini gerçekleştirmek. Bu yöntem, biyolojik ve farmasötik çalışmalarda temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Canlı tek hücrelerde bulunan moleküller nelerdir ve dokularda nasıl dağılırlar gibi. Bu tekniğin temel avantajı, tek probun hem canlı tek hücre analizi hem de yüksek çözünürlüklü ortam kütle spektrometresi görüntüleme deneyleri için kullanılabilen çok işlevli bir cihaz olmasıdır. Bu yöntem tek hücreleri ve dokuları analiz edebilse de, kimyasalların ve canlı mikrokolonilerin ve biyofilmlerin spar analizi gibi mikro ölçekli örneklemenin arzu edildiği diğer sistemlere de uygulanabilir.

Prosedürü benimle birlikte göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Wei Rao olacak. İlgilendiğiniz bütün bir fare organını küçük bir plastik kuyunun ortasına yerleştirin. Organı, yaklaşık 10 mm yüksekliğe kadar doku gömme bileşiğine batırın.

Dokuları hızlı dondurma için hemen sıvı nitrojene yerleştirin. Fare dokusu bölümünü hazırlamak için donmuş fare organını alın ve sıcaklık kontrollü bir kriyo-mikrotomda 15 santigrat dereceye kadar çözdürün. Dokuyu yaklaşık 500 mikrolitre doku gömme bileşiği ile çelik bir tabana sabitleyin ve istenen kesit oryantasyonunun bıçağa sunulması için bir kriyo-mikrotom kesit yuvasına yerleştirin.

Dokuyu 12 mikron kalınlığında bölümlere ayırın. Daha sonra kesitli doku dilimlerini polikarbonat mikroskop lamlarına yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika kurumaya bırakın. 1 mililitre HeLa Hücre Süspansiyonu gibi bir hücre örneği alın ve standart 10 cm'lik bir hücre kültürü plakasında 9 mL tam hücre kültürü ortamına ekleyin.

Hücreleri, büyüyen yüzey hücre kültürü plakasında% 70-80 oranında kaplanana kadar, iki ila üç gün boyunca% 5 CO2 ile% 37 santigrat derecede kültürde tutun. Hücre kültürü plakasında hücre geçişi gerçekleştirin. Bunu yapmak için, büyüme ortamını aspire edin ve hücreleri 5 mL 1x fosfat tamponlu tuzlu su ile durulayın.

Steril bir aspirasyon ucu kullanarak PBS'yi çıkarın ve hücreleri kültür plakasından ayırmak için hücreleri 37 santigrat derecede yaklaşık 5 dakika boyunca 2.5 mL tripsin ile inkübe edin. 7.5 mL tam hücre kültürü ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini durdurun ve ardından hücreleri düzgün bir şekilde yeniden süspanse edin. Hücre örneklerini tek hücreli kütle spektrometresi veya SCMS deneyi için hazırlamak için, önce tek tek mikro örtü slaytlarını 12 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin.

Daha sonra, kuyucuğa 1.8 mL hücre kültürü ortamı ve 0.2 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Yaklaşık 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 CO2 ortamında inkübe etmeden önce hücreleri plakanın hafif çalkalanması ile nazikçe karıştırın. Kültürlenmiş hücrelerin ilaç muamelesini gerçekleştirmek için, 12 oyuklu hücre kültürü plakasına bir ilaç bileşiği çözeltisi ekleyin.

Çift delikli kuvars boruyu bir lazer mikro pipet çektirmesine yerleştirin ve çift delikli bir kuvars iğnesi çekin. Başlangıç noktaları olarak, ısıyı 400'e, filamanı üçe, hızı 80'e, gecikmeyi 150'ye ve çekmeyi 250'ye ayarlayın. Çekme ucunu, diğer ucunda yaklaşık 5 mm çekilmemiş çift delikli kuvars kılcal kalacak şekilde kesin.

Erimiş silika kılcal damarın 80 mm'lik bir bölümünü solvent sağlayan bir kılcal damar olarak kesin. Ardından kılcal damarı, çift delikli kuvars iğnenin düz ucundaki bir deliğe yerleştirin. Kaynaşmış bir silika kılcal damarı nanoESI yayıcı olarak çekmek için alevi kullanarak, 7-10 mm uzunluğunda kesin ve çift delikli kuvars iğnenin düz ucundaki diğer deliğe yerleştirin.

Çift delikli kuvars iğnenin düz ucuna minimum miktarda UV kürleme reçinesi uygulayın. Solvent sağlayan kılcal damarı ve nanoESI yayıcıyı sabitlemek için reçineyi bir LED UV lambası kullanarak yaklaşık 20 saniye katılaştırın. Ardından, standart bir mikroskop cam lamını uzunlamasına ikiye bölün.

Ardından, nanoESI yayıcı dışa bakacak şekilde tek probu cam sürgünün bir ucuna yerleştirin. Normal epoksiyi, sertleşme için gece boyunca bırakmadan önce cam sürgüye sabitlenecek şekilde tek probun gövdesine uygulayın. Bu sistem, kütle spektrometresinin özelleştirilmiş bir iyon kaynağı arayüz flanşı ve USB dijital mikroskop, minyatür manuel XYZ çeviri aşaması ve motorlu XYZ çeviri aşaması sistemi ile tutturulmuş bir alüminyum optik kart içerir.

Kütle spektrometresinin iyon kaynağı arayüz flanşını değiştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi dijital stereomikroskobun standını üretin. Modifiye edilmiş dijital stereomikroskobu, bir USB dijital mikroskobu, esnek bir kelepçe tutuculu minyatür bir manuel XYZ çeviri aşamasını ve motorlu XYZ çeviri aşaması sistemini alüminyum optik karta takın. Tek bir prob ile tutturulmuş cam sürgüyü sabitlemek için esnek kelepçe tutucuyu kullanın.

Ardından, tek prob kurulumunu kütle spektrometresine takın. Tek probun yayıcısını kütle spektrometresinin girişinin önüne yerleştirmek için esnek kelepçe tutucusunu ve minyatür XYZ aşamasını ayarlayın. Numune bölümünü oda sıcaklığında çözdürün ve tek probun altındaki motorlu XYZ translasyon aşaması sistemine yerleştirin.

Kontrol yazılımındaki koordinatları değiştirerek numune konumunu ayarlayın. Numune alma solventini uygun bir oranda pompalamak için bir şırınga kullanın. Ve sonra iyonizasyon voltajını uygulayın.

Tek probun yüksekliğini, numunenin yüzeyinin hemen üzerinde duracak ve metabolitlerin yüzey ekstraksiyonunu gerçekleştirebilecek şekilde ayarlayın. Z aşamasını dikkatlice kaldırın ve ardından tek prob ucu ile doku yüzeyi arasındaki mesafe değişimini izlemek için USB dijital mikroskobu kullanın. Örnek içindeki ilgilenilen bölüm boyunca rasterleştirme parametrelerini ayarlayın.

Burada sunulan fare böbrek bölümleri için saniyede 10 mikrometre rasterleştirme hızı ve satırlar arasında 20 mikrometre mesafe kullanın. Örnek içindeki ilgilenilen bölüm boyunca rasterleştirme parametrelerini ayarlayın. Burada sunulan fare böbrek bölümleri için saniyede 10.0 mikrometre rasterleştirme hızı ve çizgiler arasında 20 mikrometre mesafe kullanın.

Kütle spektrometresinden MS spektrumlarının otomatik olarak alınması için bir yöntem oluşturun. Bir fare böbrek örneğinde yüksek kütle çözünürlüklü MSI için, 60.000 kütle çözünürlüğü, 5kV pozitif mod, 1 mikro tarama, 150 milisaniye maksimum enjeksiyon süresi ve otomatik kazanç kontrolü kullanın. MSI veri alımını başlatın ve ardından metin protokolünde açıklandığı gibi ham MS dosyalarından MS görüntüleri oluşturun.

Tek prob sistemini MSI talimatlarına göre kurun ve solvent akış hızını ayarlayın. Kültürel ortamı ve hücre dışı ilaç bileşenlerini çıkarmak için mikro örtü cam slaytlarına bağlı kültürlenmiş hücreleri PBS ile yıkayın. Daha sonra hücre içeren cam slaytı deney için motorlu XYZ translasyon aşaması sistemine yerleştirin.

Analiz sırasında hücre penetrasyonunu izlemek için dijital stereomikroskobu numunenin üzerinde, tek probun ucuna odaklayın. Tek prob üzerindeki nanoESI yayıcının çalışma koşullarını izlemek için tek probun yan tarafındaki USB dijital mikroskobu kullanın. İlgilenilen bir hücreyi bulmak ve tek prob ucunu numunenin üzerine hassas bir şekilde yerleştirmek için motorlu XYZ aşama kontrol programını ve dijital stereomikroskobu kullanın.

Tek prob ucu hücreye yerleştirilmeden önce MS veri alımını başlatın. Tek prob ucunu hücreden dışarı çekmek için hücre içeren plakayı aşağı indirin. Son olarak, tek probu tamamen yıkamak için çözücünün yaklaşık üç dakika akmasına izin verin.

Fare böbrek bölümlerinin ortam kütle spektrometresi görüntülemesi yapıldı ve doku yüzeyinde bulunan çok sayıda molekül tespit edilebildi. Doku yüzeyindeki çoklu moleküllerin uzamsal dağılımı ve nispi bolluğu çizildi. Kütle spektrometresi verilerinde bulunan özelliklerin keskin geçişlerinin gözlemlenmesiyle 8.5 mikronluk bir uzamsal çözünürlük elde edilmiştir.

Tek probun keskin uçlu ve açık kanallı olarak üretilmesi, tek hücreli analiz için kritik öneme sahiptir. Hedef hücreleri bulmak ve hücre penetrasyon sürecini izlemek için mikroskoplara ihtiyaç vardır. Kütle spektrumlarından gelen sinyal değişikliği ayrıca hücre penetrasyonunu doğrulamak için ek bilgi sağlar.

Canlı tek hücrelerden çok sayıda molekül tespit edilmiştir. Anti-kanser ilaç çalışmaları için kullanıldığında, anti-kanser ilaç tedavisinin farkını göstermek için kontrol hücresi deneyleri kullanılır. Bu videoyu izledikten sonra, tek probun nasıl üretildiğini ve bu cihazın tek hücreli kütle spektrometrisi analizi ve biyolojik dokuların ortam kütle spektrometresi görüntülemesi için nasıl kullanıldığını iyi anlamış olmalısınız.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, tek problu cihazı imal etmek, tüm sistemi kurmak ve aletleri çalıştırmak için ayrıntılı talimatlar gerektiğinden mücadele edebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, tek hücre analizi birçok hücre için sürekli olarak gerçekleştirilebilir. Ve her analiz üç dakikadan az sürer.

Bir ortam MS görüntüleme deneyinin tamamlanması, numune boyutuna, uzamsal çözünürlüğe ve kullanılan kütle spektrometresine bağlı olarak birkaç saat sürebilir. Bu prosedürü denerken, yüksek kaliteli bir tek prob üretmenin kilit adım olduğunu unutmamak önemlidir. Ek olarak, bir deneyin başarılı bir şekilde yürütülmesi için cihazın ayarlanması ve çalıştırılması kritik öneme sahiptir.

Burada sunulanlara benzer prosedürler izlenerek başka yöntemler de geliştirilebilir. Örneğin, numune çözücüsüne reaktifler eklenebilir ve numunelerden moleküllerin tespitini iyileştirmek için reaktif tek hücreli analiz ve ortam MSI gerçekleştirilebilir. Bu teknik geliştirildikten sonra hem tek hücre analizi hem de ortam koşullarında kütle spektrometresi görüntüleme çalışmalarında araştırmacıların önünü açmıştır.

Bu teknik, hücre biyolojisi araştırmaları, farmakoloji çalışmaları ve klinik testler için potansiyel olarak kullanılabilir. Keskin kuvars kılcal damarlar ve UV ile kürlenen epoksi ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven ve UV koruyucu gözlük takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.