Name: Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Keşfedin FRET tabanlı konfokal görüntüleme yöntemiyle damar düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulum içi kalsiyum seviyelerini doğrudan ölçme tekniğini. Bu yöntem hücre içi kalsiyum döngüsünü ve ER stresi ilişkisini daha doğru şekilde araştırmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma [CVB &amp; ME MOP-1112666] Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri fon tarafından desteklenmiştir.

Etik deyimi: Bütün deneyler ve prosedürler British Columbia, Vancouver, Kanada Üniversitesi Laboratuvar Biyogüvenlik kurallarına anlaşma yapılmıştır. FRET tabanlı Konfokal Mikroskopi için 35 mm Cam-bottom Kültür Yemekleri hazırlanması 1. <ol><li> Aşağıdaki yordam 36-48 saat önce deneyler kullanarak tabak hazırlayın. </li><li> C depolama ° -20 seçilen jelatinimsi protein karışımı ve% 0.25 tripsin-EDTA Al ve kullanıma kadar mobil buz banyosu içinde saklayın. NOT: Kaplama proteini karışımı, sadece kullanımdan önce katılaşmasını karışımı önlemek için kısa bir zaman süresi için oda sıcaklığına maruz olmalıdır. ihtiyaç kadar Tripsin çözümü de soğutulmuş tutmak gerekir; Seçenek olarak ise, tripsin 1.5 adım tamamlandıktan sonra -20 ° C depolama alınabilir. </li><li> DMEM (hiçbir eklenen serum, soğutulmuş): protein karışımı 1:25 seyreltme hazırlayın. Her plaka hazırlanan protein karışımı / DMEM uygun hacimde aktarın. 35 mm cam tabanlı plakalar için tam plakanın altındaki iç cam daire kapsayacak şekilde yaklaşık 200 ul ekleyin. </li><li> güvenlik kabini içinde ve oda sıcaklığında en az 30 dakika süreyle oturmaya plakaları bırakın. Bu süre içinde, su banyosu içinde 37 ° C,% 10 NCS ile sıcak DMEM. </li><li> hemen önce sonraki adımlara 37 ° C su banyosunda sıcak tripsin. </li><li> Bir cam pipet ve emme kullanarak kültür şişelerinde şu anda DMEM çıkarın. Sıcak steril PBS ile balonun yıkayın zemin kalan DMEM artıklarını çıkarın. </li><li> şişeyi alttan önceden kültüre düz kas hücreleri çıkarmak: NOT: Flask hücreleri plaka hazırlanmasından önce istenen confluency (yaklaşık% 80) ulaşmak için izin vermek için bu adımı gün kuruldu. Hücreler ilk olarak% 10 NCS DMEM, 20 ml bir şişe içinde süspansiyon haline getirilmiş ve DMEM kaynağı tazelendi ve hücreler inkübatöre geri konuldu, sonra, 24 saat için,% 5 CO2 kaynağı ile 37 ° C&#39;de inkübe edildi. DMEM eve tazelendiHücreler birleşmeye ulaşana kadar ry 48 saat bu ilk adımları izleyerek. <ol><li> Yıkama tripsin 1 ml hızlı şişe ve daha sonra emme ile 1 ml tripsin çıkarın. </li><li> Tripsin bir 1 ml ekleme ve enzim, şişenin tüm alt ile temas sağlamak için balon swishing, daha uzun bir süre (yaklaşık 30-60 saniye) bekletin. </li><li> şişeden ayrılma memnun kadar mikroskop altında müstakil ne kadar hücreler gözlemleyin. şişeden ayrılan hücrelerin oranı ile memnun kadar alternatif hışırtı tripsin solüsyonu ve kontrol hücre dekolmanı. NOT: şişesi 37 ° C&#39;de bu süreci hızlandırmak için yaklaşık 30-60 saniye boyunca inkübatör iade edilebilir. </li><li> Hücreler tripsin kullanılarak yerinden alındıktan sonra (tripsin şişede toplam hacminin 1/8 inci oluşturacak şekilde yeterli hacmi), tripsin reaksiyonu durdurmak için şişeye% 10 NCS ile taze DMEM ekleyin. Not: 250 ml&#39;lik bir kültür şişesi ile, örneğin, bu olur7 mi DMEM hücre çözeltisine 8 ml ile sonuçlanması tripsin 1 ml üzere eklenir. </li></ol></li><li> Temiz (etiketlenmiş), 50 ml konik tüp şişeye hücre çözeltisi elde transferi. </li><li> Her plaka 1 ml taze DMEM artı% 10 NCS ekle (yeterli ortam 24 saat sürecek) hazırlanmaktadır. </li><li> Yavaşça tüp oluşmuş olabilecek pelet kırmak için hücre çözümü birden çok kez içeren ters çevirin. </li><li> Pipet Her plaka içine yavaşça karma hücre çözeltisinin hacmi istenen. NOT: Bu protokol için kaplama önerilen SMC&#39;lere numarası 35 mm kültür kaplarına başına 0.5-0.8 x 10 6. Bu numaralar hücre tipine bağlı olarak değişebilir ve her bir laboratuar tarafından test edilmiş ve modifiye edilmelidir. </li><li> Cam alt kısmında hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için iyice / saat yönünün tersine her plaka girdap. </li></ol> D1SR Ca 2+ Göstergesi Taşıma adenoviral Vektör 2. Geçici Transfeksiyon <ol><li> Benim ilavesinden sonradium ve her bir plakanın hücre çözeltisi hücre yemekler altındaki cam doğru bağlamak için izin vermek için en az 1 saat boyunca CO2 kaynağı 5% ile 37 ° C&#39;de inkübe plakaları bırakın. Hücreler açıkça bağlı olan kadar 15 dakika aralıklarla mikroskop altında plakaları kontrol edin. </li><li> -80 ° C depolama adenovirüs-D1SR kısım Al ve biyolojik güvenlik kabini için taşımak için mobil buz banyosu içinde tutmak. </li><li> Pipet Arzu edilen doz, her plakaya soğutulmuş D1SR arasında (100 enfeksiyon çokluğu). Not: plaka başına gerekli adenoviral çözelti hacmi hesaplama plak oluşturucu birim (pfu) olarak gösterilen orijinal stok solüsyonu, virüs titresi bağlıdır. Bizim deneyime dayalı, biz kültür plakasına bir düz kas hücresi (SMC) bulaştırmak için gerekli sayı veya virüs partikülleri olarak yorumlanır 100 enfeksiyonu (İçişleri Bakanlığı), çokluğu öneriyoruz. </li><li> % 5 CO2 kaynağı O / N 37 ° C &#39;de enfekte hücreleri inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, taze DMEM 1 ml artı% 10 NCS hücreleri doldurmak. </li><li> CO2 göre O / N,% 5 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde inkübe edin. </li></ol> FRET tabanlı Confocal Görüntüleme Kullanılması 3. Ölçüm SR Lüminal Ca 2+ <ol><li> O / N inkübe edildikten sonra, plaka kültür ortamı çıkarın. </li><li> Ihtiva eden 1 ml ılık fizyolojik Hepes-PSS tamponu ile kültürü plakası yıkayın (mmol·L bölgesindeki - 1) NaCl 140, glükoz 10, KCI 5, HEPES 5, CaCl2 1.5 ve MgCI2 1 (pH 7.4) ile üç kez. </li><li> hemen önce kayıt başlamadan 1 ml taze sıcak HEPES-PSS tamponu ekleyin. </li><li> konfokal mikroskop ilişkili yazılım üzerinde FRET SE (Hassaslaþan Emisyon) uygulaması (veya benzer bir özellik) kullanarak başlangıç ​​görüntüleme gerçekleştirin. <ol><li> Uygulama açıldıktan sonra, istenilen deneysel koşullar elde etmek için ayarları yapmak için &quot;Setup&quot; sekmesine tıklayın. </li> &lt;hücreleri (donör için ve kanallar FRET) 440 nm&#39;de sırayla heyecan duyuyoruz ve (alıcı kanalı için) 513 nm böylece li&gt; Manuel kanal ayarlarını değiştirin. (Donör için) 488 nm ve 535 nm (FRET ve alıcı için) emisyon dalga boylarını toplayın. </li><li> ve maruziyet arasında 10 sn aralıklarla (üç ardışık CFP donör, FRET ve YFP alıcı kanalları için kayıt süresi) hücrelerin 150 ms uyarma pozlama süresi ile,% 15 iletim ışığın yoğunluğunu ayarlayın. </li></ol></li><li> mikroskop sahnede plaka stabilize. </li><li> görüntü çözünürlüğünü kontrol etmek için &quot;Canlı&quot; düğmesini kullanın. İstenilen çözünürlük ulaşılana kadar daha ince ayar. </li><li> Yine &quot;Kur&quot; sekmesi altında, &quot;Yakalama görüntü&quot; düğmesini kullanarak örnek bir görüntü alır. </li><li> &quot;Değerlendirme&quot; sekmesine taşıma, deneyler için FRET verimlilikleri yapılıyor hesaplamak için uygun yöntemi seçin. Yöntem 3, oranlı metrik hesaplama [E A (i) = B / A kullanarak], Örneğin D1SR göstergesi olarak cameleons içeren deneyler için tavsiye edilir. </li><li> yoğunluk değerleri deney sırasında grafik şeklinde kaydediliyor gözlemlemek mümkün &quot;Graph&quot; sekmesine geçiş. </li><li> Deney ilerledikçe grafik üzerinde ilgi bu alanda karşılık gelen ortalama yoğunluğunu gözlemlemek için görüntü izleyicide bir ROI çizin. NOT: Araştırmacı aynı zamanda birden fazla ROI&#39;ları çizmek ve şiddetleri kaydedildi ve grafik üzerinde eş zamanlı olarak gösterilebilir gelen var seçebilirsiniz. Alternatif olarak, araştırmacılar ilk kayıt için tek bir yatırım getirisi anahat ve yazılım veri analizi odaklı versiyonunda deneme dosyasını açarak bir sonraki seferde birden fazla ROI&#39;leri anahat geçebilirsiniz. NOT: FRET-tabanlı deneyler kurmak için gerekli adımlar hakkında ilave detay FRET uygulama sihirbazı kılavuzları bulunabilir. mikroskop FRET Sihirbazı ile donatılmış değilse, aşağıdaki protokol parametrelerini ayarlamak için kullanılabilirManuel kayıt. </li><li> Kaydı başlatmak ve önceki faiz ajan tanıtmak için sinyalin sürekli bazal kaydedilmesini sağlamak için en az 3 dakika süreyle veri toplama izin verir. </li><li> -moving Maddesi Ca2 + tanıtılması (örneğin 2 uM thapsigargin 100 nm endotelin-1) elle İlgi varlığın bölgeye kadar yakın bir noktada plaka doğrudan önceden tespit edilmiş bir doz pipetleme SR Ca2 + tüketen için bir araç olarak mümkün olduğu kaydedilmiştir. istenen zaman sonrası tedavi için kayıt devam edin. </li><li> Yakalama oranlı metrik FRET SE uygulamasını kullanarak konfokal ters mikroskop 63X yağ daldırma amacı ile seri görüntüler (512 x 512 piksel) FRET. </li><li> biçimlendirmek ve istatistik tabanlı yazılım kullanarak analiz sonradan faiz (ROI) her bölgede 5-10 SMC&#39;lerin bir kümesinden görüntüleme kaynaklanan verileri toplamak ve. <ol><li> daha sonra kullanmak için verileri kaydetmek için, kaydedilen iz üzerinde sağ tıklayın ve sav &quot;Export&quot; seçeneğiaraştırmacının seçtiği sürücüsünde kaydedilen ortalama sinyal şiddetleri ile e-tablo. </li><li> zaman noktasında 0 sn gözlenen başlayan yoğunluk değerine göre her veri noktası bölerek her deneyden veri normalleştirmek. </li><li> elle kopyalama ve özgün tablo / sn alakalı veri satırlarını yapıştırarak bir istatistik programı proje dosyasına elektronik tablolar İthalat normalize veri. </li><li> Otomatik olarak programa yapıştırılan veri setine karşılık gelen grafikler oluşturmak. NOT: Programın varsayılan ayarları içe aktarılan verilerin satır grafikler oluşturmak. Görüntülenen grafiğin tipi ana araç içinde bulunan başlığinı &quot;Değişim&quot; başlığı altında &quot;grafiğin farklı bir türü seçin&quot; butonuna tıklayarak değiştirilebilir. </li><li> Tek bir veri sayfası içine özdeş deneyler daha büyük bir grup içinde birden fazla bağımsız denemeler temsil Havuz verileri gerçekleştirilen özel test için ortalama bir iz üretmek. </li></ol></li></ol&gt; Sitoplazmik Ca 4. hazırlanması 2+ Gösterge <ol><li> Siyah bir mikrosantrifüj tüpü içinde, dimetil sülfoksit (DMSO), 1 ml 0.0125 g pluronik asit (PA) içinde çözündürülür (PA çözülür yardımcı mobil su banyosu içinde tüp sıcak gerekebilir). </li><li> -20 ° C depolama sitoplazmik Ca 2 + gösterge boya (Fluo-4 AM) bir boru (50 ug) Al. </li><li> ışık ile temas mümkün olduğunca korunması için folyo boyanın boru sarın. </li><li> Pipet boya içeren bir tüp içine DMSO + PA çözeltisi 45 ul. Oda sıcaklığında folyo ve mağaza DMSO + PA çözüm sarın. </li><li> iyice çözüm yukarı ve aşağı birden çok kez pipetleme tüp içeriği karıştırın. Seçenek olarak ise, 10 dakika boyunca, boya tüp sonikasyon. NOT: iyice yeterli olacaktır DMSO + PA çözeltisi boyunca boya dağıtmanın iki yöntem; sadece araştırmacının bir tercih meselesidir. Araştırmacı çözümü ses dalgalarına maruz seçerse, onuDiğerleri gürültü etkilenmez edilecek bir izole alan / odada yapılmalıdır. Araştırmacı ayrıca kulaklarını korumak için ağır susturucular kullanmalıdır. <ol><li> Çözümü sonicating ise 2/3 tam (ile dH 2 O) sonikatör banyosu içinde bir köpük tüp tutucu ve yerin içinde boya içeren folyo sarılı tüp yerleştirin. </li><li> izole alan / odası ve güç makinesinde yer sonikatör banyosu (koruyucu Şapkalar sağlamak önceki sonikasyon işlemini başlatmadan yerinde olduğundan). odadan ve tüp (mümkün olduğunca uzun için ışıktan korumak için folyo ile sarılmış tutmak) o kapatılması ve almadan önce 10 dakika süreyle çalışan makineyi bırakın. </li></ol></li><li> karanlık mikrosantrifüj tüpler içine şimdi iyice karışık bir çözüm alikotu (tüp başına 5 ul, 10 tüpler toplam yapmak mümkün olmalıdır). </li><li> folyo Her eş pay, tüp sarın. kullanılana kadar -20 ° C koşullarda kurutucu Etiket tüpler saklayın. </li></ol> 5. Sitoplazmik Ca ölçümü 2 + <ol><li> Sıçan aort SMC&#39;lerin kültür plakaları hazırlamak için 1.1-1.12 adımları izleyin. </li><li> 48 saat sonrası kültüründe plakadan kültür ortamı çıkarın. </li><li> -20 ° C depolama sitoplazmik Ca 2 + göstergesi (5 ul), daha önce hazırlanmış kısım çıkarın ve kullanılana kadar mobil buz banyosu içinde muhafaza. </li><li> Ihtiva eden 1 ml ılık fizyolojik Hepes-PSS tamponu ile kültürü plakası yıkayın (mmol·L bölgesindeki - 1) NaCl 140, glükoz 10, KCI 5, HEPES 5, CaCl2 1.5 ve MgCI2 1 (pH 7.4) ile üç kez. </li><li> Sıcak HEPES-PSS 1 ml göstergesi karıştırın ve kültür plaka üzerine yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat için bir gösterge (24 ° C) SMC&#39;lerinin inkübe edin. </li><li> kültür plakasından göstergesini çıkarın ve 1 ml ılık fizyolojik HEPES-PSS tamponu üç kez yıkayın. </li><li> hemen önce kayıt başlamadan 1 ml taze sıcak HEPES-PSS tamponu ekleyin. </li><li> Bir 63X o seri görüntüler (512 x 512 piksel) Yakalamakonfokal ters mikroskop il-daldırma objektif. <ol><li> El ile hücreler 488 nm heyecanlı böylece ayarlarını değiştirmek ve emisyon dalga boyları 700 Hz tarama hızı ile 555 nm toplanır. </li><li> Hücrelerin 150 msn uyarma maruz kalma süresi (hücre kayıt sırasında belirlenen zaman aralıklarında ışığa maruz kalan süreyi) ve maruziyet arasındaki 5 sn aralıklarla,% 15 iletim ışığın yoğunluğunu ayarlayın. </li></ol></li><li> Mikroskop sahnede plaka Stabilize ve kaydetmeye başlayın. </li><li> en az 3 dakika süreyle kayıt önce ilgi maddenin eklenmesi, sinyal sabit bir taban kayıt sağlamak. </li><li> (Adım 3.16 tarif edildiği gibi) 2 + SR Ca tüketen ve zaman tedavi sonrası istenen miktarda kayıt devam için bir araç olarak Ca2 + -moving madde (örneğin, 2uM thapsigargin) sunar. </li><li> Kayıt sinyal yoğunluğu floresan si ortalamasını alarak mikroskop özel yazılımını kullanarakFaiz (ROI) her bölgede 5-10 SMC&#39;lerin bir kümeden gnals (F / F 0). Toplamak biçimi ve veri analiz yazılımı kullanılarak görüntüleme kaynaklanan verileri analiz. Bu yazılımı kullanarak veri toplama tanımı ve analizi için Adımlar 3.18.1-3.18.5 bakın. </li></ol>

<ol><li>Hennings, H., Michael, D., Cheng, C., Steinert, P., Holbrook, K., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Whitfield, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+calcium+and+cyclic+AMP+in+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of calcium and cyclic AMP in cell proliferation.</a> Ann N Y Acad Sci. 339 (1), 216-240 (1980).</li>
<li>Nicotera, P., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in apoptosis.</a> Cell Calcium. 23 (2-3), 173-180 (1998).</li>
<li>Wei, C., Wang, X., Chen, M., Ouyang, K., Song, L. S., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+flickers+steer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium flickers steer cell migration.</a> Nature. 457 (7231), 901-905 (2009).</li>
<li>Ashby, M. C., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+calcium+and+the+functions+of+intracellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER calcium and the functions of intracellular organelles.</a> Sem Cell Dev Biol. 12 (1), 11-17 (2001).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+calcium+and+Alzheimer%27s+disease%3A+in+a+state+of+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+signal%22%5BJournal%5D)">ER calcium and Alzheimer's disease: in a state of flux.</a> Sci signal. 3 (114), (2010).</li>
<li>Rutkowski, D. T., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trip+to+the+ER%3A+coping+with+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A trip to the ER: coping with stress.</a> Trends Cell Biol. 14 (1), (2004).</li>
<li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">ER stress and the unfolded protein response.</a> Mutat Res. 569 (1-2), 29-63 (2005).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Poburko, D., Liao, C. H., van Breemen, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in vascular smooth muscle cells.</a> Circ Res. 104 (1), 104-112 (2009).</li>
<li>Esfandiarei, M., Fameli, N., Choi, Y. Y., Tehrani, A. Y., Hoskins, J. G., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waves+of+calcium+depletion+in+the+sarcoplasmic+reticulum+of+vascular+smooth+muscle+cells%3A+an+inside+view+of+spatiotemporal+Ca2%2B+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Waves of calcium depletion in the sarcoplasmic reticulum of vascular smooth muscle cells: an inside view of spatiotemporal Ca2+ regulation.</a> PloS one. 8 (2), e55333(2013).</li>
<li>Cobbold, P. H., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+bioluminescence+measurement+of+cytoplasmic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and bioluminescence measurement of cytoplasmic free calcium.</a> Biochem J. 248 (2), 313-328 (1987).</li>
<li>Park, M. K., Ashby, M. C., Erdemli, G., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear%2C+perigranular+and+sub-plasmalemmal+mitochondria+have+distinct+functions+in+the+regulation+of+cellular+calcium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear, perigranular and sub-plasmalemmal mitochondria have distinct functions in the regulation of cellular calcium transport.</a> The EMBO journal. 20 (8), 1863-1874 (2001).</li>
<li>Lovett, J. L., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+stores+in+Toxoplasma+gondii+govern+invasion+of+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium stores in Toxoplasma gondii govern invasion of host cells.</a> J Cell Sci. 116 (14), 3009-3016 (2003).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Palmer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+indicators+based+on+computationally+redesigned+calmodulin-peptide+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs.</a> Chem Biol. 13 (5), 521-530 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Bu protokol SR lümeninde Ca 2 + kavkıdaki D1SR adenovirüs ile VSMC&#39;Ierin aktarıldığı açıklanmaktadır. Bu yöntem, doğrudan bu organel olan Ca2 + ölçümü hem de değişik kalsiyum hareket eden maddelerin uygulanmasının bir sonucu olarak SR üzerinden içindeki hareketinin / sağlar. Bu yöntem SR ve sitoplazmik Ca 2 + düzeyleri değişiklikleri genel hücresel sağlığını etkiler ve nasıl bu değişiklikler birbiriyle ilişkili nasıl kapsamlı bir anlayış doğrultusunda çalışan araştırmacılar için birç...

Ca 2 + vücuttaki her hücre içinde bolca bulunan çok önemli bir iyon olduğunu. Bu büyüme, çoğalma, göç ve apoptosis 1-4 dahil olmak üzere birçok farklı hücresel fonksiyonları, önemli rolleri vardır. İyi Ca 2 + hem doğrudan hem de dolaylı eylemlerle bu süreçleri etkileyebilir olduğunun tespit edilmesi ve bu nedenle, bu iyonun normal hücre içi konsantrasyonları değişiklikleri kolayca etkilenen hücreler için olumsuz sonuçlara neden olabilir. SR hücresinin 5 içinde en büyük hücre içi Ca 2 + mağaza olarak kabul edilir. SR ve sitoplazma hem de Ca 2+ kararlı durum düzeyleri normal içine ve bu organel Ca 2+ -transporting kanalları dışında sürekli bir akış yoluyla korunur. Nedeniyle yaralanma ya da hastalık herhangi bir biçimde hücrelere dayatılan stresli koşullar genellikle onun üzerinde uzun süreli etkilere sahip gitmek SR Ca önemli değişiklikler 2+ ile ilişkiliHücrenin alth. Olguların çoğunda şiddetli, stresli bir hücrenin yetersizlik kurtarmak için ve kararlı durum SR Ca korumak 2+ seviyeleri bile apoptozis 6-8 ölümle sonuçlanacak olabilir. Hücresel Ca 2 + dinamikleri güncel araştırma az sayıda çalışma testi Ca 2+ mağaza içeriği doğrudan 9-11 organel gerçeği ile sınırlıdır. En yaygın uygulama yerine SR Ca 2 + içerik 12-14 değişikliklerin dolaylı ölçümleri gibi sitoplazmik Ca 2 + düzeyleri ölçümü içerir. Bu deneylerde, Ca 2 + yaygın organel en azalmasına neden farmakolojik ajanların (örn thapsigargin) kullanılarak SR serbest bırakılmasını indüklenir. Sonuçlar daha sonra sitoplazmik Ca 2 + konsantrasyonları dalgalanmalara göre SR Ca 2+ değişiklikler ile ilgili çizilir. dolambaçlı ma böyle sonuçlara varmak için araştırmacılar için kalan yeteneğine rağmennner, SR Ca 2+ ölçüm bu yöntem toplanan verilerin yorumlanması ile ilgili birçok sınırlamalar bu bilgileri, toplamak için dolaylı yoldan açıkça. Bu açık kısıtlama atlamak için, SR lümen ağ içinde doğrudan bulundu Ca 2+ miktarını ölçmek için gereklidir. Doğrudan intraluminal SR Ca 2 + rekor seviyelere edememek nihai sonucu açısından hayati hücre kültürü araçları ve kullanılan Ca 2 + göstergesidir. Mevcut yazıda referans veriler için, kullanılan VSMC donmuş hücre hattından gelen dikkat etmek önemlidir. Hücreler,% 5 CO2 kaynağı ile sabit bir 37 ° C &#39;de kuluçkaya yatırılır Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) + belirtilen deneyler için geçitlerin 22-26 fazla% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS), kültürlenmiştir. Mevcut yöntem kullanılarak, örneğin, hücreler, çok başarılı bir şekilde ekstrasel- simüle eden bir protein karışımı ile yetiştirilendokuda 15, birçok farklı türde çevre. SR Ca ven boyunca başarısı için önemli 2+ araştırma kullanılan protein karışımı türüdür; Bu durumda, düşük büyüme faktörü çeşitli normal Ca2 + sinyali etkileyen hareketleri sürekli olarak test edilen hücreler içinde meydana gelen bu aracın bileşenlerini önlemek için gerekliydi. Test hücrelerinin başarılı büyümenin ardından, Ca 2 + göstergesi de etkin bir şekilde bu kültür hücreleri devreye sokulmalıdır. Bu SR-yerleşik Ca 2+ göstergesi D1SR taşıyan adenoviral bir vektör ile mümkün hale gelmiştir. Yüksek bir transfeksiyon verimliliği elde etmek için, hücreler önce, görüntüleme için en az 36-48 saat boyunca viral vektörler ile inkübe edilmesi gerekir. Bu hazırlık ca yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik SR lümeninde 2+ geçişlerini ölçmek için güvenilir bir araç sağlar. Bu protokolde kullanılan D1SR gösterge D1ER Ca değiştirilmiş çeşididir 2+ iBaşlangıçta California Üniversitesi&#39;nden Dr. Roger Y. Tsien laboratuarında, San Diego, ABD 9,16 tarafından oluşturulan ndicator. Orijinal D1ER önceki Ca 2 + göstergelere 9,16 oranla çok daha geniş aralık (0,5-160 uM) üzerinden Ca 2+ hassasiyetleri göstermek cameleons denilen genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri ikinci nesil aittir. Yeni varyant D1SR Dr. Wayne Chen (Alberta, Kanada Üniversitesi&#39;nden) bir tür hediye, ancak, bir mutant calsequestrin dizisi (yerine orijinal D1ER gibi bir kalretikülinden dizisi) taşır. Mutant calsequestrin bir 11 lümen SR içinde Ca 2 + bağlayıcı endojen calsequestrin rekabet sorununu ortadan kaldıran Ca 2+ bağlanma azalttı. D1SR göstergesi kesik geliştirilmiş siyan floresan proteini (OBP) ve sarı floresan protein (YFP) modifiye kalmodulin (CaM) ve M13 içeren bir bağlayıcı protein tarafından bağlanan (t taşırCaM) dizilerine bağlanan miyozin hafif zincir kinaz o 26-kalıntı peptit. CaM-M13 sekansı, endojen kalmodulin bağlanmasını M13 önlemek için modifiye edilmiştir. Ayrıca, SR tutulmasını sağlamak için, calsequestrin sekansı CFP 11 5 &#39;ucunda eklenmiştir. Ca2 + bağlandığında, Eksantrik M13 alan FRET sinyal yoğunluğunda bir artış olarak kaydedilir yan CFP ve YFP arasında enerji transferi bir artışa neden şekilsel değişiklik geçer. 2 + SR lümen Ca konsantrasyonu düştüğünde Öte yandan, Eksantrik M13 alan komşu CFP ve YFP ve FRET sinyal yoğunluğunda belirgin bir düşüş arasındaki enerji transferinde bir azalma ile sonuçlanır ters şekilsel değişiklik geçer .

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (yüksek glikoz, piruvat)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11995-065</td><td>37 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membran Matris Büyüme Faktörü Azaltılmış, 5 ml</td><td>Corning</td><td>356230</td> -<td>20 °C'de tutun; Kullanmadan hemen öncesine kadar C</td></tr><tr><td>Yenidoğan Buzağı Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>-20 ° C'de tutun; Kullanmadan hemen önce C</td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı plakalar</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 0.2 & mu; M havalandırmalı mavi fişli conta kapağı şişesi</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA Çözeltisi</td><td>Ömrü teknolojileri</td><td>25200056</td><td>-20 °C'de tutun; Kullanmadan hemen öncesine kadar</td></tr><tr><td>C 50 ml Polipropilen Konik Boru</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Hediye</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>F-23917</td><td>-20 °C'de tutun; Kullanmadan hemen öncesine kadar C</td></tr><tr><td>1.5 ml Siyah Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 konfokal mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 2.6.3 (FRET SE Wizard uygulaması ile)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kullanımı kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde kalsiyum değişiminin Ölçülmesi fret tabanlı konfokal görüntüleme

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Vasküler düz kas hücrelerinin (VSMC'ler) sarkoplazmik retikulumunda (SR) kararlı durum kalsiyum (Ca2+) seviyelerinin korunması, genel sağlıkları için hayati önem taşır. Hücre içi Ca2+ içeriğinin önemli bir kısmı VSMC'lerdeki SR depolarında bulunur. Plazma zarı-SR bağlantıları yoluyla çevredeki hücre dışı boşlukla yakın ilişkisi olan tek hücre içi organel olan SR'nin, Ca2+ geçici olaylarındaki herhangi bir düzensizliğe veya hücrenin yaşadığı strese ilk yanıt hattını oluşturduğu düşünülebilir. Pek çok işlevi arasında, en önemlilerinden biri, aşağı akışta hücre çapında daha fazla reaksiyonu indüklemek için hücre boyunca Ca2+ tarafından düzenlenen sinyallerin iletilmesindeki rolüdür. Bu bağlamda sitoplazmik Ca2 + göstergelerinin daha yaygın kullanımı, intraluminal SR Ca2 + deposunda henüz tam olarak karakterize edilmemiş olan oldukça dinamik değişikliklerin araştırılması için genel olarak yetersizdir. Burada, luminal SR Ca2 + 'nın doğrudan ve net ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu araç, hücrenin normal işlevi ve sağlığı üzerinde daha sonra önemli etkileri olan SR Ca2 + 'daki nüanslı değişikliklerin araştırılması için kullanışlıdır. Özellikle SR Ca2+ içeriğindeki dalgalanmalar, hücrenin yaşadığı hastalık veya stres durumlarına hücresel tepkilerle ilgili önemli miktarda bilgi sağlayabilir. Bu yöntemde, SR hedefli bir Ca2+ göstergesinin değiştirilmiş bir versiyonu olan D1SR, ajanların kültürlenmiş sıçan aort düz kas hücrelerine (SMC'ler) girmesine yanıt olarak Ca2+ dalgalanmalarını tespit etmek için kullanılır. D1SR indikatörü ile inkübasyonun ardından, konfokal floresan mikroskobu ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı görüntüleme, kontrol koşulları altında intraluminal SR Ca2+ seviyelerindeki değişiklikleri doğrudan gözlemlemek için ve hücre içi Ca2+ hareketini indüklemek için işlev gören agonist ajanların eklenmesiyle kullanılır.

Bu bölüm, dolaylı sitoplazmik Ca dalgalanmaları gözlemleyerek Ca 2 + deposu konsantrasyonları organele değişiklikleri ölçmek yaygın olarak kullanılan şekilde göre SR lümen Ca2 + konsantrasyonu verilerini yakalamak için tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini içerir 2+ . Şekil 1A YFP kanal (514 nm uyarma / 535 nm emisyon) &#39;de D1SR adenovirüs...

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Bu görüntüleme tekniğinin genel amacı, özellikle vasküler düz kas hücrelerinde, kalsiyum mobilize eden ajanlara yanıt olarak lümenal SR kalsiyum seviyelerindeki dalgalanmaları izlemektir. Bu yöntem, hücresel kalsiyum döngüsünün daha doğrudan bir şekilde aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Örneğin, sarkoplazmik retikulumdaki kalsiyum taşınımı ile ER stresi arasındaki ilişkiyi bilmek oldukça önemlidir.Bu tekniğin avantajı, kalsiyumu sitoplazmadaki değişimlerin dolaylı ölçümlerinden ekstrapole etmek yerine, doğrudan sarkoplazmik retikulum lümeninin içinden ölçebilmemizdir. Bu tekniği laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Gabriela Ziomek uygulamalı olarak gösterecek. Bu prosedüre başlamak için, DMEM içerisinde protein karışımının 1/25'lik bir dilüsyonunu hazırlayın.Ardından, her bir 35 mm cam tabanlı plağın dipteki iç cam daireyi tamamen kaplayacak şekilde 200 µL protein karışımlı DMEM aktarın. Plakları güvenlik kabini içerisinde oda sıcaklığında en az 30 dakika bekletin. Bu sırada, yüzde 10 NCS içeren DMEM'i bir benmari içinde 37 °C'ye kadar ısıtın.Ardından, DMEM'i cam pipet kullanarak kültür balonundan uzaklaştırın. Sonrasında, kalan DMEM kalıntılarını temizlemek için balon tabanını

measurement-calcium-fluctuations-within-sarcoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yüksek çözünürlüklü Ca Detayları...

Odak Ca 2 +</supDüz kas> Geçici Algılama

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak canlı hücreler yavaş akıları hızlı (mikrosaniye) kalsiyum olayları izole etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem, bir hücrede birkaç yüz piksel kayıt satırı tarar kalsiyum göstergeler floresan dalgalanmaları ölçer. Histogram analizi, bize farklı kalsiyum akıları zaman ölçeklerinde izole etmek için izin verir.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Doğrudan kalsiyum kıvılcım ölçülmesi için bir yöntem aşağıda tarif edilmiştir, Ca2 + elementer birim sağlam iskelet kas lifleri Sarkoplazmik retikulumdan bırakın. Bu yöntem, izole kas lifleri riyanodin reseptörü, Ca2 + serbest ozmotik stres-kaynaklı tetikleme kullanır. Dinamikleri ve hücre içi Ca 2 + sinyalizasyon homeostatik kapasitesi sağlığı ve hastalıkları, kas fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilir.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Kalsiyum çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yollarında rol oynamaktadır. Canlı hücre görüntüleme özel ekipman gerektirir ve zaman alıcı olabilir. Süspansiyon haline getirilmiştir yapışık epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum göreli değişiklikleri belirlemek için bir akış Sitometreyi kullanarak hızlı, basit bir yöntem optimize edilmiştir.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Hücre içi kalsiyum geri dönüşüm cardiomyocytes sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Burada, sarcoplasmic retikulum Ca2 + rezerv ve diyastolik kalsiyum kaldırma cardiomyocytes işlevinde bir kalsiyum görüntüleme sistemi tarafından değerlendirmek için bir protokol açıklayın.

Sarcoplasmic retikulum kalsiyum koruma ve hücre içi diyastolik kalsiyum kaldırma izole Ventriküler Cardiomyocytes olarak değerlendirilmesi

HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Protokol, kesilmiş sinirden fare motor sinir terminallerine floresan kalsiyum boyası yükleme yöntemini açıklar. Ek olarak, konfokal mikroskopi kullanarak periferik sinir uçlarındaki hızlı kalsiyum geçicilerini kaydetmek için benzersiz bir yöntem sunulmuştur.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Mevcut protokol, neredeyse in vivo bir ortamda hava yolunu ve intrapulmoner arteriyel düz kas kontraktilitesini değerlendirmek için fare hassasiyetiyle kesilmiş akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklamaktadır.

Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

Keşfedin FRET tabanlı konfokal görüntüleme yöntemiyle damar düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulum içi kalsiyum seviyelerini doğrudan ölçme tekniğini. Bu yöntem hücre içi kalsiyum döngüsünü ve ER stresi ilişkisini daha doğru şekilde araştırmanıza olanak tanır.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme (Video) | JoVE Journal

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Daha fazla video keşfet