Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Bu görüntüleme tekniğinin genel amacı, özellikle vasküler düz kas hücrelerinde, kalsiyum mobilize eden ajanlara yanıt olarak lümenal SR kalsiyum seviyelerindeki dalgalanmaları izlemektir. Bu yöntem, hücresel kalsiyum döngüsünün daha doğrudan bir şekilde aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Örneğin, sarkoplazmik retikulumdaki kalsiyum taşınımı ile ER stresi arasındaki ilişkiyi bilmek oldukça önemlidir.

Bu tekniğin avantajı, kalsiyumu sitoplazmadaki değişimlerin dolaylı ölçümlerinden ekstrapole etmek yerine, doğrudan sarkoplazmik retikulum lümeninin içinden ölçebilmemizdir. Bu tekniği laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Gabriela Ziomek uygulamalı olarak gösterecek. Bu prosedüre başlamak için, DMEM içerisinde protein karışımının 1/25'lik bir dilüsyonunu hazırlayın.

Ardından, her bir 35 mm cam tabanlı plağın dipteki iç cam daireyi tamamen kaplayacak şekilde 200 µL protein karışımlı DMEM aktarın. Plakları güvenlik kabini içerisinde oda sıcaklığında en az 30 dakika bekletin. Bu sırada, yüzde 10 NCS içeren DMEM'i bir benmari içinde 37 °C'ye kadar ısıtın.

Ardından, DMEM'i cam pipet kullanarak kültür balonundan uzaklaştırın. Sonrasında, kalan DMEM kalıntılarını temizlemek için balon tabanını sıcak steril PBS ile yıkayın. Kültürlenen düz kas hücrelerini balon tabanından ayırmak için, balonu bir mililitre tripsin ile hızlıca yıkayın ve tripsini uzaklaştırın.

Ardından bir mililitre daha tripsin ekleyin. Şişeyi çıkarmadan önce enzimin şişenin tüm tabanıyla temas ettiğinden emin olmak için yaklaşık 30 ila 60 saniye boyunca çalkalayın. Hücreler tripsin ile yerinden ayrıldıktan sonra, tripsin reaksiyonunu durdurmak için şişeye yüzde 10 NCS içeren taze DMEM ekleyin.

Elde edilen hücre çözeltisini flasktan temiz ve etiketlenmiş 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Ardından, hazırlanan her plakaya bir mililitre taze DMEM artı yüzde 10 NCS ekleyin. Bundan sonra, oluşmuş olabilecek herhangi bir peleti dağıtmak için hücre çözeltisini içeren tüpü nazikçe birkaç kez altüst edin.

Hafifçe karıştırılmış hücre solüsyonunun istenen hacmini her bir plakaya pipetleyin. Ardından, hücrelerin dipteki cam yüzeye eşit şekilde dağıldığından emin olmak için her bir plağı saat yönünde veya saat yönünün tersine iyice sallayın. Etkili görüntüleme için hücrelerin önümüzdeki 48 saat içinde yeterince yüksek konfluense ulaşmasını sağlamak amacıyla, plakaya yeterli miktarda hücre eklemek gereklidir.

Her bir plakaya besiyeri ve hücre çözeltisinin eklenmesinin ardından, hücrelerin cam tabana düzgün bir şekilde yapışmalarını sağlamak için plakaları 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren ortamda en az bir saat inkübe edin. Hücreler net bir şekilde yapışana kadar plakaları on beş dakikalık aralıklarla mikroskop altında kontrol edin. Ardından, Adenovirus D1 SR alikotunu -80 °C saklama alanından çıkarın ve mobil bir buz banyosu içerisinde biyolojik güvenlik kabinine taşıyın. Sonrasında.

Her plakaya soğutulmuş D one SR'nin istenen dozunu pipetleyin ve enfekte hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri bir mililitre taze DMEM artı yüzde on NCS ile yenileyin. Ardından, plakaları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de, yüzde beş karbondioksit ile gece boyunca inkübe edin.

Gece boyunca süren inkübasyonun ardından, kültür ortamı plakadan uzaklaştırılır. Kültür plağı, bir mililitre ılık fizyolojik HEPES-PSS tamponu ile üç kez yıkanır. Ardından, kayıt işleminden hemen önce bir mililitre taze ılık HEPES-PSS tamponu eklenir.

Konfokal mikroskobun ilişkili yazılımını açarak FRET SE uygulaması ile başlangıç görüntülemesini gerçekleştirin. Uygulama açıldığında, istenen deneysel ayarları düzenlemek için kurulum sekmesine tıklayın. Kanal ayarlarını manuel olarak değiştirerek hücrelerin sırasıyla donör ve FRET için 440 nanometrede ve akseptör için 513 nanometrede uyarılmasını sağlayın.

Ardından emisyon dalga boylarını donör için 488 nanometre, FRET ve akseptör için ise 535 nanometre olarak ayarlayın. Sonrasında, ışık yoğunluğunu yüzde 15 geçirgenlikte, hücreler için 150 milisaniyelik eksitasyon maruziyet süresi ve maruziyetler arasında 10 saniyelik aralıklar olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra plakayı mikroskop tablasında sabitleyin.

Görüntü çözünürlüğünü kontrol etmek için canlı (live) düğmesini kullanın. İstenen çözünürlük için ayarları daha da düzenleyin. Kurulum (setup) sekmesi altında, görüntü yakala (capture image) düğmesini kullanarak numunenin bir görüntüsünü alın.

Şimdi değerlendirme sekmesine geçerek, gerçekleştirilen deneyler için FRET verimliliklerini hesaplamak üzere uygun yöntemi seçin. D1SR indikatörü gibi Cameleonların kullanıldığı deneyler için rasyometrik hesaplama yöntemini kullanan üçüncü yöntem önerilir. Ardından, kaydedilen yoğunluk değerlerini bir grafikte gözlemlemek için grafik sekmesine geçiş yapın.

İstenirse, grafikte bu ilgi alanının karşılık gelen ortalama yoğunluğunu gözlemlemek için görüntüleyiciye bir ROI çizilmelidir. İlgili ajanı eklemeden önce kararlı bir baz hattı sinyali sağlamak için verileri toplamak amacıyla en az üç dakika boyunca kayıt başlatın. Ardından, kaydedilen ilgi bölgesinin yakınına, plaka içine doğrudan uygulayarak SR kalsiyumunu tüketmek için bir kalsiyum hareket ettirici ajan ekleyin.

Kayıt işlemini, işlemden sonra istenen süre boyunca sürdürün. Ardından, FRET SE uygulaması kullanılarak konfokal evirtmiş bir mikroskop ile rasyometrik FRET seri görüntülerini yakalayın. Bu adımda, sıçan aort düz kas hücresi kültür plakalarını hazırlamak için kültür plağını üç kez bir mililitre sıcak fizyolojik HEPES-PSS tamponu ile yıkayın.

Ardından, indikatörü bir mililitre sıcak HEPES-PSS ile karıştırın ve kültür plaklarına yükleyin. Düz kas hücrelerini indikatör ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, indikatörü kültür plağından uzaklaştırın ve plağı bir mililitre sıcak fizyolojik HEPES-PSS tamponu ile üç kez yıkayın.

Ardından, kayıt işleminden hemen önce bir mililitre taze sıcak HEPES-PSS tamponu ekleyin. Konfokal ters mikroskop ile seri görüntüler yakalayın. Sonrasında, SR kalsiyumunu tüketmek için bir araç olarak kalsiyum hareket ettirici ajanı ekleyin ve işlem sonrası istenen süre boyunca kayda devam edin.

Burada, CFP, FRET ve YFP bant geçiren filtreler kullanılarak D one SR indikatörü ile transfekte edilmiş bir düz kas hücresinin temsili anlık görüntüleri gösterilmiştir. Bu şekil, D one SR ile transfekte edilmiş kültürlenmiş sıçan aortik düz kas hücrelerinin gerçek zamanlı yalancı renkli anlık görüntülerini sunmaktadır. 2 µM Thapsigargin uygulaması, sinyal yoğunluğunda bir azalma meydana getirmiş olup bu durum Thapsigargin kaynaklı kalsiyum salınımı nedeniyle SR kalsiyum içeriğinde belirgin bir düşüş olduğunu göstermiştir. Ve bu grafik, 2 µM Thapsigargin ile işlem görmüş kültürlenmiş düz kas hücrelerindeki normalize edilmiş D one SR oranına ait temsili izi göstermekte olup SR kalsiyumundaki belirgin düşüşü doğrulamaktadır.

Sitozolik kalsiyum indikatörü ile yüklü ve iki mikromolar Thapsigargin ilele işlem görmüş kültürlenmiş sıçan aortik düz kas hücrelerinin temsilci kareleri burada verilmiştir. Görüldüğü üzere, Thapsigargin, SR'den kalsiyum salınımı nedeniyle sitoplazma içerisinde sinyal yoğunluğunda belirgin bir artışa neden olur. Bu grafik ise, iki mikromolar Thapsigargin ile işlem görmüş kültürlenmiş düz kas hücrelerindeki normalize edilmiş Fluo four AM oranına ait temsilci bir izi göstermektedir. Betimlenen kalsiyum sinyali artışının, SR'den salınan kalsiyum miktarıyla orantılı olduğu kabul edilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde başlangıçtan sona yaklaşık 48 saatte tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, kalsiyum indikatörü ile transfeksiyondan önce hücrelerin sağlıklı olduğundan emin olmak için hücreleri belirtilen koşullarda tutmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, D one SR indikatörü kullanılarak lümenal SR kalsiyum seviyelerinin ölçülmesine olanak sağlamak amacıyla kültürlenmiş hücrelerin nasıl hazırlanacağı konusunda net bir anlayışa sahip olmalısınız.