Uyanık Farelerde Nöroaktif Maddelerin Microiontophoretic Uygulaması ile birlikte Nöronal Faaliyet dışı Kaydı

Bu prosedürün genel amacı, uyanık hayvanlarda nöroaktif maddelerin mikroiyontoforetik enjeksiyonlarını kullanarak nöronal işlemenin sinaptik girdilerinin etkisini manipüle etmektir. Bu yöntem, nörotransmiterlerin rolü ve bunların duyusal uyaranlar ve kodlama üzerindeki etkileşimleri gibi duyusal sistemleri kullanarak temel işlevlerin çözülmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, anesteziden etkilenmeden sekmeye lokal sinatik girdilerin manipülasyonuna ve nöronal modülatör sistemlerin incelenmesine izin vermesidir.

Bu savurgan burada kısıtlanmış farelerde olmasına rağmen, yarasalar, sıçanlar veya kobaylar gibi diğer memelilerde de kullanılabilir. Bu prosedüre başlamak için, tungsten tellerini kesmek için özel olarak yapılmış bir hizalama aletine yerleştirin. Tellerin gevşek uçlarını yapışkan bantla dikkatlice tutturun ve istenen uzunlukta kesin.

Ardından, tungsten tellerini hizalama aletinden çıkarmak için bandı hafifçe çekin. Tüm tellerin banda bağlı kaldığından emin olun. Ardından, bandı cilalı bir pirinç milin üzerine yuvarlayın ve iyi bir elektrik bağlantısı olması için telleri mile sıkıca tutun.

Bundan sonra, iş milini iş istasyonundaki 5 RPM'lik bir motora bağlayın. Mil erişimi, aşındırma çözeltisinin yüzeyine göre 45 derece açılıdır. Daha sonra, tellerin üçte birini çözeltiye batırın.

Ardından, devreyi kapatmak için bir karbon çubuk elektrodu aşındırma banyosuna daldırın. İş istasyonunu açın, böylece mil dönmeye başlar, ardından elektrotlardan ve aşındırma çözeltisinden geçen akımı 250 miliampere ayarlayın. Tel uçlarını çok ince noktalara kazımak için akım 200 miliampere düştüğünde uç aşındırmayı durdurun.

Şimdi, alt ucu modelleme kili ile tıkanmış bir borosilikat cam kılcal damara bir tel yerleştirin. Pipeti bir ısıtma bobini ve asılı bir piston kullanarak tutun. Cam kaplı teli mikroskobun altına yerleştirmeden önce bir slayta sabitleyin.

Ucu ayarlayın ve odaktaki borik boncuğa dokunun. Sonra boncuğu hafifçe eriyene kadar ısıtın. Bundan sonra, yaklaşık 10 ila 15 mikron tel ucunu yerleştirin ve ısıtma potansiyometrelerini kapatın.

Boncuk soğudukça, tungsteni ortaya çıkarmak için camı elektrotun ucundan çıkarın. Yaklaşık 15 milimetrelik bir uç elde etmek için poları uygun parametrelere ayarlayın. Ucu tenha olan iki pipet elde etmek için kılcal damarı çekin.

Modelleme kili kullanarak bir slayta bir direk pipeti monte edin ve ince makas, forseps veya bir neşterin düz tarafını kullanarak ucunu kırın. Daha iyi bir yapıştırma ve daha ince bir topluluk elde etmek için elektrot ile çoklu namlu arasındaki açıyı hafifçe ayarlayın. Mikroskop altında, tungsten elektrodu çok namlulu ucun üzerine dikkatlice hizalayın.

Hizalandıktan sonra, elektrodu çoklu namluya temas edene kadar indirin. İki üst namlu arasındaki oluğa oturtun, ardından elektrotun ucunu çoklu namlunun ucundan 15 ila 20 mikrometre uzağa çıkıntı yapana kadar kaydırın. Şimdi tungsten ve çok namlulu topluluğa uçlarından yaklaşık 5 milimetre uzakta küçük bir damla ışıkla kürlenebilen yapıştırıcı uygulayın.

Çok namlulu kanalların tıkanmasını önlemek için yapıştırıcının uçlara ulaşmasını önleyin ve mavi ışıklı bir LED lamba kullanarak yapıştırıcıyı sertleştirin Şimdi, anestezi uygulanmış hayvanı sıcaklığını 38 santigrat derecede tutmak için bir ısıtma battaniyesinin üzerine yerleştirin ve hayvanların kafasını iki kulak çubuğu ve bir ısırma çubuğu ile stereotaksik bir çerçevede sabitleyin Ardından gözleri korumak için oftalmik jel uygulayın. Ardından, kafa derisini tıraş edin ve cildi dezenfekte etmek için povidon iyot uygulayın. Bir neşter kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için orta hat boyunca bir kesi yapın ve peridal ve oksipital kemiklerin daha rostral kısmını kaplayan perastium'u geri çekin.

Ardından, kafatasına ve baş direğinin tabanına ince bir ışıkla kürlenebilen yapışkan tabakası uygulayın. 10 saniye bekleyin ve baş direğini orta hat boyunca parietal kemiklerin rostral bölgesinin üzerine yerleştirin. Etkili bir yapışma gücü için yapıştırıcıyı 20 saniye kürlemek için mavi bir ışık kaynağı kullanın.

Ardından, küçük bir matkap ucu kullanarak baş direğinin tabanının etrafına ve arkasına iki delik açın. Kafatası ile kafa aşaması arasında ek bir temas noktası görevi görmesi için delinmiş bir deliğe bir saat vidası yerleştirin. Vidaları sıkıca takmak için bir buçuk tur atın ve gevşek olmadıklarından emin olmak için forseps ile test edin.

Ardından, gümüş topraklama kablosunun ucunu üçüncü deliğe sokun ve dura ile temas ettiğinden emin olun. Teli kafatasına bağlamak için küçük bir damla suya dayanıklı siyanoakrilat yapıştırıcı sürün. Daha sonra, baş direğinin tabanını, gümüş telin alt kısmını ve vidaları kaplayarak baş direğinin kafatası ile bağını güçlendirmek için ışıkla sertleşen kompozit uygulayın.

Kayıt sırasında erişime izin vermek ve kompoziti mavi bir ışık kaynağı kullanarak kürlemek için lambda'nın ötesine geçmemeye dikkat edin. Ardından, boynun arkasındaki kası, kafatasına yerleştirildiği yere yakın bir yere geri çekin. Küçük bir trephine kullanarak, inferior colliculus'u ortaya çıkarmak için lambda sütürünün hemen altına ve orta hattın yanına yuvarlak bir pencere açın.

Bu prosedürde, hayvanın vücudunu özel yapım köpük yastıklı bir süzgecin içine yerleştirin. Baş direğini stereotaksik çerçeveye takılı bir tutucuya sabitleyin. Bu, hayvana sıvı bir ödül vermek için iyi bir zamandır.

Daha sonra, hayvanın vücudunu pamuklu bir battaniyeyle örtün ve plastik bir yarım silindir ve yapışkan bant kullanarak gevşek bir şekilde sabitleyin. Varilleri seçilen ilaçlarla doldurmak için esnek uçlu bir şırınga kullanın. Mikro manipülatörü kullanarak çok namlulu elektrodu tutucusuna yerleştirin.

Ardından, her bir varilin içine kodlanmamış bir gümüş tel yerleştirin, böylece bir ucu çözeltiye temas eder ve diğer ucu erişilebilir olur. Daha sonra bu uçları mikroiyontoforez cihazına bağlayın. Bundan sonra, pozitif terminali tungsten elektrotun ucuna ve toprak terminalini duraya temas eden gümüş kabloya bağlayın.

Daha sonra, çok namlulu elektrodu, uç beynin yüzeyine temas edene kadar hareket ettirin. Beyin dokusunun kurumasını önlemek için ılık steril salin uygulayın. Bu noktada, tek birim aktivitesi ararken namlu ucundan ilaç sızıntısını önlemek için tutma akımı uygulayın.

Gabazinin nöral aktivitesini ve iyontoforetik uygulamasını kaydedin. Burada, gabazinin mikro iyontoforetik enjeksiyonundan önce ve sırasında inferior kollikulusta kaydedilen dört nöronun frekans yanıt alanı gösterilmektedir. Siyah çarpılar, frekansların nadir ve tekrarlayan sesler olarak sunulmayı seçtiğini gösterir.

Burada, gabazin enjeksiyonu öncesinde ve sırasında yanıt alanını oluşturmak için sunulan tüm frekanslara ve yoğunluklara nöral yanıtın birikmiş peristimulus zaman histogramları bulunmaktadır. Siyah çubuklar ses süresini gösterir. Burada, gabazin uygulamasından önce ve uygulama sırasında kırmızı renkte nadir ve mavi renkte tekrarlayan uyaran olarak sunulan bir çift frekansa verilen ani tepkinin nokta rasterleri verilmiştir.

Gölgeli arka plan, uyaranın süresini gösterir. Bu nokta rasterleri, parafrekansların göreceli olasılıkları değiştirildiğinde verilen yanıtları gösterir. Bu grafik, gabazin uygulaması öncesinde ve sırasında nadir ve tekrarlayan ses olarak sunulan yedi çift frekansa tek nöron yanıtlarını göstermektedir.

Ve bu grafik, gabazin uygulamasından önce ve uygulama sırasında ölçülen nadir ve tekrarlayan seslere verilen nöral yanıtın SSA indekslerini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, açıklanan Prosedür, nöral yapıya ve ilgilenilen nöron tipine göre spesifik parametrelerin ayarlanmasına izin verir. Baş desteği hayvan kayıtlarını denerken, kayıt sürelerinin hayvanın alışkanlık düzeyine göre belirlendiğini ve sınırlandırıldığını hatırlamak çok önemlidir, ancak önemli bir avantaj, aynı hayvan üzerinde birkaç gün birden fazla kayıt insizyonu yapılabilmesi ve kullanılan hayvan sayısını en aza indirgemesidir.

Piggy back elektrotları kullanarak mikroiyontoforetik performans göstererek, girdilerin kaynağı ve kayıt alanı içindeki nöronların projeksiyon hedefi gibi ek soruları yanıtlamak için nöral transistör enjeksiyonları gibi diğer prosedürler birleştirilebilir. Uyanık hayvanlarla çalışırken kritik bir konu onların sağlığıdır, bu nedenle protokolünüzde onaylanan geri çağırma süresini asla aşmayın ve herhangi bir rahatsızlık belirtisini kontrol etmek için lütfen sürekli izleyin. Eğer öyleyse, kaydı hemen durdurmalısınız.