Bir Yöntem Hedef ve Fare İzole Havayolu-innerve Duyu Nöronlar için

Bu deneyin genel amacı, vagus sinirinin havayolunu innerve eden nodoz nöronlarını işaretlemek ve izole etmektir. Bu yöntem, Periferik Nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, havayolunu innerve eden nöronlar hangi tanımlayıcı özelliklere sahiptir?

Bu tekniğin temel avantajı, belirli nöronal popülasyonları hedeflemek ve izole etmek için sağlam ve yüksek kapasiteli bir yöntem sunmasıdır. Duyusal ganglionlar toplandıktan sonra, ganglionları rahatsız etmeden her tüpten 500 µL ganglion disosyasyon solüsyonu aspire edin. Ardından, her örneğe 1 mL PBS ekleyin ve ganglionların tüplerin dibine çökmesini bekleyin.

Ardından, PBS'yi uzaklaştırın ve nöronlara sindirim enzimi ile takviye edilmiş bir mililitre gangliyon disosiasyon çözeltisi ekleyin; ardından pozitif kontrol tüpüne 20 mikrolitre Fast Blue ekleyin. Tüpleri, sindirim enziminin yaşına bağlı olarak uygun süre boyunca 37 derece Celsius'ta inkübe edin. Gangliyonların sindirim çözeltisiyle tamamen kaplandığından emin olmak için tüpleri her 15 dakikada bir kısa süreliğine sallayın ve hafifçe vurun.

Sinir hücreleri sindirilirken, her örnek için bir adet 1,5 mililitrelik tüpe, 400 microliters %28 yoğunluktaki çözeltinin üzerine yavaşça ve dikkatlice taze hazırlanmış 400 microliters %12 yoğunluktaki çözeltiyi ekleyin. Biri diğerinden daha koyu olmak üzere iki belirgin katman görülmelidir. Ardından, her ayıklama örneği için bir adet Fast Blue pozitif ve bir adet Fast Blue negatif tüp olacak şekilde, ayıklama işlemi için 1,5 mililitrelik toplama tüplerini etiketleyin.

Sindirim süresinin sonunda, sindirim enzimini atın ve ganglionları az önce gösterildiği gibi bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra her tüpe 200 mikrolitre taze ganglion disosiyasyon solüsyonu ekleyin. Ardından, 100 mikrolitre hacme ayarlanmış 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, kabarcık oluşmamasına dikkat ederek hücreleri tek hücre süspansiyonuna dönüştürmek için ganglionları birkaç kez yukarı aşağı pipetleyin.

Görünürde hiç sağlam doku parçası kalmadığında, 70 mikronluk bir hücre süzgecini bir elle sıkıca tutarak, disosiye edilmiş hücre solüsyonunu pipetle süzgecin merkezine aktarın. Ardından, ek hücreleri toplamak için disosiyasyon tüpünü 100 microliters taze gangliyon disosiyasyon solüsyonu ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu süzgeçten geçirin ve yeni bir pipet ucu kullanarak süzgecin alt kısmında kalan hücre içeren solüsyonu aspire edip hücre süspansiyonuna ekleyin.

Şimdi, hücrelerin tüm 300 µL'sini önceden hazırlanan yoğunluk gradyanının üzerine dikkatlice katmanlandırın. Ardından ganglion hücrelerini santrifüj yoluyla toplayın. Hücreler santrifüj edilirken, ayıklama kılıf sıvısının lizis tamponunu önemli ölçüde seyreltmemesini sağlamak için, Fast Blue pozitif toplama tüpüne 300 µL taze hazırlanmış lizis tamponu ve negatif toplama tüpüne 600 µL lizis tamponu ekleyin.

Santrifüjleme işleminin sonunda, hücre döküntülerinin çoğunu içeren üstteki 700 microliters çözeltiyi dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, kalan hücreleri 700 microliters taze gangliyon disosiyasyon çözeltisi ile karıştırın. Hücreleri santrifüjleyerek çöktürün ve süpernatanı dikkatlice atın.

Ardından, 1.000 mikrolitrelik bir pipeti 200 mikrolitreye ayarlayarak hücreleri 200 ila 300 mikrolitre sorting ganglia dissociation solution içinde tekrar süspande edin. Ve hücreleri, ayıklama işlemi için hazır olana kadar buz üzerinde bekletin. Gangliyon hücrelerini FACS ile saflaştırdıktan sonra, nöronları lizis tamponu içerisinde bir dakika boyunca vorteksleyerek homojenize edin.

Ardından, hücreleri bir hacim %70 ethanol ile birkaç kez karıştırın ve numunenin 700 microliters kadarını bir spin kolona aktarın. Kolonu bir mikrosantrifüjde 8,000 x g hızında 15 saniye boyunca santrifüjleyin ve süzüntüyü atın. Numunenin tamamı spin kolondan geçtikten sonra, RNA'yı standart RNA saflaştırma protokollerine göre ekstrakte edin.

Ardından, üretici spesifikasyonlarına uygun olarak RNA kalitesini test etmek için bir mikroakışkan elektroforez sistemi kullanın. Bu grafiklerde, sıralama kapılarını (sorting gates) ayarlamak için kullanılan negatif ve pozitif Fast Blue kontrolleri gösterilmiştir. Dissosiye edilmiş Fast Blue işaretli Nodose hücreleri daha sonra Fast Blue pozitif ve Fast Blue negatif popülasyonlar şeklinde ayrıştırılabilir.

Bu yöntem için ayıklama verimliliği %73 ile %85 arasındadır ve ortalama olarak yaklaşık 1.500 veya daha az Fast Blue pozitif ve yaklaşık 60.000 Fast Blue negatif hücre toplanır. Bu temsili örnekte gözlemlendiği gibi, mikroakışkan elektroforez ile elde edilen 18S ve 28S pikleri, daha sonra ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini belirlemek için RNA bütünlük numarasını hesaplamak amacıyla kullanılabilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde dört buçuk saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, adımları hızlıca tamamlamanın ve RNA ekstraksiyonu için taze hazırlanmış çözeltiler kullanmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, havayolunu innerve eden nöronlara özgü fonksiyonel özellikler nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için nöronal kültürleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, Periferik Nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların, vagus sinirinin nodose ganglionlarındaki spesifik bir havayolu-innerve eden nöron popülasyonunun benzersiz özelliklerini keşfetmesinin yolunu açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, RNA dizileme için kullanılabilecek veya fonksiyonel çalışmalar için ekilebilecek nodoz ganglionlardaki spesifik nöronların nasıl işaretleneceği ve ayrıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. 2-Merkaptoetanol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu bileşiği kullanırken eldiven giymek ve kimyasal çeker ocakta çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.