Bir Yöntem Hedef ve Fare İzole Havayolu-innerve Duyu Nöronlar için

Bu deneyin genel amacı, vagus sinirinin hava yolunu innerve eden nodoz nöronlarını etiketlemek ve izole etmektir. Bu yöntem, Periferik Nörobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, hava yolunu innerve eden nöronlar hangi tanımlayıcı özelliklere sahiptir?

Bu tekniğin ana avantajı, belirli nöronal popülasyonları hedeflemek ve izole etmek için sağlam ve yüksek verimli bir yöntem sağlamasıdır. Duyusal gangliyonları topladıktan sonra, gangliyonları rahatsız etmeden her tüpten 500 mikrolitre ganglion ayrışma solüsyonu aspire edin. Daha sonra, her numuneye bir mililitre PBS ekleyin ve ganglionların tüplerin dibine yerleşmesini bekleyin.

Daha sonra, PBS'yi çıkarın ve nöronlara sindirim enzimi ile takviye edilmiş bir mililitre ganglion ayrışma çözeltisi ekleyin, ardından pozitif kontrol tüpüne 20 mikrolitre Fast Blue ekleyin. Tüpleri, sindirim enziminin yaşına bağlı olarak uygun süre boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ganglionların sindirim çözeltisi ile kaplandığından emin olmak için tüpleri her 15 dakikada bir kısa bir süre sallayın ve

Sinir hücreleri sindirilirken, numune başına 1,5 mililitrelik bir tüpe 400 mikrolitre taze hazırlanmış %12 yoğunluklu solüsyonu 400 mikrolitre %28 yoğunluklu solüsyona yavaş ve dikkatli bir şekilde ekleyin. Biri diğerinden daha koyu olan iki farklı katman görünür olmalıdır. Ardından, sıralama numunesi başına bir Fast Blue pozitif ve bir Fast Blue negatif tüp dahil olmak üzere sıralama için 1,5 mililitrelik toplama tüplerini etiketleyin.

Sindirim süresinin sonunda, sindirim enzimini atın ve gangliyonları gösterildiği gibi bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, her tüpe 200 mikrolitre taze ganglion ayrışma solüsyonu ekleyin. Daha sonra, 100 mikrolitrelik bir hacme ayarlanmış 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, hücreleri tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak için gangliyonları birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve kabarcıkları önlemeye dikkat edin.

Sağlam bir doku parçası görünmediğinde, 70 mikronluk bir hücre süzgecini bir elinizde sıkıca tutarak, ayrışmış hücre solüsyonunu süzgecin ortasına pipetleyin. Daha sonra, ek hücreleri toplamak için ayrışma tüpünü 100 mikrolitre taze gangliyon ayrışma solüsyonu ile yıkayın. Yıkamayı süzgeçten geçirin ve süzgecin alt tarafında kalan hücre içeren solüsyonu aspire etmek için yeni bir pipet ucu kullanın ve bunu hücre süspansiyonuna ekleyin.

Şimdi, hücrelerin 300 mikrolitresinin tümünü önceden hazırlanmış yoğunluk gradyanının üzerine dikkatlice yerleştirin. Ve gangliyon hücrelerini santrifüjleme ile toplayın. Hücreler dönerken, ayırma kılıfı sıvısının lizis tamponunu önemli ölçüde seyreltmemesini sağlamak için Fast Blue pozitif toplama tüpüne 300 mikrolitre taze hazırlanmış lizis tamponu ve negatif toplama tüpüne 600 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.

Santrifüjlemenin sonunda, hücre kalıntılarının çoğunu içeren üst 700 mikrolitre çözeltiyi dikkatlice çıkarın. Daha sonra 700 mikrolitre taze gangliyon ayrışma solüsyonunu kalan hücrelerle karıştırın. Hücreleri santrifüjleme ile pellet yapın ve süpernatanı dikkatlice atın.

Daha sonra hücreleri, 200 mikrolitreye ayarlanmış 1.000 mikrolitrelik bir pipetle 200 ila 300 mikrolitre ayırma ganglion ayrışma solüsyonunda yeniden askıya alın. Ve hücreleri sıralamaya hazır olana kadar buzun üzerine yerleştirin. Gangliyon hücrelerini FACS ile saflaştırdıktan sonra, nöronları girdap ile bir dakika boyunca lizis tamponunda homojenize edin.

Daha sonra, hücreleri birkaç kez% 70'lik bir hacim etanol ile karıştırın ve numunenin 700 mikrolitresine kadar bir spin kolonuna aktarın. Kolonu bir mikrosantrifüjde 8.000 x g'de 15 saniye santrifüjleyin ve akışı atın. Numunenin tamamı spin kolonundan geçtiğinde, RNA'yı standart RNA saflaştırma protokollerine göre çıkarın.

Ardından, RNA kalitesini üreticinin spesifikasyonlarına göre test etmek için bir mikroakışkan elektroforez sistemi kullanın. Bu grafiklerde, sıralama kapılarını ayarlamak için kullanılan negatif ve pozitif Fast Blue kontrolleri gösterilir. Ayrışmış Hızlı Mavi Etiketli Nodoz hücreleri daha sonra Hızlı Mavi pozitif ve Hızlı Mavi negatif popülasyonlara ayrılabilir.

Bu yöntem için sıralama verimliliği, ortalama olarak toplanan yaklaşık 1.500 veya daha az Fast Blue pozitif ve yaklaşık 60.000 Fast Blue negatif hücre ile %73 ila 85'tir. Bu temsili numune için gözlemlendiği gibi, mikroakışkan elektroforez ile elde edilen 18S ve 28S tepe noktaları daha sonra ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini belirlemek için RNA bütünlük numarasını hesaplamak için kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa dört buçuk saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, adımlardan hızlı bir şekilde geçmeyi ve RNA ekstraksiyonu için yeni hazırlanmış solüsyonları kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hava yolunu innerve eden nöronlara özgü fonksiyonel özelliklerin neler olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için nöronal kültürleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, Periferik Nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların, vagus sinirinin nodoz gangliyonlarındaki belirli bir hava yolunu innerve eden nöron popülasyonunun benzersiz özelliklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, daha sonra RNA dizilimi için kullanılabilecek veya fonksiyonel çalışmalar için kaplanabilecek nodose gangliyonlarının spesifik nöronlarının nasıl etiketleneceğini ve ayrıştırılacağını iyi anlamış olmalısınız. 2-Merkaptoetanol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu bileşiği kullanırken eldiven giymek ve kimyasal bir başlıkta çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.