BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma

Bu farklılaşma protokolünün genel amacı, kültürde homojen atriyal kardiyomiyosit popülasyonları oluşturmaktır. Dolayısıyla bu yöntem, kardiyak gelişim ve atriyal aritmi gibi kardiyak hastalıkların incelenmesinde kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, in vitro olarak homojen atriyal kardiyomiyosit kültürleri üretmesi ve minimum eğitimle yapılabilmesidir.

Fare embriyonik kök hücresini veya mESC kültürlerini kurmadan dört gün öncesine kadar, sterilize edilmiş bir doku kültürü davlumbazında oyuk başına 1 mililitre jelatin içeren altı oyuklu plakada, her biri 5 mililitre% 0.2 jelatin çözeltisi içeren 10 santimetrelik doku kaplarını kodlayın. Kültür gününde, ekstra jelatin çözeltisini çıkarın ve jelatin kaplı 10 santimetrelik tabaklardan birine 10 mililitre orta ekleyin. Ardından, şişenin merkezinde sadece küçük bir buz kristali kalana kadar 37 derecelik bir Celcius su banyosunda 1 çarpı 10 ila 6 mESC'lik bir şişeyi hafifçe döndürmek için kriyomaşa kullanın.

Şişeyi tek kullanımlık, tüy bırakmayan bir mendille kurulayın ve %70 etanol ile sterilize edin. Daha sonra şişeyi doku kültürü başlığına yerleştirin ve ESC'leri tabağa eklemek için bir P1000 pipeti kullanın. Hücreleri% 5 karbondioksit içeren 37 derecelik Celcius nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı yavaşça önden arkaya ve yan yana hareket ettirin.

İnkübasyonun sonunda, hücre ekini doğrulamak için bir parlak alan mikroskobu kullanın. Bazı kalıntılar ve ölü hücreler gözlenecektir. Ortamı 10 mililitre taze mESC ortamıyla değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri koyun.

Kültür% 60 ila 70 birleştiğinde, plakayı magnezyum ve kalsiyum içermeyen 5 mililitre steril DPBS ile durulayın ve hücreleri beş dakika boyunca 37 derece Cantius'ta 2 mililitre tripsin EDTA içinde inkübe edin. Hücreler inkübe edilirken, fazla jelatin çözeltisini pasajlı kültür başına 10 santimetrelik yeni bir tabaktan aspire edin ve her plakaya 10 mililitre ortam ekleyin. Daha sonra ayrılan hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte santrifüjleme yoluyla toplayın ve peleti 10 mililitre mESC ortamında yeniden süspanse edin.

İstenen bölme oranına bağlı olarak, her 10 santimetrelik çanağa 0,5 ila 1 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri koyun, hücreleri her bir tabakta gösterildiği gibi nazikçe dağıtın. Pasajlı hücreler% 70 birleştiğinde, bunları az önce gösterildiği gibi tripsin EDTA ile ayırın, ardından tek hücreli süspansiyonu 5 mililitre embriyoid cisimciği veya EB ortamında yeniden süspanse edin. mESC'leri sayın ve daha sonra bunları uygun hacimde EB ortamında 2.5 kat 10 ila 3'lük bir nihai konsantrasyona seyreltin.rd mililitre başına hücreler.

Daha sonra, asılı damla kültürü başına bir steril 10 santimetre bakteriyel petri kabının dibine 2 mililitre PBS ekleyin ve EB süspansiyonunu steril bir çözelti havzasına aktarın. Şimdi, kapağı hazırlanan yemeklerden birinden çıkarın ve 60 adet 20 mikrolitrelik EB süspansiyonunu iç yüzeye dikkatlice bırakmak için altı uçlu çok kanallı bir pipet kullanın. Kapağı yavaşça tabağın üzerine geri yerleştirin, asılı damlaları yerinden çıkarmamaya dikkat edin ve bulaşıkları iki gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne koyun.

EB'ss'yi yıkamak için, kapağı asılı damla kültüründen dikkatlice çıkarın ve 45 derecelik bir açıyla eğin. Ardından, oda sıcaklığında EB ortamı içeren 5 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, EB'leri kapağın altındaki bir havuza nazikçe yıkayın. Yüzeye yapışmış EB'ler için kapağı dikkatlice inceleyin, ardından EB'leri kaplamasız, 6 santimetrelik bir petri kabına aktarın.

EB'leri iki gün daha doku kültürü inkübatörüne geri koyun, plakaları EB agregasyonu ve eki için günlük olarak kontrol edin. EB'leri kaplamadan önce, hazırlanan altı oyuklu plakanın her bir oyuğundaki fazla jelatin kaplama solüsyonunu 2 mililitre taze hazırlanmış, oda sıcaklığında Grem2 işlem ortamı ile değiştirin. Daha sonra, her bir oyuğa 30 EB aktarmak için 100 mikrolitreye ayarlanmış bir P1000 pipeti kullanın, ardından plakayı gece boyunca inkübatöre geri koyun ve hücreleri gösterildiği gibi yumuşak bir hareketle eşit şekilde dağıtın.

EB'ler kuyuların dibine bağlandıktan sonra, Grem2 ortamını 10. güne kadar her iki günde bir değiştirin. Ardından, sağlıklı bir hücre kültürünü korumak için hücreleri her iki günde bir taze EB ortamı ile besleyin. Asılı damla kültüründen önce, pluripotent kök hücreler kompakt olmalı ve spontan farklılaşma içermemelidir.

Spontan farklılaşma gözlenirse, hücreler asılı damla kültürlerinde kullanılmamalıdır. Kaliteli EB genellikle eşit aralıklı, iyi yuvarlatılmış asılı damlalar içinde en iyi şekilde oluşturulur. Farklılaşmanın ikinci gününde, EB'ler, asılı damlaların uçlarında farklılaşan kök hücrelerin küresel düzenlemeleri olarak çıplak gözle görülebilmelidir.

Dördüncü günde, iyi şekillendirilmiş EB'ler serbest yüzer ve boyut ve şekil olarak homojen olmalıdır. Kaplandıktan sonra, hücreler EB'den doku kültürü plakasının yüzeyine göç ederken, burada sekiz ve 10. farklılaşma günlerinde gözlemlendiği gibi, EB'ler düzleşecektir. Tedavi edilmemiş kontrol kuyularında, altıncı gün kadar erken ve dokuzuncu gün kadar geç saatlerde küçük, yavaş büzülen yamalar gözlenir.

Grem2 ile muamele edilmiş kuyularda, nispeten hızlı bir daralma oranına sahip büyük yamalar yaygındır. Farklılaşmış hücrelerdeki gen ekspresyonunun RT-QPCR analizi, tipik olarak Grem2 ile tedavi edilen kültürlerde yüksek seviyelerde kardiyak yapısal ve düzenleyici genleri ortaya çıkarır. Alfa-MHC DsRed nükleer hücre hattı kullanılırsa, kardiyomiyositlerin artan verimi, Grem2 ile muamele edilen kuyucuklarda daha fazla sayıda DsRed etiketli çekirdek olarak gözlenir.

Grem2 tedavisi ayrıca, RT-QPCR ve hücresel aksiyon potansiyeli süresinin yama kelepçesi ölçümleri ile onaylandığı gibi, atriyal benzeri bir fenotipe doğru farklılaşmayı önyargılıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, farklılaşan kök hücreler Grem2 ile 60 dakika gibi kısa bir sürede tedavi edilebilir ve boncuklanma hücreleri genellikle yedinci gün kadar erken bir sürede gözlenir. Bu prosedürü denerken, brachyury gibi gastrulasyon belirteçlerinin en yüksek ekspresyonundan sonraki dördüncü günde sürekli olarak Grem2 eklemeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, üretilen hücrelerin fonksiyonel ve moleküler özelliklerini anlamak için elektrofizyoloji ve QPCR gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Grem2 kullanarak fare ESC'lerinden atriyal kardiyomiyositlerin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.