Name: BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Öğrenin, pluripotent kök hücrelerden Grem2 kullanarak atriyal kardiyomiyosit farklılaşması için homojen popülasyonlar üretme yöntemini. Bu protokol, kalp gelişimi ve aritmi araştırmalarında yüksek verimli sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe HL083958 ve HL100398 (AKH) ve 2T32HL007411-33 tarafından desteklenen &quot;Kardiyovasküler Mekanizmaları Programı: Soruşturmasında Eğitimi&quot; (JB).

Hücre Kültürü Medya, Çözümler ve Reaktifler 1. hazırlanması. <ol><li> Fare embriyonik kök hücre, 500 ml (Mesc) karıştırılması ve steril süzme (0.2 um gözenek boyutu) 445 mi Glasgow Minimum Esansiyel Medium (GMEM), 50 mi, ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile ortam hazırlanması 5 mi 100X L- konsantre edildi ml başına 1 x 10 7 birim ve 1.43 ul ß-merkaptoetanol (nihai konsantrasyon 50 uM olan) glutamin yerine, 5 ul rekombinant fare lösemi önleyici faktörü (LİF). Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Karıştırma ve steril filtreleme 391 ml embriyoid Gövde (EB) farklılaşma ortam 500 ml Hazırlama Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı (IMDM) FBS, 100 mi, ısı, 5 mi 100X L-Glutamin yerine konsantre edildi, 5 mi 100X olmayan temel amino asitler konsantre edildi (MEM&#39;dir) ve 2.86 ul ß-merkaptoetanol (nihai konsantrasyon 100 uM&#39;dir). hazır olana kadar 4˚ C&#39;de saklayın kullanmak için. </li><li> % 0.2 hazırlamasüzüldü, 500 ml 1 g domuz derisi jelatin tozu ile kanştınlarak Jelatin / hac çözeltisi, damıtılmış H2O otoklav sterilize edilir. jelatin, oda sıcaklığında su içinde tamamen çözünür olması unutmayın. jelatin Otoklavlamadan sonra tamamen yok edilmesi gerekir. Kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın. </li><li> 0.5 ug / ul stok çözelti yapmak için% 0.1 BSA ile takviye edilmiş 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde liyofilize GREM2 50 ug pelet çözülmesiyle GREM2 yeniden birleştirici protein eşit miktarlarda hazırlayın. hazır kadar en -80˚ C Kısım beş steril 1.5 ml&#39;lik santrifüj tüplerine içine bu stok solüsyonu 20 ul ve mağaza kullanmak için. </li><li> 10X stok olarak yayınlanmış protokoller veya satın alma uygun PBS hazırlamak ve seyreltme 19 çalışan bir 1X yapmak için süzüldü damıtılmış H2O ile 1:10 oranında seyreltin. Kullanmadan önce otoklav ile PBS sterilize edin. Kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın. Bazı adımlarda, kullanılan 2+ Ca 2 + ve Mg olmadan DPBS. Bu pu1x çözelti olarak rchased. Sipariş bilgileri reaktifler tablosuna dahil edilir. </li></ol> Jelatin 2. Hazırlık 10 cm&#39;lik doku kültür tabakları Kaplı <ol><li> steril doku kültürü kaputu kaplama her 10 cm doku kültürü çanağı% 0.2 jelatin çözeltisi 5 ml. En az 30 dakika veya 4 güne kadar 37 ° C&#39;de inkübatör içinde yer yemekler. </li></ol> Jelatin 3. 6-yuvalı doku kültür plakaları Kaplı <ol><li> Bir steril doku kültürü başlık bir 6-yuvalı doku kültür plakasının her bir oyuğuna 0.2% jelatin 1 ml. En az 30 dakika veya 4 güne kadar 37 ° C&#39;de inkübatör içinde yer plakalar. </li></ol> 4. Embriyonik Kök Hücre Kültürü <ol><li> çözülme mESCs <ol><li> steril doku kültürü kaputu RT&#39;ye ısıtarak Mesc ortamını hazırlayın. jelatin kaplı 10 cm çanak 10 ml RT ortam ekleyin. </li><li> Yaklaşık 1 x 10 6 hücre içeren mESCs 1 şişe çıkarınkriyodepolama. 37 ˚C su banyosunda maşa, yer cryovial tutarak. Hücre süspansiyonu çözülmüş ve sadece küçük bir buz kristali şişenin merkezinde kalana kadar yavaşça girdap. ile şişeyi kapalı kuru atılabilir havsız silin ve% 70 EtOH ile sterilize edin. </li><li> Steril doku kültürü kaputu cryovial bir P1000 ucunu kullanarak çözülmüş hücreleri çıkarmak ve 4.1.1 hazırlanan 10 cm çanak) transfer. </li><li> Arkaya doğru hafifçe plaka ön hareket ettirerek hücreleri dağıtmak eşit% 5 CO 2 ile 37 ˚C nemlendirilmiş hücre kültürü kuvöz içine 10 cm çanak yerleştirin ve sonra yan yana. Hücreler O / N plaka veya en az 6 saat eklemek için izin ver. </li><li> İlk şey parlak bir alan mikroskobu kullanılarak eki için ertesi sabah kontrol hücreleri. Bazı hücre yıkıntıları ve ölü hücreler ortamda gözlenecektir. Bu normal. yemekler aspire medya ve 10 ml taze Mesc medya ile değiştirin. </li><li> farklılaşma önlemek için her gün hücreleri üzerinde ortamı değiştirmek devam ediyor. </li></ol></li><li&gt; Pasajlanması mESCs <ol><li> Passage hücreleri zaman% 60-70 konfluent. Medya aspirasyon ve MgCl2 ve CaCl2 olmadan 5 ml steril 1X DPBS ile durulama geçiş için hücreleri hazırlayın. 2 mi% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir inkübatörde yerleştirin. </li><li> Hücreler inkübe edilirken, jelatin solüsyonu aspire RT Mesc ortam 10 ml ekleyerek yeni 10 cm tabak hazırlar. 5 dakika sonra dekolmanı hücreleri kontrol edin. Hücreler bağlı kalır ise tamamen müstakil kadar bir seferde 2 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe devam etmektedir. </li><li> Mesc ortam 3 ml ekleyerek tripsin-EDTA söndürün. pelet 5 dakika 200 x g&#39;de 15 ml santrifüj tüpüne ve spin hücre süspansiyonu aktarın. pelet aspire medya ve 10 ml Mesc medyada askıya yeniden. </li><li> İstenen bölme oranına bağlı olarak, aşama 4.2.2&#39;de hazırlanan her bir çanak) hücre süspansiyonu, 0.5-1.0 ilave edin. sonra yavaşça öne geri yan yana hareket ettirerek hücreleri dağıtmak eşit inkübatör çanak yerleştirin ve. tümakış hücreleri O / N ya da en az 12 saat süre ile birleştirebilir. NOT: 1:10 Bölünmüş oranı - 01:20 çoğu Mesc hatları için yaygındır. Bu oran, yeni bir çanak kullanılan çizgi, kanal adedi ve istenen izdiham bağlı olarak değişebilir. yeni hazırlanmış jelatin-kaplı 10 cm&#39;lik bir tabakta 1:10 bölünme oranı 9 mi Mesc ortam içine 1 ml hücre süspansiyonu transferi ve plaka için. </li></ol></li></ol> Embriyoid Cisimlerin 5. Hazırlık Not: santrifüj dışında tüm adımlar steril doku kültürü kaputu gerçekleştirilir. <ol><li> EB Medya Hücre süspansiyonunun hazırlanması <ol><li> % 70 confluency (genellikle 24-48 saat sonrası geçiş) sonra, EB oluşumu için hücreleri kullanın. 4.2.3) - sökülmesi ve bölümlere 4.2.1) göre taneleştirilerek EB oluşumu için hücreleri hazırlayın. Not: (. Örneğin, çok az hücre ölümü, kontaminasyon, uygun morfoloji) en az bir kez post-çözülme geçiş hücrelerine en iyi ve sağlığı için kontrol edin ve güçlü büyüme (e.g., önce her 24-48 saat meydana gelen nüfus çiftlenmeler) EBS yapmak için kullanılacak. </li><li> 5 ml EB medya pelet yeniden askıya. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacını kullanarak hücreleri saymak. </li><li> / Ul 25 hücre (veya 2.5 x 10 3 hücre / mi) içindeki bir nihai konsantrasyon yapmak EB ortamının gerekli hacimde bir hücre süspansiyonu ile seyreltilir. bir petri kabı, her kapak 60 EBS tutan ve hücre süspansiyonu, yaklaşık 1.3 ml gerektirdiğini not edin. Bu adımda, EBS istenen bir sayı üretmek için, hücre süspansiyonunun yeterli hacmi hazırlar. 240 EBS deney için gerekli olan, örneğin, 2.5 x 10 3 hücre / ml&#39;de 5.2 ml hazırlar. Not: EB formasyonu için kullanılmayan mESCs Mesc ortam içinde yeniden süspansiyon haline ve Bölüm 4.2&#39;de tarif edildiği gibi kaplama, aşağı iplik gelecekteki deneyler için de kullanılabilir. </li></ol></li><li> Embriyoid Kuruluşlarının Yaratılış <ol><li> e altına 1X PBS 2 ml ekleyerek steril 10 cm tanecik oluşumu asılı bakteriyel petri yemekler hazırlamakach. </li><li> steril bir çözelti havzasına adım 5.1 EB süspansiyon) aktarın. </li><li> Hazırlanan petri kapağını kaldırın ve dikkatlice iç yüzeyi üzerine EB süspansiyon altmış, 20 ul damla yatırmak. etkin bir şekilde 6 uçları ile donatılmış çok kanallı bir pipet kullanılarak bunu. Her 20 ul damla şimdi 500 hücreleri vardır. </li><li> Yavaşça damla asılı çıkarmak için dikkatli olmak, bakteriyel petri yemek alt yarısında üzerine kapağı değiştirin. 2 gün sonra 37˚ C&#39;de hücre kültürü kuvöz içine yemekleri yerleştirin hücreleri) 5.3 anlatıldığı gibi yıkamak için hazırız. </li></ol></li><li> Embriyoid Cisimlerin Yıkama-down Not: Tüm yıkama-aşağı adımlar steril doku kültürü kaputu yapılmaktadır. <ol><li> 2 gün sonra EB aşağı yıkamak için hazır ve 6 cm bakteriyel petri kaplarına transfer. RT&#39;ye petri başına EB medya Pre-sıcak 3 ml. Her 6 cm bakteriyel petri etkin bir damla asılı değerinde 2 kapakları tutabilir. Not: olmayan bir kaplı petri f kullandığınızdan emin olunveya bu adım (malzeme tabloya bakınız). Bir doku kültürü çanak veya hücre yapışmasını teşvik başka bir yüzeye kullanmayın. Bölüm 6&#39;da tarif edildiği gibi EBS hazır olana kadar ortamda kaplanmıştır için askıda kalır gerekir. </li><li> kuluçka 10 cm petri kapları çıkarın ve steril doku kültür davlumbaz içine yerleştirin. Dikkatle EBS ile kapağı çıkarın ve 45 derecelik açıyla eğin. </li><li> RT EB ortam 3 ml ihtiva eden bir 5 ml serolojik pipeti kullanarak, yavaşça kapak altındaki bir havuza EBS yıkayın. Dikkatle yüzeye yapışmış ve gerekirse-durulama yeniden EBS için kapağı kontrol edin. </li><li> 6 cm&#39;lik petri tüm EBS transferi yıkadıktan sonra. </li><li> Tümünü tekrarla EBS için) -5.3.4) 5.3.2 yineleyin. Her 6 cm petri iki 10 cm kapaklar gelen EBS içermelidir. İki gün daha 37 ˚C geri kuvöz içine tüm yemekleri yerleştirin. NOT: Çok süspansiyonda birbirine yakın EBS birbirine yapışmasına ve büyük agrega oluşabilir. Bu olumsuz kalp farklılaşma verimliliği etkileyebiliryanı sıra önemli ölçüde mevcut EBS sayısını azaltmak. toplanmasını önlemek için, EBS, her gün kontrol ve yavaşça ileri geri hareket ettirerek ayrılmalıdır, daha sonra yan yana. Erken farklılaşma adımda bakteriyel yemekler kullanımı çanak EB bağlanmayı önleyen ve EBS süspansiyon içinde büyümeye izin vermek için gerekli olan. </li></ol></li></ol> GREM2 ile EBS 6. Kaplama ve Tedavi <ol><li> 1-5 mg / ml bir nihai seyreltme için GREM2 RT EB ortamına stoklar yeterli hacmi (0.5 ug / ml) ilave edilerek GREM2 işleme ortamı hazırlayın. Not: EBS tedavisi için etkili konsantrasyon hücre hattı ve GREM2 mevcut çok spesifik aktivitesine bağlı olarak değişir. Dozu kullanmadan önce maksimum etkinliği bulmak için titre edilmesi tavsiye edilir. CGR8 Mesc hattı için rutin GREM2 3-5 ug / ml kullanmak. arasında hızla daralan hücreler üretecek atriyal miyosit üretimi için GREM2 etkin yoğunluktaher iyi genelinde yaygın olan günler 7-8. sözleşme fenotipi işlenen kültürlerde gözlenen değilse GREM2 belirtilen aralık içinde titre edilebilir doz tavsiye edilir. </li><li> her bir jelatin kaplama çözeltisi aspire RT GREM2 işleme ortamının 2 ml eklenerek 6-yuvalı doku kültürü plakaları hazırlayın. Inkübatör EBS çıkarın ve steril doku kültürü kaputu içine yerleştirin. </li><li> her kuyuya 6 cm petri 100 ul transferi 30 EBS ayarlanmış bir P1000 kullanma. Yeri EBS kuvöz içine ve eşit yan sonra ön arka tarafını plakasını hareket hafifçe tarafından dağıtmak. <ol><li> EBS jelatin kaplı kuyulara bağlı sonra, sağlıklı hücreleri korumak için her iki günde bir, taze EB medya günden 10 güne sonra 10 kadar GREM2 tedavinin kesilmesine iki günde GREM2 ortamını değiştirin ve ekleyin. NOT: taktıktan sonra, EBS kaplı plaka yüzeyi boyunca dışarı dümdüz olacak. </li></ol></li></ol> RT-qPCR Analy 7. hücre ayrışmaabla <ol><li> Tripsin-EDTA ile hücre ayrışma <ol><li> Her bir aspire ortam ve steril DPBS eksi Ca + 2 ve Mg + 2 oyuk başına 1 ml ile iki kez yıkayın. </li><li> her bir hücre elde edilecek olan 0.5 ml% 0.25 steril Tripsin-EDTA solüsyonu ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübatör içinde plaka koyun. </li><li> ayrılması için 5 dakika kontrol hücreleri sonra. Hücreler yine de musluğun altına takılı kalırsa yavaşça gevşetin. dokunarak hücrelerinin gevşetmek etmezse, geri kuvöz içine yerleştirin ve hücreler tamamen müstakil kadar her 2 dakikada bir monitör. </li><li> her oyuğa 0.5 ml EB ortamı eklenerek tripsin-EDTA çözeltisi nötralize. </li><li> 1.5 ml mikro santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu tüm 1 ml aktarın. </li><li> 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca bir masa üstü santrifüj iplik Pelet hücreleri. </li><li> Aspire pelet medya ve lizis için hazır olana kadar -70 ° C&#39;de hemen lizis veya mağaza pelet geçmek. Uzun terBu RNA bozunmasına yol gibi pelet m saklanması tavsiye edilmez. </li></ol></li><li> Hücre parçalama ve moleküler analizi <ol><li> Bu noktada hücreler (malzemelerin tabloya bakınız) ticari bir kolon ekstre etme kiti kullanılarak ve üretici tarafından sağlanan protokollere göre, bir RNA özütleme reaktif kullanılarak RNA izolasyonu için hazırdır. Bir kez izole, transkripsiyonu RNA ters ve 21 standart teknikler 20 kullanılarak RT-qPCR analizi için cDNA kullanın. NOT: RT-qPCR için bu laboratuvarı tarafından kullanılan primerler Tablo 1&#39;de Atriyal kimlik listelenen kayıt aksiyon potansiyeli süresi (bakınız bölüm 8) atriyal ve ventriküler genlerin ifadesi ve elektrofizyoloji bakmak için RT-qPCR bir arada kullanarak teyit edilir. bir gen seçimi, güvenilir atriyal ve ventriküler markerlerinin bir örnek olarak, bu protokolde yer almaktadır. Pluripotent kök hücre farklılaşması bağlamında atriyal ve ventriküler gen ekspresyonu ile ilgili daha fazla bilgi referans 14&#39;de bulunmaktadır. &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 8. Elektrofizyolojik Analizi <ol><li> Kollajenazının ile hücre Ayrışma <ol><li> her bir ve steril PBS göz başına 1 ml ile iki kez yıkayın aspire ortam. </li><li> Her / ml kolagenaz çözelti, 1 mg, 0.5 mi de ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübatör içinde plaka koyun. </li><li> ayrılması için 5 dakika kontrol hücreleri sonra. hücreler hala birbirlerine ya da musluğun altına takılı kalırsa yavaşça gevşetin. Dahası, bir P1000 nazik toz haline getirilerek hücreleri ayırmak. NOT: Tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar yama kelepçe kayıtları hücreleri kolaylaştırmak için toz haline edilmelidir. </li><li> her kuyuya 0.5 ml EB medya ekleyin ve pipetleme karıştırın. </li><li> 1.5 ml mikro santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu tüm 1 ml aktarın. </li><li> 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca bir masa üstü santrifüj iplik Pelet hücreleri. </li><li> Hücre pelet aspire medya. </li><li> 500 hücreleri yeniden askıyatek bir hücre süspansiyonu içine çiğnemek için emin olmak,% 10 FBS ile PBS mcL. </li></ol></li><li> Elektrofizyolojik Karakterizasyonu. NOT: Birçok mükemmel protokolleri hücre zarı potansiyellerini ölçmek için tek bir hücre yama kelepçe kullanarak bu dergide yayınlandı. Tek hücreli yama acemi okuyucu kelepçe nasıl gerçekleştirileceği hakkında ayrıntılı bilgi için bu protokollerin 21-24 denir. Aşağıdaki deneyimli elektrofizyolog hazırlamak ve Mesc alt tipi karakterizasyonu için CMS türetilmiş idare yardımcı olacaktır bu protokol için özel bilgileri içerir. <ol><li> 10 mM HEPES tamponu, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mM potasyum glutamat, 10 mM KCI ve 10 mM NaCI: Aşağıdakilerden oluşan hücre içi kayıt çözeltisi hazırlayın. NaOH ile 7.2 arasında bir pH değerine çözelti ayarlayın. </li><li> Hücre dışı kayıt (banyo) aşağıdakilerden oluşan çözelti hazırlayın: 2 mM HEPES, 10 mM glükoz, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5.4 mM KCI, 137mM NaCI. NaOH ile 7.4 arasında bir pH değerine çözelti ayarlayın. </li><li> Filament standart borosilikat camını kullanarak kayıt çözümü ile geri dolduruldu zaman 2-5 MQ direncini ölçen bir cam pipet hazırlayın. </li><li> Transfer P200 kullanılarak hücre dışı kayıt solüsyonu içeren bir kayıt odasına süspansiyon 100 ul hücre. Not: Hücreler, kullanımı kolaylaştırmak ve ilaç tedavisi ve / veya perfüzyon deneyleri için kullanılacak, süspansiyon içinde yama ya edilebilir 8.2.5 belirtildiği gibi bir jelatin kaplı lamel) üzerinde tohumlanabilir. </li><li> 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna 10 mm çapında bir cam lamel yerleştirerek ve bu protokol) Bölüm 3.1 de tarif edildiği gibi bir jelatin çözeltisi ile kaplayarak jelatin kaplamalı cam lamel hazırlayın. <ol><li> En az 30 dakika aspire jelatin solüsyonu sonra ve kapak ve en az 2 saat boyunca ya da hücre eklenmiş kadar inkübatör içine bütün 6-plaka doğrudan süspansiyon 100 ul hücre ilave edin. Hücreler ekledikten sonra, Rekstrasellüler kayıt çözümü ile odasına kayıt olarak aldır kapak kayma ve yer. Not: αMHC-DsRed flüoresan kardiyak raportör Mesc hattı kullanıldığında, CM&#39;ler kendi kırmızı flüoresan çekirdekleri tarafından tanımlanabilir. Kalp muhabir hattı kullanarak değilse, kendiliğinden sözleşme hücreleri görülebilir ve ölçümler için izole edilmiştir. Pluripotent kök hücre tam olarak oluşmuş yetişkin kardiyak miyositler karakteristik dikdörtgen morfolojisi eksik, CM&#39;ler genellikle daha küçük ve daha yuvarlak türetilmiş. </li></ol></li><li> 37 ˚C tüm kayıtları yapın. 2-5 MQ direnci borosilikat cam pipet ile akım kelepçe modunda tüm hücre kelepçe kullanarak tek hücre yama. tüm hücre erişmesini önce gigaohm mühür elde etmek için hafif negatif basınç kullanın. membran rüptürü ve membran potansiyelleri kaydetmeden önce tam hücre erişmek için hızlı negatif basınç uygulayın. </li><li> Geçerli enjeksiyonları depolarizan 4 msn kullanarak aksiyon potansiyelleri uyandırmak. NOT:PSC türetilmiş CM&#39;ler için akım miktarı tekrarlanabilir aksiyon potansiyelleri değişebilir tetiklemek için gereken. tekrarlanabilir aksiyon potansiyelleri elde edilene kadar uygun eşik akımını bulmak için, kademeli bir şekilde nispeten düşük akım ve artış tetikleme akım genliği başlar. Not: GREM2 kaynaklı atriyal miyositlerde için hareket potansiyeli sürelerine sahiptir 20-40 ms aralığında genellikle bir plato fazı (Şekil 6B) sahip değildirler. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+differentiation+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hepatic differentiation of pluripotent stem cells.</a> Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).</li>
<li>Narazaki, G., Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+and+systematic+differentiation+of+cardiovascular+cells+from+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., Pak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+as+models+of+trophoblast+differentiation%3A+progress%2C+opportunities%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations.</a> Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).</li>
<li>Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+Into+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Burridge, P. W., Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).</li>
<li>Cai, C. L., Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isl1+Identifies+a+cardiac+progenitor+population+that+proliferates+prior+to+differentiation+and+contributes+a+majority+of+cells+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart.</a> Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).</li>
<li>Fujiwara, M., Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+enhancement+of+cardiac+cell+differentiation+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+Cyclosporin-A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).</li>
<li>Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+antagonism+by+Dkk1+counter+activates+canonical+wnt+signaling+and+promotes+cardiomyocyte+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Lian, X., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Klos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gremlin+2+promotes+differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+atrial+fate+by+activation+of+the+JNK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway.</a> Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).</li>
<li>Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Müller, I. I., Melville, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+in+zebrafish+demonstrates+that+the+atrial-fibrillation-associated+gene+GREM2+regulates+cardiac+laterality%2C+cardiomyocyte+differentiation+and+atrial+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).</li>
<li>Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+protein+related+to+DAN+and+cerberus+%28PRDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC).</a> Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).</li>
<li>Schulz, H., Kolde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FunGenES+Database%3A+A+genomics+resource+for+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).</li>
<li>Phosphate-buffered saline (PBS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+Real-Time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egr-1+regulates+expression+of+the+glial+scar+component+phosphacan+in+astrocytes+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke.</a> American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).</li>
<li>Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).</li>
<li>Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%B6pfl%2C+G+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. , 254-279 (2004).</li>
<li>Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mouse+embryonic+stem+cell+based+assay+for+quantifying+cardiogenic+Induction+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAntonchuk%2C+J+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22">Basic Cell Culture Protocols</a>. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
</ol>

Bu makalenin yazarlarının birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Bu protokol rutin atriyal soyunun karakteristik CM&#39;ler yüksek bir yüzde ile kültürleri üretmektedir. herhangi bir farklılaşma protokolü ile olduğu gibi, farklılaşma öncesi mESCs kalitesi özellikle önem verilmelidir. mESCs rutin uygun morfoloji (Şekil 1A) için izlenmelidir. Önce EBS oluşumuna oluşan herhangi bir spontan farklılaşma ciddi cardiogenesis etkinliğini sınırlamak ve (Şekil 1B) Pasajlanması önce çıkarılmalıdır. EB boyutu da cardiogenesis etkiler. 200 ve EB başına 1.000 aras...

Pluripotent kök hücreleri oluşturma ve özellikle insanlarda 1-5, Temel araştırma ve ön-klinik çalışmalar için erişim doku zor bir ana hücreleri incelemek için güçlü araçlardır. gelişimsel sinyal yollarının düzgün modülasyon arzu edilen fenotipik kaderine pluripotent kök hücrelerin farklılaşması yönlendirebilirsiniz. Birçok protokol pluripotent kök hücreler 6-14 den kardiyomiyositlerde (CMS) oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu protokoller, genellikle TFGβ süper ailesinin (Aktivin, BMP ve TGFβ) ve Wnt eksojen büyüme faktörleri ve / ya da küçük moleküllerin 10,12-15 zaman ayarlı eklenmesiyle yolları modülasyonunu içerir. Bu protokoller CMS haline hücrelerin yüzdesi artan genellikle etkilidir, ancak atriyal, ventriküler, ve düğüm / iletim sistemi soy temsil hücrelerin oluşan karışık bir nüfus üreten, özgüllük yoksundur. Belirli kardiyak incelemek için bir daha yönlendirilmiş farklılaşma beğenme alt tipleriach gereklidir. Gremlin2 (Dan ve kısa Cerberus ve PRDC İlişkin GREM2 olarak da adlandırılan protein) zebrabalıkları 16 kardiyak gelişimi sırasında uygun bir kardiyak farklılaşma ve atriyal odacıktan oluşumu için gerekli olan bir eden sekrete edilmiş BMP antagonistidir. Sadece mezodermal belirteçleri T Brachyury ve 1 gibi Cerberus pik ifadesinden sonra, farklılaşma 4. günde GREM2 farklılaşan embriyonik kök hücreleri tedavi CMS verimini artırır ve ağırlıklı olarak atriyal soy 14 hücre havuzu oluşturur. Rekombinant GREM2 farklılaşan hücrelerin tedavi etmek için kullanılır ve standart bir protein üretim teknikleri 17 kullanılarak yapılabilir veya ticari olarak satın alınabilir. Bu sulu çözeltiler içinde yüksek derecede çözünür olan ve istenen bir zaman noktasında kültürlere eksogen olarak ilave edilebilir. Farklılaşma markörleri temsilcisi ekspresyonunu ölçmek için RT-qPCR kullanılarak izlenebilirkardiyovasküler ataları, kalp atalarıdır ve taahhüt CMS. Immünofloresans tespit etmek ve kardiyak hücre tipleri dağılımını görselleştirmek için kullanılabilmektedir. belirlemek ve CMS izole etmek için bir raportör sistemi kullanırken saf nüfusu gerektiren uygulamalar daha kolay yapılır. Bu amaçla, αMHC-DsRedNuc fare CGR8 ES hücre hattı 14 içine inşa oluşturduk. CGR8 hücreleri genişleme ve farklılaşma deneyleri 18 kolaylaştırılması, büyümeye ve besleyici hücreler olmadan pluripotent kalır. ES hücre soyu gen promoteri (MHC ya Myh6 a) kardiyak spesifik alfa miyozin ağır zincir altında nükleer lokalizasyon sinyali ile DsRed floresan proteini kodlama dizisini içerir. Bu hücreleri kullanılarak, CM&#39;ler kolayca tespit ve ölçümü, hücre sıralama, elektrofizyoloji, ilaç ekranlar ve atriyal farklılaşma mekanizmaları çalışmak için izole edilebilir.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11710</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Doku Kültürü</td><td>Plakaları Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Bakteriyel Petri Kapları</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Bakteriyel Petri Kapları</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Gremlin 2 rekombinant protein</td><td>R & Amp; D Systems</td><td>2069-PR-050</td><td></td></tr><tr><td>Steril filtre üniteleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin (domuz derisinden)</td> <td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS, Steril</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>%0,05 Tripsin-EDTA çözümü</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Kalsiyum yok, Magnezyum yok</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14200</td><td></td></tr></tbody></table>

bmp rakip grem2 kullanma pluripotent kök hücreleri atriyal kardiyomiyositlerde farklılaşma

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

pluripotent kök hücrelerinden kardiyomiyositlerinin popülasyonlarının oluşturmak için protokoller geliştirilmiştir, ancak bunlar genellikle karışık fenotip hücreleri verim. Belirli miyosit alt tiplerinin yer aldığı çalışmalarına devam ilgilenen araştırmacılar, daha yönlendirilmiş farklılaşma yaklaşımı gerektirir. GREM2, in vivo olarak atriyal odacıktan oluşumu için gerekli olan bir eden sekrete edilmiş BMP antagonist fare embriyonik kök (ES) hücreleri tedavi olarak, atriyal fenotip ile kalp hücreleri, çok sayıda üretilebilir. işlenmiş Myh6-DsRed-Nuc pluripotent kök hücre çizgisinin teşhisinde kullanılan, seçim ve kardiyomiyositlerde saflaştırılması için izin verir. Bu protokolde embriyoid organları asılı damla yöntemiyle Myh6-DsRed-Nuc hücrelerinden üretilir ve farklılaşma 4. günde (d4) kadar süspansiyon içinde tutulması. d4 hücre GREM2 ile muamele edilir ve jelatin kaplı plakalara kaplanmıştır. d8-d10 büyük müteahhitlik alanlarında kültürlerde gözlemlenen ve genişletmeye devam m olan ArasındaD14 ile çalıçtırdıgınızda. Moleküler, histolojik ve electrophysiogical analizler GREM2 ile muamele edilmiş hücrelerdeki hücre atriyal kardiyomiyositlerin biyoloji ve çeşitli farmakolojik maddeler tepkilerini üzerinde çalışmak için in vitro bir model sağlayan, atriyal benzeri özellikler elde etmektedir.

Önce farklılaşma, pluripotent kök hücreler kompakt ve spontan farklılaşma arındırılmış olmalıdır. Şekil 1A&#39;da gösterilen hücrelerin singularized ve protokol bölümünün 5.1 de tarif edildiği gibi damla asılı kullanılmak üzere hazırdır. Şekil 1B de gösterilen hücrelerin spontan ayırt edilir ve asma damlaların hazırlanmasında kullanılan kullanılmamalıdır. Paneller 2 gösteri ba...

Pluripotent kök hücrelerden in vitro kardiyomiyositlerin üretilmesi, temel bilim ve klinik uygulamalar için in vitro olarak büyük miktarlarda kalp dokusuna erişim sağlar. Bu protokol, hem elde edilen kardiyomiyositlerin sayısını artırmak hem de atriyal fenotipli kardiyomiyositler oluşturmak için atriyalize edici faktör Grem2'yi kullanır.

BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Bu farklılaşma protokolünün genel amacı, kültürde homojen atriyal kardiyomiyosit popülasyonları oluşturmaktır. Dolayısıyla bu yöntem, kardiyak gelişim ve atriyal aritmi gibi kardiyak hastalıkların incelenmesinde kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, in vitro olarak homojen atriyal kardiyomiyosit kültürleri üretmesi ve minimum eğitimle yapılabilmesidir.Fare embriyonik kök hücresini veya mESC kültürlerini kurmadan dört gün öncesine kadar, sterilize edilmiş bir doku kültürü davlumbazında oyuk başına 1 mililitre jelatin içeren altı oyuklu plakada, her biri 5 mililitre% 0.2 jelatin çözeltisi içeren 10 santimetrelik doku kaplarını kodlayın. Kültür gününde, ekstra jelatin çözeltisini çıkarın ve jelatin kaplı 10 santimetrelik tabaklardan birine 10 mililitre orta ekleyin. Ardından, şişenin merkezinde sadece küçük bir buz kristali kalana kadar 37 derecelik bir Celcius su banyosunda 1 çarpı 10 ila 6 mESC'lik bir şişeyi hafifçe döndürmek için kriyomaşa kullanın.Şişeyi tek kullanımlık, tüy bırakmayan bir mendille kurulayın ve %70 etanol ile sterilize edin. Daha sonra şişeyi doku kültürü başlığına yerleştirin ve ESC'leri tabağa eklemek için bir P1000 pipeti kullanın. Hücreleri% 5 karbondioksit içeren 37 derecelik Celcius nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı yavaşça önden arkaya ve yan yana hareket ettirin.İnkübasyonun sonunda, hücre ekini doğrulamak için bir parlak alan mikroskobu kullanın. Bazı kalıntılar ve ölü hücreler gözlenecektir. Ortamı 10 mililitre taze mESC ortamıyla değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri koyun.Kültür% 60 ila 70 birleştiğinde, plakayı magnezyum ve kalsiyum içermeyen 5 mililitre steril DPBS ile durulayın ve hücreleri beş dakika boyunca 37 derece Cantius'ta 2 mililitre tripsin EDTA içinde inkübe edin. Hücreler inkübe edilirken, fazla jelatin çözeltisini pasajlı kültür başına 10 santimetrelik yeni bir tabaktan aspire edin ve her plakaya 10 mililitre ortam ekleyin. Daha sonra ayrılan hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte santrifüjleme yoluyla toplayın ve peleti 10 mililitre mESC ortamında yeniden süspanse edin.İstenen bölme oranına bağlı olarak, her 10 santimetrelik çanağa 0,5 ila 1 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri koyun, hücreleri her bir tabakta gösterildiği gibi nazikçe dağıtın. Pasajlı hücreler% 70 birleştiğinde, bunları az önce gösterildiği gibi tripsin EDTA ile ayırın, ardından tek hücreli süspansiyonu 5 mililitre embriyoid cisimciği veya EB ortamında yeniden süspanse edin. mESC'leri sayın ve daha sonra bunları uygun hacimde EB ortamında 2.5 kat 10 ila 3'lük bir nihai konsantrasyona seyreltin.rd mililitre başına hücreler.Daha sonra, asılı damla kültürü başına bir steril 10 santimetre bakteriyel petri kabının dibine 2 mililitre PBS ekleyin ve EB süspansiyonunu steril bir çözelti havzasına aktarın. Şimdi, kapağı hazırlanan yemeklerden birinden çıkarın ve 60 adet 20 mikrolitrelik EB süspansiyonunu iç yüzeye dikkatlice bırakmak için altı uçlu çok kanallı bir pipet kullanın. Kapağı yavaşça tabağın üzerine geri yerleştirin, asılı damlaları yerinden çıkarmamaya dikkat edin ve bulaşıkları iki gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne koyun.EB'ss'yi yıkamak için, kapağı asılı damla kültüründen dikkatlice çıkarın ve 45 derecelik bir açıyla eğin. Ardından, oda sıcaklığında EB ortamı içeren 5 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, EB'leri kapağın altındaki bir havuza nazikçe yıkayın. Yüzeye yapışmış EB'ler için kapağı dikkatlice inceleyin, ardından EB'leri kaplamasız, 6 santimetrelik bir petri kabına aktarın.EB'leri iki gün daha doku kültürü inkübatörüne geri koyun, plakaları EB agregasyonu ve eki için günlük olarak kontrol edin. EB'leri kaplamadan önce, hazırlanan altı oyuklu plakanın her bir oyuğundaki fazla jelatin kaplama solüsyonunu 2 mililitre taze hazırlanmış, oda sıcaklığında Grem2 işlem ortamı ile değiştirin. Daha sonra, her bir oyuğa 30 EB aktarmak için 100 mikrolitreye ayarlanmış bir P1000 pipeti kullanın, ardından plakayı gece boyunca inkübatöre geri koyun ve hücreleri gösterildiği gibi yumuşak bir hareketle eşit şekilde dağıtın.EB'ler kuyuların dibine bağlandıktan sonra, Grem2 ortamını 10. güne kadar her iki günde bir değiştirin. Ardından, sağlıklı bir hücre kültürünü korumak için hücreleri her iki günde bir taze EB ortamı ile besleyin. Asılı damla kültüründen önce, pluripotent kök hücreler kompakt olmalı ve spontan farklılaşma içermemelidir.Spontan farklılaşma gözlenirse, hücreler asılı damla kültürlerinde kullanılmamalıdır. Kaliteli EB genellikle eşit aralıklı, iyi yuvarlatılmış asılı damlalar içinde en iyi şekilde oluşturulur. Farklılaşmanın ikinci gününde, EB'ler, asılı damlaların uçlarında farklılaşan kök hücrelerin küresel düzenlemeleri olarak çıplak gözle görülebilmelidir.Dördüncü günde, iyi şekillendirilmiş EB'ler serbest yüzer ve boyut ve şekil olarak homojen olmalıdır. Kaplandıktan sonra, hücreler EB'den doku kültürü plakasının yüzeyine göç ederken, burada sekiz ve 10. farklılaşma günlerinde gözlemlendiği gibi, EB'ler düzleşecektir. Tedavi edilmemiş kontrol kuyularında, altıncı gün kadar erken ve dokuzuncu gün kadar geç saatlerde küçük, yavaş büzülen yamalar gözlenir.Grem2 ile muamele edilmiş kuyularda, nispeten hızlı bir daralma oranına sahip büyük yamalar yaygındır. Farklılaşmış hücrelerdeki gen ekspresyonunun RT-QPCR analizi, tipik olarak Grem2 ile tedavi edilen kültürlerde yüksek seviyelerde kardiyak yapısal ve düzenleyici genleri ortaya çıkarır. Alfa-MHC DsRed nükleer hücre hattı kullanılırsa, kardiyomiyositlerin artan verimi, Grem2 ile muamele edilen kuyucuklarda daha fazla sayıda DsRed etiketli çekirdek olarak gözlenir.Grem2 tedavisi ayrıca, RT-QPCR ve hücresel aksiyon potansiyeli süresinin yama kelepçesi ölçümleri ile onaylandığı gibi, atriyal benzeri bir fenotipe doğru farklılaşmayı önyargılıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, farklılaşan kök hücreler Grem2 ile 60 dakika gibi kısa bir sürede tedavi edilebilir ve boncuklanma hücreleri genellikle yedinci gün kadar erken bir sürede gözlenir. Bu prosedürü denerken, brachyury gibi gastrulasyon belirteçlerinin en yüksek ekspresyonundan sonraki dördüncü günde sürekli olarak Grem2 eklemeyi unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, üretilen hücrelerin fonksiyonel ve moleküler özelliklerini anlamak için elektrofizyoloji ve QPCR gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Grem2 kullanarak fare ESC'lerinden atriyal kardiyomiyositlerin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

differentiation-atrial-cardiomyocytes-from-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Bu protokolde, hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesi gösterilecektir. Bu protokoldeki ana strateji, embriyonik kök hücre hatlarına tasarlanmış floresan raportörler kullanarak kardiyak progenitör hücreleri akış sitometrisi ile zenginleştirmektir.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Burada, insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) için sağlam, hızlı ve ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu büyük ölçekli yöntem kullanılarak türetilen kardiyomiyositler, insan kardiyovasküler hastalık modellemesinde, yüksek verimli ilaç taramasında ve potansiyel olarak klinik uygulamalarda etkili kullanımları için yeterli hücre sayısı sağlayabilir.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Bu el yazması, Gata4, Hand2, Mef2c ve Tbx5'in retrovirüs aracılı bir iletimini kullanarak çeşitli yeniden programlanmış kardiyak alt tiplerin oluşturulması ve ölçülmesi için adım adım bir protokolü açıklar.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Bu yöntemin amacı, progenitör hücre spesifikasyonu ve fonksiyonel özelliklerini incelemek ve kalp hastalığı modelleme için oda spesifik kardiyak hücreler oluşturmak için, in vitro kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücreleri oluşturmadır.

In vitro Generation fare kalp alanı-spesifik kardiyak progenitor hücreler

Bu yöntem, floresan etiketli sarkomere proteinleri ile pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler kullanarak sarkomere kısaltmasını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Etiketli Sarkom Proteinleri kullanılarak Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerin Sarkomer Kısaltılması.

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi

Öğrenin, pluripotent kök hücrelerden Grem2 kullanarak atriyal kardiyomiyosit farklılaşması için homojen popülasyonlar üretme yöntemini. Bu protokol, kalp gelişimi ve aritmi araştırmalarında yüksek verimli sonuçlar sağlar.

BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma

Daha fazla video keşfet