İnsan sklera Konfokal Mikroskobu gerçekleştirmek için bir Laminasyon Tekniği

Bu metodolojinin genel amacı, insan sklerasının konfokal mikroskobunu gerçekleştirmektir. Bu yöntem, oftalmik alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Sağlıklı kişilerde bağışıklık hücresi dağılımı ve vasküler durum ve Sklera'daki patolojik durumlar gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, yoğun bağ dokusunun konfokal görüntülenmesine izin vermesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Stefan Kremers olacak. Başlamak için, ayrı tüplerde yüzde 96 Etanol ve PBS hazırlayın.

Daha sonra, yüzde iki BSA içeren PBS'nin önerilen seyreltilmesinde primer antikorların numunesi başına 100 mikro litre hazırlayın ve tüm çözeltileri buz üzerinde tutun. Bir ila iki Colibri forseps, düz mikro diseksiyon makası, kavisli makas, 10 numara neşter veya oftalmik neşter mikro tüyü, dört adet 26 gauge iğne ve bir bez dahil olmak üzere temiz aletler düzenleyin. Alüminyum folyoyu bir polistiren plakanın etrafına sarın veya dokuyu sabitlemek için bir mantar plaka hazırlayın.

Metin protokolüne göre öne açık bir ampul ürettikten sonra, Sklera'yı açık kısmı yukarı bakacak şekilde bir çubuk üzerine yerleştirin. Daha sonra retinayı çıkarmak için kolibri forseps kullanın ve pigmentli uveal tabakaları sklera bu tabakalardan kurtulana kadar iç skleradan çıkarın. Daha sonra, retinayı ve uvelayı papilladan çıkarmak için gerekirse kavisli makas kullanın.

Daha sonra kalan konjonktivayı, ekstra oval kasları ve zıvana kapsülünü yüzeysel skleradan çıkarın. Şimdi dokuyu nazikçe tutmak için kolibri forseps kullanarak, düz makasla doku üzerindeki farklı yerlerden yaklaşık iki santimetre kare büyüklüğünde skleral örnekler kesin, alanı konfokal mikroskopi için uygun hale getirmeyecek forseps ile tekrarlanan tutmaktan kaçının. Numuneleri 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin, 1,5 mililitre yüzde 96 etanol ekleyin ve dokuyu sabitlemek için 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra etanolü çıkardıktan sonra, numuneleri çalkalarken her biri beş dakika boyunca üç kez yıkamak için 1.5 mililitre PBS kullanın. Daha sonra, numuneleri yüzde beş BSA ile 1.5 mililitre PBS'ye aktarın ve laminasyona yardımcı olmak ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için numunelerin şişmesine neden olacak şekilde oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Numuneler şiştiğinde, stereo-binoküler mikroskop altında, posterior skleral numuneleri folyo sarılı polistiren membrana veya mantar plakaya sabitlemek için kenarlardan bükülmüş 26 gauge iğne kullanın.

Daha sonra, tam kalınlıktaki numuneleri lamine etmek için, skleral dokunun ön kenarını yatay olarak tutmak için kolibri forseps kullanın. 10 numara neşterle, yüzeysel skleranın alttaki tabakadan mümkün olduğunca ince bir tabakasını dikkatlice kesin. Dokunun kurumasını önlemek için, katmanların üzerine 50 mikro litre PBS pipetleyin.

Daha sonra katmanlar kesildikten sonra, bunları 96 oyuklu bir plakada 100 mikro litre PBS'ye yerleştirin ve hem yönlendirmeyi hem de katmanı etiketlemek için su geçirmez bir işaretleyici kullanın. Katmanları izole etmeye devam edin ve doku tamamen lamine olana kadar 96 oyuklu plakaya aktarın. İmmünohistokimyayı gerçekleştirmek için, pipeti her bir kuyucuğun duvarına karşı tutarak ve sıvıyı aspire ederek ortamı 96 oyuklu plakadan çıkarın.

Daha sonra, uygun kuyucuklara yüzde iki BSA ile PBS'de bir ila 100 oranında seyreltilmiş 100 mikro litre primer antikor ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri bir çalkalayıcıda her biri beş dakika boyunca üç kez yıkamak için 200 ila 300 mikro litre PBS kullanın. Gerekirse, başka bir primer antikor kullanın ve gece boyunca dört santigrat derecede tekrar inkübe edin.

Daha sonra, karşılık gelen ikincil antikorlardan 100 mikro litre ekleyin, PBS'de yüzde iki keçi serumu ile bir ila 300 seyreltin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir ila iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri çalkalayıcı üzerinde her biri beş dakika boyunca üç kez tekrar durulamak için 200 ila 300 mikro litre PBS kullanın. Daha sonra her bir kuyucuğa 100 mikro litre bir ila 2000 seyreltme DAPI ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin.

Numuneleri iki kez yıkamak için 200 ila 300 mikro litre PBS kullanmadan önce. Numunenin slayt üzerinde düz durduğundan emin olmak için numuneleri stereo-binoküler mikroskop altındaki mikroskop slaytlarına aktarın ve bir ila iki damla floresan montaj ortamı ekleyin. Ardından üstüne bir örtü yerleştirin ve kenarları kapatmak için şeffaf oje kullanın.

Daha sonra kullanmak üzere karanlıkta dört santigrat derecede saklayın veya doğrudan konfokal mikroskopi ile inceleyin. Numunelerin kalınlığını doğrulamak için, skleral konuma bağlı olarak kalınlık ekvator ve posterior olarak farklılık gösterdiğinden z-yığınları alın. Bu görüntüler, anterior ve posterior episkleradan türetilen lamine insan sklerasındaki kan damarı pleksisinin çeşitli ağını göstermektedir.

Kan damarları yeşil renkle gösterildiği gibi CD31 için pozitiftir. Bu şekilde, episkleranın LYVE1 pozitif bağışıklık hücreleri ve bunların CD31 pozitif kan damarları ile ilişkisi gösterilmiştir. Z-stack serisi, kan damarlarının ve bağışıklık hücrelerinin üç boyutlu ilişkilerini incelemek için 10x büyütmede çekildi.

Burada gösterildiği gibi, sklera içinde yer alan ekstra oküler kaslar, sırasıyla CD31 ve LYVE1 belirteçleri kullanılarak kan damarlarının veya bağışıklık hücrelerinin varlığı açısından da analiz edilebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, laminasyon tekniği uygun şekilde yapılırsa bir saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, dokunun kurumasını önlemeyi unutmamak önemlidir.

İnsan dokusu ile çalışmanın potansiyel olarak bulaşıcı olabileceğini ve mikrobiyolojik ve virolojik teşhis gibi önlemlerin her zaman önceden alınması gerektiğini unutmayın.