Name: İnsan sklera Konfokal Mikroskobu gerçekleştirmek için bir Laminasyon Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Öğrenin, insan sklera dokusunda konfokal mikroskopi için laminasyon tekniğini. Bu yöntem, immün hücre dağılımını ve vasküler durumu inceleyerek oftalmolojik araştırmalara katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alman Araştırma Vakfı (FOR2240 "Gözün İnflamatuar Hastalıklarında (Lenf) Anjiyogenez ve Hücresel Bağışıklık" ile CC ve LMH'ye; HE 6743/2-1 ve HE 7643/3-1'den LMH'ye; CU47/6-1'den CC'ye), Alman Kanser Yardımı (LMH ve CC'ye), Köln Üniversitesi GEROK programı (SLS ve LMH'ye) ve AB COST BM1302 "Kornea Rejenerasyonuna Güçlerin Birleştirilmesi" (CC'ye).

insan dokularının kullanılması gözden geçirilmiş ve bir kurumsal inceleme kurulu veya eşdeğeri tarafından onaylanmalıdır. Burada anlatılan çalışma yerel etik komitesi tarafından onaylanmış ve bilimsel inceleme için onay aldı. Bu çalışma Helsinki Bildirgesi göre yapıldı. İnsan skleral örnekleri Göz Hastalıkları Anabilim Dalı Göz Bankası, Köln Üniversitesi, Almanya&#39;da (maksimum postmortem süresi 24 saat) küre vericilerden gözlerinden elde edilmiştir. 1. Deneysel hazırlanması <ol><li> % 96 etanol hazırlayın ve farklı tüplerde tamponlu tuz (PBS) fosfat. PBS,% 2 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden Tavsiye edilen seyreltme birincil antikorların hazırlanması ve buz üzerinde tüm çözümler tutun. örnek başına 100 ul hazırlayın. </li><li> bütün aletleri temizleyin ve keskin neşter kullanın. Aynı neşter ile kesim tekrarlanır sonra neşteri değiştirin. </li><li> 1-2 colibri forseps, düz mikro kesme makasları, bir 10. neşter eldeOftalmik neşter mikro tüy ve dört 26 G iğne veya. </li><li> Bir polistiren plaka etrafında alüminyum folyo sarın veya doku sabitlemek için bir mantar plaka kullanın. binoküler stereo mikroskop altında çalışın. Gerekirse bir laminer hava akımı altında steril çalışın. </li></ol> 2. sklera hazırlayın <ol><li> Yavaşça ampul tutun ve korneoskleral parçası üzerinde delme öldüğünü keşfetmek gerçekleştirmek, sonra Trepan döndürün. eşit yuvarlak kesim gerçekleştirmek için yüzeye dikkatlice ve eşit Trepan döndürün. 15,5 mm büyüklüğünde Trepan kullanın. kavisli makas ile kalan ekleri kesin. korneoskleral öldüğünü keşfetmek çıkarın. Bu öne açılan ampul neden olacaktır. <ol><li> yukarı açık bölümü ile bir bez üzerinde sklerasına koyun. sklera her iki katmanları (retina ve uvea) koparmak için colibri forseps kullanarak, retinaya ve uvea çıkarın. İç sklera pigmente uvea bırakmayın. papilladan retina ve uvea kaldırmak için kavisli makas kullanın. rem kaldırTahliye konjonktiva, göz dışı kaslar ve yüzeysel skleradan Tenon kapsülü. </li></ol></li><li> düz tip makas ve colibri forseps kullanarak gerekli boyutta skleral örnek çıkarın. Yaklaşık 2 cm farklı yerlerden 2 boyutlu skleral örnekler alabilir. Çünkü küçük boyutu, nazikçe sklera tutun ve düz tip makas kullanarak kareler olarak gerekli boyut kesip. korneoskleral trepanasyon skleral numune ön kenar tanımlar. <ol><li> tekrarlanan yakaladı doku konfokal mikroskopi analiz için uygun değildir alanı olarak forseps ile kapma kaçının. Ve kullanılan antikorların miktarı (Şekil 1 karşılaştırmak, örneğin anterior vs posterior) deney türüne bağlı olarak numunelerin gerekli sayıda hazırlayın. </li></ol></li><li> daha sonra kullanmak için 1.5 ml tüpler örnekleri koyun. 15 dakika boyunca 1.5 ml% 96 ​​etanol içerisinde örnekleri saptamak, ve daha sonra 5 dakika boyunca her üç kez yıkayınçalkalayıcı üzerinde 1.5 ml PBS içerisinde. Dondurulmuş doku ile çalışıyorsanız, ek donma önce bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Taze doku kullanın. Bu mümkün değil ise, ancak, ek sıvı azot içinde sklera dondurmak ve daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklayın. dondurulmuş doku kullanımdan önce çözülme ile çalışma durumunda. Tekrarlanan çözülme ve donma döngüleri kaçının. </li><li> 2 saat boyunca oda sıcaklığında 1.5 ml 5% BSA ihtiva eden PBS içinde, her bir örnek tutun. Bu adım Lamine için yararlıdır örnek bir şişmesine neden ve aynı zamanda belirsiz bağlama engeller. </li><li> Numuneler kabarmış sonra, laminasyon skleral kareler hazırlamak. Örneğin bir binoküler stereo mikroskop mikroskop altında çalışın. alüminyum folyo veya 26 G iğneler kullanılarak mantar plaka sarılı polistiren zarı arka skleral örnekleri yapıştırın. </li><li> onlar mikroskop altında görme alanı karışmaz, böylece iğne kenarlarını bükün. </li><li> tam kalınlıkta skleral samp Laminatles. <ol><li> İlk olarak, colibri forseps kullanılarak ön skleral kenarına tutun. Sonra dikkatlice 10. neşteri, oftalmik neşter mikro tüy veya spatula bıçak kullanarak yüzeysel sklera ince bir tabaka kesti. yatay neşter tutun ve alttaki katmanla itibaren ince mümkün olduğunca yüzeysel katmanı kesti. </li><li> skleral meydanına ince bir skleral tabaka teşrih. Standart cerrahi teknikler trabekülektomiye sırasında kanat hazırlamak ve 30-80 um kalınlığında tabakalar (Şekil 2 ile karşılaştırınız) ile sonuçlanmalıdır Bu yöntem karşılaştırılabilir. </li></ol></li><li> Örneğin, 50 ul PBS bir pipet kullanılarak doku PBS küçük miktarlarda eklenmesi ile sklera kurumasını önler. </li><li> Su geçirmez renk örn ve katman (yüzeysel ve derin) (extern ve stajyer doğru) 96 plaka PBS 100 ul halinde kesilmiş katmanları koyun ve yönünü hem de etiket. </li><li> Doku tamamen lamine kadar tekrarlayın 2.7-2.9 adımları tekrarlayın. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. İmünohistokimya gerçekleştirin <ol><li> Tavsiye edilen seyreltme halinde gerekli birincil antikor 100 ul ekle. Burada, örneğin kullanımı CD 31 (monoklonal, fare anti-insan) ve LYVE1 antikor (tavşan anti insan), 1 seyreltme hem de: (% 2 BSA içeren) PBS içinde 100 ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. 96 oyuklu bir plaka içerisinde orta değiştirmek üzere, iyi duvarına pipet tutun ve sıvıyı. </li><li> Sonraki gün, bir karıştırıcı üzerinde 200-300 ul PBS ile 5 dakika için numuneler üç kez yıkayın. karşılık gelen sekonder antikor, 100 ul ilave et; Burada keçi anti fare floresein izotiosiyanat (FITC) ve keçi anti tavşan siyanin boyası 3 (Cy3) kullanın ve 1-2 saat için oda sıcaklığında örnekleri inkübe edin. İkincil antikorlar 1 seyreltilir: 300 PBS,% 2 keçi serumu ihtiva eden. </li><li> çalkalayıcıda 200-300 ul PBS içinde 5 dakika boyunca tekrar üç kere, her numune durulayın. </li><li> Çekirdek boyama gerçekleştirin, örneğin </&gt; Em. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (seyreltme oranı: 1: 2.000, her biri 100 ul de ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir), daha sonra bir karıştırıcı üzerinde 200-300 ul PBS içinde tekrar 2 kez yıkayın. </li><li> , Mikroskop lamı üzerine örnekleri aktarın embed onları floresan montaj orta 1-2 damla, bir lamel eklemek, şeffaf vernik ile kenarları kaplayarak mühür ve mağaza 4 ° C&#39;de daha sonra kullanmak üzere veya doğrudan konfokal ile slaytlar incelemek mikroskop. </li><li> örnekleri analiz etmek için bir konfokal mikroskop (veya eşdeğeri) kullanın. İstenilen büyütme, örneğin 10-40X büyütme kullanın. </li><li> Örneklerin kalınlığı doğrulamak için, konfokal mikroskopi Z-Yığınlar kullanarak ölçün. kalınlık ekvatorial ve posterior (giriş karşılaştırın) farklıdır mümkün skleral bölümlerin miktarı, sklera konumuna bağlıdır. </li></ol>

<ol><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+%28LYVE1%29-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li>
<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li>
<li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li>
<li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis%3A+what+can+we+learn+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li>
<li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li>
<li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact%2C+functional+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li>
<li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+chamber-associated+immune+deviation%2C+ocular+immune+privilege%2C+and+orthotopic+corneal+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li>
<li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li>
<li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li>
<li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+content+of+the+scleral+spur%2C+trabecular+mesh%2C+and+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li>
<li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoster%2C+CS+%22The+sclera%22">The sclera</a>. , Springer. (2012).</li>
<li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Der+Blutkreislauf+des+Auges%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225(1943).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li>
<li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm%27s+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li>
<li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li>
<li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li>
<li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Ophthalmol+Soc+U+K%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li>
<li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Ganka+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali açıklama beyan etmemektedir. Bu makalenin içeriği tamamen yazarların sorumluluğundadır.

İnsan sklera Laminasyon Bu doku üzerinde eş odaklı mikroskopi gerçekleştirmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu süreçte kritik bir adım doku yapıştırılması için etanol kullanımı yerine formalin olduğunu. sabitleme için etanol yerine formalin kullanırken bizim deneyim, daha iyi sonuçlar elde edilmektedir. Blunt neşter prosedürü ağırlaştırmak ve kaçınılmalıdır. Benzer şekilde, sklera kuruması o prosedürü komplike ve görüntülerin kalitesini azaltır, kaçınılmalıdır. İmmünohistokimyasal boyama il...

sklera yoğun bağ dokusu yapılmış göz kapakları, sert dış tabakasıdır. Göz içi yapıları korumak için ve göz içi basıncı korumaya yardımcı olur. Böylece, sklera net görüş için gereklidir. Bu lenf damarlarının 1,2 yoksun ve böylece o ve lenfatik serbest gözün iç 3-7 arasında bir dış lenfatik serbest sınırını oluşturur. Aynı zamanda bu sayede tendonların anatomik benzerlik paylaşarak, göz dışı kaslarının için bağlanma siteleri sağlar. Sklera esas tip I kollajenin yoğun demetleri oluşur ve kolajen tip III, IV, V, VI, VIII, 8,9 ve elastin 10,11 daha az sayıda sahip olduğu için, bu doku immünohistokimya için kullanımı kolay değildir. (1) yüzeysel vaskülarize episkleraya, konjonktiva ve tenon kapsülünün altında bulundu ve iki tarafın ve inci doğru: Anatomik olarak, sklera üç ana katmandan ayrılabiliryörüngeye bakan gözün e geri; (2) sklera stroma, sklera ana parçası; ve (3) ile doğrudan uvea üzerinde bulunan ince, pigmentli tabaka, tabakanın fusca. Sklera ile ilgili bizim anatomik bilgi 20. yüzyılın ilk yarısında kaynaklanmaktadır. O zaman, araştırmacılar başta Hindistan mürekkep enjeksiyonları 12 kullanılarak ve damar 13-15 döküm damarsal anatomisi okudu. Daha sonra, bu anjiografik çalışmalar 16-19 yılında araştırılmıştır. O zamandan bu yana, eski teknikler geliştirildi ve yenileri bize önceki anatomik bilgiyi tamamlamak için izin olduğunu geliştirilmiştir. Bu lenfatik damar endotel spesifik hiyalüronan alıcısı-1 (LYVE1) 20 veya podoplanin 21 gibi, güvenilir lenf belirteçleri beri Örneğin, sadece on yıl olmuştur. Mikroskopisi farklı ti anatomik özelliklerini incelemek için yeni imkanlar sunuyorgöz ssues. Birden lekeler hücrelerin işaretleri ayırt etmek için ya da kan damarları ve diğer anatomik yapılara göre hücre lokalizasyonu için kullanılmak üzere bu sağlar. Numune daha büyük bir boyutta olduğunu ve ne zaman belirli bir hücre tipi arama bize örnek üzerinden tarama sağlar zaman bir bakış sağlar. Z yığın tekniği ile, konfokal mikroskopi 100-200 um kadar örnekler için kullanılabilir. Sklera kas eklemeleri arkasında 0.3 mm ve arka kutupta 11 1 mm arasındaki kalınlıklarda farklıdır. kalınlığı ve opaklık hem nedeniyle, sklera geleneksel yöntemlerle konfokal mikroskopi için uygun değildir. Bu durumu düzeltmek için, skleral dokular konfokal mikroskobu ile analiz için izin lamine edilmiştir. Bu teknoloji, insan sklera hem de fizyolojik ve patolojik durumların daha iyi anlamaya için yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>% 96 etanol</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Almanya</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>binoküler stereo mikroskop ve nbsp;</td><td>Motic, Hongkong, Çin</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G iğneler&nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Belçika</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Almanya</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>no.10 nbsp;</td><td>Tüy, pfm medikal, Osaka, Japonya</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>oftalmik neşter mikro tüy&nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japonya</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 antikoru (monoklonal fare anti insan)</td><td>Dako, ABD</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 antikoru&nbsp; (Poliklonal tavşan anti insan)</td><td>Zytomed, Almanya</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>keçi anti fare FITC antikoru</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Almanya</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>keçi anti tavşan Cy3 antikoru</td><td>Dianova, Almanya</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Serumu normal</td><td>Dako, Glostrup, Danimarka</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop slaytlar&nbsp;</td><td>Engelbrecht, Ederm&uuml; nde, Almanya</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Lamelleri 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Almanya</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO floresan montaj ortamı&nbsp;</td><td>DAKO, ABD</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 konfokal mikroskopi&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Almanya</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan sklera konfokal mikroskobu gerçekleştirmek için bir laminasyon tekniği

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

sklera kapakları ve göz koruyan yoğun bağ dokusu olduğunu. Özellikle yoğun kolajen demetleri (tip I, III, IV, V, VI ve VII) oluşur. Nedeniyle otofloresansı, opaklık, ve kalınlık için, konfokal mikroskopi için uygun bulunmamıştır. Antijen alımı için doku ön ısıtma, özellikle, immünhistokimya için parafine gömüldü formalin ile fikse sklerasına kullanan teknik zorlukları vardır Burada sunulan birine alternatif bir yaklaşım. sklera hücreleri ve damarlar hem de göreceli olarak zayıf olduğu için, daha büyük doku örneklerinin kullanılması bakan hücreleri önlemek ve gemi ve diğer anatomik sitelere ilişkin kendi yerleşimini anlamada yardımcı olmak için araştırılmıştır. konfokal mikroskop altında daha büyük bir doku örneklerinin analizi için izin vermek için, bir laminasyon tekniği sklera ince tabakaları oluşturmak için gerçekleştirilmiştir. CD31 kan damarları ve lenfatik damar endotel hyalu sonuçlarının analizini takibenronan reseptör 1 (LYVE1) Bilimsel inceleme için onay elde edildiği için pozitif hücrelerin, bu yöntemin avantajları ve sınırlılıkları tartışılmıştır.

Burada gerçekleştirilen temsili denemelerde, bu özel laminasyon tekniği kullanılarak elde edilen gösterilebilir faydaları vardır. İlk deneme üç temsilci resim (Şekil 3) episkleral damar pleksusun farklı ağını göstermektedir. gemiler CD31 pozitiftir. İkinci deneme episkleraya ve CD31 pozitif kan damarları olan ilişkilerine özellikle LYVE1 + hücrelerde, bağışıklık hücrelerini gösterir. Burada Z-Yığın teknoloji d...

İnsan sklera dokusu esas olarak kollajendir; bu nedenle immünohistokimya için kolay kullanılamaz. Skleral dokunun konfokal mikroskobu için immünohistokimya yapma hedefine ulaşmak için bir laminasyon tekniği kullanıldı.

İnsan sklera Konfokal Mikroskobu gerçekleştirmek için bir Laminasyon Tekniği


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Bu metodolojinin genel amacı, insan sklerasının konfokal mikroskobisini gerçekleştirmektir. Bu yöntem, oftalmoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, skleradaki sağlıklı ve patolojik durumlarda immün hücre dağılımı ve vasküler durum gibi konular.Bu tekniğin temel avantajı, yoğun bağ dokusunun konfokal görüntülemesine olanak tanımasıdır. Prosedürü, laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Stefan Kremers uygulamalı olarak gösterecek. Başlamak için, ayrı tüplerde %96'lık Ethanol ve PBS hazırlayın.Ardından, yüzde iki BSA içeren PBS'de önerilen seyreltmede, her numune için 100 µL primer antikor hazırlayın ve tüm solüsyonları buz üzerinde tutun. Bir veya iki adet Colibri pens, düz mikro-diseksiyon makası, eğri makas, 10 numara bistüri veya oftalmik bistüri mikro tüyü, dört adet 26 gauge iğne ve bir pamuklu çubuk dahil olmak üzere temiz aletleri düzenleyin. Dokuyu sabitlemek için bir polistiren plakayı alüminyum folyo ile sarın veya bir mantar plaka hazırlayın.Metin protokolüne uygun olarak ön tarafı açılmış bir bulbus hazırladıktan sonra, Sklera'yı açık kısmı yukarı bakacak şekilde bir pamuklu çubuk üzerine yerleştirin. Ardından, sklera bu tabakalardan tamamen arınana kadar retinayı ve pigmentli uveal tabakaları iç skleradan uzaklaştırmak için colibri pens kullanın. Daha sonra, gerekirse retinayı ve uveayı papilladan temizlemek için eğri makas kullanın.Ardından, kalan konjunktivayı, ekstra-oküler kasları ve tenon kapsülünü yüzeysel skleradan uzaklaştırın. Şimdi, dokuyu nazikçe tutmak için colibri pens kullanarak, düz makasla dokunun farklı bölgelerinden yaklaşık iki santimetrekare boyutunda skleral örnekler kesin; konfokal mikroskopi için bölgeyi uygunsuz hale getirecek pensle tekrarlanan kavramalardan kaçının. Örnekleri 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin, 1,5 mililitre %96 etanol ekleyin ve dokuyu sabitlemek için 15 dakika inkübe edin.Ardından etanolü uzaklaştırdıktan sonra, örnekleri çalkalayarak beşer dakikalık üç kez 1,5 mililitre PBS ile yıkayın. Sonra, örnekleri %5 BSA içeren 1,5 mililitre PBS'ye aktarın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin; bu işlem örneklerin şişmesini sağlayarak laminasyona yardımcı olacak ve spesifik olmayan bağlanmayı önleyecektir. Örnekler şiştiğinde, stereo-binoküler mikroskop altında, kenarları bükülmüş 26 gauge iğneler kullanarak posterior sklera örneklerini folyo kaplı polistiren membrana veya mantar plakaya sabitleyin.Ardından, tam kalınlıktaki örnekleri lamine etmek için sklera dokusunun ön kenarını yatay olarak tutmak üzere colibri pens kullanın. 10 numara bir bistüri ile, yüzeysel skleradan mümkün olduğunca ince bir tabakayı alt tabakadan dikkatlice kesin. Dokunun kurumasını önlemek için tabakaların üzerine 50 µL PBS pipetleyin.Ardından, katmanlar kesildikten sonra bunları 96 kuyucuklu bir plaka içinde 100 µL PBS'ye yerleştirin ve hem yönü hem de katmanı işaretlemek için suya dayanıklı bir kalem kullanın. Doku tamamen lamine olana kadar katmanları izole etmeye ve 96 kuyucuklu plakaya aktarmaya devam edin. İmmünohistokimya işlemini gerçekleştirmek için, pipeti her bir kuyucuğun duvarına yaslayarak ve sıvıyı aspire ederek ortamı 96 kuyucuklu plakadan uzaklaştırın.Ardından, %2 BSA içeren PBS içinde 1/100 oranında seyreltilmiş 100 µL primer antikoru uygun kuyucuklara ekleyin ve 4 °C'de gece boyu inkübe edin. Ertesi gün, bir çalkalayıcı üzerinde örnekleri üç kez, her biri beş dakika sürecek şekilde 200 ila 300 µL PBS ile yıkayın. Gerektiğinde başka bir primer antikor kullanın ve tekrar 4 °C'de gece boyu inkübe edin.Ardından, %2 keçi serumu içeren PBS içerisinde 1/300 oranında seyreltilmiş 100 µL ilgili sekonder antikor ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta bir ila iki saat inkübe edin. İnkübasyon sonrası, örnekleri çalkalayıcı üzerinde beşer dakikalık üç yıkama işlemiyle 200 ila 300 µL PBS kullanarak tekrar yıkayın. Daha sonra her kuyucuğa 1/2000 oranında seyreltilmiş 100 µL DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta inkübe edin.Örnekleri iki kez yıkamak için 200 ila 300 µL PBS kullanmadan önce, örneğin lam üzerine düz bir şekilde yerleştiğinden emin olmak için örnekleri stereo binoküler mikroskop altında mikroskop lamlarına aktarın ve bir ila iki damla floresan kapatma medyumu ekleyin. Ardından üzerine bir kapatma camı yerleştirin ve kenarları mühürlemek için şeffaf oje kullanın.Daha sonraki kullanım için dört derece Celsius'ta karanlıkta saklayın veya doğrudan konfokal mikroskopi ile inceleyin. Sklera konumuna göre ekvatoryal ve posterior kalınlıklar farklılık gösterdiğinden, örneklerin kalınlığını doğrulamak için z-yığınları alın. Bu görüntüler, anterior ve posterior episkleradan türetilmiş lamine insan sklerasındaki kan damarı pleksusunun çeşitli ağını göstermektedir.Kan damarları, yeşil renkte gösterildiği üzere CD31 için pozitiftir. Bu şekilde, episklera'nın LYVE1 pozitif bağışıklık hücreleri ve bunların CD31 pozitif kan damarlarıyla olan ilişkileri gösterilmektedir. Kan damarlarının ve bağışıklık hücrelerinin üç boyutlu ilişkilerini incelemek için z-yığın serisi 10x büyütmede alınmıştır.Burada gösterildiği gibi, sklera içinde bulunan ekstraoküler kaslar, sırasıyla CD31 ve LYVE1 belirteçleri kullanılarak kan damarları veya bağışıklık hücrelerinin varlığı açısından da analiz edilebilir. Laminasyon tekniği bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, dokunun kurumasını önlemeyi unutmamak önemlidir.İnsan dokusuyla çalışmanın potansiyel olarak enfeksiyöz olabileceğini ve mikrobiyolojik ile virolojik tanı gibi önlemlerin her zaman önceden alınması gerektiğini unutmayın.

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu protokol kimyasal ikinci harmonik üretimi görüntüleme ve diferansiyel kalorimetre taramakullanarak tavşan sklera cross-linking değerlendirmek için teknikler açıklanır.

Tavşan sklera bir araç olarak ikinci harmonik üretimi sinyalleri tedavi doku (TXL) için miyopi Cross-linking değerlendirilmesi için

Bu çalışmada tersinir doku takas, immunostaining, 3D işleme ve analiz insan plasenta villus örneklerinde sırasına 1-2 mm3damar ağları için bir protokol sunar.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Burada, bağışıklık hücreleri ışık sayfalık mikroskobu kullanarak üç boyutlu (3D) kolajen dizey içinde gömülü görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı da hücre göç 3D iz sürmeyi ayrıntılandırdığı. Bu iletişim kuralı 3D Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam edilebilir.

İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu

Lazer fare gözün ön odasında timik implantlar mikroskobu tarama timositleri boyuna intravital gerçek zamanlı izleme göstermek için protokol hedefidir. Kornea saydamlığını ve vaskülarizasyon greft sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kaydetmek için izin verir.

Gerçek zamanlı timositleri mikroskobu tarama lazer göz ön odasında Vivo içinde Takibi

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

Burada konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu tek bir enstrüman platformu nda birleştiren Conpokal tekniğinin protokolü sunulmuştur. Conpokal aynı hücre, aynı bölge, eşzamanlı konfokal görüntüleme ve canlı biyolojik örneklerin mekanik karakterizasyonu yakın sağlar.

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Bu protokolün amacı, subakut oküler hipertansiyonu indükleyen limbal vasküler pleksusun 360° termik koterizasyonuna dayanan yeni bir glokomatöz nörodejenerasyon modelini karakterize etmektir.

Kemirgenlerde Cerrahi Olarak İndüklenen Glokom için Limbal Vasküler Pleksusun Tam Daire Koterizasyonu

Protokol, bir doku temizleme yöntemi olan ScaleSF kullanılarak beyin diliminde ayrıntılı bir nöronal görüntüleme yöntemi sağlar. Protokol, beyin dokusu hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dilimlerin işlenmesi ve nöronal yapıların mezoskopikten mikroskobik seviyelere kadar konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntülemesini içerir.

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

Mevcut protokoller, oküler lensteki periferik yapıların görüntü niceleme yöntemleriyle görselleştirilmesi için yeni tam montajlı görüntülemeyi tanımlamaktadır. Bu protokoller, lens mikro ölçekli yapıları ile lens gelişimi/işlevi arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için yapılan çalışmalarda kullanılabilir.

Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme

Öğrenin, insan sklera dokusunda konfokal mikroskopi için laminasyon tekniğini. Bu yöntem, immün hücre dağılımını ve vasküler durumu inceleyerek oftalmolojik araştırmalara katkı sağlar.

İnsan sklera Konfokal Mikroskobu gerçekleştirmek için bir Laminasyon Tekniği

Daha fazla video keşfet