Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Bu deneyin genel amacı, MyoD protein ortaklarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmektir. Bu yöntem, iskelet kası biyolojisi alanında, anahtar kas transkripsiyon faktörü MyoD ile iskelet kası ton deformasyonunun moleküler regülasyonu gibi temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, biri belirli bir subnükleer bölmede lokalize, seçmeli olarak düşük bolluğa sahip MyoD ortaklarını çözmemize izin vermesidir.

Bu yöntem kas farklılaşmasının düzenlenmesi hakkında fikir verebilse de, diğer dokular gibi diğer sistemlere, özellikle nükleer farklılaşmaya da uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan Dr.Lauriane Fritsch olacaktır. Bu protokolde, MyoD kompleksleri, MyoD'yi FLAG glutenin etiketleri ile stabil bir şekilde eksprese eden HeLa S3 hücrelerinden saflaştırılacaktır.

Boş vektör ile dönüştürülen HeLa S3 hücreleri kontrol olarak kullanılacaktır. Her iki hücre hattı da protokol metninde açıklandığı gibi daha önce eksi 80 santigrat derecede büyütüldü, toplandı ve saklandı. Hızla, hücre peletlerini 37 santigrat derecede bir su banyosunda çözün.

Tüm tamponlar ve homojenizatörler önceden soğutulmalı ve tüm bu prosedür soğuk bir odada gerçekleştirilmelidir. Tipik olarak, her deney noktası için 20 gram hücre kullanılır, ancak bu gösterinin amaçları için sadece 10 gram veya yaklaşık 10 mL hücre işlenecektir. İlk başta 5 mL tampon kullanarak hücreleri 10 mL hipotonik tampon A'da yeniden süspanse edin.

Daha sonra 2,5 mL ve ardından 2,5 mL daha eklenir. Maksimum hücre elde etmek için pipeti taze tamponla iyice yıkayın. Hücre süspansiyonunun 20 mL'sini sıkı oturan bir tokmak ile önceden soğutulmuş homojenizatöre aktarın.

Hücreleri 20 vuruşla homojenize edin. Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücrelerin maksimum geri kazanımı için homojenizatörü 3,5 mL sükroz tamponu ile yıkayın.

Çekirdeği korumak ve sızıntıyı sınırlamak için bu süspansiyonu hızlı bir şekilde 50 mL'lik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun 30 mikrolitrelik bir alikotunu 30 mikrolitre% 4 Tripan Mavisi ile boyayın ve lizis verimliliğini belirlemek için mikroskop altında analiz edin. Lizis başarılı olursa tüm çekirdekler mavi olmalıdır.

Gerekirse homojenizasyonu tekrarlayın. Çekirdeği peletlemek için 10.000 x g ve dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Süpernatanı sitoplazmik bir fraksiyon olarak kaydedin.

Çekirdek peletini 4 mL sükroz tamponu içinde yeniden süspanse ederek nükleer tuz ekstrakte edilebilir fraksiyonu hazırlama prosedürüne başlayın. Ardından, 300 mM sodyum klorür nihai konsantrasyonunu elde etmek için bir girdap üzerinde iyice karıştırırken damla damla 4 mL yüksek tuz tamponu ekleyin. Her beş dakikada bir karıştırarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, 8 mL sükroz tamponu ekleyerek sodyum klorür konsantrasyonunu 150 mM'ye düşürün. 13.000 x g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Tuzla ekstrakte edilebilir kısım olan süpernatanı toplayın ve buzun üzerinde bırakın.

Kromatine bağlı fraksiyonu hazırlamak için, peleti 3.5 mL sükroz tamponu içinde titizlikle yeniden süspanse edin. 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona kalsiyum klorür ekleyin ve karıştırın. Kalsiyum klorür, daha sonra eklenecek olan mikrokok nükleazını aktive edecektir.

Süspansiyonu 37 santigrat derecede bir dakika önceden ısıtın. Mikrolitre başına 35 5 birimlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için mikrolitre başına 5 birim 25 10 mikroleaz stoğu ekleyin. 37 santigrat derecede tam olarak 12 dakika inkübe edin.

Her dört dakikada bir karıştırın. 12 dakika sonra, reaksiyonu hemen buzun üzerine yerleştirin. Mikrokokal nükleaz aktivitesini durdurmak için, 4 mM ve girdaplık bir nihai konsantrasyona 56 mikrolitre 5 molar EDTA pH 8.0 ekleyin.

Buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Her seferinde yüksek genlikte bir dakika boyunca beş kez sonikasyon yapın ve sonikasyonlar arasında bir dakikalık bir mola verin. Hem ekstrakte edilebilir tuzu hem de nükleozomla zenginleştirilmiş fraksiyonları dört santigrat derecede 85.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin.

Süpernatantları toplayın. Tuzla ekstrakte edilebilir fraksiyon yaklaşık 13 mL olmalıdır. Ve nükleozomla zenginleştirilmiş fraksiyon yaklaşık 6 mL olmalıdır.

MyoD protein kompleksleri, çift afinite saflaştırması ile saflaştırılacaktır. FLAG bazlı ve HA bazlı saflaştırma prosedürleri benzer olduğundan, sadece FLAG bazlı saflaştırma gösterilecektir. TEGN'i ekledikten sonra, uygun hacimde FLAG reçinesini 50 mL'lik bir tüpe aktarın.

Her deney noktası için ticari %50 stok ön yıkama FLAG reçinesinden elde edilen 300 mikrolitre FLAG reçinesine ihtiyaç vardır. 1.000 x g'da iki dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, soğuk TEGN ekleyin ve tekrar santrifüjleyin.

FLAG reçinesini soğuk TEGN ile toplam beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, FLAG reçinesini eşit hacimde TEGN ile tekrar süspanse edin. Her deney noktası için 300 mikrolitre yıkanmış FLAG reçinesi ve karşılık gelen protein ekstraktını karıştırın.

Nükleozomla zenginleştirilmiş fraksiyon için 15 mL'lik bir tüp ve tuzla ekstrakte edilebilir fraksiyon için 50 mL'lik bir tüp kullanın. Tüpleri gece boyunca dört santigrat derecede dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. Ertesi gün, tüm tüpleri dört santigrat derecede 1.000 x g'da iki dakika santrifüjleyin.

Süpernatanları toplayın ve saflaştırma verimliliği testinin sonucu elde edilene kadar dört santigrat derecede tutun. Tuzla ekstrakte edilebilir numuneler için, FLAG reçinesini 4 mL TEGN içinde yeniden süspanse edin ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Boncukları kaybetmemek için bu adımı üç kez tekrarlayın, her seferinde aynı 15 mL'ye aktarın.

Dört santigrat derecede 1.000 x g'da iki dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, FLAG reçinesine 13 mL TEGN ekleyin ve dört santigrat derecede 1.000 x g'de iki dakika santrifüjleyin. Reçineyi bu şekilde yedi kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, reçineyi 1 mL TEGN içinde tekrar süspanse edin ve 1.5 mL düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın. İki dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. pH 7.8'de 4 mg / mL'de 100 mikrolitre FLAG peptit çözeltisinde her deney noktası için reçineyi yeniden süspanse edin İyice karıştırın ve 100 mikrolitre TEGN tamponu ekleyin.

Bağlı proteinleri elüte etmek için en az dört saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İki dakika santrifüjleyin ve reçineyi ve süpernatanı 2 mL'lik bir tüpe yerleştirilmiş boş bir spin kolonuna aktarın. Kolonu 6.000 x g'da bir dakika santrifüjleyin.

Kalan süpernatanı 2 mL'lik tüpte toplayın. Saflaştırma verimliliği daha sonra HA bazlı saflaştırmaya devam etmeden önce protokol metninde açıklandığı gibi test edilir. Burada gösterilenler, FLAG HA MyoD'yi kararlı bir şekilde ifade eden bir HeLa S3 hücre hattının nükleer tuzla ekstrakte edilebilir veya nükleozomla zenginleştirilmiş fraksiyonlarından çift afinite saflaştırılmış MyoD komplekslerinin temsili sonuçlarıdır.

Gümüş boyama, sahte hücre hattında bulunmayan okla gösterilen BAYRAK HA MyoD'yi tanımladı. Çift afinite saflaştırılmış MyoD kompleksleri, gliserol gradyanları üzerinde fraksiyone edildi. Anti-FLAG antikorları kullanılarak fraksiyonların batı lekelenmesi, iki subnükleer bölmedeki MyoD alt komplekslerini ortaya çıkardı.

Özellikle, tuzla ekstrakte edilebilir MyoD üç alt komplekse dağıtılırken, kromatine bağlı MyoD esas olarak bir komplekse aittir. Nükleer tuzdan ekstrakte edilebilir ve nükleozomla zenginleştirilmiş fraksiyonlardan izole edilen MyoD interaktörlerinin kütle spektrometresi analizi, MyoD'nin bir dizi bilinen ortağını ve yeni ortaklarını tanımladı. Burada, her iki fraksiyonda veya özellikle fraksiyonlardan biri için bulunan MyoD interaktörleri, fonksiyonel açıklamalarına göre gruplandırılır.

Kütle spektrometresinin bir kısmı, interaktörlerin MyoD kompleksleri üzerinde Western blot ile doğrulandığını ortaya çıkardı. Bunlar, transkripsiyon faktörleri CBF, SWI / SNF alt birimi BAF47 ve HP1 proteinlerini içerir. HeLa hücreleri kas hücreleri olmadığından ve normalde MyoD'yi eksprese etmediğinden, yeni tanımlanan interaktörler ile MyoD ve miyoblastlar arasındaki etkileşimleri doğrulamak gerekir.

Çoğalan ve farklılaşan fare miyoblastlarından elde edilen nükleer toplam ekstraktlar, immünopresipitasyon ve belirtilen antikorlarla Western analizi için kullanıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa iki buçuk gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, elde edilen sonuçları miyoblastlarda rafine etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, etkileşimin işlevsel anlamı gibi ek soruları yanıtlamak için miyoblastlar gibi ilgili sistemde belirli bir partnerin yıkılması gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, gelişimsel biyolojik epigenetik alanındaki araştırmacıların çoğu vücut sistemindeki beş transkripsiyon faktörünün düzenleme ağını keşfetmelerinin yolunu açar. Bu videoyu izledikten sonra, hücre fraksiyonlaması ve ardından kütle spektrometresi ile birlikte tandem afinite saflaştırması yaparak transkripsiyon faktörünün ortaklarını nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.