Name: Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: Keşfedin MyoD protein ortaklarını tanımlamak için tandem afinite arıtma ve kütle spektrometrisi yöntemini. Bu teknik, kas biyolojisi ve hücre farklılaşması araştırmalarında düşük yoğunluklu etkileşimleri ortaya çıkarır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ait-Si-Ali laboratuvarındaki çalışma, Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon) tarafından desteklenmiştir; Ulusal Kanser Enstitüsü (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot ve ''Ben Kimim?'' Mükemmeliyet Laboratuvarı #ANR-11- LABX-0071, Fransız Hükümeti tarafından #ANR-11-IDEX-0005-01 hibesi kapsamında ANR tarafından yürütülen "Geleceğe Yatırımlar" programı aracılığıyla finanse edilmiştir. EB, bir INCa hibesi ile desteklendi.

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

sunulan yöntem, bir transkripsiyon faktörü, myod ortaklarından ayrıntılı tanımlanmasına izin verir. Bu MyoD kaynaklı farklılaşması, yani HeLa-S3 hücreleri dirençli bir heterolog sistemde MyoD ortakları saptandı. Böylece, tanımı gereği, belirlenen MyoD ortakları yayg ifade edilmiştir. Bu genel sekansa özel kopyalama faktörleri, kromatin değiştirici enzimler, RNA işleme proteinleri kinazlar (Tablo 1 ve 2) içerir. HeLa-S3 hücreleri MyoD kaynaklı trans-farklılaşma dirençli olduğu için, MyoD...

Ökaryotik çok hücreli organizmalar farklı organ ve dokularda oluşmaktadır. Her işlevsel doku, her farklılaşma adımında belirlenen spesifik bir gen deseni ifade vardır. Hücresel farklılaşma gen bir dizi hücre proliferasyonu ile ilgili olanlar gibi bir susturma, genel olarak özel genlerin aktivasyonu, kendi ifade bakım gerektirir ve. İskelet kası farklılaşma veya Miyogenesis, o miyoblastların içine mezodermal kök hücrelerin belirlenmesi ile başlar, böylece çok adımlı bir süreçtir ve daha sonra ilk mono-çekirdekli ve daha sonra çoklu çekirdekli, myotubes bu miyoblastların terminal farklılaşmasına yol açar . Böylece, miyoblastlar hala çoğalmaya edebiliyoruz hücreleri, &quot;kararlı&quot;, ama onlar embriyonik gelişim sırasında veya yetişkin kas rejenerasyonu ya iskelet kas hücrelerine sadece ayırt edebilir, böylece iskelet kası soy taahhüt ve edilir. iskelet kası terminal işlemi farklıdırayırt edilmesi gibi E2F hedef genlerin 1 proliferasyon ilişkili genlerin, kesin bir susturma neden miyoblast öncü hücrelerin hücre döngüsüne kalıcı çıkış ile başlayan belirli bir genetik program tarafından yönetilen bir almaktadır. Gerçekten de, farklılaşması sürecinde, miyoblast proliferasyonu tutmak iskelet kası, belirli genlerin ekspresyonunu ve miyotüplerinin 2&#39;ye miyoblastların füzyon öncesinde çok önemli bir adımdır. Böyle bir program iskelet kası hasarı aşağıdaki rejenerasyon sürecinde ayırt etmek için erişkin kas kök hücrelerini de denilen uydu hücreleri, izin verir. Memeli Miyogenesis myojenik temel helix-loop-sarmalın bir ailenin kritik bağlıdır (bHLH) transkripsiyon sıklıkla iskelet kası belirleme faktörleri veya MRF (kas Düzenleyici Faktörler) 3 ailesinin olarak anılacaktır myod, Myf5, MRF4 ve Myogenin, faktörler. Bunların her biri tarifnamede ve dif önemli bir rol oynariskelet kası hücreleri ferentiation ve belirli bir sentezleme modelini Nisan 05-07 yer alır. Myf5 ve myod aktivasyonu miyojenik soy hücreleri taahhüt belirleyici bir adım teşkil ve Myogenin sonraki ifadesi gibi MCK (kas Kreatin Kinaz) olarak iskelet kası belirli genlerin aktivasyonu ile Miyogenesis tetikler. Miyojenik bHLH transkripsiyon faktörleri önceden sessiz loci 8 kas genlerin aktivasyonuna MEF2 aile üyeleri ile işbirliği. Ayrıca çeşitli gen düzenleyici bölgeler 8 sözde e-kutuları bağlanan D proteinleri olarak bilinen her yerde bHLH proteinler, E12 ve E47, ile heterodimerler olarak iskelet kası, gen transkripsiyonu teşvik eder. Büküm, Kimliği (farklılaşma inhibitörü) ve diğer faktörler olumsuz 8 bağlayıcı E proteinleri için myod ile rekabet ederek, bu süreci düzenler. MyoD kas terminal farklılaşma 9 tetikleyen önemli bir oyuncu olarak kabul edilir </syukarı&gt; birçok tamamen farklılaşmış olmayan kas sistemlerinde 10-13 bir myojenik belirleme / farklılaşma (trans-farklılaşma) programı neden kapasitesine sahip çünkü. Nitekim, myod zorla ifadesi farklı hücresel türde başka embriyolojik kökenli 12 türetilmiş hatta trans-farklılaşmasını uyarır. Örneğin, MyoD kas-benzeri hücrelere hepatositler, fibroblastlar, melanosit, neuroblasts ve adipositler dönüştürebilirsiniz. Myod trans-farklılaşma eylem orijinal genetik programı (özellikle, çoğalma genleri) susturulmasına eşlik olmayan bir kas ortamda myojenik genetik programın anormal aktivasyonunu (özellikle hedef genler), içerir. Miyoblastları çoğalan yılında MyoD ifade ama onların rehberleri 14-16 bağlanır bile hedef genleri aktive edemiyor edilir. Bu nedenle, MyoD sürekli farklılaşmamış miyoblastların ifade edilmesi şartı oldukça ELU kalırsive. MyoD önce kromatin remodeling aktive 14,17 enzimleri yüklenmesiyle miyoblastları çoğalan baskıcı kromatin değiştirici enzimlerin işe nedeniyle hedef genleri bastırmak olabilir. Örneğin, miyoblastlar çoğalan, MyoD histon H3 lizin 9 veya H3K9 ve H3K27 KMTs içeren transkripsiyonel ko-represör KAP-1, histon deasetilaz (HDAC) ve baskı lisin metiltransferaz (KMTs) ile ilişkili ve aktif hedef genlerin ekspresyonunu baskılayan bir bir yerel baskıcı kromatin yapısı 14,17 kurarak. Önemli olarak, yeni bir rapor MyoD kendisi doğrudan H3K9 KMT G9A olan transaktivasyon aktivitesini, 16 inhibisyonu ile sonuçlanan metillenmektedir olduğunu göstermiştir. MyoD non-kas hücrelerinin, bu şekilde trans-farklılaşmada rol oynayan epigenetik mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Özellikle, bazı hücre çizgilerinden MyoD kaynaklı trans-farklılaşma dayanıklıdır. Böylece HeLa hücrelerinde, MyoD ya olmayan veyaHatta bağlı kompleks SWI / SNF 18 remodeling kromatin BAF60C alt biriminin ekspresyonu olmaması bastıncısı yerine transkripsiyon aktivatörü olarak işlev olabilir. Bu model, bu şekilde daha iyi bir MyoD kaynaklı geni sentezlenmesi mekanizmalarını tanımlamak için bir seçim olabilir. Ilişkili ortakları ile hedef odakta baskıcı kromatin ortamı teşvik ve bu nedenle terminal farklılaşma ince ayar yapmak için miyoblastları çoğalan olarak MyoD bağımlı baskıcı mekanizmaları ortaya çıkarmak için myod yeteneğini tahlil edilmesi de uygundur. Burada kütle spektrometrisi (MS) karakterizasyonu bağlanmış Tandem afinite saflaştırma (TAP-Etiketi) kullanılarak MyoD ortaklarının tespiti için protokol açıklar. stabil Bayrak-HA-myod ifade HeLa-S3 hücrelerinin kullanılması fraksiyone nükleer ekstrelerinden MyoD kompleksleri arındırmak için yeterli malzeme almak için izin verdi. heterolog sistemde MyoD ortaklarının tespiti validati izlediilgili bir sistemde üzerinde.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Hücre hatları< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Spinner</td><td>Corning</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör: &nbsp; Dounce homojenizatör&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 ve 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>İplikçiler için çalkalama cihazı</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Marienfeld Superior&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>Düşük bağlayıcı tüpler</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>Boş spin sütunu</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-poliakrilamid %4-12&nbsp; jel</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x yükleme tamponu&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x indirgeyici ajan</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş boyama kiti</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj filtre üniteleri, 10K</td><td>Millipore UFC501024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein G agaroz boncukları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G&nbsp; Reçine</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Bayrak reçinesi (anti-Flag M2-agaroz afinite jeli)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA reçinesi (monoklonal Anti-HA agaroz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Bayraksız peptit (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Özel sentez</td><td>50 mM'de 4 mg / ml'ye kadar yeniden askıya alın Tris-HCl, pH 7.8</td></tr><tr><td>HA serbest peptit (YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Özel sentez</td><td>50 mM'de 4 mg / ml'ye kadar yeniden süspansiyon Tris-HCl, pH 7.8</td></tr><tr><td>Bikinkoninik asit bazlı protein tahlil kiti: BCA kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Luminol bazlı geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) HRP substratı</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Kesilmiş somon sperm DNA'sı (somon testislerinden elde edilen deoksiribonükleik asit sodyum tuzu)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Spermin tetrahidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS çalışan tampon</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (yüksek glikoz)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>Ön ısıtma&nbsp; 37 ° C'de; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05 fenol kırmızısı</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Serum</td><td>GE sağlık yaşam bilimleri&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>Her serum lotu önce hücreleriniz için test edilmelidir.</td></tr><tr><td>Penisilin ve Streptomisin&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4Yaşam</td> <td>teknolojileri</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Su (steril filtreli)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sıçanlardan (12CA5)</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr><td>Şikayet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>Batı lekeleme için kullanmak için</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>İmmünopresipitasyon ve batı lekeleme için kullanmak için</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Aktin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG Fare</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Tavşan</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-sıçan -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

tandem affinity arıtma kullanarak myod interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

İskelet kası terminal farklılaşma iskelet hücreleri pluripotent mezodermal öncü hücrelerin taahhüdü ile başlar. Bu hücreler hala çoğalmaya yeteneğine sahip ya da myofibers oluşturmak için daha olgunlaşmak çok çekirdekli miyotüplerinden, içine ayırt ve sigorta olabilir. İskelet kası terminal farklılaşma özellikle kas Düzenleyici Faktörler veya MRF üyeleri (MyoD, Myogenin, Myf5 ve MRF4), aynı zamanda miyojenik bHLH transkripsiyon faktörleri ailesi olarak adlandırılan, çeşitli transkripsiyon faktörleri koordineli hareket tarafından orkestra edildiği. Bu faktörler iskelet Miyogenesis ulaşmak için ayrıntılı kopyalama düzenleyici ağı içinde kromatin-remodeling kompleksleri ile işbirliği. Bu bağlamda, MyoD kas terminal farklılaşma tetikleme master myojenik transkripsiyon faktörü olarak kabul edilir. Bu kavram iskelet kası hücrelerine olmayan kas hücrelerini dönüştürmek için myod yeteneği ile güçlendirilmiştir. Burada myod tanımlamak için kullanılan bir yaklaşım tanımlamakiskelet kası farklılaşması dahil çeşitli faktörleri aydınlatmak için ayrıntılı bir şekilde protein ortakları. Uzun vadeli amaç iskelet kası genlerin düzenlenmesi, yani., MyoD hedefleri yer alan epigenetik mekanizmalar anlamaktır. MyoD ortakları iskelet kası farklılaşması esnasında ilgili mümkün rolü doğrulama ve ardından kütle spektrometrisi (MS) karakterizasyonu bağlanmış bir heterolog sistemde, Tandem afinite saflaştırma (TAP-Etiketi) kullanılarak tespit edilir. kas rejenerasyon konjenital myastenia, miyotonik distrofi rabdomiyosarkomda ve kusurları: miyojenik faktörler, ya da anormal düzenleme anormal şekilleri, kas bozuklukları sayısı ile ilişkilidir. Bu nedenle, myojenik faktörler hastalığın tedavisini artırabilir hastalığın kendisi ve rejeneratif mekanizmaların neden mekanizmaları ile ilgili hem kas bozukluklarında potansiyel terapötik hedefler havuzu sunmaktadır. Bu nedenle, ayrıntılı understankas kaynaklı faktörler tarafından kontrol edilen moleküller arası etkileşimlerin ve genetik programları Ding etkin terapiler rasyonel tasarımı için gereklidir.

MyoD etkinliğinin düzenlenmesini anlamak için, kütle spektrometrisi (MS) ile ve ardından MyoD bir çift etiketli formda imüno göre, biyokimyasal saflaştırma ile MyoD komplekslerinin ayrıntılı karakterizasyon üstlenmiştir. Bayrak-HA-etiketli myod ve Bayrak-HA izinleri ifade eden bir kontrol hücre hattı ifade HeLa-S3 hücre hattının kullanılması Bayrağı-HA-myod çift-afinite saflaştırma gerçekleştirerek MyoD kompleksi arındırmak için yeterli malzeme elde etmek için. <p class="jove_content...

MyoD, birçok tamamen farklılaşmış kas dışı hücre hattının miyojenik transdiferansiasyonunu indükleme kapasitesine sahip miyojenik bir transkripsiyon faktörüdür. Bu transdiferansiyasyonda yer alan epigenetik mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, MyoD ortaklarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kütle spektrometresi ile takip edilen bir çift afinite saflaştırma yöntemini açıklıyoruz.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Bu deneyin genel amacı, MyoD protein ortaklarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmektir. Bu yöntem, iskelet kası biyolojisi alanında, anahtar kas transkripsiyon faktörü MyoD ile iskelet kası ton deformasyonunun moleküler regülasyonu gibi temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, biri belirli bir subnükleer bölmede lokalize, seçmeli olarak düşük bolluğa sahip MyoD ortaklarını çözmemize izin vermesidir.Bu yöntem kas farklılaşmasının düzenlenmesi hakkında fikir verebilse de, diğer dokular gibi diğer sistemlere, özellikle nükleer farklılaşmaya da uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan Dr.Lauriane Fritsch olacaktır. Bu protokolde, MyoD kompleksleri, MyoD'yi FLAG glutenin etiketleri ile stabil bir şekilde eksprese eden HeLa S3 hücrelerinden saflaştırılacaktır.Boş vektör ile dönüştürülen HeLa S3 hücreleri kontrol olarak kullanılacaktır. Her iki hücre hattı da protokol metninde açıklandığı gibi daha önce eksi 80 santigrat derecede büyütüldü, toplandı ve saklandı. Hızla, hücre peletlerini 37 santigrat derecede bir su banyosunda çözün.Tüm tamponlar ve homojenizatörler önceden soğutulmalı ve tüm bu prosedür soğuk bir odada gerçekleştirilmelidir. Tipik olarak, her deney noktası için 20 gram hücre kullanılır, ancak bu gösterinin amaçları için sadece 10 gram veya yaklaşık 10 mL hücre işlenecektir. İlk başta 5 mL tampon kullanarak hücreleri 10 mL hipotonik tampon A'da yeniden süspanse edin.Daha sonra 2,5 mL ve ardından 2,5 mL daha eklenir. Maksimum hücre elde etmek için pipeti taze tamponla iyice yıkayın. Hücre süspansiyonunun 20 mL'sini sıkı oturan bir tokmak ile önceden soğutulmuş homojenizatöre aktarın.Hücreleri 20 vuruşla homojenize edin. Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücrelerin maksimum geri kazanımı için homojenizatörü 3,5 mL sükroz tamponu ile yıkayın.Çekirdeği korumak ve sızıntıyı sınırlamak için bu süspansiyonu hızlı bir şekilde 50 mL'lik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun 30 mikrolitrelik bir alikotunu 30 mikrolitre% 4 Tripan Mavisi ile boyayın ve lizis verimliliğini belirlemek için mikroskop altında analiz edin. Lizis başarılı olursa tüm çekirdekler mavi olmalıdır.Gerekirse homojenizasyonu tekrarlayın. Çekirdeği peletlemek için 10.000 x g ve dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Süpernatanı sitoplazmik bir fraksiyon olarak kaydedin.Çekirdek peletini 4 mL sükroz tamponu içinde yeniden süspanse ederek nükleer tuz ekstrakte edilebilir fraksiyonu hazırlama prosedürüne başlayın. Ardından, 300 mM sodyum klorür nihai konsantrasyonunu elde etmek için bir girdap üzerinde iyice karıştırırken damla damla 4 mL yüksek tuz tamponu ekleyin. Her beş dakikada bir karıştırarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.Daha sonra, 8 mL sükroz tamponu ekleyerek sodyum klorür konsantrasyonunu 150 mM'ye düşürün. 13.000 x g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Tuzla ekstrakte edilebilir kısım olan süpernatanı toplayın ve buzun üzerinde bırakın.Kromatine bağlı fraksiyonu hazırlamak için, peleti 3.5 mL sükroz tamponu içinde titizlikle yeniden süspanse edin. 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona kalsiyum klorür ekleyin ve karıştırın. Kalsiyum klorür, daha sonra eklenecek olan mikrokok nükleazını aktive edecektir.Süspansiyonu 37 santigrat derecede bir dakika önceden ısıtın. Mikrolitre başına 35 5 birimlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için mikrolitre başına 5 birim 25 10 mikroleaz stoğu ekleyin. 37 santigrat derecede tam olarak 12 dakika inkübe edin.Her dört dakikada bir karıştırın. 12 dakika sonra, reaksiyonu hemen buzun üzerine yerleştirin. Mikrokokal nükleaz aktivitesini durdurmak için, 4 mM ve girdaplık bir nihai konsantrasyona 56 mikrolitre 5 molar EDTA pH 8.0 ekleyin.Buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Her seferinde yüksek genlikte bir dakika boyunca beş kez sonikasyon yapın ve sonikasyonlar arasında bir dakikalık bir mola verin. Hem ekstrakte edilebilir tuzu hem de nükleozomla zenginleştirilmiş fraksiyonları dört santigrat derecede 85.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin.Süpernatantları toplayın. Tuzla ekstrakte edilebilir fraksiyon yaklaşık 13 mL olmalıdır. Ve nükleozomla zenginleştirilmiş fraksiyon yaklaşık 6 mL olmalıdır.MyoD protein kompleksleri, çift afinite saflaştırması ile saflaştırılacaktır. FLAG bazlı ve HA bazlı saflaştırma prosedürleri benzer olduğundan, sadece FLAG bazlı saflaştırma gösterilecektir. TEGN'i ekledikten sonra, uygun hacimde FLAG reçinesini 50 mL'lik bir tüpe aktarın.Her deney noktası için ticari %50 stok ön yıkama FLAG reçinesinden elde edilen 300 mikrolitre FLAG reçinesine ihtiyaç vardır. 1.000 x g'da iki dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, soğuk TEGN ekleyin ve tekrar santrifüjleyin.FLAG reçinesini soğuk TEGN ile toplam beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, FLAG reçinesini eşit hacimde TEGN ile tekrar süspanse edin. Her deney noktası için 300 mikrolitre yıkanmış FLAG reçinesi ve karşılık gelen protein ekstraktını karıştırın.Nükleozomla zenginleştirilmiş fraksiyon için 15 mL'lik bir tüp ve tuzla ekstrakte edilebilir fraksiyon için 50 mL'lik bir tüp kullanın. Tüpleri gece boyunca dört santigrat derecede dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. Ertesi gün, tüm tüpleri dört santigrat derecede 1.000 x g'da iki dakika santrifüjleyin.Süpernatanları toplayın ve saflaştırma verimliliği testinin sonucu elde edilene kadar dört santigrat derecede tutun. Tuzla ekstrakte edilebilir numuneler için, FLAG reçinesini 4 mL TEGN içinde yeniden süspanse edin ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Boncukları kaybetmemek için bu adımı üç kez tekrarlayın, her seferinde aynı 15 mL'ye aktarın.Dört santigrat derecede 1.000 x g'da iki dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, FLAG reçinesine 13 mL TEGN ekleyin ve dört santigrat derecede 1.000 x g'de iki dakika santrifüjleyin. Reçineyi bu şekilde yedi kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, reçineyi 1 mL TEGN içinde tekrar süspanse edin ve 1.5 mL düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın. İki dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. pH 7.8'de 4 mg / mL'de 100 mikrolitre FLAG peptit çözeltisinde her deney noktası için reçineyi yeniden süspanse edin İyice karıştırın ve 100 mikrolitre TEGN tamponu ekleyin.Bağlı proteinleri elüte etmek için en az dört saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İki dakika santrifüjleyin ve reçineyi ve süpernatanı 2 mL'lik bir tüpe yerleştirilmiş boş bir spin kolonuna aktarın. Kolonu 6.000 x g'da bir dakika santrifüjleyin.Kalan süpernatanı 2 mL'lik tüpte toplayın. Saflaştırma verimliliği daha sonra HA bazlı saflaştırmaya devam etmeden önce protokol metninde açıklandığı gibi test edilir. Burada gösterilenler, FLAG HA MyoD'yi kararlı bir şekilde ifade eden bir HeLa S3 hücre hattının nükleer tuzla ekstrakte edilebilir veya nükleozomla zenginleştirilmiş fraksiyonlarından çift afinite saflaştırılmış MyoD komplekslerinin temsili sonuçlarıdır.Gümüş boyama, sahte hücre hattında bulunmayan okla gösterilen BAYRAK HA MyoD'yi tanımladı. Çift afinite saflaştırılmış MyoD kompleksleri, gliserol gradyanları üzerinde fraksiyone edildi. Anti-FLAG antikorları kullanılarak fraksiyonların batı lekelenmesi, iki subnükleer bölmedeki MyoD alt komplekslerini ortaya çıkardı.Özellikle, tuzla ekstrakte edilebilir MyoD üç alt komplekse dağıtılırken, kromatine bağlı MyoD esas olarak bir komplekse aittir. Nükleer tuzdan ekstrakte edilebilir ve nükleozomla zenginleştirilmiş fraksiyonlardan izole edilen MyoD interaktörlerinin kütle spektrometresi analizi, MyoD'nin bir dizi bilinen ortağını ve yeni ortaklarını tanımladı. Burada, her iki fraksiyonda veya özellikle fraksiyonlardan biri için bulunan MyoD interaktörleri, fonksiyonel açıklamalarına göre gruplandırılır.Kütle spektrometresinin bir kısmı, interaktörlerin MyoD kompleksleri üzerinde Western blot ile doğrulandığını ortaya çıkardı. Bunlar, transkripsiyon faktörleri CBF, SWI / SNF alt birimi BAF47 ve HP1 proteinlerini içerir. HeLa hücreleri kas hücreleri olmadığından ve normalde MyoD'yi eksprese etmediğinden, yeni tanımlanan interaktörler ile MyoD ve miyoblastlar arasındaki etkileşimleri doğrulamak gerekir.Çoğalan ve farklılaşan fare miyoblastlarından elde edilen nükleer toplam ekstraktlar, immünopresipitasyon ve belirtilen antikorlarla Western analizi için kullanıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa iki buçuk gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, elde edilen sonuçları miyoblastlarda rafine etmeyi unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, etkileşimin işlevsel anlamı gibi ek soruları yanıtlamak için miyoblastlar gibi ilgili sistemde belirli bir partnerin yıkılması gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, gelişimsel biyolojik epigenetik alanındaki araştırmacıların çoğu vücut sistemindeki beş transkripsiyon faktörünün düzenleme ağını keşfetmelerinin yolunu açar. Bu videoyu izledikten sonra, hücre fraksiyonlaması ve ardından kütle spektrometresi ile birlikte tandem afinite saflaştırması yaparak transkripsiyon faktörünün ortaklarını nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

identification-myod-interactome-using-tandem-affinity-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Drosophila ama derinlemesine biyokimyasal analiz uygunluğu için, güçlü genetik manipülasyon ünlüdür. Burada sinek beyin ilgi herhangi bir proteinin etkileşim ortakları belirlemek için TAP-tabanlı bir prosedür mevcut. Bu prosedür, potansiyel araştırma yeni yollar yol açabilir.

Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em&gt; Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından&gt; Adult Başlar (TAP)

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Aşağıdaki adımların her biri için ayrıntılı bilgi içeren optimize edilmiş bir tandem kütle etiketi (TMT) etiketleme protokolü salıyoruz: protein ekstraksiyonu, nicelikselleştirme, yağış, sindirim, etiketleme, proteomik bir tesise teslim ve veri analizleri.

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Burada, endojen fosfoprotein fosfatazların ve bunların hücre ve dokulardan etkileşen proteinlerinin zenginleştirilmesi ve kütle spektrometrisine dayalı proteomiklerle tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ile peptitler ve proteinlerin analizi için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir.

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

Coomassie Brillant Blue (CBB) poliakrilamid jeller G-250 ile protein boyanması için kısa bir protokol CBB ile klasik boyama işlemleri gibi organik çözücüler veya asetik asit kullanmadan açıklanmıştır.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

Keşfedin MyoD protein ortaklarını tanımlamak için tandem afinite arıtma ve kütle spektrometrisi yöntemini. Bu teknik, kas biyolojisi ve hücre farklılaşması araştırmalarında düşük yoğunluklu etkileşimleri ortaya çıkarır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Daha fazla video keşfet